CN103146586B

CN103146586B - 一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN103146586B
Application number: CN201310075968.6A
Authority: CN
Inventors: 赵斌; 董金皋; 赵巍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2033-03-11
Also published as: CN103146586A

Abstract

本发明涉及一种防治植物真菌病害、促进植物生长的高效哈茨木霉菌。本发明所述哈茨木霉菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7230。本发明涉及的哈茨木霉菌具有较高的抑制植物病原真菌生长的能力，不污染环境，生态安全，能够广泛应用到植物病原致病真菌，特别是腐霉病菌(Pythiumspp.)、镰刀菌（Fusariumspp.）、灰霉病菌（Botrytiscinerea）中的防治，是一株在瓜果蔬菜和农作物生物防治中有较高应用价值的菌株。该高效哈茨木霉菌单独使用或与其它植物生长所需要的有机、无机营养成分一起使用,制备成的生物复合肥料具有显著的促生长，抗早衰，防病，增加提高产量和改良品质量的作用。

Description

一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和生物肥料领域，特别是涉及哈茨木霉，具体而言，本发明涉及一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌及其应用。

背景技术

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，一直以来化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。但由于化学农药的大量使用，带来很多负面作用，如污染生态环境、危害人畜、产生抗药性，伤害非靶标生物，农药残留等问题，严重影响了人类健康和生态平衡等一系列问题，这促使人们探寻对人类和环境无害并具良好防治效果的新型植物病虫害防治策略。随着全球范围内研制开发高效低毒生防制剂的兴起，开发微生物菌剂来控制有害生物，已经成为替代或减少化学农药使用的新型防治措施之一，受到世界各国学者、企业和消费者的重视。利用有益微生物防治植物病害始于1921年的Hartely利用真菌防治猝倒病（王晓宇，中国农业科学，2011）。

木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，由于木霉菌的广泛适应性、抑菌广谱性以及多机制性，本霉菌被普遍认为能够代替多种化学农药的生防因子。早在1932 年，Weidling 就发现木素木霉对立枯丝核菌等病原菌有抑制作用，之后经多年的研究，发现该菌对很多种植物病原菌具有抑制作用，如在粮食作物中，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的纹枯病、由稻梨孢（Magnaporthe grisea）引起的稻瘟病、由禾白粉菌（Erysiphe raminis）引起的禾谷类白粉病等；蔬菜中由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的茄科和葫芦科灰霉病、由尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）引起的黄瓜枯萎病、由瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）引起的根腐病以及由疫霉属(Phytophthora)引起的疫病和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等引起的蔬菜病害；木霉菌属还可以控制采后水果的多种疫病如草莓灰霉病（Botrytis cinerea）和白粉病（Erysiphe raminis），香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum）等；此外，木霉菌属防治林果病害也有较好的效果，如由聚生小穴壳菌(Dothiorella grearia)引起的杨树溃疡病，由苹果柱盘孢霉（Cylindrosporium pomi）引起的黑点病等。木霉菌对植物病害的生防作用机制包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等。不同作用方式之间往往存在着协同作用。

可知，木霉菌属现已成为一种理想的生防菌株，筛选对病原真菌有高效抑制作用的菌株是防治植物病害的有效方法之一。

但是，目前已知对植物真菌病害具有防治作用的木霉菌大多效果不佳、作用对象比较单一、易受自然环境影响、竞争存活能力有限等弊端。出乎意外地，本申请发明人经过多年悉心研究，从植物根际土壤中分离到一株新的哈茨木霉菌菌株，该菌株对多种植物真菌病害具有良好的防治效果，遗传稳定，且不容易产生抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的哈茨木霉菌菌株，所述菌株对多种植物真菌病害的防治有明显效果。

本发明所述的哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）于2013年1月28日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.7230。

本发明所提供的哈茨木霉菌是从植物根际土壤中分离得到的，其实验室命名为菌株MSB1211。

将菌株MSB1211在PDA培养基上培养，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，将5mm MSB1211菌株的菌丝块接种到PDA 培养基上，28℃恒温培养24h 后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌落扩展较快，培养72h时菌落直径为68mm，菌丝层较厚，致密绒状，菌落初期为白色，后期因产生孢子而呈绿色。菌落背面初为无色，后期成黄褐色。在显微镜下观察，菌丝透明，有隔，内含物丰富，细胞壁光滑，菌丝生长端呈椭圆形。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，对生二至三级分枝，分枝与分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶体端部尖削，微弯，尖端生分生孢子，表面光滑。根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法初步鉴定菌株MSB1211为木霉属(Trichoderma)，利用分子生物学技术对其ITS序列鉴定后该菌为哈茨木霉Trichoderma harzianum。

