CN1891812B - 一株具杀线虫活力的曲霉属真菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具毒杀植物寄生线虫作用的真菌的培养及其代谢物制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的真菌菌株Asipergillus.niger snf0407009，已于2006年5月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1714。snf0407009的分类地位是有丝分裂孢子菌类，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属，黑曲霉。通过常规液体发酵培养制备，其代谢物对植物寄生线虫，特别是根结线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点，室内测定本菌株发酵液对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)2龄幼虫和卵囊孵化的影响。不同稀释浓度发酵液的处理和无菌水处理有显著差异，发酵液的1倍液以上浓度与10μg/ml涕灭威的防效相当。具良好的应用开发前景。

Description

一株具杀线虫活力的曲霉属真菌及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法和应用。

背景技术：

植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，p1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CABInternational)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，从真菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。

发明内容：

本发明的目的是选择对根结线虫具高杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的根结线虫优选是南方根结线虫。

本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株是Asipergillus.niger snf0407009，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2006年5月18日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.1714。A.niger snf0407009是从大量土壤真菌菌株中筛选出的一株对南方根结线虫具有良好杀线虫活性的真菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤真菌有很多株真菌都具有较高的杀线虫活性，从这些真菌中筛选出一株性状相对最好的真菌菌株A.niger snf0407009进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其是由本发明的真菌菌株A.nigersnf0407009经过常规的液体发酵培养后提取制备的。

本发明的真菌菌株A.niger snf0407009是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：

1.试管种培养

培养基配方为马铃薯琼脂(PDA)培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；水1000mL。

2.液体发酵培养

其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.996％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，余下为水，pH为6-7，优选pH为6.5。

将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵240h。

本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的真菌菌株A.nigersnf0407009本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的真菌菌株A.niger snf0407009或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是根结线虫(Meloidogynes spp.)。

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

具体实施方式：

首先对A.niger snf0407009菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。

实施例1：菌株A.niger snf0407009的培养

将A.niger snf0407009的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；水1000mL。25℃培养10d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)：蔗糖(2.83％)、硫酸铵(1.367％)、K₂HPO₄(0.064％)、MgSO₄·7H₂O(0.182％)、KCl(0.996％)、FeSO₄(0.02％)，余下为水，pH 6.5。25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵240h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。

实施例2：菌株A.niger snf0407009的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(3％)、硫酸铵(5％)、K₂HPO₄(0.08％)、MgSO₄·7H₂O(0.4％)、KCl(2.0％)、FeSO₄(0.002％)，pH 7。

实施例3：菌株A.niger snf0407009的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(6％)、硫酸铵(3％)、K₂HPO₄(2％)、MgSO₄·7H₂O(0.5％)、KCl(5.2％)、FeSO₄(0.04％)，pH 6。

实施例4：菌株A.niger snf0407009的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(5％)、硫酸铵(7％)、K₂HPO₄(1.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.3％)、KCl(4.5％)、FeSO₄(0.01％)，pH 6.8。

实施例5：菌株A.niger snf0407009的杀线虫活性：

将发酵液浓缩5倍液的基础上依次稀释为-5×(浓缩5倍液)、1×、5×、10×、20×、，分别对南方根结线虫2龄幼虫。

1.制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备的真菌菌株A.niger snf0407009，用不同倍数的发酵液进行杀线虫活性试验。

2.制备试验用线虫

(1)制备南方根结线虫卵囊、卵及2龄幼虫

根结线虫在温室中用番茄(品种：新L-402番茄，黑龙江省富拉尔基农业科研所)繁殖，待病株产生大量卵囊时，将病根取出洗净。于解剖镜下挑取卵囊，放入直径9cm的培养皿内，用0.5％NaOCl表面消毒3min，无菌水洗3次后备用。将经消毒后的卵囊放入垫有2层擦镜纸的线虫分离器中，在室温下孵化3d～4d，便可得到大量纯2龄幼虫。将病根洗净，剪成0.5cm～1cm的小段，放入500mL三角瓶中，加1％NaOCl 200mL剧烈震荡5min，用200目及500目网筛反复冲洗收集，在500目筛子中可收集到纯净的线虫卵。

3.试验方法：

3.1A.niger snf0407009代谢物对线虫的作用：在经灭菌的特制的贝氏小皿内中加入不同浓度的试验用发酵液各1mL，以加1mL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100μL线虫悬浮液(约含线虫100条)，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。

3.2Aniger snf0407009代谢物对南方方根结线虫卵囊孵化的作用：

在每个经高温灭菌的培养皿(直径6cm)中放入2个表面消毒的发育较一致的卵囊，分别加入5mL不同浓度的试验用发酵液，以加入5mL无菌水作为对照。试验在25℃下进行，将各处理培养皿用封口膜封严，以减少污染以及液体蒸发。10d后镜检各处理卵囊孵化情况。计算卵囊孵化线虫数和卵囊孵化的相对抑制率。每处理重复3次。

4.试验结果

(1)A.niger snf0407009代谢物对南方根结线虫2龄幼虫的杀线虫效果

表1发酵液不同稀释倍数对南方根结线虫2龄幼虫的影响

稀释倍数dilution	2龄幼虫的平均死亡率％ average mortality ofJ2	校正死亡率％revised mortality
			-5× 1× 5× 10× 20× CK1 CK2	98.92a  91.87a  82.95b  66.2lc  50.36d  94.53a  1.45e	98.90 91.75 82.70 65.71 49.63 94.45

注：“-5×”：浓缩五倍液：CK1：10 μg/ml涕灭威处理：CK2：无菌水处理；

结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照之间差异显著，浓缩5倍、1倍液和10μg/ml涕灭威对线虫的相对致死率都达到了90％以上，三者之间差异不显著。

(2)A.niger snf0407009代谢物对南方根结线虫卵囊孵化的作用

表2曲霉发酵液不同稀释倍数对南方根结线虫卵囊孵化的影响

稀释倍数  dilution	卵囊平均孵化线虫数(条)average numbers ofegg masses hatching	相对抑制率％relative inhibition rate
			-5×    1×    5×    10×    20×    CK1    CK2	1.67e    16.67e    41.67d    103.67c    180.00b    12.00e    485.67a	99.66    96.57    91.42    78.65    62.94    97.53    ------

结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照处理的卵囊之间，对线虫孵化影响差异显著，特别是浓缩5倍和1倍液几乎不能孵化，与10μg/ml涕灭威抑制率相当，其相对抑制率都达到95％以上。

通过对两种线虫杀线虫和对卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，A.niger snf0407009是一株极具有应用价值的真菌，特别是对南方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。

Claims (7)

1.一株具有杀线虫活性的真菌，其特征在于：该菌株为Aspergillus niger，已于2006年4月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1714。

2.一种防治植物寄生线虫的真菌发酵液，其特征在于，是由权利要求1所述的真菌经过常规的液体发酵提取制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄ 0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.996％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，pH为6-7。

3.根据权利要求2所述的真菌发酵液，其特征在于，所述的pH为6.5。

4.权利要求1所述的具有杀线虫活性的真菌的发酵方法，其特征在于：该真菌的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄ 0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.996％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，pH为6-7。

5.一种杀线虫制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌发酵液作为活性成分。

6.权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌发酵液或权利要求5所述的杀线虫制剂在植物寄生线虫生物防治中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为根结线虫(Meloidogynespp.)。