CN112501034B

CN112501034B - 一株耐盐碱哈茨木霉及其在蔬果防病及促生中的用途

Info

Publication number: CN112501034B
Application number: CN202011441588.6A
Authority: CN
Inventors: 陈娜; 余昕彤; 梁锏文
Original assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Current assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112501034A

Abstract

本发明涉及一株耐盐碱哈茨木霉及其在蔬果防病及促生中的用途。本发明的哈茨木霉是一株有效的生防菌株，筛选自土壤，能够拮抗多种土传病害病原菌，并有较好的促生作用，可以成为生物农药中的有效微生物成分。

Description

一株耐盐碱哈茨木霉及其在蔬果防病及促生中的用途

技术领域

本发明涉及耐盐碱哈茨木霉及其用途，尤其是在蔬果防病及促生中的用途。

背景技术

木霉(Trichoderma)菌是一类易于分离的丝状真菌，属半知菌类的丝孢纲，丛梗孢目科。木霉菌在自然界中分布广泛，具有生长速率快、生命力强和适应性好的特点。研究发现，木霉菌对多种病原真菌和细菌有拮抗作用，其生物防治(简称生防)机制有多种，如竞争植物表面的生长位点形成“保护罩”、重寄生作用甚至诱导寄主产生局部抗性和系统抗性等，其代谢产物同样具有抵抗植物病原菌的功能。同时，木霉菌可以通过提高养分利用率、产生植物激素等机制提高植株生物量，从而促进植物生长(简称促生)。

我国蔬果等农作物的生产经济效益较高，因此集约化程度高，具有作物单一、轮作倒茬困难和复种指数高的特点。长期同种植物的种植和大量化肥的使用易造成土壤表层盐分累积以及严重病虫害，严重影响蔬果等农作物的产量。化学药剂的使用一方面导致化学药剂易残留在土壤中污染土壤环境，造成土壤酸化和板结，另一方面所生产的农产品中的农药残留也威胁人类身体健康。而生物农药通过有益微生物的加入，能够有效解决蔬果等农作物重茬障碍问题，因此成为目前环保、高效、安全的新型农药。

本领域依然存在对包含有益微生物以解决农作物集约化种植导致问题的新型农药的强烈需求。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物，所述哈茨木霉TH19菌株以保藏号GDMCC No:60917保藏于广东省微生物菌种保藏中心。

本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含上述的哈茨木霉TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物。

在一些实施方案中，所述的组合物还包含其它的植物防治药剂和/或植物促生药剂。

本发明的另一个方面涉及一种上述哈茨木霉TH19菌株的发酵菌粉。

本发明的一个方面涉及一种利用上述哈茨木霉TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物、上述组合物和/或上述发酵菌粉防治有此需要的植物的土传病害和/或土传病害病原菌的方法，其包括将防治有效量的所述的哈茨木霉TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物、组合物和/或发酵菌粉施用到所述植物。

在一些实施方案中，所述土传病害选自瓜类：灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病和多种细菌性病害等；茄果类：灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等；豆类：灰霉病、枯萎病、疫病、根腐病、菌核病、细菌性疫病等；其他类：白菜软腐病、辣椒青枯病、莴苣菌核病、小麦全蚀病、棉花立枯病、黄瓜枯萎病、黄瓜猝倒病等。在进一步的实施方案中，所述土传病害选自立枯病、灰霉病、毁灭柱孢、腐皮镰孢、纹枯丝核菌、立枯丝核菌、禾谷镰孢或终极腐霉。

在一些实施方案中，所述土传病害病原菌选自立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl)。

在一些实施方案中，所述植物选自小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦或稻；甜菜，例如糖用甜菜或饲料甜菜；水果，例如仁果、核果或无核小果(soft fruit)，例如苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、树莓、黑莓或醋栗；豆科植物，例如小扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料植物，例如油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻油植物、油棕、花生或大豆；葫芦科植物，例如南瓜、黄瓜或甜瓜；纤维植物，例如棉花、亚麻、大麻或黄麻；柑桔水果，例如橙、柠檬、葡萄柚或柑橘；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、圣女果、马铃薯、葫芦或红辣椒；月桂科植物，例如鳄梨、肉桂或樟脑；能量和原料植物，例如玉米、大豆、油菜、甘蔗或油棕；玉米；烟草；坚果，如核桃、板栗、榛子；咖啡；茶树；香蕉；藤本植物(食用葡萄(table grapes)和葡萄汁葡萄)；蛇麻草；坪草；甜叶(也称为甜叶菊)；天然橡胶植物或观赏植物和森林植物，例如花、灌木、阔叶树或常绿树，例如针叶树。在进一步的实施方案中，所述植物选自马铃薯、糖用甜菜、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻、玉米、棉花、大豆、油菜、豆、向日葵、咖啡或甘蔗；水果；藤本植物；观赏植物；或蔬菜，如黄瓜、番茄、菜豆或南瓜。

