CN101942403A

CN101942403A - 短小芽孢杆菌及其培养方法和用途

Info

Publication number: CN101942403A
Application number: CN 201010201531
Authority: CN
Inventors: 陈卫良; 姚岚; 程丹丹
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-06-12
Filing date: 2010-06-12
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-06-12
Also published as: CN101942403B

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus pumilus 223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2010075。本发明还同时公开了上述短小芽孢杆菌的培养方法，以及利用上述短小芽孢杆菌制备抗菌活性物质的方法：1)、取菌株在PDA培养基上划线培养；2)、单菌落在SMA液体培养基中培养；3)、菌液涂布于SMA固体培养基上培养；4)、用磷酸缓冲液浸泡步骤3)所得物，离心；5)、在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，放置后离心，所得沉淀用磷酸缓冲液重溶。本发明的短小芽孢杆菌和抗菌活性物质均能用于防治水稻纹枯病。

Description

短小芽孢杆菌及其培养方法和用途

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，涉及一种用于防治水稻纹枯病的新菌株，特别涉及一株用于防治水稻纹枯病的芽孢杆菌(Bacillus sp.)及其抗菌活性物质的制备方法。

背景技术

水稻是世界上仅次于小麦的第二大粮食作物，全世界超过50％的人口都以稻米为主食，因此发展水稻生产对于保障全球粮食平稳生产与供应具有十分重要的意义。水稻纹枯病发生面积广、流行性强且频率高，其所致损失往往超过稻瘟病，成为水稻稳产高产的严重障碍。如何有效控制水稻纹枯病的发生与危害、加强对该病的防治和保障水稻稳产高产已经引起了人们的广泛关注。

随着水稻纹枯病病害的加重，国内外对该病的防治技术等做了较多的工作，取得了一些研究成果，但至今尚未发现对水稻纹枯病的高抗品种(可能不存在基因对基因的抗性品种)，且该病对国内的主要防治药剂——井冈霉素已产生一定的抗药性(胡秀荣，许文耀，吕伟成等，2006)；从而导致用药周期逐渐缩短，用药量也增加到二十年前的三到四倍(陈志谊等，2000)；因此，利用拮抗微生物开发防治纹枯病的药剂已引起人们的重视。近年来，先后发现了一些对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，其中研究得最多的是枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、腊质芽孢杆菌、假单孢菌属和木霉菌属。其中，芽孢杆菌属拮抗微生物，目前基本上与井冈霉素等农药混合制成微生物复配农药，其它拮抗微生物用于纹枯病的生物防治尚处于试验研究阶段，有待进一步开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能用于防治水稻纹枯病的短小芽孢杆菌及其培养方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种短小芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus pumilus223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2010075。

本发明还同时提供了上述短小芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1)、固体平板培养：用接种环蘸取Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075在PDA固体培养基上划线接种，于35℃培养12h，得到菌种I；所述菌种I能在4℃下保存3个月；

2)、液体摇瓶培养：取一环菌种I接入装有100ml PD液体培养基的容器中，于35℃、200r/min培养12h，得到菌种II；所述菌种II为Bacillus pumilus 223 CCTCC NO：M2010075。

作为本发明的短小芽孢杆菌的培养方法的改进：

PDA固体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g和琼脂18g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PDA固体培养基；

PD液体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PD液体培养基。

本发明还同时提供了一种抗菌活性物质的制备方法，依次包括如下步骤：

1)、取-70℃保存的Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075在PDA培养基上划线，35℃下培养24h；

2)、用接种环蘸取PDA平板上长出的单菌落，接入装有100ml SMA液体培养基的容器中，于35℃、200r/min培养30h；

3)、取100μl步骤2)所得的菌液均匀涂布于SMA固体培养基上，在超净工作台中吹干后，于35℃下倒置培养48h；

4)、用含质量浓度2％NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)浸泡步骤3)的所得物，1h后将浸泡液离心，得上清液；

5)、按照每100ml上清液加入37～41克固体(NH₄)₂SO₄的比例，在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，于0～4℃放置10～14小时，然后于12000r/min离心20min，所得沉淀用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重溶后，即为抗菌活性物质粗提液。

作为本发明的抗菌活性物质的制备方法的改进：

SMA液体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 6.0g，K₂HPO₄ 14.0g，NaCitrate·3H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖4.0g，加水至1000ml；自然pH，121℃灭菌20min。

SMA固体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 6.0g，K₂HPO₄ 14.0g，NaCitrate·3H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖4.0g，琼脂18g，加水至1000ml；自然pH，121℃灭菌20min。

