CN106591144A

CN106591144A - 一株多功能木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN106591144A
Application number: CN201611087339.5A
Authority: CN
Inventors: 戚继艳; 秦云霞; 唐朝荣; 肖小虎; 方永军; 龙翔宇; 阳江华
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: CN106591144B

Abstract

本发明公开了一株多功能木霉菌株及其应用。该木霉菌株为木霉(Trichoderma sp.)Hb5P‑3 CGMCC No.13164。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性天然气体化合物，该菌株能够拮抗橡胶树红根病菌，拮抗炭疽病菌，对橡胶幼苗无害，而且在适当增加木霉菌快速扩繁所需营养物质后，能够广泛应用于植物组培繁育的防治污染、促进生长，缩短练苗和壮苗的时间的生产中。

Description

一株多功能木霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株多功能木霉菌株及其应用。

背景技术

木霉属Trichoderma Pers.(有性阶段曾称为“肉座菌属”Hypocrea Fr.)隶属于粪壳菌纲Sordariomycetes，子囊菌门Ascomycota，肉座菌科Hypocreaceae，肉座目Hypocreales。该属真菌种类繁多，分布广泛，是一类重要的可再生自然资源，具有较高经济价值和应用前景(Doi 1969，1972；朱兆香和庄文颖，2014)。木霉菌(Trichoderma spp.)是一类重要的多功能益生真菌，广泛存在于自然界。其资源丰富，种类众多，不仅能通过多种机制来控制病原菌的侵染和病害发生，还具有促进作物生长、提高作物抗生物和非生物胁迫的能力，是一种公认的环境友好型真菌。其应用于农业、工业、环境保护等领域，其中部分种类对植物病原真菌具有较强的杀伤能力，自1950年代以来，木霉属真菌作为生物防治制剂被广泛使用。以木霉菌这种对人畜无害、多功能、活力强、容易繁殖的微生物为研究对象，具有很强的实践应用意义。

国内外热带地区木霉菌的筛选鉴定研究已经开始并积累了经验。如利用可可内生木霉菌防治可可链疫孢荚腐病(Moniliophthora roreri)。我国木霉菌的研究和开发主要集中在大宗粮食作物如玉米、水稻、蔬菜等作物上，热带地区木霉菌的研究相对薄弱。热带地区植物种类众多，真菌病害更为肆虐，并且热带土壤肥力低下，持水能力差，因此热带地区土壤和水资源保护、以及经济发展对建立生态、绿色农业的需求更为紧迫，热带作物的生物防治更是迫在眉睫的事情。目前我国已经有热带特异的木霉菌新种的报道，如Zhu&Zhuang(2014)报道了采自我国海南省和福建省的木霉属新种南方木霉T.sino australe和绿黄木霉T.viridiflavum。(Zhu ZX,Zhuang WY,2014.Two new species of Trichoderma(Hypocreaceae)from China.Mycosystema,33:1168 1174.)也已经有内生木霉菌防治热带经济作物的报道，如辣椒的生物防治。

但是关于内生真菌的研究多集中在分离、鉴定、生物学特性及多样性分析等方面，而真正能够用于生物防治的产品并不多，主要是由于大部分真菌扩繁、保存、生产和应用成本高，容易退化变异及环境适应能力不强等原因。

据已有的研究表明，橡胶树红根病的致病菌是Ganoderma pseudoferreum(Wakef.)Over.et steinm，具有寄主多、潜伏期长、在土壤中蔓延迅速等特点，是危害橡胶树的世界性根部传染性病害。红根病病原菌属于真菌界担子菌门，层菌纲，灵芝属，危害巴西橡胶树根颈部。红根病菌主要依靠根系接触传染。橡胶树红根病在我国各植胶区内发生普遍,感染严重的林段发病率可达4.0％,若没有及时处理死亡率可为100％。橡胶树根病的调查需要大量人力劳动，早期跟踪调查工作不到位，普查效率低。而当橡胶树地上部出现明显的病症时，发病已严重，防治成本高且防效差。此病害的防治措施主要是采用化学防治和机械挖除。2010年，尼日利亚N.O.Ogbebor等开始筛选生防菌(包括木霉菌)防治橡胶树红根病，但至今还未见防治效果的报道，国内还未见有利用木霉菌菌剂防治橡胶树根病的应用报道。但是，近20年来，利用木霉菌进行根病防治的工作在多种经济和粮食作物上展开，例如杨树,玉米、水稻，中草药，西瓜等。

橡胶树叶部炭疽病害是由半知菌属胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz)引起的，病菌可以侵染寄主地上部分的任何器官。病斑能无限扩展，常引起叶枯、梢枯、芽枯、花腐、果腐和枝干溃疡等病害。对实生苗可造成毁灭性损失，呈现出不同的病症：如古铜色嫩叶感病后，呈现不规则暗绿色，像被开水烫过一样的水渍状病斑，病斑大而凹陷。淡绿色嫩叶感病后呈现出近圆形或不规则形的暗绿色或褐色病斑，病斑边缘凹凸不平，叶片皱缩畸形；随着叶片老化，病斑边缘变褐，中央呈灰褐色，并会穿孔。接近老化的叶片感病后，病斑凸起成小圆锥体。嫩梢、叶柄、叶脉感病后，出现黑色下陷小点或黑色条斑。国内未见有利用木霉菌菌剂防治橡胶树炭疽病的应用报道。

发明内容

木霉菌与植物协同进化，独特而丰富，而且木霉菌对不同作物甚至不同品种都有特异性，考虑到木霉菌的地域适应能力及拮抗能力的差异，因此决定筛选本地优势菌株。

本发明的目的是提供一株能够抑制橡胶树红根病菌、橡胶树棒孢霉落叶病菌、炭疽病菌等多种病菌的具有较广抑菌谱的木霉菌，它生长快，扩繁效率高，并能促进橡胶苗的生长，因而是有希望应用于橡胶苗商业化生产的菌株。

本发明所提供的来自热带地区的一株益生菌株为木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3。

所述木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3是从健康橡胶树嫩树枝韧皮部分离得到，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.13164。

