CN109486687B - 一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用，从土壤中分离筛选得到一个微生物菌株，结合形态学特征及分子鉴定，将该菌株鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，其菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018183，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株能够明显抑制香蕉FOC发病率，提高香蕉苗生长势，具有良好的枯萎病防治效果与应用潜力。

Description

一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用。
背景技术
我国是世界上重要的香蕉生产国，2015年全国种植面积达到43.11万公顷，产量达到1264.16万吨，成为我国南方重要的农业经济产业支柱(《中国香蕉产业发展报告》，2017年)。然而，我国香蕉产业良好发展正在饱受枯萎病(尖孢镰刀菌，Fusuraum oxysporumf.sp.cubense，FOC)严峻的考验。FOC是一种土壤真菌病害，严重破坏香蕉维管束组织，导致感病香蕉苗短时间大面积死亡，极大程度上降低老百姓收入，打击果农生产积极性。
化学农药防治依然是我国香蕉枯萎病防治主要技术手段。但化学农药的使用不仅带来土壤水体的环境污染，打破整个生态系统平衡，而且通过食物链威胁人体健康。2015年，我国农业部制定了《到2020年农药使用量零增长行动方案》，提出“预防为主、综合防治”的方针和“科学植保、公共植保、绿色植保”的理念，依靠科技进步，大力推进绿色防控、环境友好型病虫害可持续治理技术体系；主要农作物病虫害生物、物理防治覆盖率达到30％以上，实现农药减量控害，保障农业生产安全、农产品质量安全和生态环境安全。
生物防治对环境无污染、无残留、对环境中有益微生物无影响，成为利国利民的首选方法，因此生物防治迎来国家政策利好，发展潜力巨大。利用土壤有益微生物抑制FOC的生长繁殖，是一种方法可行、绿色防控的技术措施。
目前，我国已经有少许香蕉枯萎病拮抗菌的研究，如，利用芽孢杆菌Bsp.6可以同时抑制FOC 1号和4号生理小种(一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用.CN201310023046)；采用灰黄青霉XJ-EP-058对香蕉FOC孢子萌芽抑制率达到10％，平均防治效果达到74.38％(一株灰黄青霉XJ-EP-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制剂与应用.CN201110396251)。然而，由于土壤微生物对环境中土壤理化性状、土壤pH值以及当地气候等敏感，导致不同香蕉产区土壤中拮抗微生物多样性差异明显，同一个菌株在大范围跨区域蕉园防治枯萎病效果差异显著。因此，适用于大规模田间应用以及不同小区域小气候的生防微生物资源依然很少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021，其菌种保藏号为CCTCC NO：M2018183，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2018年04月08日。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是
上述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021在抑制香蕉枯萎病中的用途。
一实施例中：所述抑制香蕉枯萎病为抑制香蕉枯萎病病原菌生长。
一实施例中：所述香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusuraum oxysporumf.sp.cubense(FOC)。
一实施例中：所述香蕉枯萎病的病原菌为FOC4号生理小种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是
一种包含上述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021的香蕉枯萎病抑制制剂，为HQF8021发酵液，其中的HQF 8021浓度不低于1×108cfu/mL。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是
一种上述的香蕉枯萎病抑制制剂的制备方法，将HQF 8021接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中，26～30℃，160～200rpm/min培养4～6天，至HQF 8021浓度不低于1×108cfu/mL。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是
一种上述的香蕉枯萎病抑制制剂的使用方法，将所述制剂浇淋于栽种有香蕉的土壤中，每隔4～6天浇淋一次。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明从土壤中分离筛选得到一个微生物菌株，结合形态学特征及分子鉴定，将该菌株鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，该菌株能够显著抑制香蕉枯萎病病原菌生长，对香蕉苗枯萎病盆栽防效达85％，且香蕉苗叶片深绿、长势良好，表明HQF 8021菌株能够明显抑制香蕉FOC发病率，提高香蕉苗生长势，具有良好的枯萎病防治效果与应用潜力。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明采用的香蕉枯萎病菌FOC4号生理小种。
