CN109844095A - 对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉f22菌株及其用途 - Google Patents

对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉f22菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明包括对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株；及含有所述菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分的，针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂；用于防治植物寄生线虫的方法，包括通过所述微生物制剂处理作物、作物的种子或栽培地的方法；及包括所述菌株培养步骤的针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法。

Description

对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉F22菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉F22菌株及其用途，更详细来说，本发明包括对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株；及含有所述菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分的，针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂；用于防治植物寄生线虫的方法，包括通过所述微生物制剂处理作物、作物的种子或栽培地的方法；及包括所述菌株培养步骤的针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法。
背景技术
给韩国主要园艺作物、果蔬类园艺栽培地带来损害的典型线虫为包括根结线虫(root-knot nematode)的植物寄生线虫(plant-parasitic nematode)。特别是温室土壤中的根结线虫对农作物造成严重损害。植物寄生线虫根据破坏模式和寄主，分为根结线虫(Meloidogyne spp.)、球异皮线虫(Globodera spp.)、小麦粒线虫(Anguina spp.)，茎线虫(Ditylenchus spp.)、滑刃线虫(Aphalenchoides spp.)、短体线虫(Pratylenchus spp.)、矮化线虫(Tylenchorhychus spp.)、盘旋线虫(Rotylenchulus spp.)等。影响农业的主要根结线虫有红薯根结线虫(Meloidogyne incognita)、胡萝卜根结线虫(Meloidogynehapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)和花生根结线虫(Meloidogynearenaria)。
近年来，为了防治植物寄生线虫，已采用了栽培、物理或化学防治。栽培防治是通过使用新鲜水、荒地、干燥的土壤、深翻、运土、稻轮作栽培、抗病品种等，物理防治是通过热处理(蒸汽、干热、热水浸泡方法)、太阳热消毒等，化学防治是通过使用化学药物如呋喃、噻唑磷(线虫弹)等来实现防治线虫的。由于地域条件和作物的原因，栽培防治费用昂贵或应用有限，尤其抗病品种的应用局限于作物，因此实用性差。虽然化学杀线虫剂对植物寄生线虫具有较高的防治效果，但它们大部分是有机磷或氨基甲酸酯，它残留在土壤中累积时，不仅具有很强的毒性，造成对环境的污染，还由于对土壤中有利于作物生长的有益微生物的无区别杀菌作用，对农作物的损害加重，并逐渐使土壤更加贫瘠。因此，由于使用农药产生环境污染、对生态系统的破坏、对人畜的毒害危险性等问题，以及由于对环保农产品需求的增加，农药的使用已被废止。另外，已普遍用作防治线虫的土壤熏蒸剂甲基溴(Methylbromide)也将因臭氧层耗竭问题被禁止使用。(Caboni et al.(2013)J.Agric.FoodChem.61,1794-1803)。因此，需要开发一种可以取代上述农药的，对环境更加安全的杀线虫剂。
近年来，在环保的植物寄生线虫防治方法中，有一种利用微生物的方法。一些研究表明，随着微生物的生长，它们产生各种2次代谢产物，或直接作用于植物病原体，表现出多种抗菌和杀虫活性。(Zhao et al.(2014)Antagonistic action of Bacillus subtillisstrain SG6on Fusarium graminearum.PLoS one.9(3),e92486)。因此对于多种微生物培养液，通过杀线虫活性的筛选分离菌株，并利用该菌株开发防治植物寄生线虫病的菌株的研究仍在进行中。