以上述木霉菌Hb5P-3为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在作为植物病原菌拮抗菌中的应用也属于本发明的保护范围。

木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述植物病原菌为橡胶树红根病菌，橡胶棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌。

本发明还要求保护一种植物病原菌拮抗菌剂，其活性成分为木霉(Trichodermasp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164。

本发明还要求保护一种生物菌肥，包括木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCCNo.13164。

所述生物菌肥中还包括钼元素、锌元素和/或铜元素。所述钼元素通过钼酸铵添加，添加的质量百分浓度为0.05％-0.3％；所述锌元素通过硫酸锌添加，添加的锌离子的浓度是1-4mM，所述铜元素通过硫酸铜添加，添加的质量百分比浓度为0.0001-0.0006％。

所述生物菌肥中还可以包括大量元素和/或有机肥。

木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在促进橡胶树幼苗或组培苗生长和/或在制备促进橡胶树苗或组培苗生长的生物菌剂或生物菌肥中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在制备挥发性抑菌气体中的应用；其中，挥发性气体对橡胶树红根病菌，橡胶棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌具有抑菌效果。

本发明所得的菌株具有生长繁殖快、成本低、抑菌谱宽、而且对叶部病害和根部病害都有抑制作用等优点。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性天然气体化合物，该菌株能够拮抗橡胶树红根病菌，拮抗炭疽病菌，对橡胶幼苗无害，而且在适当增加木霉菌快速扩繁所需营养物质后，能够广泛应用于植物组培繁育的防治污染、促进生长，缩短生根培养和壮苗的时间。

利用组培材料，体内同时接种Hb5P-3木霉菌和红根病菌，发现本发明的木霉菌能抑制红根病菌侵染组培苗，在考察该木霉菌株的生物学特性及厚垣孢子形成特性后发现，该菌株将是防治橡胶树红根病的生物菌肥开发的优选菌株。另外该菌的确具有广谱的抗病菌潜力，可以应用于生物防治和促进农业可持续发展应用中。

本发明中采用通过ITS、tef1两对引物鉴定其种属。对峙生长实验表明，该木霉菌株具有拮抗橡胶树红根病菌，炭疽病菌等多种病原菌的能力，还具有防治其它多种杂菌污染和促进橡胶苗生长的作用。在橡胶苗规模化培育过程中，具有防止橡胶苗被污染的作用。因此可以根据生产需要，应用于橡胶树苗期培育过程，促进橡胶苗的健康生长，屏蔽或抑制橡胶树根部病害的发生。

利用本发明所得到的具有拮抗橡胶树红根病的木霉菌Hb5P-3菌剂进行生物防治，是完善橡胶树根病综合防控的有效辅助措施，真正起到提前预防作用，将有利于橡胶树种植业的持久、安全发展。

附图说明

图1为Hb5P-3在两种不同培养基上的生长特征，I为Hb5P-3在PDA培养基上的生长和分生孢子(A为Hb5P-3在PDA培养基上生长6天的情况、B为Hb5P-3在PDA培养基上生长10天后分生孢子形成情况)；II为Hb5P-3在孟加拉红培养基上生长7d的特征，(A为正面生长特征、B为反面生长特征，显示其褶皱纹)。

图2为Hb5P-3的形态特征，图示分生孢子梗、分生孢子大小和厚垣孢子。

图3为在不同培养基上Hb5P-3菌株的生长状态；图中，A为土豆培养基，B为NA培养基，C为胡萝卜培养基，D为CA培养基，E为玉米粉培养基，F为Min培养基。

图4为在不同碳源的平板上Hb5P-3的生长情况；A为甘露醇、B为山梨醇、C为甘油、D为淀粉、E为玉米粉、F为半乳糖、G为葡萄糖、H为果糖、I为蔗糖、J为木糖。

图5为钼元素对Hb5P-3的作用。图中Mo0代表不加钼元素，Mo1-Mo5代表平板中钼元素的质量百分比浓度为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％和0.3％。

图6为中量元素Zn²⁺和微量元素Cu²⁺对木霉菌株Hb5P-3的促生作用；

(图6I中，A为0mMZnSO₄、B为0.5mMZnSO₄、C为1mMZnSO₄、D为2mMZnSO₄、E为4mMZnSO₄、F为10mMZnSO₄；图6II中，A为0PPMCuSO₄、B为1PPMCuSO₄、C为6PPMCuSO₄、D为10PPMCuSO₄)。

图7为木霉菌Hb5P-3与红根病病菌B05和DF的对峙培养情况，图7中I是Hb5P-3与红根病病菌B05对峙生长7天的效果，其中红根病菌先接种4天后，再接种Hb5P-3，对峙生长7天后的情况；图7中II是DF同样先接种4天，后接种Hb5P-3，对峙生长4天的效果。

图8为在PDA平板上Hb5P-3菌株对植物病原真菌的抑制作用A，Hb5P-3与橡胶树棒孢霉落叶病菌HbYN58对峙培养；B和C为Hb5P-3与橡胶炭疽菌HDHL和HZ对峙培养；D和F为Hb5P-3与大薯炭疽病菌12DP06和12DP116对峙培养；E为Hb5P-3与香蕉枯萎病菌FOC4对峙培养。

图9为在PDA平板上Hb5P-3菌株与香蕉枯萎病菌FOC4以及橡胶树棒孢霉落叶病菌YN49同时接种于平板对峙培养6天试验结果照片。

图10为Hb5P-3对大薯炭疽病菌12DP116侵染大薯叶片的抑制情况图中叶子上方A是同时接种病原菌和木霉菌Hb5P-3，下方B是只接种病原菌作为对照。

图11橡胶树红根病菌和大薯炭疽病菌受Hb5P-3挥发物抑制的生长情况

A和C为病原菌不受Hb5P-3影响(加盖无菌皿底)的对照的生长状况；B和D为病原菌受Hb5P-3影响(加盖生长Hb5P-3的皿底)后生长被抑制状况。

图12木霉Hb5P-3 CGMCC No.13164对橡胶试管苗的促生作用，I和II为两次独立重复试验，I和II中A,B,C,D试管中的橡胶苗是Hb5P-3处理后的植株的生长情况，CK(I中E，II中的E-H)中试管苗不加Hb5P-3，只加营养液的效果，其中I培养50天，II培养44天。