本发明的另一个方面涉及一种利用上述哈茨木霉TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物、上述组合物和/或上述发酵菌粉促进有此需要的植物的生长的方法，其包括将促生有效量的所述的哈茨木霉TH19菌株及其孢子、突变体和/或代谢产物、组合物和/或发酵菌粉施用到所述植物。

在一些实施方案中，所述植物选自小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦或稻；甜菜，例如糖用甜菜或饲料甜菜；水果，例如仁果、核果或无核小果(soft fruit)，例如苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、树莓、黑莓或醋栗；豆科植物，例如小扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料植物，例如油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻油植物、油棕、花生或大豆；葫芦科植物，例如南瓜、黄瓜或甜瓜；纤维植物，例如棉花、亚麻、大麻或黄麻；柑桔水果，例如橙、柠檬、葡萄柚或柑橘；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、圣女果、马铃薯、葫芦或红辣椒；月桂科植物，例如鳄梨、肉桂或樟脑；能量和原料植物，例如玉米、大豆、油菜、甘蔗或油棕；玉米；烟草；坚果，如核桃、板栗、榛子；咖啡；茶树；香蕉；藤本植物(食用葡萄(table grapes)和葡萄汁葡萄)；蛇麻草；坪草；甜叶(也称为甜叶菊)；天然橡胶植物或观赏植物和森林植物，例如花、灌木、阔叶树或常绿树，例如针叶树；优选地，马铃薯、糖用甜菜、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻、玉米、棉花、大豆、油菜、豆、向日葵、咖啡或甘蔗；水果；藤本植物；观赏植物；或蔬菜，如黄瓜、番茄、菜豆或南瓜。

换言之，编号TH19的哈茨木霉是一株有效的生防菌株，它筛选自土壤中，能够拮抗多种土传病害病原菌，并有较好的促生作用，因此可以成为生物农药中的有效微生物成分。并且，该耐盐碱的哈茨木霉相对于普通的哈茨木霉来说，更能在盐碱环境下生长，有更强的环境耐受性，并能发挥出哈茨木霉普遍的生防效果，适宜用于盐碱环境作物的生防。

生物材料保藏：

广东省微生物菌种保藏中心(Guangdong Microbial Culture CollectionCenter,GDMCC)，2019年11月29日，保藏编号为GDMCC No:60917。

附图说明

图1显示了哈茨木霉TH19的系统进化树。

图2显示了哈茨木霉TH19的抑菌率效果图。A：左图显示了立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的对照菌落，右图显示了哈茨木霉TH19对立枯丝核菌的抑菌效果。B：左图显示了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的对照菌落，右图显示了哈茨木霉TH19对禾谷镰孢菌的抑菌效果。C：左图显示了亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)的对照菌落，右图显示了哈茨木霉TH19对亚洲镰孢菌的抑菌效果。D：左图显示了尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum Schl)的对照菌落，右图显示了哈茨木霉TH19对尖孢镰刀菌的抑菌效果。

图3显示了哈茨木霉TH19在不同pH条件下的生长情况。

图4显示了哈茨木霉TH19在不同NaCl浓度下的生长情况。

图5显示了哈茨木霉TH19对圣女果的促生效果。

图6显示了哈茨木霉TH19对草莓的促生效果。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“哈茨木霉”(Trichoderma harzianum)是指按照传统分类系统，属于无性型真菌(anamorphic fungi)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)、木霉属(Trichoderma sp.)中的一员。木霉属分布广泛，主要存在于森林、坡沟、农田和草地等潮湿的生境中，土壤、枯枝、落叶和腐木等植物残体以及其它真菌的子实体都是其生长基物，其物种丰富多样。