同时，韩国公开专利第2006-0002789号揭示了“杀线虫剂”，韩国公开专利第2010-0116562号揭示了“贝莱斯芽孢杆菌G341菌株及利用该菌株的植物病防治方法”。然而，目前还没有任何说明如本发明揭示对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉F22菌株及其用途的情况。
发明内容
因此，本发明的目的是解决上述现有技术存在的问题，本发明确认，在61种真菌中，黑曲霉(Aspergillus niger)F22(KCTC 12771BP)是不仅在实验室条件下对植物寄生线虫幼虫显示杀线虫活性，甚至在利用番茄作物的温室条件下也显著抑制根结线虫病发病的菌株。另外，本发明证实，当制备5种基本剂型即悬浮剂(SC)、悬浮微生物剂(SM)、吸附性颗粒剂(吸附式GR)、造粒式颗粒剂(造粒式GR)和可湿性粉剂(WP)，调查对番茄根结线虫的防治活性时，发现可湿性粉剂有最优秀的防治值。因此，本发明人已经证实，本发明的菌株可以作为防治植物寄生线虫的生物农药取代化学农药，可提供一个突破性的生物防治剂防止由环境污染引起的问题，基于这些事实，完成本发明。
为了解决上述课题，本发明提供对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株。
同时，本发明提供含有所述菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分的，针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂。
本发明还提供用于防治植物寄生线虫的方法，包括通过所述微生物制剂处理作物、作物的种子或栽培地的方法；
本发明还提供针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法，包括所述菌株培养步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明中的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株，不仅在试管内试验(in vitro)中而且在番茄根结线虫病的温室内试验中，都以依赖浓度的方式显示杀线虫活性，因此它作为植物寄生线虫防治剂，被认为具有很高的开发可能性。该菌株当被制成可湿性粉剂时，仍显示出优秀的防治效果，若随后经过最佳发酵工艺和制剂优化过程时，可以作为一种新型的微生物杀线虫剂代替传统的化学农药。因此，本发明的菌株可作为突破性的生物防治剂防止由环境污染引起的问题，可以非常有效地加以利用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1显示以各种浓度的本发明的入选菌株培养滤液处理时番茄根结线虫(Meloidogyne incognita)的杀线虫活性的图表；
图2显示本发明的入选菌株用10％浓度的培养滤液处理致死的番茄根结线虫(Meloidogyne incognita)形态的结果，及与无处理区的对比；
图3显示了本发明中的入选菌株利用ITS区(A)和26s RNA(B)序列的系统进化分析位置；
图4显示本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株在不同培养基中显示出的杀线虫活性图表；
图5是利用本发明的黑曲霉F22菌株培养滤液进行处理时，盆栽实验后，显示出的番茄根结线虫病的防治活性图表；
图6显示了用本发明的黑曲霉F22菌株培养滤液10倍稀释液处理后的番茄植物根系形态与无处理区进行比较的结果；
图7显示利用本发明的黑曲霉F22菌株培养液的基本剂型对番茄根结线虫的防治值图表；
图8显示本发明的黑曲霉F22菌株可湿性粉剂的100倍和50倍稀释溶液处理区的番茄植物根系形态与无处理区及阿维菌素(Abamectin,全明星)3000倍稀释溶液处理区进行比较的结果；
图9显示黑曲霉F22菌株培养滤液浓度对胡萝卜根结线虫和松材线虫的杀线虫率。
具体实施方式
以下本发明的详细说明，通过本发明可以付诸实践的特定实施例来阐述，通过充分详细地说明，使得本行业的人能够将本发明付诸实施。本发明的各种实施例应当被理解为可以彼此不同，但彼此没必要互相排斥。因此下面描述的详细说明，并不应被解释为局限的含义，本发明的范围应被理解为专利权利请求范围内记载的内容和与其同等的所有范围。
为了实现所述目标，本发明提供了对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株。
本发明确认，在61种真菌中，特定培养滤液在实验室条件下对植物寄生线虫幼虫显示杀线虫活性，甚至在利用番茄作物的温室条件下也显著抑制根结线虫病发病，所述菌株被识别为是黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株。所述黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株，于2015年3月18日被收录在韩国生命科学和生物技术研究所(收录编号：KCTC12771BP)。