图13为木霉菌Hb5P-3促进橡胶苗生长，A处理组；B对照组。

图14为Hb5P-3在橡胶树幼苗不同组织的定植情况。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、Hb5P-3菌株的筛选和鉴定

1、木霉菌株的筛选

从天然橡胶产业发展的实际需求出发，我们从2013年开展木霉菌的应用基础研究。首先从橡胶树根际及丰产橡胶树的不同组织等143份材料筛选木霉菌，初步发现热带地区木霉菌资源丰富多样而独特。筛选到了具有生防价值的哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉，还有螺旋木霉、卵孢木霉等。通过初步的体外对峙实验发现所获得木霉菌株不但拮抗效率高而且对多种病原菌(橡胶树红根病菌、褐根病菌、棒孢霉落叶病菌、炭疽病菌，甚至对香蕉枯萎病菌等)都有效果(抑制率在50％-90％以上)。具体方法为：从海南省儋州市橡胶园的健康橡胶树上(热研7-33-97品系)，选取不同组织(芽、叶、叶柄、嫩茎、茎、根)，通过严格的体外消毒处理(流水冲洗组织材料30分钟-1小时，70％乙醇表面消毒3分钟，20％次氯酸钠溶液消毒15分钟，无菌水洗5遍)接种于孟加拉红培养基上(氯霉素0.01g/L+孟加拉玫瑰红0.05g/L)，28℃培养3d；挑取木霉菌菌落再接种于孟加拉红培养基上(不加抗生素)，28℃培养3d，进一步单孢分离纯化，获得木霉菌株，再编号鉴定。

对分离纯化的木霉菌株进行病原菌拮抗菌的筛选，最终获得一株对病原菌特别是橡胶树红根病病原菌具有优异拮抗性能的木霉菌，将其命名为Hb5P-3，Hb5P-3是从树皮上分离得到的。

2、Hb5P-3菌株的形态特征

将Hb5P-3菌株接种于PDA培养基平板上培养，木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3的基本培养形态特征为：在PDA平板上，28℃培养1天后菌落直径为2.9cm。菌丝白色，具分枝，有隔，直或弯曲，光滑；分生孢子梗对称分枝或偶尔轮生分支，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形；分生孢子单孢，椭圆状或球状。基本生长特性及类别如表1所示。

表1 Hb5P-3的基本生长特性及类别

采用插片法对本发明的菌株Hb5P-3进行光学显微形态观察鉴定。该菌株在PDA平板上培养容易形成分生孢子，光学显微形态观察中，在PDA平板中央接种Hb5P-3菌块，相距2cm处与琼脂平板成45度斜插入盖玻片。28℃培养10天，定期取出盖玻片，显微镜下观察。该菌株在PDA上培养时能形成少量厚垣孢子(图2箭头所示，图2为Hb5P-3在固体培养基上生长7天后，利用棉兰染色制片，用Olympus相机，型号DP27，在放大252倍的情况下，分生孢子的大小为长*宽2.48～3.46μm*2.63～3.12μm；孢子梗直径为2.83～3.78μm；厚垣孢子的大小为7.16～10.40μm。

3、本发明中木霉菌株Hb5P-3的分子鉴定

利用通用引物ITS4、ITS5扩增木霉ITS1-5.8S-ITS2段序列，产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，所得序列信息通过TrichoKEY软件进行序列比对，鉴定菌株种类。

a.木霉基因组DNA的提取

参照曹文波等(2008)的方法并略作修改，具体步骤如下：收集分离培养生长在PDA培养基上的木霉菌株Hb5P-3的菌丝，称取0.1g用液氮研磨，加入已经预热好的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA,pH8.0，2％CTAB)，并添加少许灭菌了的石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨后移入离心管中，并在65℃下孵育15分钟，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，将上清液移入到另一个新离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液到另一个新离心管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc溶液(pH5.2)，一20℃放置20min，12000r/min离心5min，弃上清、加70％无水乙醇漂洗两次DNA沉淀，离心1min，弃上清，室温风干挥发乙醇，加入灭菌水溶解。放置4℃冰箱过夜溶解；一20℃保存。

b.rDNA一ITS区测序分析

进一步对该菌株的18S rDNA-ITS序列，ITS1，5.8S，ITS2和28S区域部分序列进行扩增鉴定：提取菌株的基因组DNA作为模板,采用两条通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增，pCR反应体系(25μL):Taq酶0.20μL，10xbuffer 2.5μL、dNTP 0.2μL、10μL的primer各0.5μL，ddH2O21.1μL。DNA模板25ng PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30秒，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。获得大小约0.6Kb的扩增产物。扩增片段克隆后送由上海Invitrogen Biotechnology Co.,Ltd进行测序，测序获得643个碱基的ITS序列，序列如序列表中序列1所示，该序列与不同Trichoderma属菌株的rDNA-ITS区序列相似性为98～100％。

tef1鉴定序列如序列表中序列2所示；选用延伸因子1(tef1)的α-基因片段用于鉴定，是因为该片段中含有比较长的第四个内含子，理论上内含子越长，能够辨析的种内、种间序列差异序列越丰富，可以更好地用于鉴定差异。

通过上述表型特征和分子特征鉴定Hb5P-3为木霉(Trichoderma sp.)，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.13164。

4、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164不同保存方法的研究

利用PDA培养基作为活化培养基。主要采用了四种方法，分别是4℃平板保存法，常温石蜡油保存法、-80℃超低温保存法、斜面保存法。4℃平板保存法：PDA平板接种菌块后，28℃暗培养1周后保存于4℃；-80℃超低温保存法：PDA平板接种菌块后，28℃暗培养2周后，用营养液把分生孢子洗下来，与灭菌甘油混合均匀，于-80℃保存；斜面保存法：将斜面活化培养好的，具有大量成熟分生孢子保菌管4℃保存。常温石蜡油保存法：向斜面活化培养好的，具有大量成熟分生孢子保菌管中加入严格灭菌后的石蜡油(石蜡油的量要充分覆盖培养面)封口膜封闭，室温保存。