在本发明的上下文中，术语“哈茨木霉TH19”、“TH19哈茨木霉”、“TH19”、“非洲哈茨木霉TH19”和“非洲哈茨木霉”可互换使用。

如本文所用，术语“耐碱”是指耐高于pH 7.5的酸碱度。在某些实施方案中，耐碱是指所述编号TH19的哈茨木霉耐pH 8-12，优选地，耐pH 9-11.5、10-11。

如本文所用，术语“耐酸”是指耐低于pH 6.5的酸碱度。在某些实施方案中，耐酸是指所述编号TH19的哈茨木霉耐pH 3-6，优选地，耐pH 3.5-5.5、4-5。

如本文所用，术语“耐盐”是指耐等效3g/L的氯化钠浓度，优选5g/L、6g/L、8g/L、10g/L，更优选12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L、25g/L、30g/L、40g/L，甚至高达80g/L。所述盐是指盐碱地中常见的盐，如NaCl、MgCl₂、KCl、CaCl₂、MgSO₄等。

如本文所用，术语“蔬果”是指人类正常利用和食用的蔬菜和水果。可以受益于本发明的哈茨木霉TH19的植物不限于蔬果，而是任何可能受害于土传病害的植物。在一些实施方案中，可以受益于本发明的哈茨木霉TH19的植物选自小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦或稻；甜菜，例如糖用甜菜或饲料甜菜；水果，例如仁果、核果或无核小果(soft fruit)，例如苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、树莓、黑莓或醋栗；豆科植物，例如小扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料植物，例如油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻油植物、油棕、花生或大豆；葫芦科植物，例如南瓜、黄瓜或甜瓜；纤维植物，例如棉花、亚麻、大麻或黄麻；柑桔水果，例如橙、柠檬、葡萄柚或柑橘；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、圣女果、马铃薯、葫芦或红辣椒；月桂科植物，例如鳄梨、肉桂或樟脑；能量和原料植物，例如玉米、大豆、油菜、甘蔗或油棕；玉米；烟草；坚果，如核桃、板栗、榛子；咖啡；茶树；香蕉；藤本植物(食用葡萄(table grapes)和葡萄汁葡萄)；蛇麻草；坪草；甜叶(也称为甜叶菊)；天然橡胶植物或观赏植物和森林植物，例如花、灌木、阔叶树或常绿树，例如针叶树。在一些实施方案中，可以受益于本发明的哈茨木霉TH19的植物选自马铃薯、糖用甜菜、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻、玉米、棉花、大豆、油菜、豆、向日葵、咖啡或甘蔗；水果；藤本植物；观赏植物；或蔬菜，如黄瓜、番茄、菜豆或南瓜。

如本文所用，术语“防病”是指防治土传病害对植物造成的病害。

如本文所用，术语“促生作用”是指促进作物生长，例如促进植物的植株生长，促进植物的座果率，促进植物果实的产量等。

如本文所用，术语“生防”是指利用一种生物对付另外一种生物的方法。在本文中，生防是指利用本发明的哈茨木霉TH19对付侵害植物的土传病害。

如本文所用，术语“拮抗”是指一种物质被另一种物质阻抑。在本文中，拮抗是指本发明的哈茨木霉TH19阻抑侵害植物的土传病害。

如本文所用，术语“土传病害”是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。在一些实施方案中，土传病害有瓜类：灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病和多种细菌性病害等；茄果类：灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等；豆类：灰霉病、枯萎病、疫病、根腐病、菌核病、细菌性疫病等；其他类：白菜软腐病、辣椒青枯病、莴苣菌核病、小麦全蚀病、棉花立枯病、黄瓜枯萎病、黄瓜猝倒病等。

如本文所用，术语“土传病害病原菌”是指导致土传病害的病原菌。在一些实施方案中，土传病害病原菌选自灰霉病、毁灭柱孢、腐皮镰孢、纹枯丝核菌、立枯丝核菌、禾谷镰孢、终极腐霉等。

如本文所用，术语“防治有效量”是指对防治土传病害有效的哈茨木霉TH19及其孢子、突变体和/或代谢产物、组合物和/或发酵菌粉的量。本领域技术人员根据所需要防治的具体土传病害病原菌的种类及病害的严重程度常规地确定该有效量。

如本文所用，术语“促生有效量”是指有效促进植物生长的哈茨木霉TH19及其孢子、突变体和/或代谢产物、组合物和/或发酵菌粉的量。本领域技术人员根据所需要促生的具体植物及需要达到的促生效果常规地确定该有效量。