图2为本发明实施例中的平板对峙结果(A.FOC；B.HQF 8021+FOC)。
图3为本发明的HQF 8021菌株的菌落形态(A)和分生孢子结构(B)。
图4为本发明的HQF 8021rDNA-ITS序列PCR扩增结果(泳道M：DL2000DNA Marker；泳道1～3：HQF 8021菌株PCR产物)。
图5为本发明的HQF 8021菌株基于青霉属rDNA-ITS序列的系统发育树。
图6为本发明的HQB 8021菌株对香蕉苗发病的影响，从上到下分别为CK组、FOC处理组、HQF 8021处理组。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
1、拮抗菌株的分离与筛选
(1)土壤样品的采集及香蕉枯萎病菌种
土壤取自福建漳州香蕉园。
香蕉枯萎病致病菌为FOC4号生理小种，由广东省农业科学院果树研究所提供。
(2)拮抗菌的分离
将采集后的土样自然室内晾干后破碎，过100目筛。称取1g过筛样品，加灭菌水100mL，剧烈振荡30min，依次稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL浓度梯度，充分混匀。取1mL稀释液加入冷却至约50℃的选择性培养基中，轻微摇匀，在28℃下培养3～5天，挑取不同类型的菌落，划线纯化培养。
(3)拮抗菌初筛
用打孔器(直径6mm)在已活化的病原菌平板打孔，将菌块接种于PDA平板中央，在28℃下恒温培养1天后，将分离得到的菌落点种于病原菌块四周，28℃恒温培养5天后，挑选有抑制病原菌生长效果的菌落，编号记录。
(4)拮抗菌复筛
使用平板对峙法，用打孔器(直径为6mm)分别在已活化的病原菌、初筛得到的待测菌HQF 8021打孔，分别置于同一PDA平板两侧，两菌饼相距5cm，以单独接种病原菌为对照，设3个重复。待对照菌丝长满培养皿后，观察待测菌对病原菌落的抑制情况(图2)。由图可知，该待测菌拮抗系数为Ⅱ级。
拮抗系数分级标准，根据Bell D K(1982)进行修正，分为5级：
Ⅰ级，拮抗菌占据培养皿100％，病原菌菌落萎缩；
Ⅱ级，拮抗菌占据培养皿大于2/3，病原菌菌落边缘萎缩；
Ⅲ级，拮抗菌占据培养皿大于1/3且小于2/3，病原菌停止生长，菌落边缘凹陷；
Ⅳ级，拮抗菌占据培养皿小于1/3，拮抗菌停止生长；
Ⅴ级，病原菌占据培养皿100％。
(5)菌株保藏
将筛选的拮抗菌株接种于PDA试管斜面，放置于4℃保藏。
2、HQF 8021菌株的鉴定
(1)形态鉴定
采用形态学特征观察以及rDNA-ITS序列比对分析对HQF 8021菌株进行种属鉴定。
将HQF8021菌株接种于PDA平板，28℃下培养7天，菌落直径55～72mm，其形态特征如图3A。菌落形态较大，平坦或近于平坦，外观干燥，不透明，质地疏松，呈现绒毛状，菌丝体初为白色，成熟后逐渐变为黄绿色、暗绿色；期间分生孢子大量产生且易脱落，分生孢子面呈暗绿色，渗出液缺乏，反面近于无色，可溶性色素缺乏。
显微镜下HQF 8021的分生孢子形态如图3B。分生孢子梗明显，发于基质，帚状枝通常双轮生，偶有三轮生或单轮生；梗基每轮2～3个，彼此紧贴；瓶梗每轮5～8个，彼此紧密，顶部略有叉开，呈瓶状或披针状，梗颈明显；分生孢子呈椭圆形，大小约为4.0～5.0μm×3.0～4.0μm。
根据以上菌落和分生孢子形态特征，参照《真菌鉴定手册》及《中国真菌志》对比分析，HQF 8021符合青霉菌属的生长特性，初步鉴定为半知菌纲(Fungi Imperficti)壳霉目(Sphaeropsidales)杯霉科(Discellaceae)青霉属(Penicillium)。
(2)分子鉴定
以如SEQ ID No.1所示的HQF 8021菌株的基因组DNA为模板，以真菌rDNA-ITS序列通用引物如SEQ ID No.2所示的ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和如SEQ ID No.3所示的ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)作为引物，图4为PCR扩增产物电泳图；测序结果显示rDNA-ITS全序列大小为603bp。
将该序列与Genbank中相关序列进行BLAST比对，与已发表的青霉属序列相似度为100％。选择相似度高的序列，利用MEGA 5.0软件构建以青霉属ITS序列为基础的系统发育进化树(图5)，由图可知，HQF 8021菌株与草酸青霉同属一个分支，且同源性达100％。
3、草酸青霉HQF 8021的对香蕉盆栽苗枯萎病的防治
将拮抗菌株和香蕉枯萎病致病菌FOC分别接种至马铃薯葡萄糖液体培养基(广东环凯微生物科技有限公司)中，28℃，180rpm/min培养5天，至HQF 8021浓度达到1×108cfu/mL。选取长势一致的香蕉盆栽苗(香蕉苗为易感品种巴西蕉，来自漳州唯天生物科技有限公司)，采用伤根处理法接种致病菌。同时，配制土壤含枯萎病致病菌量为1×105cfu/g的土样。试验设置3个处理组：(1)HQF 8021组，即接种FOC后的香蕉苗，栽培至含有致病菌的土壤中，每隔5天浇淋50mL HQF 8021发酵菌液；(2)FOC组，即接种FOC后的香蕉苗，栽培至含有致病菌的盆栽土壤中；(3)CK组，即香蕉苗栽培于不含FOC致病菌的土壤中，清水处理。每处理设5次重复。正常水肥，盆栽种植50天后，随机取样检测，统计植株发病率，计算病情指数。