本发明还同时公开了上述短小芽孢杆菌的用途：用于防治水稻纹枯病。

本发明还同时公开了上述抗菌活性物质的用途：用于防治水稻纹枯病。

在本发明中，含质量浓度2％NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的制备方法如下：先按照标准方法配制好0.2M的磷酸缓冲液(PH7)，然后稀释4倍，成50mM磷酸缓冲液(pH7.0)；再加入NaCl，直至NaCl的重量含量为2％。

发明人于2007年9月从浙江省富阳市水稻叶面分离得到一株水稻纹枯病拮抗细菌，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16S rDNA序列分析，该菌株223鉴定为一种短小芽孢杆菌。

本发明的短小芽孢杆菌能有效抑制水稻纹枯病菌的菌丝生长，在温室水稻防治实验中也表现出良好的防治效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是拮抗细菌(短小芽孢杆菌)223菌株对水稻纹枯病菌的抑制图；

A：拮抗细菌；B：水稻纹枯病菌；

图2是拮抗细菌(短小芽孢杆菌)223菌株对Rhizoctonia solani菌丝的拮抗作用的微观结构图(10×)；

A：被抑制的菌丝；B：正常菌丝；

图3是拮抗细菌(短小芽孢杆菌)223菌株抗菌产物对水稻纹枯病菌的抑制图；

A：抗菌活性物质粗提液；B：水稻纹枯病菌；C：磷酸缓冲液(对照)

具体实施方式

实施例1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)223菌株的获得：

(1)细菌的分离纯化：

采用单孢分离法：分别称取不同地区水稻样本1g，放入100ml无菌水中，振荡20min后即为细菌悬浮液。分别吸取1ml，稀释1000倍后，取30μl涂布于LB平板上，略干后倒置30℃培养。48h后，根据平板上的菌落形态、颜色的特征，挑选代表性菌落于LB平板上划线纯化，纯化后的细菌分离物接种于斜面培养基，4℃保存待用。最后从水稻植株内共分离获得238株菌株。

LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g，加水至1000ml，调pH至7.0，121℃灭菌20min。

(2)拮抗细菌的筛选：

采用平板对峙培养法(Bell D K.，et al.1982)：将28℃恒温培养的水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)菌核接在PDA固体培养基一侧，在另一侧点接纯化后的细菌。置28℃恒温对峙培养，24h后观察抑菌状况。从238株菌株中共筛选得到15株对水稻纹枯病菌有拮抗作用的菌株。从细菌对水稻纹枯病菌的生长抑制结果分析发现，在杭州市富阳地区分离到的一株拮抗细菌效果最好，抑菌带宽度为6.8mm，命名为223菌株。保存于-70℃冰箱。

本发明的223菌株经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验，以及16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为一种短小芽孢杆菌，其特征如下：

(A)形态特征：菌体为短杆状，革兰氏染色阳性，芽孢中生，无鞭毛；

(B)培养特征：菌落呈圆形，浅黄色，表面光滑，有光泽；

(C)生理生化特征：该菌株为好养细菌，生长温度15～50℃，最适生长温度为35℃。可承受的培养基pH范围为4～10，最适生长pH为7。

(D)16S rDNA序列分析：结果在Genbank中进行最大同源性比较，结果发现，该菌株与已报道的Bacillus pumilus的16S rDNA(登录号为EU447665.1)有99％的相似性，这说明该菌株与短小芽孢杆菌的亲缘关系很近，因此鉴定后基本确定该拮抗菌株是属Bacillus pumilus。

拮抗菌的16S rDNA序列经测定，全长为1440bp，具体如SEQ ID NO：1所示。

上述223菌株进行了保藏，保藏名称为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2010075。

该菌株以下简称：短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075(或者Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075)。

实施例2、一种抗菌活性物质的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、取-70℃保存的短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075(Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075)，在PDA培养基上划线，35℃下培养24h。

PDA培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用两层纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g和琼脂18g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PDA培养基。

2)、用接种环蘸取一环步骤1)所得的PDA平板上长出的单菌落，接入装有100ml SMA液体培养基的500ml三角瓶中，于35℃、200r/min培养30h；得菌液。

SMA液体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 6.0g，K₂HPO₄ 14.0g，NaCitrate·3H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖4.0g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min。

3)、取100μl步骤2)所得的菌液，均匀涂布于SMA固体培养基上(培养皿直径9cm，每皿含SMA固体培养基约25ml)，在超净工作台中吹干后，35℃下倒置培养48h。

4)、用含质量浓度2％NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)浸泡长好菌的平板(每皿加5ml的上述磷酸缓冲液)，1h后将浸泡液移至离心管，12000r/min离心4min，得到上清液。