结果发现，常温石蜡油保存法可以保持菌的活性，但是复活时菌丝相对生长慢；4℃平板保存时间越长，被污染的可能性越大。为降低污染，在有条件的情况下，可以采用-80℃保存法作长期保存。

实施例2、Hb5P-3菌株的生物学特性

一、Hb5P-3菌株的碳源、氮源需求特性

1、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在如下所述的固体培养基(pH6)平板上生长情况的比较：

Min(Minimal agar medium)培养基:KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，FeCl₃ 0.02g，葡萄糖10g，琼脂14g，定容至1000mL；

PDA(马铃薯葡萄糖)培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

CMV(玉米粉)培养基：玉米粉30g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

OA(燕麦)培养基：燕麦片30g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

CA(胡萝卜)培养基：胡萝卜200g，葡萄糖20g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂14g，定容至1000mL；

上述培养基均在121℃，灭菌20min。

分别在直径9cm的培养皿中倒入20mL灭菌后的上述六种固体培养基，凝固后即得各种培养基的等厚度固体平板，在平板中央接种直径约4mm大小的培养了4天的木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164菌块，每种培养基设三次重复，28℃暗培养，每天后测量菌落大小，计算菌落生长速度。

结果如表2所示，在CA平板上生长速度最快，其次为PDA平板，Min平板，OA平板，NA平板和CMV平板，在CMV平板上的生长速度最慢。如图3所示，Hb5P-3菌株在6种不同培养基上的生长速度存在明显差异，从其在最低营养培养基和玉米培养基上的生长情况来看，可以看出该菌株生长和营养需求不高，属于容易扩繁类型。在CMV，NA，PDA和CA培养基上菌落质地疏松，在Min和OA培养基上菌落质地非常紧密。分生孢子的形成的快慢顺序是Min>CMV>OA>CA>NA>PDA平板,菌落由淡绿色变为绿色，深绿色。Hb5P-3在PDA平板上，菌丝生长旺盛，菌落平整，边缘较规则；在孟加拉红培养基上平板背面产生明显且较规则的褶皱纹(见图1-II孟加拉红培养基平板背面褶皱纹)。

表2.Hb5P-3在不同培养基上的生长速度(菌落直径/培养时间)

2、Hb5P-3菌株的碳源、氮源需求特性

不同碳/氮源对木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164生长的影响

配制不同碳源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用甘露醇，甘油、玉米粉、D-葡萄糖，半乳糖，淀粉，D-山梨醇，D-果糖，D-木糖替换Czapek培养基中的蔗糖，其它成分不变，制备得到以这些物质为唯一碳源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。

配制不同氮源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，酵母提取物，牛肉浸膏，酵母浸膏，蛋白胨替换Czapek培养基中的硝酸钠，其他成分不变，制备得到以这些物质为唯一氮源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。

上述Czapek培养基的配方为：MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 1g，KCl 0.5g，FeSO₄ 7H₂O0.01g，NaNO₃ 2g，蔗糖20g，定容为1000mL，pH7.0(加入琼脂配制固体培养基)。均经121℃，20min灭菌。

采用固体平板法测其菌落平均直径计算生长速度：分别将上述不同碳原和氮原的固体培养基以及Czapek固体培养基灭菌后，倒入直径9cm的培养皿中，20mL/皿，制备相应的碳源或氮源培养基平板。在平板中央接种4mm大小Hb5P-3菌块，设三次重复，28℃暗培养3天，用十字交叉法测量菌落直径。结果如图4所示，Hb5P-3菌株在7种碳源条件下的生长速度差异不明显(在玉米粉培养基上生长最快)，但是对于分生孢子形成的多少和快慢则是存在很大差异，比如在含唯一碳源为蔗糖的平板上，其分生孢子形成最早，在玉米粉和可溶性淀粉平板上菌丝生长速度最快，菌丝层最厚；在含唯一碳源为D-木糖的平板上生长最差；在蔗糖、淀粉、玉米粉、山梨醇这三种碳源培养基上，分生孢子出现早而且多，考虑的产品的价格等因素，所以培养该菌确定用玉米粉、蔗糖。

在含唯一氮源平板上，在以硝酸钠为唯一氮源的平板上生长最快，其次分别为硝酸钾，酵母浸膏，蛋白胨，牛肉浸膏，酵母提取物和硝酸铵，而在硫酸铵平板上生长最慢。

表3.不同唯一碳氮源、碳源平板上Hb5P-3菌株生长直径(mm/天)

如表3所示，Hb5P-3菌株在8种氮源条件下的生长速度差异不明显(牛肉浸膏和硝酸铵稍低)，考虑的产品的价格等因素，所以培养该菌确定用硫酸铵作为氮源。

二、Hb5P-3菌株的碳/氮比率需求特性

由于Hb5P-3能很好地利用玉米粉作为碳源，兼顾考虑的成本以及材料的易得性，本发明以玉米粉和硫酸铵作为碳源(30g/L)和氮源(比例分别是碳源的0:0(这里指只加入碳源而不加氮源)，10:1，20:1，40:1，80:1)，在加入K₂HPO₄ 1g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄.7H₂O0.01g/L，MgSO₄.5H₂O 0.5g/L，Agar 14g/L，考察其碳、氮比率需求特性。

结果如表4和图5所示，结果表明：Hb5P-3菌株在相同的培养时间内，在20:1，40:1的比例的培养基上有分生孢子形成，以40:1的比例形成的数量多。

表4、Hb5P-3菌株在不同碳/氮比率培养基上的生长情况

三、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164在以下液体培养基(pH4-5)下厚垣孢子形成快，所以选用于液体扩繁。