进一步地，本发明提供上述哈茨木霉菌防治植物真菌病害的用途。

优选地，导致所述植物真菌病害的植物真菌病原体为腐霉病菌(Pythium spp.)、镰刀菌（Fusarium spp.)、灰霉病菌（Botrytis cinerea）中的一种或几种。

更优选地，所述植物真菌病害为黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum )、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）。

进一步的，本发明的哈茨木霉菌可以制成微生物菌剂，即将本发明的上述菌株接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25℃-30℃、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3-4 天，并调节孢子浓度为1×10⁶ 个/mL，即制得本发明哈茨木霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵：将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到1L的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将10mL上述哈茨木霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25℃-30℃发酵培养3-4天后制得本发明所述微生物菌剂。

进一步地，本发明的哈茨木霉菌可以制成如下生物肥，即将上述哈茨木霉菌的微生物菌剂与有机肥料、大量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述大量元素肥料为氮肥、磷肥或钾肥。

所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾

进一步地，本发明的哈茨木霉菌可以制成如下生物肥，即将上述哈茨木霉菌的微生物菌剂与有机肥料、微量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述微量元素肥料为选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或几种。

腐霉菌，是一种适应性较强的细菌。它多侵害植物的叶、花、果等部位。为害瓜类、豆类、茄科、烟草、玉米、棉花、甜菜等植物的幼苗及果实，引起幼苗猝倒，根茎和瓜果腐烂。在潮湿条件下病部表面长出发达的白色棉絮状霉层。腐霉菌侵害不同植物造成不同腐霉病害，如腐霉病菌侵染黄瓜、丝瓜等瓜类植物引发黄瓜腐霉病、丝瓜腐霉病等瓜果腐霉病；腐霉病菌侵染茄子等茄科植物引发茄子腐霉病等茄科腐霉病；豆科腐霉病菌等。本发明通过使用哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制侵染黄瓜的腐霉菌的生长，对黄瓜腐霉病具有显著的生防作用。

镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最困难的重要病害之一。本发明通过使用哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制镰刀菌枯萎病，对镰刀菌具有显著的生防效果。

灰霉病菌属真菌病害，它能危害番茄、黄瓜、草莓、辣椒、葡萄等多种蔬菜、果树和观赏植物，目前已发现的寄主植物至少有235种，且花、果、叶、茎均可发病。寄主植株从苗期到挂果期都可以发病，叶、茎、花、果实均可感染病害。感病后，叶部症状表现有“V”形病斑、不规则病斑、叶柄折断等症状。茎部症状表现为茎腐烂、茎基腐烂。花部症状表现为花腐烂和凋萎。果实症状表现为腐烂和果实脱落。本发明通过哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制灰葡萄孢菌，对灰霉病具有显著的生防效果。

本发明的效果

1、在平板对峙法中，本发明的哈茨木霉菌对黄瓜腐霉病菌、甜瓜尖孢镰刀菌和番茄灰霉病菌三类植物病原真菌具有良好的抑制效果，抑制率均在79.8%以上，说明本发明菌株具有较广的抑菌谱；

2、将本发明所述菌株制成微生物菌剂后，对黄瓜腐霉病菌、甜瓜尖孢镰刀菌和番茄灰霉病菌三类植物病原真菌具有良好的生物防治效果，且防效均在80%以上，说明本发明菌株在田间对植物病原真菌具有较好的防治效果；

3、本发明所述哈茨木霉MSB1211菌丝以缠绕或平行生长等方式寄生于病菌菌丝上，病菌菌丝生长受到限制，菌丝变形和扭曲，从而抑制植物病原真菌的生长，进行防治。

附图说明：

图1本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对黄瓜腐霉病菌的抑制效果

图2本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对甜瓜尖孢镰刀菌的抑制效果

图3本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对番茄灰霉病菌的抑制效果

图4本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对黄瓜腐霉病菌的重寄生作用

具体实施方式

本发明公开了一种高抗真菌活性的哈茨木霉菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的木霉已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 土样的采集和本发明哈茨木霉菌株的分离