在本发明的一个实施例中菌株中，所述植物寄生线虫可以是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)或根结线虫(Meloidogyne spp.)，优选的根结线虫可以选自红薯根结线虫(Meloidogyne incognita)、胡萝卜根结线虫(Meloidogyne hapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和番茄根结线虫(Meloidogyne incognita)中的一个或多个，但不限于此。
在本发明的一个实施例的菌株中，首选的植物寄生线虫可以是番茄根结线虫(Meloidogyne incognita)、胡萝卜根结线虫(Meloidogyne hapla)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，但不限于此。
本发明提供含有所述菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分的，针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂。
所述微生物制剂可以包含对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分。
所述微生物制剂优选为悬浮剂(SC)、悬浮微生物剂(SM)、吸附性颗粒剂(吸附式GR)、造粒式颗粒剂(造粒式GR)和可湿性粉剂(WP)，首选为可湿性粉剂(WP)，但不限于此。
所述微生物制剂包括把所述菌株在所述培养条件下进行培养来制备的培养液，并可用于抗菌微生物农药、种子包衣剂、微生物营养剂、土壤改良剂，堆肥腐熟剂、叶面喷雾剂或灌注喷撒剂。
在本发明的微生物制剂中，对于黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株及其培养液，可将其作为液体或粉状形态，根据所属行业已知的方法进行各种变化来使用，但优选地，可以将黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株的培养液或浓缩液，用载体如淀粉、粗蛋白或石粉吸附干燥。与本发明的菌株的培养液或浓缩液混合使用的载体，可以是所属行业使用的任何一种载体。具体来说，本发明可以使用的载体包括谷类如大米、小麦、玉米、大麦、大豆、黍米、高粱、稷米、荞麦等，块茎类如马铃薯等，块根类如红薯、木薯等，或其加工品(例如粉末)、及其衍生出的淀粉和其衍生物。此外，琼脂、明胶、果胶(聚半乳糖醛酸)、壳聚糖、羧甲基纤维素及其衍生物、蛋白石、天然蜡、天然胶、高岭土、膨润土等粘土矿物、吉奥赖特等硅藻土材料也可作为载体。可以单独使用这种不同的载体，或者将两个或更多的载体以适当的比例混合以获得具有改进的物理性质的载体。当使用上述载体时，载体可被微生物代谢为营养物质，并且由于这些载体具有非常高的粘度，因而对植物表面具有增强的粘附性能，所以效果比较好。
本发明还可以包括通过干燥法获得的菌株或菌种培养液的干燥产物和含有该产物的生物农药。所述干燥产物可用选自可湿性粉剂(WP)、固状剂(GM)、水分散颗粒剂(WG)、颗粒剂(GR)、粉剂(DP)和种子处理水分散性粉剂(WS)组合的群中的剂型来制备生物农药。与传统液体制剂相比，这种生物农药制剂具有优异的稳定性和物理化学性质，可用于防治植物病害。
生物农药中，可湿性粉剂是作为粉状用水稀释时，可被稀释的农药剂型，固状剂是将微生物培养液与固状物体混合或吸附到固状物体的，不属于粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂的一种剂型。同时，水分散颗粒剂是作为颗粒状，被水稀释使用的农药剂型，所述颗粒剂是指按照颗粒原状态使用的农药剂型，种子处理水分散性粉剂是作为粉状，在对种子进行处理前，与水结合，作为悬浮液使用的农药剂型。
根据本发明的一个实施例的可湿性粉剂可包括黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株作为活性成分(active ingredien)、白碳(white carbon)作为吸湿剂、双-2-乙基己基磺基琥珀酸钠作为保湿剂、木质素磺酸钠作为分散剂、高岭土作为增容剂。优选地，可湿性粉剂可包括10重量％的黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株、1重量％的白碳(whitecarbon)、1重量％的双-2-乙基己基磺基琥珀酸钠、1重量％的木质素磺酸钠、87重量％的高岭土。
根据本发明的一个实施例中的悬浮剂用于防治植物寄生线虫。为了使用本发明的微生物制剂来防治植物寄生线虫，微生物制剂可以用水均匀稀释，然后使用诸如电动喷雾器之类的合适的喷雾装置喷洒在作物、作物种子或栽培地。本发明中的悬浮剂用水稀释时，悬浮剂的浓度为了确保其活性成分的生物有效剂量，应在103到105cfu/mL范围内调整,优选地应为104cfu/mL左右，但不限于此。