5)、按照每100ml上清液加入39克固体(NH₄)₂SO₄的比例，在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，从而使(NH₄)₂SO₄的饱和度约为60％。于4℃放置12小时(过夜)，12000r/min离心20min，所得沉淀用4.0ml的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重溶后，即为抗菌活性物质粗提液。

实施例3、体外条件下，短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075(Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075)对水稻纹枯病菌生长的作用：

对峙培养法(Bell D K.，et al.1982)：取28℃恒温培养的水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)菌核接在PDA固体培养基一侧，在另一侧点接短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075。置28℃恒温对峙培养，24h后观察抑菌状况，实验重复三次。

对峙培养表明，短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075对水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)拮抗效果明显，培养皿中肉眼可见抑菌圈的纹枯病菌菌丝边缘结构较为致密，而对照的正常菌丝边缘则较为疏松(图1)。显微镜下观察抑制的水稻纹枯病菌菌丝结构短缩紧密，末端平齐；而对照的正常菌丝结构舒展，有明显尖端(图2)。

实施例4、温室条件下，短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075(Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075)对水稻纹枯病的防治效果：

(1)水稻植株的培养

供试水稻品种为WK3，对纹枯病中度感病。将稻种WK3浸泡过夜后，用四层潮湿纱布包裹置28℃培养箱，并注意避光，每隔一定时间用冷水冲泡散热以避免中心发霉腐烂，24～36h后，有80％左右稻种萌发出根和芽时进行播种。在秧龄15d时移栽，共十五盆，每盆5株，浇水、施肥、除草和杀虫剂的应用按常规管理。

(2)病原菌的制备和接种

水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)在PDA平板上培养72h后，选取成熟的菌核，在水稻移栽后45天左右进行接水稻纹枯病菌的工作。接菌时，用水稻纹枯病菌核接在稻株的基部并夹紧基部，用塑料透明薄膜套住水稻植株以保持一定的湿度，所有稻株全部接种。

(3)防治试验设计

试验包括以下5个处理：

处理1(T1)，喷雾井岗酶素(5％水剂稀释十倍后使用)；

处理2(T2)，喷雾拮抗细菌发酵液；

处理3(T3)，喷雾井岗酶素(5％水剂稀释十倍后使用)和拮抗细菌发酵液的混合液(1∶1的体积比)；

处理4(T4)，喷雾液体PDA培养基；

处理5(T5)，对照(CK)，喷雾蒸馏水。

每个处理3个重复，共15个小区，所有小区完全随机排列。以上处理在纹枯病菌菌核接种后的第4天进行，每个处理的喷雾量相等(喷雾以不形成水珠为度)。

上述拮抗细菌发酵液的制备方法为：取保存于-70℃冰箱中的短小芽孢杆菌CCTCCNO：M2010075的悬浮液50μl，用划线法接种于PDA培养基平皿上，置生化培养箱中在35℃下培养直至长出单菌落(约24小时)。将活化的单菌落接种于含50ml PD培养液(PD液体培养基)的250ml三角瓶中，在35℃下，以200rpm转速在摇床中培养过夜(12小时)。然后将培养好的细菌液以3.0％的体积比接种于含200ml PD培养液的500ml三角瓶中；35℃下，以200rpm转速在摇床中培养12小时，作为拮抗细菌发酵液。

(4)病害评估

在喷雾10、15和20d后，测量纹枯病相对病斑高率(病斑高度占植株高度的百分率)(李湘民等，2003)，每小区调查5株。

(5)数据分析

应用DPS数据处理软件进行分析。

(6)试验结果

不同处理对纹枯病相对病斑高度的抑制效果见表1。喷雾井冈霉素与拮抗细菌发酵液的混合液(1∶1)的处理效果最好，喷雾拮抗细菌发酵液与喷雾井冈霉素的防效相当，由此说明223菌株能在一定程度上抑制水稻纹枯病。同时，随着时间的推移，三种处理的防效均有一定程度的下降。

表1、温室条件下不同处理对水稻纹枯病的防效

说明：

¹⁾同一列内相同的字母表示经Duncan新复极差法检验(p＝0.05)没有显著差异；

²⁾T1：喷雾井冈霉素；T2：喷雾拮抗细菌发酵液；T3：喷雾井冈霉素与拮抗细菌发酵液的混合液(1∶1)；T4：喷雾液体PDA培养基；T5：对照，喷雾蒸馏水。

实施例5、体外条件下，抗菌活性物质粗提液(实施例2所得)对水稻纹枯病菌的作用：

拮抗物质活性测定方法采用打孔法：将纹枯病菌0.5cm(打孔器直径)菌碟分别接在PDA平板中心，作为指示菌，28℃下培养至直径2cm时，同时距边缘1.5cm处均匀打孔，挑去琼脂块后即为加样孔，加入50μl实施例2所得的抗菌活性物质粗提液，对照孔加入50μl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，然后继续培养约6小时，即可观察结果(图3)。