1、样品采集

样品采集自河北饶阳黄瓜田间根际土壤。

用取土器材拨开田间3-5cm 的表土层，将土壤连同植物的根系一起挖出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。

2、哈茨木霉菌株MSB1211 的分离获取

将粘附土壤的根系稍风干，轻拍根系，使粘附在上面的土壤脱落，用无菌水梯度稀释，分别吸取0.1mL 稀释液滴入到TSM培养基平板基(MgSO₄,·7H₂O 0.2 g，KH₂PO₄·3 H₂O 0.9 g，KCI 0.25 g，NH₄NO₃1.0 g，葡萄糖3.0 g，玫瑰红0.15 g，氯霉素0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8～7.0)上，用灭菌的L 形涂布棒涂布均匀，置于25-28℃的恒温培养箱中培养3-4 天。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到PDA 平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到PDA 斜面上。

筛选：在同一PDA 平板上接种哈茨木霉已纯化木霉菌株菌饼并与病原菌菌饼进行对峙培养（两个菌饼中心的垂直距离为7cm），25-28℃的恒温培养箱中培养3-4 天，观察并统计抑制率，各3次重复。选择一个抑制作用最强的菌株，即本申请所涉及的上述哈茨木霉菌株，将其命名为MSB1211。

实施例2 本发明哈茨木霉菌株的鉴定

1 形态学鉴定

根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法，采用PDA 培养基培养真菌，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，将5mm MSB1211菌株的菌丝块接种到PDA 培养基上，28℃恒温培养24h 后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌落扩展较快，培养72h 菌落直径为68mm，菌丝层较厚，致密绒状，菌落初期为白色，后期因产生孢子而呈绿色。菌落背面初为无色，后期成黄褐色。在显微镜下观察，菌丝透明，有隔，内含物丰富，细胞壁光滑，菌丝生长端呈椭圆形。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，对生二至三级分枝，分枝与分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶体端部尖削，微弯，尖端生分生孢子，表面光滑。根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法初步鉴定菌株MSB1211为木霉属(Trichoderma )。

2 分子生物学鉴定

ITS鉴定：将筛选菌株的孢子液接入PDB 液体培养基中，28℃摇床培养48 h，过滤获得菌丝，提取真菌基因组DNA。以提取的真菌DNA 作为模板，以ITS5和ITS8 引物对进行PCR 扩增。PCR 反应体系为25 μl，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，NS1引物1μL，NS8 引物1μL，dNTPs 2μL，Taq 酶 0.25μL，ddH2O 17.25μL。反应条件为： 94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s ；循环30 次；72℃ 10 min。PCR 扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA 序列，输入NCBI，用Blast 程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用DNAman进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，本发明所分离的菌株属于木霉属哈茨木霉。

表1 MSB1211菌株ITS序列同源比对结果

序列ID	菌株	同源性
			gi\|16580098\|AY027781.1	Trichoderma harzianum GJS 99-225	99%
gi\|288887112\|GU048855.1	Hypocrea lixii isolate S17TH	99%
			gi\|383792312\|JQ040359.1	Hypocrea lixii strain SHSJ5003	99%
gi\|290109309\|GU479422.1	Hypocrea lixii isolate NBAII(N)ASS	99%
			gi\|423252379\|JX241670.1	Trichoderma inhamatum strain GL0834	98%
gi\|410824576\|JX644593.1	Trichoderma harzianum isolate NBAII-Th33	98%
			gi\|409194940\|JX518930.1	Trichoderma harzianum isolate IBSD-T137	98%
gi\|409194937\|JX518927.1	Trichoderma harzianum isolate IBSD-T112	98%
			gi\|409194935\|JX518925.1	Trichoderma harzianum isolate IBSD-T101	98%
gi\|409194930\|JX518920.1	Trichoderma harzianum isolate IBSD-T89	98%