如本文所用，术语“哈茨木霉TH19的孢子”或“哈茨木霉TH19的孢子悬液”是指真菌的主要繁殖器官，通过将孢子转入无菌液体中振摇，使孢子分散后形成的悬浮液即为孢子悬液。

如本文所用，术语“哈茨木霉TH19的发酵菌粉”是指本发明的哈茨木霉TH19发酵后的产物，其可以例如通过固态发酵的方式获得。

如本文所用，术语“哈茨木霉TH19的代谢产物”是指哈茨木霉TH19的代谢活动所产生的产物。本领域知晓，真菌的代谢产物通常具有特定的生物活性，其落入本发明的保护范围。

如本文所用，术语“哈茨木霉TH19的突变体”是指通过对哈茨木霉TH19进行修饰、突变等操作所获得的具有改进性质的突变体，例如对其基因组进行定点突变、特定片段的缺失和/或插入后获得的突变体。

如本文所用，术语“其它的植物防治药剂”和/或“其它的植物促生药剂”是指可以跟本发明的哈茨木霉TH19组合使用的其它植物防治和/或促生药剂种类，例如各种化学类生防制剂，如先正达、陶氏、巴斯夫等厂家推出的植物防治和/或促生药剂。在一些实施方案中，所述其它的植物防治和/或促生药剂是指链接http://sdzpny.1988.tv/pro/ sdzpnysjj.html中列出的药剂。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种病原菌均来源于商业途径的标准病原菌。

实施例

实施例1、哈茨木霉菌株的分离与筛选

样本来自河南省烟草种植地采集到的土壤样本。

称取5g样本土壤，加入到灭菌的45mL浓度为0.1％的吐温80水中，震荡1分钟混匀并静置25分钟，取土壤液体梯度稀释至10^-3、10^-4浓度，然后涂布于PDA固体培养基(PDA固体培养基配方：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。)中，于28℃恒温培养箱中倒置培养4d，4d后挑取单一真菌菌落，接种于PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d。经筛选，获得一株菌株，对该菌株的ITS(5.8S rDNA和28SrDNA基因间隔序列)序列进行种属鉴定，测定结果见SEQ ID NO：1：

GGGACATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAA

鉴定类别为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)。

使用TEF序列(598bp，Genebank登录号:AB646533)提交至NCBI数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/submit/和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/？back_url＝https％3A//submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/genbank/)，鉴定结果为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)；从GenBank数据库中获得了木霉菌属的序列，并结合NCBI数据库的标准模式菌序列，利用MEGA5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joiningmethod)，进行了聚类分析和系统进化树构建。构建的系统进化树详见图1。

至此，判定该菌株为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)，菌株编号记为哈茨木霉TH19。随后，将哈茨木霉TH19送至广东省微生物菌种保藏中心(GuangdongMicrobial Culture Collection Center,GDMCC)保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No:60917，保藏日期为2019年11月29日。

实施例2、哈茨木霉TH19孢子悬液和发酵菌粉的制备

在PDA固体培养基上活化TH19，置于28℃恒温培养箱培养5～7天至绿色孢子产满平板，用无菌蒸馏水洗下培养基表面的孢子，用无菌蒸馏水稀释调整孢子数为1×10⁷sp/ml，即为待用孢子悬液。

TH19在PDA固体培养基上活化产孢后，挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床RPM120振荡培养3～5天，形成种子液，菌活为0.15～0.30cfu/ml。将种子液按10％的比例接种至固体发酵培养基，保持28℃恒温和相对湿度85％以上发酵培养8～9天，发酵液干燥以后即可得到哈茨木霉发酵菌粉。

PDA固体培养基配方：马铃薯浸粉5.0g(北京鸿润宝顺科技有限公司Y047B)，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。

PDB液体培养基配方：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000ml。

固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固体料：干燥玉米芯50％，干燥小麦麸皮40％，干燥稻壳10％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。固液比为1：1.8(质量比)。