1)PDB：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，玉米油4.0mL，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL。初始pH＝4.5，转速165rpm。

2)蔗糖培养基：蔗糖20.0g，KCl 0.5g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，玉米油4.0mL，定容至1000mL。初始pH＝4.5，转速165rpm。

3)山梨糖醇培养基：山梨糖醇10.0g，蔗糖20.0g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，玉米油4.0mL，ZnSO₄·7H₂O 0.5g，Na₂MoO₄·4H₂O 0.05g，CuSO₄·5H₂O 0.025g。定容至1000mL，初始pH＝4.5，转速165rpm。

4)1/2MS+PDB培养基，玉米油4.0mL，初始pH＝4.5，转速165rpm

上述培养基均为121℃，灭菌20min。

用灭菌打孔器打取1块菌龄为3天(PDA培养基平板上培养)、直径约为4mm的Hb5P-3菌块到所优化好的最适培养基上，28℃，培养8天，用无菌水把孢子洗下来，用血细胞计数器定量为1*10⁷/ml，然后取1ml菌液接种到250ml三角瓶中(每个液体扩繁培养基接种3瓶，pH值为4.5)，28℃，180rpm摇菌培养4天，26℃，165rpm摇菌培养2天，28℃，180rpm摇菌培养4天。分别取第4天到第6天，第8天，第10天菌液，分别取2ml菌液，测定OD₅₂₀并换算为厚垣孢子数量。

结果发现:厚垣孢子形成数量在第8天达到最高，随后逐渐下降。这几种培养基都可以获得1*10^9-10/ml的厚垣孢子。

3、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164菌株生长温度范围研究

PDA平板的制备：在直径9cm的培养皿中倒入20mL溶化的PDA固体培养基，凝固后即得等厚度的PDA固体平板，在平板中央接种打孔得到的直径约4mm大小Hb5P-3(CGMCCNo.13164)菌块，分别置于不同的温度(4℃(处理3天)，16℃(处理3天)，37℃(处理1天)，45℃(处理1h))，50℃(处理1h))和55℃(处理1h))，后放置在28℃下暗培养，每个测试温度设三次重复，于培养3天后，测量各处理后Hb5P-3菌落生长直径。结果表明，Hb5P-3在8个温度条件下28℃为其生长最适温度50℃处理后生长速度显著变慢，55℃处理后生长速度为1cm/天，但还是没有死，可见该菌株对高温环境有一定的适应能力。

实施例3、Hb5P-3菌株的对特殊环境耐性

一、Hb5P-3菌株的耐盐特性

配制含有盐NaCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)或KCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)的PDA培养基、含有碱份KOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基、含有NaOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基或含有Na₂CO₃(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基，用于检测Hb5P-3菌株对不同浓度盐碱的耐受。

制备上述培养基的平板，并接种Hb5P-3菌株菌块，每个培养基处理三次重复。28℃暗培养7天,用十字交叉法测量菌落直径。

结果如表5所示，结果表明：Hb5P-3菌株至少能耐受质量百分比浓度为10％的NaCl，至少能够耐受11％KCl。但是对碱的耐受力很差，在三种碱KOH、NaOH或Na₂CO₃质量百分比浓度为1％的浓度上不能够生长。

二、Hb5P-3菌株的耐盐碱特性

表5.Hb5P-3菌株在含不同浓度盐、碱的PDA平板上生长7天后菌落平均直径(cm)

三、Hb5P-3菌株的pH特性

木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164生长pH值范围检测

制备不同pH值的PDA平板：分别用1M HCl和1M NaOH调节液体PDA培养基pH值到4，5，6，7，8，9，10，11，12，调节好pH后，加入琼脂配制成固体培养基，121℃，20min灭菌得到PH值分别为4，5，6，7，8，9，10，11，12的PDA平板。

在上述制备的pH值平板中央分别接种4mm大小的Hb5P-菌块，分别置28℃暗培养，培养3天，分别用十字交叉法测量菌落直径，三次重复，求取平均数和标准差。结果如表6所示该菌株在供试pH4～9范围内都能生长，生长速度差异不大，最适生长pH为5，在碱性培养基上也能生长，但是速度显著减慢。

表6、Hb5P-3菌株在不同pH培养基上的生长速度

实施例4、木霉菌(Trichoderma)Hb5P-3菌株CGMCC No.13164对不同浓度重铬酸钾的耐受研究

重铬酸钾是一种重金属盐类，能够抑制真菌的生长，在分离土壤放线菌时，培养基中加入50μg/mL的重铬酸钾即可较好得起到抑制真菌污染的效果。

在培养了木霉菌(Trichoderma)Hb5P-3 4天的PDA培养基平板上菌落边缘用灭菌打孔器打取直径约4mm的菌块，分别接种于含有10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL或1000μg/mL的重铬酸钾的PDA培养基的平板中央(培养基平板的制备方法同步骤5)，每个浓度的重铬酸钾处理进行三次重复，将平板置于28℃暗培养2天后测量菌落直径，直到第5天。

结果如表7所示，随着重铬酸钾浓度的升高，菌株Hb5P-3的生长速度递减。Hb5P-3菌株在含1000μg/mL重铬酸钾的PDA平板上，2天后菌落直径为1.02cm，5天后菌落直径可达7.3±0.67cm。由于该菌株对重铬酸钾具有较强的耐性，在以后考察其在植物根部的定植鉴定过程中，利用该特性可以很好的抑制杂菌污染，从而可以进一步将其或相关菌从宿主植物中分离出来。

表7.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3在含不同浓度重铬酸钾的PDA平板上，生长2天的菌落平均直径(cm)