实施例3 本发明哈茨木霉菌株的抑菌效果

实验组：在同一PDA 平板上接种哈茨木霉MSB1211 菌饼和病原菌菌饼进行对峙培养（两个菌饼中心的垂直距离为7cm）；以只接种病原菌菌饼的PDA平板作为对照组；25℃黑暗培养一定时间后测量病原菌的菌落直径（最长直径和最短直径的平均值）并计算抑制率见表2，对黄瓜腐霉病菌抑菌效果如图1所示，对甜瓜尖孢镰刀菌抑菌效果如图2所示，对番茄灰霉病菌抑菌效果如图3所示。由图可见，本发明所述哈茨木霉MSB1211 菌均抑制其生长，并在其菌丝上继续生长寄生。抑制率=（对照组病原菌的菌落直径 - 实验组病原菌的菌落直径）/ 对照组病原菌的菌落直径×100%。每种致病菌设置三个重复处理，对照设置三个重复处理，结果取平均值。

表2 各个培养时间后哈茨木霉MSB1211 对各病原菌的抑菌率（%）

	4天	8天	12天
				黄瓜腐霉病菌	79.84±4.31%	88.23±3.79%	92.46±3.71%
甜瓜镰刀菌	80.01±4.52%	87.31±2.86%	91.37±2.59%
				番茄灰霉病菌	82.50±2.85%	84.41±1.09%	86.41±3.37%

实施例4 本发明哈茨木霉MSB1211微生物菌剂的制备

采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基发酵，培养基按比例组成为：马铃薯150-250g、葡萄糖15-25g、水1000ml，进行液体发酵培养3-4 天，培养条件为，温度25℃-30℃，摇床转数125r/min-150r/min，并调节孢子浓度为1×10⁶ 个/mL，即制得本发明哈茨木霉菌的2级培养液；

固体发酵将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到1L的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用；将10mL 上述哈茨木霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25℃-30℃发酵培养3-4天后记得本发明所述微生物菌剂。

如下的抑菌试验采用的是将本实施例所制得的菌剂用0.03%的吐温20溶液洗脱并收集制成分生孢子悬液。

实施例5本发明哈茨木霉MSB1211微生物菌剂的温室抑菌效果

用50-55℃温开水烫种消毒10分钟，不断搅拌以防烫伤。然后用约30℃温水浸4 -6小时，搓洗干净，涝起沥干，在28-30℃的恒温箱或温暖处保湿催芽，20小时开始发芽。在人工气候箱育苗，苗龄15-20天（2片真叶）时定植，于晴天或傍晚进行，要注意保护根系，起苗前淋透水，起苗时按顺序，做到带土定植，以防伤根。

实验组：每株黄瓜幼苗接种15mL 实施例4制得的哈茨木霉MSB1211微生物菌剂（孢子浓度为1×10⁶ 个/mL）和15mL 黄瓜腐霉病菌孢子悬浮液（孢子浓度为1×10⁶ 个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；

对照组：每株黄瓜幼苗接种15mL 黄瓜腐霉病菌孢子悬浮液（孢子浓度为1×10⁶ 个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。接种孢子悬浮液20 天后调查发病率（黄瓜腐霉病分级调查标准见表3）并计算病情指数。

表3 黄瓜腐霉病分级调查表

病级	分级标准
		0级	全株无病
1级	全株1/4以下的叶片有少数病斑
		2级	全株1/2以下的叶片有少数病斑或1/4以下的叶片有较多的病斑
3级	全株3/4以下的叶片发病或1/4以下的叶片全叶枯黄
		4级	全株3/4以上的叶片发病或1/2以下的叶片枯黄~整株枯黄

发病率=发病苗数/调查苗数×100%

病情指数= 100×∑（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)

相对防效（%）＝[(对照组病情指数－处理组病情指数)÷对照组病情指数]×100%

结果表明，哈茨木霉MSB1211对黄瓜腐霉病具有显著的生防效果。结果见表4。

表4 哈茨木霉MSB1211对黄瓜腐霉病的温室防治效果

处理	病株率（%）	病情指数	相对防效（%）
				实验组	10.1	2.1	80.3
对照组	78.2	8.6	---

哈茨木霉MSB1211微生物菌剂的温室抑菌效果本发明所述仅以对黄瓜腐霉病的防效为例，对甜瓜尖孢镰刀菌和番茄灰霉病菌的防治效果相同，均在80%以上。

实施例6 本发明哈茨木霉MSB1211菌剂对植株的促生能力

实验组1 ：每株黄瓜幼苗接种15mL 实施例4制得的哈茨木霉MSB1211微生物菌剂（孢子浓度为1×10⁶ 个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；