本发明还提供用于防治植物寄生线虫的方法，包括通过所述针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂来处理作物、作物的种子或栽培地的方法。
防治植物寄生线虫的方法可以采用将培养本发明的菌株的培养液或将利用所述菌株的微生物制剂用来浸渍、灌溉或喷洒作物或作物的种子。采用浸渍法的情况下，培养液和制剂可以倒入植物周围的土壤上，或者把种子浸泡在培养液或制剂中。对于可应用于本发明方法的植物，没有特别限制。
本发明还提供包括所述菌株培养步骤的、针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法。所述黑曲霉(Aspergillus niger)F22菌株的培养方法及微生物制剂制备方法可以使用任意所属行业已知的方法，不用特别局限于特定的方法。
此外，该菌株可在MEB培养基(Malt extract broth)、PDB培养基(Potatodextrose broth)、CDB培养基(Czapek Dox broth，)、或者SDB培养基(Sabouraud dextrosebroth，)中培养，优选PDB培养基，但本发明不限于此。在本发明中，培养所述菌株后，采用96孔微孔板生物测定方法，对番茄根结线虫幼虫悬浮液使用10％浓度的培养液进行处理，3天后检查杀线虫活性。结果为，PDB培养基显示94％的防治活性，具有最高的杀线虫活性，因此选择了PDB培养基作为最佳培养基。
以下将根据实施例对本发明进行详细说明。但以下实施例只是本发明的具体示例，本发明的内容并不局限于以下实施例。
实施例1：具有杀线虫活性的菌株的筛选及杀线虫活性分析
为了筛选具有优异的杀线虫活性的丝状真菌，本发明人收集到61种丝状真菌培养滤液，进行了杀线虫活性筛选。具体地说，把被感染根结线虫的番茄植物的根部用自来水清洗除去杂质，之后，把洗净的树根每隔1厘米或更少的间隔切断，放入搅拌机，以根部可以被浸渍的量加入0.5％次氯酸钠溶液，磨碎一分钟。然后用65μm筛滤出根屑，筛出的卵用25μm筛收集，然后用灭菌水多次冲洗。使用立体显微镜测量采集的根结线虫虫卵的浓度。
61种真菌培养滤液的杀线虫活性筛选采用96孔微孔板生物测定方法进行。每个孔添加含有50只幼虫的根结线虫幼虫悬浮液45μL，然后用10％培养滤液处理。样本经过3天的处理后，使用下面的公式确定杀线虫活性。实验反复进行3次，无处理对照区使用10％的灭菌水，按致死浓度1μg/ml使用阿维菌素(Abamectin)作为对照药剂。
杀线虫活性(％)＝[死亡的线虫数/(存活的线虫数+死亡的线虫数)]×100
结果如图1所示，10％的F22菌株培养滤液表现出100％完美的杀线虫活性，即使使用5％培养滤液也表现出96％的较强的杀线虫活性。可以看出，样本处理后，线虫幼虫为笔直的一字形状，没有蠕动，而与此相反，在无处理区，幼虫为柔性弯曲的形状，在蠕动，可以确认幼虫还活着(图2)。同时，使用对照药剂的阿维菌素(Abamectin)处理区，在浓度1μg/ml条件下，表现出95％的杀线虫活性。
实施例2：菌株的识别
具有优异的杀线虫活性的F22菌株，在PDB培养基里，在25℃、150rpm条件下培养七天。为了识别F22菌株，对ITS(internal transcribed spacer)区的DNA序列和26SrRNA区的DNA序列进行测定与分析。具体地说，用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)提取染色体组DNA，并把它作为PCR模板。对F22菌株的ITS区DNA序列的分析，利用一组引物即ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3：序列号：SEQ ID No.1)和ITS4(5’-TCCTCC GCT TAT TGA TAT GC-3：序列号：SEQ ID No.2)进行了PCR。对26S rRNA区的DNA序列的分析，利用一组引物即NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3：序列号：SEQ IDNo.3)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3：序列号：SEQ ID No.4)进行了PCR。
F22菌株的ITS区和26S rRNA区进行PCR扩增后，使用QIAquick PCR purificationkit(Qiagen,Hilden,Germany)纯化PCR扩增产物。通过检索美国布罗德学院提供的数据库，将分析出来的真菌菌株的DNA序列与已登记的相关菌株的序列进行比较。从DNA序列比较结果中，识别出相似度最高的菌株。结果如图3所示，两个区都与黑曲霉(Aspergillus niger)结成组，ITS区相似度为99.8％，26S rRNA区相似度为98％，因此F22菌株被识别为黑曲霉。
实施例3：选择最合适的培养基