实施例5、微量元素钼和铜、中量元素锌对木霉菌株Hb5P-3的促生作用

一、微量元素钼对木霉菌株Hb5P-3的促生作用

钼肥具有1)纯度高，不含对作物有害杂志成分2)溶解性能好：有效成分完全水溶，3)吸收效率高：酸碱适度，养分形态适合作物吸收；4)肥效持久：具有良好的叶片附着能力，耐雨水冲刷，肥效持久；5)增产优质等特点。为了探索钼肥是否会促进木霉菌的生长这个问题，本发明利用PDA为基本培养基，添加5个质量百分比浓度(0，0.05％，0.1％，0.015％，0.2％，0.3％)的钼酸铵，接种平板放置在28℃暗培养10天,用十字交叉法测量菌落直径并观察分生孢子形成量。结果表明，在0.05％-0.3％范围内，添加钼肥会促进木霉菌菌丝快速生长和增厚，对分生孢子形成快慢促进作用不大(图5)。

二、中量元素锌和铜对木霉菌株Hb5P-3的促生作用

利用PDA为基本培养基，添加6个浓度(0，0.5，1，2，4,10mM)的硫酸锌或浓度为0、1、6或10PPM(1PPM相当于质量百分浓度为百万分之一)硫酸铜，接种平板放置在28℃暗培养10天,用十字交叉法测量菌落直径并观察分生孢子形成量。结果表明，在1-6PPM Cu²⁺离子范围内和1-4mM Zn²⁺的浓度范围内，添加锌元素和铜元素会促进木霉菌菌丝快速生长、增厚和分生孢子形成(图6)。

实施例6、木霉菌Hb5P-3 CGMCC No.13164对多种病原菌的拮抗作用的测试

一、木霉菌Hb5P-3 CGMCC No.13164对病原菌的对峙试验

检测木霉菌Hb5P-3 CGMCC No.13164对病原真菌的拮抗活性，包括对橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，大薯炭疽病菌等的拮抗活性。

供试病原真菌有：香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cubense，4号小种(Foc4)(孙勇,曾会才,彭明,王旭初,易小平*香蕉枯萎病致病分子机理与防治研究进展热带作物学报2012，33(4)：759-766)，橡胶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.30012)，下述根据其在拮抗实验中的编号将其命名为HDHL，橡胶树棒孢霉落叶病菌(Corynespora cassicola，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.3.10072)下述根据其在拮抗实验中的编号将其命名为HbYN58，另外自行采集并鉴定一株橡胶树棒孢霉落叶病菌，根据其在拮抗实验中的编号命名为YN49，株大薯炭疽病菌按照常规方法从海南大薯田间采集并鉴定，根据其在拮抗实验中的编号将其命名为12DP06和12DP116，橡胶树红根病病原菌(G.pseudoferreum)菌株YN1(涂敏等，橡胶树红根病菌遗传多态性的RAPD分析，2012，中国植物病理学会2012年学术年会论文集)、B05、BT和橡胶树红根病菌(海南分离株DF)DF，由本单位种质资源课题组的涂敏博士采自不同橡胶种植区，从田间表现红根病症状明显的橡胶树上采集样品，纯化、培养，鉴定性状等。本实验在应用之前进一步分子鉴定确认，并用PDA平板保存于4℃冰箱，并定期复苏培养，橡胶树红根病病菌的增殖培养方法用1/2MS(Murashige and Skoog)+CMA(玉米粉培养基)培养基扩增培养。

采用体外平板对峙法进行拮抗病原真菌活性评价，具体方法为：分别在PDA平板中央接种直径为4mm的上述供试病原真菌菌块，于距平板中央3cm处接种直径约4mm的Hb5P-3CGMCC No.13164圆菌块，以只接种供试病原真菌菌块不接种Hb5P-3为对照，28℃暗培养7天后观察并测量生长距离，计算抑制率。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径－处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径－原菌饼直径)]×100％。

木霉菌对红根病菌的拮抗作用：与木霉菌的生长速度相比，红根病病菌B05生长较慢，为了更准确地鉴定木霉菌株的拮抗效果，在对峙实验中我们先行接种红根病菌B05，在第5天再接种木霉菌。具体操作是，在28℃恒温培养温箱中，用4mm打孔器将复苏好的红根病(将4℃冰箱内保存的红根病病菌提前接种到PDA培养基上，使其复苏生长4天)接种到培养基上，在培养4天后，同样接种4mm Hb5P-3菌饼，使二者相隔距离2-3cm，每个菌株至少重复接种3个培养皿。定期测量红根病病菌的生长直径,同时测量没有接种木霉菌的红根病病菌的生长情况(对照)，计算抑制率，并在对峙培养中定期观察和拍照。

表8. 6天对峙培养，Hb5P-3对不同病原真菌的抑制率

图7对峙培养的实验结果表明，在B05先行接种4天后，B05的直径在2.7-4.0cm时，再接种Hb5P-3，对峙培养7天。在DF先行接种4天直径在2.7-4.0cm时，再接种Hb5P-3，对峙培养4天。结果表明Hb5P-3对红根病菌B05和DF均有显著地拮抗效果，能够快速抑制、侵占、甚至杀死红根病病菌菌丝体。另外，对YN1和BT的拮抗效果也达到DF相似的水平(图表中未显示)。将B05、YN1和DF红根病菌与Hb5P-3同时接种，对峙培养，那么Hb5P-3对它们的抑制率为100％(图略)。

木霉菌Hb5P-3 CGMCC No.13164对橡胶树棒孢霉落叶病菌、炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、大薯炭疽病菌的拮抗活性分析，由于HDYN58菌株在PDA培养基上的生长速度为6.3mm±0.09/天，12DP116菌株在PDA培养基上的生长速度为10mm±0.08/天，12DP06菌株在PDA培养基上的生长速度为13mm±0.05/天，所以用于对峙的病原菌提前4天接种于平板上，等病原菌直径大小为3-4cm时再接种Hb5P-3对峙生长7天后拍照分析。鉴定结果如图8所示,Hb5P-3菌株显著抑制橡胶棒孢霉菌YN58等植物病原真菌。其中对橡胶树橡胶棒孢霉菌和炭疽菌的抑制率达到100％。对香蕉枯萎病菌和大薯炭疽病菌的抑制率也在70％以上。所以Hb5P-3的多功能的木霉菌。