对照组1 ：每株黄瓜幼苗接种15mL 水；接种方式为将水用注射器注入根围土壤；

对照组2 ：每株黄瓜幼苗接种15mL 黄瓜腐霉病菌孢子悬浮液（孢子浓度为1×10⁶ 个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。

接种孢子悬浮液20 天后测量黄瓜植株的株高。结果见表5（三次试验的平均值）。结果表明，哈茨木霉MSB1211可以促进黄瓜植株生长。

表5哈茨木霉MSB1211菌剂对黄瓜植株的促生能力

	株高(cm)	干重(g)
			实验组1	108.4	4.08
对照组1	91.4	3.34
			对照组2	56.4	1.55

本发明哈茨木霉MSB1211菌剂对植株的促生能力本发明所述仅以对黄瓜的促生效果为例，对其他植株亦有促生作用相同。

实施例7 哈茨木霉MSB1211对黄瓜腐霉病菌的重寄生能力

在PDA 平板上对峙培养哈茨木霉MSB1211和黄瓜腐霉病菌，用5mm 的打孔器取菌丝块，将其分别接种于PDA 平板上的2cm×3cm 玻璃纸条两端，25℃对峙培养。当两菌丝接触后，在显微镜下观察哈茨木霉MSB1211对黄瓜腐霉病菌菌丝的重寄生作用。

显微镜下观察到供试的木霉菌丝以缠绕或平行生长等方式寄生于病菌菌丝上，病菌菌丝生长受到限制，菌丝变形和扭曲。在平板上培养1 周后，木霉MSB1211菌落能完全覆盖致病疫霉菌落，并大量产生绿色孢子（如图1所示）。哈茨木霉MSB1211对黄瓜腐霉病菌的重寄生作用如图4所示，本发明所述哈茨木霉MSB1211在腐霉病菌菌丝上缠绕寄生。

本发明哈茨木霉MSB1211对植物病原真菌的重寄生能力本发明所述仅以黄瓜腐霉病菌的重寄生能力为例，对植物病原真菌亦有重寄生能力。

实施例8 含有木霉菌生物肥的制备

本发明所制的的生物肥料包括以下二种：

（1）20％哈茨木霉菌生物肥

本发明所述20％哈茨木霉菌生物肥由实施例4制得的微生物菌剂与无机肥料、有机肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述无机肥料为氮肥、磷肥和钾肥，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

具体制备方法为，将20%实施例4制得的微生物菌剂与30%的无机肥料送入搅拌机作一级搅拌，均匀后再加入50％的有机肥料作二级搅拌，使物料充分均匀。

将搅拌均匀的上述物料用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。将烘干的成球经冷却、筛分，最后袋装或罐装成成品。

（2）20％哈茨木霉菌生物肥

本发明所述10％哈茨木霉菌生物肥由实施例4制得的微生物菌剂与微肥、有机肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述微肥选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

具体制备方法为，将20%实施例4制得的制剂与30%的微肥送入搅拌机作一级搅拌，均匀后再加入50%的有机肥料作二级搅拌，使物料充分均匀。

将搅拌均匀的上述物料用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。

将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。

将烘干的成球经冷却、筛分，最后袋装或罐装成成品。

本发明的一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌株及其应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum），其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.7230，其于2013年1月28日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的哈茨木霉菌在防治植物真菌病害为黄瓜腐霉病菌(cucumberPythium aphanidermatum)、甜瓜尖孢镰刀菌(melon Fusarium oxysporum)、番茄灰霉病菌（tomato Botrytis cinerea）中的用途。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，将权利要求1所述的哈茨木霉菌接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25℃-30℃、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3-4天，并调节孢子浓度为1×10⁶个/mL，即制得所述哈茨木霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵：将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到1L的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将10mL上述哈茨木霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25℃-30℃发酵培养3-4天后制得微生物菌剂。

4.一种生物肥，其特征在于，将权利要求3的微生物菌剂与有机肥料、大量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述大量元素肥料为氮肥、磷肥或钾肥。

5.根据权利要求4的生物肥，其特征在于，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾。

6.一种生物肥，其特征在于，将权利要求3的微生物菌剂与有机肥料、微量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2：3：5；所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述微量元素肥料为选自硼镁肥、钼酸钠和螯合态铜中的一种或几种。