为了选择最佳培养基用于生产F22菌株的杀线虫活性物质，利用常规培养真菌的6种培养基，检查每个培养基的杀线虫活性。F22菌株的6个培养基里，分别接种5个菌丝块(直径：6mm)，在25℃和150转速条件下转动培养七天。在这个实验中使用的6种培养基为：MEB培养基(Malt extract broth)、PDB培养基(Potato dextrose broth)、CDB培养基(CzapekDox broth，)、SDB培养基(Sabouraud dextrose broth)、V8汁培养基和CV8汁培养基(Clarified V8汁培养基，金宝汤公司)。所述利用6种培养基的F22菌株培养液用灭菌纱布过滤，获得培养滤液，并使用前述的96孔微孔板生物测定方法，对根结线虫幼虫悬浮液用10％浓度的培养液进行处理，3天后检查杀线虫活性。结果如图4，PDB培养基显示94％的防治活性，显示最高的杀线虫活性，因此选择了PDB作为最佳培养基。
实施例4：菌株培养滤液对番茄根结线虫病的防治活性
利用黑曲霉(A.niger)F22菌株培养滤液，进行对番茄根结线虫病的防治活性的盆栽实验。400克灭菌砂放入直径为9.5厘米的塑料盆中，移植了在床土播种并在温室生长3周的“Seogwang(孟山都韩国公司)”品种的番茄。按前述方法，从感染根结线虫的西红柿根系收集虫卵，每一盆接种10,000只虫卵。然后，在PDB培养基里在25℃和150转速条件下转动培养七天的F22菌株培养液用灭菌纱布过滤，获得培养滤液，利用灭菌水稀释10倍和100倍，在番茄根部周围在一周的时间间隔内土壤灌注2次。对照区用全明星(a.i.,Abamectin1.8％)3,000倍稀释液进行1次处理，无处理区用灭菌水处理。实验反复进行5次，接种线虫卵6周后，将植物的根系用自来水清洗干净，使用Taylor and Sasser(1978,Identification and Control of Root-Knot Nematodes(Meloidogyne Species)；Department of Plant Pathology,North Carolina State University:Raleigh,NC,1978；Vol.2,p 111)方法，检查根结指数。根结指数适用0～5阶段(0∶0％、1∶1～20％、2：21～40％、3:41～60％、4：61～80％、5：81～100％)进行检测。
结果如图5所示，F22菌株培养滤液的10倍稀释液里，显示71％的防治活性，并观察到植物蓬勃生长。以此可以确定，黑曲霉(A.niger)F22菌株可以用于有效防治番茄根结线虫病。
实施例5：使用黑曲霉(A.niger)F22菌株的基础制剂的根结线虫防治活性检查
1.制备黑曲霉(A.niger)F22菌株的基础制剂
为了利用F22菌株的培养液开发基本剂型，制备了2种悬浮剂(SuspensionConcentrate:SC，Suspension Microbial:SM))、2种颗粒剂(吸附式Granule：GR，造粒式Granule：GR)和1种可湿性粉剂(Wettable Powder：WP)的剂型。
①制备黑曲霉(A.niger)F22的悬浮剂(Suspension Concentrate，SC)剂型
A)制备配方：使用下表1列出的最终配方制备。
表1
B)制备工程图
1)湿磨部分(50％)
把表面活性剂充分分散在水中，将黑曲霉培养液粉碎后，与其混合。当发生泡沫时，分次少量地添加消泡剂。
2)增稠部分(50％)
防冻剂里均匀分散增稠剂，添加防腐剂和水均匀搅拌。
3)产品部分混合工程
湿磨部分和增稠部分按合适的比例(推荐50：50)混合制备。
②制备黑曲霉(A.niger)F22的悬浮微生物剂(Suspension Microbial，SM)剂型
A)制备配方：使用下表2列出的最终配方制备。
表2
B)制备工程图
1)原剂混合部分(50％)
把表面活性剂充分分散在水中，与黑曲霉F22培养液进行喷雾干燥后取得的粉末混合。当发生泡沫时，分次少量地添加消泡剂。
2)增稠部分(50％)
防冻剂里均匀分散增稠剂，添加防腐剂和水均匀搅拌。
3)产品部分混合工程
原剂混合部分和增稠部分按合适的比例(推荐50：50)混合制备。
③制备黑曲霉(A.niger)F22的吸附性颗粒剂(GR)剂型
A)制备配方：使用下表3列出的最终配方制备。
表3
B)制备工程图
把黑曲霉F22培养液与颗粒状硅藻土的混合液进行喷雾干燥后取得。
④制备黑曲霉(A.niger)F22的造粒式颗粒剂(GR)剂型
A)制备配方：使用下表4列出的最终配方制备。
表4
B)制备工程图
把原剂、佐剂和增容剂均匀混合，适量的水加入到液体表面活性剂，揉捏。此后，将所得的混合物进行造粒、干燥、筛选来制备。
⑤制备黑曲霉(A.niger)F22的可湿性粉剂(WP)剂型
A)制备配方：使用下表5列出的最终配方制备。
表5
B)制备工程图
把原剂、表面活性剂、佐剂和增容剂混合、研磨来制备。
2.利用黑曲霉(A.niger)F22菌株基础剂型的番茄根结线虫病防治活性检测