图9为Hb5P-3菌株与香蕉枯萎病菌FOC4以及橡胶树棒孢霉落叶病菌YN49对峙培养6天试验结果照片，这次是将病原菌和木霉菌株Hb5P-3同时接种。图9I中A是香蕉枯萎病菌FOC4单独培养6天的情况；B为对峙培养显示FOC4被抑制的情况。图9II中A是橡胶树棒孢霉落叶病菌YN49单独培养6天的情况；B为对峙培养显示YN49被抑制的情况。试验结果再次证明Hb5P-3对香蕉枯萎病菌FOC4和棒孢霉落叶病菌YN49的显著拮抗作用。

二、Hb5P-3对大薯炭疽病菌12DP116的抑制情况的离体叶片试验

利用离体大薯叶片，采用机械损伤接种菌块的方法，观察在有拮抗菌存在的情况下，炭疽菌对叶片的侵染能力受抑制情况。结果如图10所示，图中A是Hb5P-3和炭疽病原菌同时接种；B是只接种炭疽菌。在28℃下暗培养4天，拍照。结果表明在拮抗菌Hb5P-3存在的情况下，与对照相比，有拮抗菌的受损叶片枯黄面积较小，说明炭疽病原菌12DP116对大薯叶片的致病性显著降低，证明木霉菌Hb5P-3抑制炭疽菌的活力。试验重复了3次，结果相近。

实施例7、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164产生挥发性气体化合物及该气体对病原真菌的抑制作用实验

1、用直径为9cm的培养皿制备PDA平板，并在每个平板上接种一块直径约4mm大小的Hb5P-3培养2天的菌块，28℃培养4天，用于活性挥发性气体化合物试验。2、用同样方法接种4mm炭疽病菌等5种病原真菌(橡胶树红根病菌、橡胶树棒孢霉落叶病菌、橡胶树炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、大薯炭疽病菌)的菌块到PDA平板上，培养4天。

3、取步骤1所培养好的Hb5P-3平板，轻轻将培养皿上方的皿盖与下方具有培养基的长有Hb5P-3菌落的皿底移开，再分别将步骤2所述5种接好病原真菌的PDA平皿皿底倒扣在Hb5P-3培养皿的皿底上，用parafilm“M”封口，以倒扣在没有培养过Hb5P-3的皿底上的接好病原真菌的PDA平皿皿底作对照，三次重复，28℃暗培养10天后观察，按照实施例6的方法计算抑菌率。

结果如表9所示，所有供试病原真菌的生长都受到抑制，其中对橡胶树红根病菌(保亭分离株B05)病菌菌株抑制率最高，表明菌株Hb5P-3能够产生活性挥发性气体物质抑制病原真菌的生长。病原菌受抑制的生长情况如图11所示：图11中A-D中右图分别为受到Hb5P-3产生活性挥发性气体物质抑制影响的橡胶树红根病菌B05(图11中A和B)和大薯炭疽病菌12DP06(图11中C和D)菌落生长状况，图9中A-D中左图均为没有加盖培养过Hb5P-3的皿底(加盖无菌皿底)的对照的生长状况。

表9. 6天对峙培养，Hb5P-3挥发物对不同病原真菌的抑制率

实施例8、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164促进橡胶试管苗生长试验

为了考察Hb5P-3是否能够促进橡胶苗的生长，从2016年6月21或27日到8月12日共40-50天。我们选用生长势相对一致的热研7-33-97橡胶组培苗分别进行了两次接种试验，处理组每一个试管内接种Hb5P-3分生孢子数量为10⁷个/ml的营养液1ml(用PDB+1/2MS无机盐溶液配制)，对照组的每一个试管内加入等量不添加Hb5P-3分生孢子的PDB+1/2MS无机盐溶液。

结果如图12所示，图12为Hb5P-3促进橡胶试管苗生长的试验图12中I和II中A,B,C,D试管中的橡胶苗是是处理组；对照株CK(I中E，II中的E-H)中试管苗不加Hb5P-3。Hb5P-3处理后的植株比对照植株分别平均每株增加0.65±2.24cm和0.55±0.81cm。本发明的试验结果表明Hb5P-3对橡胶苗有明显的促生作用，增加橡胶苗的活力，因此可以应用于橡胶苗的壮苗培养。注：不同批次的试管苗的生长状态不一样，但响应木霉菌的促生作用的情况是一样的。另外，木霉菌Hb5P-3 CGMCC No.13164是否能够挽救污染橡胶试管苗的生长试验结果是该Hb5P-3可以有效防治其它杂菌的污染，保护其体的成长。

实施例9、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164促进橡胶袋装苗生长试验

2015年6月10日开始，到2015年8月28日共80天。选用大小一致的热研7-33-97袋装苗(该袋装苗是从沙床上驯化后装袋移栽10天的苗子)，共120株苗，分为1、2、3和4处理组和对照组C1、C2、C3和C4共8组，每组15株，在大棚内苗圃区进行试验，处理和对照交替排列。在每株橡胶树幼苗根部施20ml添加有Hb5P-3分生孢子的营养液(分生孢子的数量为10⁷个/ml)进行实验，对照株根部施用同样的营养液(营养液的配方为(每升营养液添加KCl 0.5g，KH₂PO4 1g，(NH4)₂SO₄ 2g，MgSO₄ 7H₂O 0.5g，FeSO₄ 7H₂O 0.002g，蔗糖5g，甘油1ml)而不加分生孢子，每10天施一次，共施用4次，8月28日测量株高(cm)。处理组和对照组其它管理与生产上方法一致。

表10.木霉菌Hb5P-3对对橡胶树幼苗的促生作用

实验结果如上表10所示，用木霉菌Hb5P-3分生孢子液处理袋装苗80天后，所处理苗子的平均株高为54.31±2.87cm，比对照株(48.25±4.94cm)平均增加高度6cm左右，而且各株新一层蓬叶的萌发更快，蓬叶生长更一致(如图13所示，A为处理组，B为对照组)。

实施例10、木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3 CGMCC No.13164的内生性鉴定