图3显示抗菌活性物质粗提液对水稻纹枯病菌有很强的拮抗活性；由于在抗菌物质制备过程中菌株的发酵培养基为合成培养基，由此可排除非菌株产生的抗菌成分的因素。

实施例6：大田环境下，抗菌活性物质粗提液(实施例2所得)对水稻纹枯病的防效：

(1)水稻的种植

按大田水稻的常规种植方法，将秧苗种成5×5的小区。抽穗前，选取不相邻的4个小区进行试验，以免相互影响。

(2)病原菌的制备和接种

水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)在PDA平板上培养72h，选取成熟的菌核。先将稻田水排干，然后将菌核接在稻株的基部并夹紧基部，所有稻株全部接种。发病期间要保持田间土壤有一定的湿度。

(3)防治试验设计

试验包括以下4个处理：

处理1(T1)，喷雾井岗酶素(5％水剂稀释十倍后使用)；

处理2(T2)，喷雾去菌后的拮抗细菌浸泡液；该拮抗细菌浸泡液为实施例2步骤4)所得的上清液；

处理3(T3)，喷雾抗菌活性物质粗提液(实施例2所得)；

处理4(T4)，作为对照(CK)，喷雾50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

每个处理3个重复，共12个小区。以上处理在纹枯病菌菌核接种后的第5天进行，每个处理的喷雾量相等(喷雾以不形成水珠为度)。

(4)病害评估

在喷雾5天和10天后，测量纹枯病相对病斑高率(病斑高度占植株高度的百分率)(李湘民等，2003)，每小区调查10株。

(5)数据分析

应用DPS数据处理软件进行分析。

(6)试验结果

不同处理对纹枯病相对病斑高度的抑制效果见表2。喷雾去菌后的拮抗细菌浸泡液和喷雾活性物质粗提液的处理效果最好，喷雾井冈霉素水剂的防效次之，由此说明短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2010075所产生的活性物质能在一定程度上抑制水稻纹枯病，且效果不亚于井冈霉素。同时，随着时间的推移，三种处理的防效均有一定程度的下降。

表2大田环境下，不同处理对水稻纹枯病的防效

说明：

¹⁾同一列内相同的字母表示经Duncan新复极差法检验(p＝0.05)没有显著差异。

²⁾T1：喷雾井冈霉素；T2：喷雾去菌后的拮抗细菌浸泡液；T3：喷雾活性物质粗提液；T4：对照，喷雾50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

cccagggggg cgtgctatac atgcaagtcg agcggacaga agggagcttg ctcccggatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccgga gctaataccg gatagttcct tgaaccgcat ggttcaagga tgaaagacgg 180

tttcggctgt cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg caagagtaac tgcttgcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa ccctagagat agggctttcc cttcggggac agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggctg cgagaccgca aggtttagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgcaaca cccgaagtcg gtgaggtacc tttatggagc cagccgcccg 1440

Claims

1.一种短小芽孢杆菌，其特征是：保藏名称为：Bacillus pumilus 223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2010075。

2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌的培养方法，其特征是包括如下步骤：

1)、固体平板培养：用接种环蘸取Bacillus pumilus 223 CCTCC NO：M2010075在PDA固体培养基上划线接种，于35℃培养12h，得到菌种I；所述菌种I能在4℃下保存3个月；

3.根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌的培养方法，其特征是：

所述PDA固体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g和琼脂18g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PDA固体培养基；

所述PD液体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PD液体培养基。

4.一种抗菌活性物质的制备方法，其特征是依次包括如下步骤：

1)、取Bacillus pumilus 223 CCTCC NO：M2010075在PDA培养基上划线，35℃下培养24h；

5)、按照每100ml上清液加入37～41克(NH₄)₂SO₄的比例，在所述上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，于0～4℃放置10～14小时，然后于12000r/min离心20min，所得沉淀用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重溶后，即为抗菌活性物质粗提液。

5.根据权利要求4所述的抗菌活性物质的制备方法，其特征是：

所述SMA液体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 6.0g，K₂HPO₄ 14.0g，NaCitrate·3H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖4.0g，加水至1000ml；自然pH，121℃灭菌20min；

所述SMA固体培养基为：(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 6.0g，K₂HPO₄ 14.0g，NaCitrate·3H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖4.0g，琼脂18g，加水至1000ml；自然pH，121℃灭菌20min。

6.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌的用途，其特征是：用于防治水稻纹枯病。

7.如权利要求4或5所述方法制备而得的抗菌活性物质的用途，其特征是：用于防治水稻纹枯病。