如上所述，制备的悬浮剂(SC)、悬浮微生物剂(SM)、吸附性颗粒剂(吸附式GR)、造粒式颗粒剂(造粒式GR)和可湿性粉剂(WP)共5种制剂以及培养液的体内(In vivo)进行番茄根线结虫的防治活性检测。具体来说，用前述的方法，在直径为9.5厘米的塑料盆中放入400克灭菌砂，并移植在温室生长3周的番茄幼苗。每一盆接种10,000只虫卵，1个小时后，黑曲霉(A.niger)F22培养液及上述制备的5种制剂中，非颗粒剂型用灭菌水稀释100倍和50倍，每一盆土壤灌注20mL；颗粒剂型进行土壤混合处理。在一周的时间间隔内进行两次样本处理，对于颗粒剂型，第2次处理时将其悬浮在水中进行。对照区用全明星(a.i.,Abamectin1.8％)3,000倍稀释液进行1次处理，无处理区使用灭菌水处理。实验反复进行5次，接种线虫卵6周后，将植物的根系用自来水清洗干净，使用Taylor and Sasser(1978,Identification and Control of Root-Knot Nematodes(Meloidogyne Species)；Department of Plant Pathology,North Carolina State University:Raleigh,NC,1978；Vol.2,p 111)方法，检查根结指数。根结指数适用0～5阶段(0∶0％、1∶1～20％、2：21～40％、3:41～60％、4：61～80％、5：81～100％)进行检测。
其结果如图7所示，F22菌株的可湿性粉剂(WP)100倍和50倍处理区，各显示16％和64％的随浓度增高的防治值。因此，可以预期，用于开发产品时，制备可湿性粉剂剂型具有更优秀的防治活性。
实施例6：菌株培养滤液对胡罗卜根结线虫和松材线虫的防治活性分析
为了检测黑曲霉(A.niger)F22菌株对多种植物寄生线虫病的防治活性，检测对胡萝卜根结线虫(Meloidogyne hapla)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的防治活性。
胡罗卜根结线虫和松材线虫的幼虫均由首尔大学应用生物学系Young Ho KIM教授的实验室提供，用此进行实验。胡罗卜根结线虫和松材线虫的2龄幼虫，以100只/100μL浓度制备，将线虫的幼虫悬浮液80μL放入96孔微孔板，加入20μL培养滤液，以20％浓度进行处理。随后在20％处理区取20μL，转移到含有80μL的线虫幼虫悬浮液的孔，使其浓度被稀释为1/4即5％。用上述方法，用20％、5％和1％的浓度检测对线虫的2龄幼虫的致死活性。样本处理后，胡罗卜根结线虫和松材线虫在25℃孵化器保管24小时后，按照以下公式检测杀线虫活性。
杀线虫活性(％)＝[死亡的线虫数/(存活的线虫数+死亡的线虫数)]×100
结果发现，黑曲霉F22的菌株以20％，5％和1％浓度培养滤液处理时，对胡罗卜根结线虫的杀线虫活性分别为99.1％、98.4％和80.9％，对松材线虫杀线虫活性分别为79.7％、18.3％和7.5％。黑曲霉F22的菌株不仅对番茄根结线虫(M.incognita)，还对胡罗卜根结线虫(M.hapla)和松材线虫(B.xylophilus)表现出优秀的杀线虫活性，尤其对胡罗卜根结线虫表现出强效的杀线虫活性(图9)。

Claims (10)

1.一种对植物寄生线虫具有杀线虫活性的黑曲霉F22菌株。
2.根据权利要求第1项所述的黑曲霉F22菌株，其特征在于，所述黑曲霉F22菌株是以收录编号为KCTC 12771BP的菌株。
3.根据权利要求第1项所述的黑曲霉F22菌株，其特征在于，所述植物寄生线虫是松材线虫或根结线虫。
4.根据权利要求第3项所述的黑曲霉F22菌株，其特征在于，，所述根结线虫可以选自红薯根结线虫、胡萝卜根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和番茄根结线虫中的一个或多个。
5.一种针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂，其特征在于，含有权利要求第1项到第4项中任何一项所述的菌株、或其孢子、培养体或其培养液作为有效成分。
6.根据权利要求第5项所述的植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂，其特征在于，所述植物寄生线虫是松材线虫或根结线虫。
7.根据权利要求第5项所述的针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是用可湿性粉剂剂型化的。
8.一种防治植物寄生线虫的方法，其特在于，采用权利要求第5项所述的针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂处理作物、作物的种子或栽培地。
9.一种针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括权利要求第1项到第4项中任何一项菌株培养的步骤。
10.根据权利要求第9项所述的针对植物寄生线虫的杀线虫用微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述菌株在PDB培养基中培养。
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