用Hb5P-3分生孢子营养液(浓度为10⁷/ml)接种污染病原菌的组培幼苗，共接种100株，成活率为95.2％。共培养时间段分别为10天、15天、30天后，分别随机选取3株经过Hb5P-3处理过的组培苗，先流水充分冲洗30分钟，再经70％(体积百分含量)酒精消毒3-5分钟，再用质量百分浓度为20％的次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水清洗5次，无菌滤纸吸干后，将不同组织切段或片置于1/2MS平板上，将最后无菌水同样涂板作为对照，以考察是否消毒完全。平板放于28℃暗培养2-3天，每天观察并统计带菌组织，并记录数据，结果表明Hb5P-3在处理后的幼苗根部的存活率为99±0.09％，茎部为15±0.21％，幼叶和老叶为9.37±0.22％，因此在Hb5P-3在处理橡胶苗后，橡胶苗可以得到持久的保护和促生作用。Hb5P-3在植物不同组织的定植情况见图14(图中5P-3即Hb5P-3，图14中，A，根部；B和D，茎部，C，老叶和嫩叶)。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一株多功能木霉菌株及其应用

<130> WHOI160077

<160> 2

<210> 1

<211> 643

<212> DNA

<213> 木霉（Trichoderma sp.）

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctgatcc gaggtcaaca 60

tttcagaagt tgggtgttta acggctgtgg acgcgccgcg ctcccgatgc gagtgtgcaa 120

actactgcgc aggagaggct gcggcgagac cgccactgta tttcggagac ggccacccgc 180

taagggaggg ccgatcccca acgccgaccc cccggagggg ttcgagggtt gaaatgacgc 240

tcggacaggc atgcccgcca gaatactggc gggcgcaatg tgcgttcaaa gattcgatga 300

ttcactgaat tctgcaattc acattactta tcgcatttcg ctgcgttctt catcgatgcc 360

agaaccaaga gatccgttgt tgaaagtttt gattcatttt cgaaacgcct acgagaggcg 420

ccgagaaggc tcagattata aaaaaacccg cgagggggta tacaataaga gttttggttg 480

gtcctccggc gggcgccttg gtccggggct gcgacgcacc cggggcagag atcccgccga 540

ggcaacagtt tggtaacgtt cacattgggt ttgggagttg taaactcggt aatgatccct 600

ccgctggttc accaacggag accttgttac gacttttact tcc 643

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> 木霉（Trichoderma sp.）

<400> 2

aacttgcagg caatgtgggc agtgtggcag tcaagaacgg gggcgtagcc ggcaccgacc 60

tggccagggt ggttcatgac gatgacctga gcggtgaaag aagcggcacc catggggggg 120

tcgttcttgg agtcaccggc aacgttacca cggcgaattt ccttaacgga aacgttcttg 180

acgttgaaac caacgttgtc accgggaaca ccctcggtga gctgctcgtg gtgcatctcg 240

acggacttga cttcagtggt gacgttggag ggagcgaagg tgacgaccat accgggcttg 300

aggacaccag tctcgatacg gccgacggga actgttccga taccaccgat cttgtagaca 360

tcctggaggg gaagacggag gggcttgtcc gtgggacgct tggggggctc gatggagtcg 420

atggcctcaa ggagggtctt gccggtgaac ttgccagcct tggtctcctt ctcccaaccc 480

ttgtaccagg ggcagttggt ggagggctgg agcatgttgt caccgttgaa accggagatg 540

gggacgaaag caacagcctt ggggttgaag ccgaccttct tgatgaagtt ggaagtctcc 600

ttgatgattt cctggtaacg agcctcggcc cagttggcag tgtccatctt gttgatggca 660

acgatgagct gcttgacacc cagggtgtag gcgagcagag cgtgctcacg agtctggcca 720

tccttggaga taccagcctc gaactcacca gtaccggcgg caatgatgag aatggcgcag 780

tcagcctggg aagtaccagt gatcatgttc ttgatgaaat cacggtggcc gggagcgtct 840

gtgaattgcc tgttagcact ggcttgcaat tgaagcatga agttgatgaa gaagacatac 900

caatgacggt gacatagtac ttgggagtct cgaacttcca cagagcaatg tcgatggtga 960

taccacgctc acgctcggcc ttgagcttgt caagaaccca agcgtacttg aaggaaccct 1020

tgccgagttc ggcggcttcc tattgatgga aaagtggtta gcatcgctga atgaccaaaa 1080

cacagagtac gttgaatggc ggggaagtga gagtgaagcc aaaaaaaaaa agcagtgcgc 1140

tagtggggtg cacaagaaac cccactaaaa ccaaaagaca gcaaaaaaat ttgcgtcgct 1200

gcaaaggagg ggtaatggaa agcggggtga cgaaaaattg tcgacacgaa aattctcttc 1260

agaatcgtcg ggcacaattg aatttggagg gagaatcgag gcgaaaatca gttgaagctt 1320

accttctcga acttctcgat g 1341

Claims

1.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.13164。

2.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCC No.13164在作为植物病原菌拮抗菌中的应用和/或在防治植物病害中的应用。

3.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCC No.13164在制备抑制植物病原菌的菌剂和/或防治植物病害的中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述植物病原菌为橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌；所述植物为橡胶树；所述植物病害是橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌引起的橡胶树病害。

5.一种植物病原菌拮抗菌剂，其活性成分为木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCCNo.13164。

6.一种生物菌肥，包括木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCC No.13164。

7.根据权利要求6所述的生物菌肥，其特征在于：所述生物菌肥中还包括钼元素、锌元素和/或铜元素。

8.根据权利要求7所述的生物菌肥，其特征在于：所述生物菌肥中还包括大量元素和/或有机肥。

9.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCC No.13164在促进橡胶树幼苗、组培苗生长或防治橡胶树病害，和/或在制备促进橡胶树苗、组培苗生长或防治橡胶树病害的生物菌剂或生物菌肥中的应用。

10.木霉(Trichoderma sp.)Hb5P-3CGMCC No.13164在制备挥发性抑菌气体中的应用；其中，挥发性抑菌气体对橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌具有抑菌效果。