表1盆栽香蕉苗病情分级标准
Figure BDA0001911111890000061
病情指数＝∑(发病数×级数)×100/(调查总株数×最高病级)
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)*100/对照病情指数
表2 HQF 8021菌株对香蕉枯萎病盆栽试验的防治效果
Figure BDA0001911111890000062
结果表明，HQF 8021菌液对香蕉苗枯萎病盆栽防效达85％，病情指数为15(表2)。HQF8021菌液处理的香蕉苗，叶片深绿，长势良好，外观特征与清水处理的CK组无明显差异(图6)。
由表3可知，HQF 8021菌株发酵液处理后，香蕉苗生长没有受到FOC影响，其生长势达到CK组水平。其中，株高、茎周长、侧根体积等三项指标，HQF 8021组与CK组没有显著差异。其叶面积与根体积甚至优于CK组。与FOC组相比，HQF 8021菌株处理的香蕉苗生长势差异显著(P<0.05)。由此可以看出，HQF 8021菌株发酵液明显抑制香蕉FOC发病率，提高香蕉苗生长势，具有良好的枯萎病防治效果。
表3 HQF8021菌株处理对香蕉苗生长势的影响
Figure BDA0001911111890000071
注：同列不同字母代表差异性显著(P<0.05).
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种抑制香蕉枯萎病的草酸青霉菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)
<400> 1
ggaagtaaaa aaacgtaaca aggtttccgt aggtgaacct gcggaaggat cattaccgag 60
tgagggccct ctgggtccaa cctcccaccc gtgtttatcg taccttgttg cttcggcggg 120
cccgcctcac ggccgccggg gggcatccgc ccccgggccc gcgcccgccg aagacacaca 180
aacgaactct tgtctgaaga ttgcagtctg agtacttgac taaatcagtt aaaactttca 240
acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 300
gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc 360
cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgccctcaag cacggcttgt gtgttgggct 420
ctcgcccccc gcttccgggg ggcgggcccg aaaggcagcg gcggcaccgc gtccggtcct 480
cgagcgtatg gggcttcgtc acccgctctg taggcccggc cggcgcccgc cggcgaacac 540
catcaatctt aaccaggttg acctcggatc aggtagggat gcccgctgaa cttaagcata 600
tca 603
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (8)

1.一种草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021，其菌种保藏号为CCTCC NO：M2018183。
2.权利要求1所述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021在抑制香蕉枯萎病中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述抑制香蕉枯萎病为抑制香蕉枯萎病病原菌生长。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusuraum oxysporum f.sp.cubense。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述香蕉枯萎病的病原菌为FOC4号生理小种。
6.一种包含权利要求1所述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021的香蕉枯萎病抑制制剂，其特征在于：为HQF 8021发酵液，其中的HQF 8021浓度不低于1×108cfu/mL。
7.一种权利要求6所述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021的香蕉枯萎病抑制制剂的制备方法，其特征在于：将HQF 8021接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中，26～30℃，160～200rpm/min培养4～6天，至HQF 8021浓度不低于1×108cfu/mL。
8.一种权利要求6所述的草酸青霉Penicillium oxalicum HQF 8021的香蕉枯萎病抑制制剂的使用方法，其特征在于：将所述制剂浇淋于栽种有香蕉的土壤中，每隔4～6天浇淋一次。
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