实施例3、哈茨木霉TH19防治黄瓜立枯病温室盆栽试验

(1)试验处理药剂包括：自来水(空白对照)、甲基硫菌灵(山东邹平农药有限公司)稀释1000倍液(化学药)、哈茨木霉孢子悬液、哈茨木霉发酵菌粉。

(2)黄瓜立枯丝核菌病原(广州白云区田间采集)培养。

(3)盆栽试验方法：将已育苗21天的黄瓜苗进行伤根处理后，移栽至新的装有灭菌翠筠靓土(翠筠园艺有限公司)的花盆中，每盆移栽3株，试验设3个重复，每重复6个花盆。移栽后在每个花盆中接种2个直径5mm、培养14天左右的立枯丝核菌饼。将哈茨木霉发酵菌粉用自来水稀释300倍，每盆100ml进行灌根。随后放置于高温高湿(温度≥30℃，湿度≥85％)条件下培养4-5天，统计黄瓜的病级情况，并计算病情指数和相对防效。

黄瓜苗根茎部发病严重度分级标准为：

0级：健康苗；

1级：茎基或根部稍现病斑或稍变色；

2级：1/3或1/2茎基或根部出现病斑或变色腐烂；

3级：全茎或根部被病斑环绕、变色、腐烂；

4级：黄瓜苗萎蔫枯死。

病情指数＝[∑(各级病株数×对应各级代表数值)/(调查总株数×发病最高级的代表数值)]×100

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

(4)试验结果：见表1。

表1：

结果表明，哈茨木霉TH19孢子悬液和发酵菌粉对黄瓜立枯丝核病有很好的防治效果，其中发酵菌粉的防治效果接近90％。

实施例4、立枯丝核病原菌生防效果评估

平板对峙实验：

供试病原菌：立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumSchl)(广州从化区、广州白云区、广东肇庆市鼎湖区田间采集)

CK(空白对照)：从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于离PDA平板中心2.5cm处，对侧中央放置直径5mm PDA琼脂块，28℃恒温培养，平板5个重复。

处理：从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于离PDA平板中央2.5cm处，从活化3天的哈茨木霉TH19菌落打取直径5mm菌饼，将其置于PDA平板另一侧中央，使病原菌和木霉的中心连线穿过平板中央，25℃恒温培养，每处理5重复。TH19对立枯丝核菌的抑制效果如图2所示。

数据采集：接种后，平板倒置培养，每隔24h测量一次病原菌直径，并根据以下公式计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100％

抑菌率效果如图2所示，抑菌率见下表2。

表2

实施例5、耐酸、耐碱以及耐盐能力评估

实验方法

耐酸和耐碱实验：待经高温高压灭菌后的PDA培养基冷却至60℃左右时，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH溶液将培养基的pH值分别调节至5、7(不用调节，对照)、9、11，并制成平板备用。从活化好的哈茨木霉TH19菌株边缘打取直径约5mm的菌饼，接种至不同pH值培养基的中央，重复3次，恒温25～28℃下培养，培养至48h时，分别测量菌落直径、记录。结果见图3。

耐盐实验：先配制含NaCl 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L的PDA培养基，高温高压灭菌后制成平板，从活化好的哈茨木霉TH19菌落边缘打取菌饼，接种至培养基上，25～28℃恒温培养，以不加NaCl的培养基为对照，观察菌落生长，生长至48h时，测量菌落直径并记录。结果见图4。

第48h的菌落直径见下表3。在弱酸和弱碱环境下，TH19菌株的生长并没有受到抑制，在强碱环境(pH＝11)菌落直径明显大于中性环境(pH＝7)。

表3

pH	5	7	9	11
					菌落直径(mm)	69.6	64.0	65.7	71.0

第48h的菌落直径见下表4。TH19菌株的菌落直径随盐浓度的增加而变小，但在盐浓度较高(NaCl 0.25mol/L)时仍能较快生长。

表4

盐浓度(mol/L)	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25
							菌落直径(cm)	76.5	60.5	62.8	56.2	49.9	43.9

实施例6、大田西红柿促生效果评估

(1)试验处理药剂包括：自来水(空白对照)、TH19发酵菌粉、武汉科诺类芽孢杆菌产品(目录号PD20151298)。

(2)试验地点：广东省广州市番禺区石碁镇兴腾试验基地

试验材料：西红柿

试验时间：2019.10.3-2019.10.27

试验方法：规划每小区面积18m²，每处理3重复。TH19发酵菌粉兑水稀释300倍后进行根际冲施。试验信息见表5。

表5

处理	施用方式	有效剂量
			TH19发酵菌粉	根际冲施	1kg/亩(稀释300倍使用)
武汉科诺类芽孢杆菌产品	根际冲施	1kg/亩(稀释1000倍使用)
			空白对照	-	-

试验结果：

相比于空白对照和施用武汉科诺类芽孢杆菌产品，施用TH19发酵菌粉后西红柿的株高明显增加，同时圣女果坐果率明显提高。结果见表6和表7。

表6

表7

实施例7、圣女果促生效果评估

(1)试验处理药剂包括：自来水(空白对照)、TH19发酵菌粉。

(2)试验地点：广东省广州市番禺区石碁镇兴腾试验基地

试验材料：圣女果

试验时间：2019.09.27-2020.01.03

试验方法：试验地每小区面积18m²，每处理3重复。TH19发酵菌粉兑水稀释300倍后进行根际冲施。试验信息见表8。

表8

处理	施用方式	有效剂量
			T19发酵菌粉	喷淋	1kg/亩(稀释300倍使用)
空白对照	喷淋	-

(3)试验结果：

圣女果产量

结果见图5和表9，发现TH19发酵菌粉处理的较空白对照小区圣女果产量增加47.32％。

表9

处理	圣女果产量(kg)	相对于CK增加(％)
			TH19发酵菌粉	7.97±0.22	47.32％
空白对照	5.41±0.20	-

实施例8、草莓促生效果评估

(1)试验处理药剂包括：自来水(空白对照)、TH19发酵菌粉。

(2)试验地点：深圳市洲石路田田农园草莓采摘园

试验材料：草莓

试验品种：红星1号

试验时间：2019.09.29-2019.12.13

试验方法见表10。

表10

处理	施用方式	有效剂量
			T19发酵菌粉	灌根	1kg/亩(稀释300倍使用)
空白对照	灌根	-

(3)试验结果：

草莓平均有效挂果数

结果见图6和表11，发现TH19发酵菌粉处理的草莓平均有效挂果数明显增加，相对于空白对照增加10.31％。

表11

序列表

<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱哈茨木霉及其在蔬果防病及促生中的用途

<130> LZ2006192CN01

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 589

<212> DNA

<213> 非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）

<400> 1

gggacattac cgagtttaca actcccaaac ccaatgtgaa cgttaccaaa ctgttgcctc 60

ggcgggatct ctgccccggg tgcgtcgcag ccccggacca aggcgcccgc cggaggacca 120

accaaaactc ttattgtata ccccctcgcg ggttttttta taatctgagc cttctcggcg 180

cctctcgtag gcgtttcgaa aatgaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg 240

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 300

atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcatgc ctgtccgagc 360

gtcatttcaa ccctcgaacc cctccggggg gtcggcgttg gggatcggcc ctgccttggc 420

ggtggccgtc tccgaaatac agtggcggtc tcgccgcagc ctctcctgcg cagtagtttg 480

cacactcgca tcgggagcgc ggcgcgtcca cagccgttaa acacccaact tctgaaatgt 540

tgacctcgga tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaaaaa 589

Claims

1.一种非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TH19菌株及其孢子，所述非洲哈茨木霉TH19菌株以保藏号GDMCC No:60917保藏于广东省微生物菌种保藏中心。

2.一种组合物，其包含权利要求1所述的非洲哈茨木霉TH19菌株及其孢子。

3.根据权利要求2所述的组合物，其还包含其它的植物防治药剂和/或植物促生药剂。

4.一种权利要求1所述的非洲哈茨木霉TH19菌株的发酵菌粉。

5.一种利用权利要求1所述的非洲哈茨木霉TH19菌株及其孢子、权利要求2或3所述的组合物和/或权利要求4的发酵菌粉防治有此需要的植物的土传病害和/或土传病害病原菌的方法，其包括将防治有效量的所述的非洲哈茨木霉TH19菌株及其孢子、组合物和/或发酵菌粉施用到所述植物，其中所述土传病害病原菌选自立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl)且所述土传病害由所述土传病害病原菌导致。

6.一种利用权利要求1所述的非洲哈茨木霉TH19菌株及其孢子、权利要求2或3所述的组合物和/或权利要求4的发酵菌粉促进有此需要的植物的生长的方法，其包括将促生有效量的所述的非洲哈茨木霉TH19菌株及其孢子、组合物和/或发酵菌粉施用到所述植物，其中所述植物选自草莓、番茄、圣女果或黄瓜。