CN105255742B - 一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用，本发明从连作平邑甜茶的健康根系中经人工分离、筛选得到一株内生草酸青霉菌A1。本发明的菌株，生长速度快，孢子大量繁殖，能够在短时间内占据大部分的生存空间，对引起苹果连作障碍的主要有害菌(腐皮、层出、串珠和尖孢)—镰孢菌有较强的拮抗作用，对串珠镰孢菌的抑制率最高，在玉米培养基上抑制率达到80％以上，并对根皮苷有一定的降解作用，为苹果连作障碍的生物防控提供了理论依据和技术基础。

Description

一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用，属于果树栽培领域。

(二)背景技术

苹果连作障碍由来已久，病因复杂。在多数地区，与土传真菌有关的生物因素是造成连作障碍的主要原因。已报道与苹果连作障碍有关的主要致病真菌属有镰孢属、柱孢属、立枯丝核属、疫霉属和腐霉属等。不同地区、不同果园连作土壤中的致病真菌不同，有研究认为镰孢菌属真菌是引起苹果连作障碍的主要病原之一。Van Schoor研究发现在南非所有连作苹果园中土壤有害真菌镰孢属、柱孢属以及腐霉属是引起连作障碍的主要原因。

轮作、土壤化学消毒(如溴甲烷)等措施曾被用来防控苹果连作障碍。轮作是目前防控苹果连作障碍效果最好的措施之一，缺点是耗时太长，一般轮作时间不能低于三年，生产中不易推广。溴甲烷等化学熏蒸剂污染环境且对人体有害，已被禁止使用，而生物防控是利用有益菌抑制土壤中真菌的数量或干扰真菌对寄土植物侵染的一种环保型防治方法，对苹果连作障碍进行生物防治是一种前景广阔的技术措施。Shin等研究认为青霉菌可产生大量生物活性成分并对真菌，植物线虫等的生长发育可能有不同程度的抑制作用，且青霉菌Penicillium simplicissimum IFM53375.中分得的Penicillide(1-4)类化合物及其衍生物具有抗真菌活性作用，同时青霉菌分泌的青霉素对根皮苷有降解作用，而在苹果连作障碍中生防青霉菌的相关研究未见报道。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明涉及一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用；本发明从连作平邑甜茶健康根系内部分离到一株具有生防功能的内生青霉菌，通过与串珠、腐皮、尖孢和层出病原镰孢菌的对峙试验探讨其生防机理，用于苹果连作障碍的防控，具有重要的理论和实践意义。

本发明首先分离得到一株内生青霉菌。

一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌，来源于连作平邑甜茶的健康根系，经人工分离、筛选得到。该菌株鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，命名为内生草酸青霉A1，菌落平坦，菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子梗顶端形成扫帚状的分枝，分生孢子椭圆形，光滑。

一株内生草酸青霉A1(Penicillium oxalicum)，已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名：A1；保藏号：CGMCC No.11111；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所；邮编:100101。

本发明还对内生草酸青霉A1的功能进行了验证：一方面提供了内生草酸青霉A1在PDA和玉米粉培养基上与腐皮、层出、串珠和尖孢镰孢菌的对峙试验结果，说明内生草酸青霉A1对引起苹果连作障碍的主要镰孢属真菌(腐皮、层出、串珠和尖孢)有明显的拮抗作用；另一方面提供了内生草酸青霉A1对根皮苷的降解效果，说明内生草酸青霉A1可减轻由根皮苷引起的苹果连作障碍。

本发明分离得到的内生草酸青霉A1，生长速度快，孢子大量繁殖，能够在很短的时间内占据大部分的生存空间，对引起苹果连作障碍(腐皮、层出、串珠和尖孢)镰孢菌真菌有很强的拮抗作用，并对根皮苷有一定的降解作用，为苹果连作障碍的生物防控提供了理论依据和技术基础。

(四)附图说明

图1为内生草酸青霉A1在PDA和CA培养基上的形态特征观察；

图2为内生草酸青霉A1的典型扫帚状分生孢子形态以及分生孢子梗形态图；

图3为内生草酸青霉A1的ITS rDNA片段1％琼脂糖凝胶电泳结果图

从图中可以看出，内生草酸青霉A1的ITS rDNA片段长度约为550bp，符合常规的ITS rDNA序列长度；

图4为利用ITS rDNA同源性序列和邻接法构建的该菌株的系统发育树

从图中可以看出内生草酸青霉A1与青霉属的遗传进化距离最近；

图5为内生草酸青霉A1的β-tubulin片段1％琼脂糖凝胶电泳结果图

从图中可以看出，内生草酸青霉A1的β-tubulin片段长度约为500bp，符合常规的β-tubulin序列长度；

图6为利用β-tubulin同源性序列和邻接法构建的该菌株的系统发育树

从图中可以看出内生草酸青霉A1与青霉属的遗传进化距离最近；

图7为内生草酸青霉A1在PDA培养基上与腐皮、层出、串珠、尖孢镰孢菌的对峙试验

说明：内生草酸青霉A1对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，在PDA培养基上菌丝生长抑制率分别为42.0％、74.0％、47.0％、54.5％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级

图8为内生草酸青霉A1在玉米粉培养基上与腐皮、层出、串珠、尖孢镰孢菌的对峙试验；

说明：内生草酸青霉A1对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，在玉米粉粉培养基上菌丝生长抑制率分别为60.5％、82.2％、68.4％、53.4％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级。

图9为根皮苷含量的标准曲线

说明：根据六种不同根皮苷浓度的系列外标溶液建立的根皮苷浓度和吸光度回归方程(见图9)，得出培养液中根皮苷的浓度。

(五)具体实施方式

本发明所涉及的培养基及组分如下：

1.PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至45℃左右时，分别加入2.5mL链霉素和1.25ml青霉素，将培养基倒入培养皿凝固。

2.PD培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至45℃左右时，分别加入2.5mL链霉素和1.25ml青霉素。

3.CA培养基：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min。

4.无机盐培养基(MBM)：NH4NO₃1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，(NH₄)2SO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

5.玉米粉培养基：玉米粉10g，水20ml，121℃高压灭菌20min，备用。

实施例1

内生青霉菌的分离纯化

将连作平邑甜茶的根系做同样的表面消毒后分成两份，一份不进行研磨作为对照培养。如果没有任何菌落长出，证明植物根系表面消毒彻底，从而证明分离得到的真菌是植物的内生真菌而不是空气中的或组织块表面附生菌。

在无菌条件下，将另一份连作平邑甜茶的根系剪成1cm长的小段，置于浓度为75％的酒精中浸泡1min后，无菌水冲洗2-3次；然后再放入浓度为0.1％的升汞中1min(或放入浓度为2％的NaClO溶液中0.5min)，无菌水冲洗4-5次，用滤纸吸取多余的水分。向吸取多余水分后的根系加入无菌水研磨，研磨后的根系研磨液分别稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个梯度；涂布后平板培养，每个梯度重复3～5次(即每个梯度的根系研磨液涂布3-5个平板)；根据各个平板上菌落的形状、大小、干湿、颜色、质地、表面、边缘及透明度8个表型特征挑取青霉菌的单菌落，转接到新的PDA平板中纯化。若分离出多个不同的青霉菌菌落，需要再次挑取青霉菌的单菌落转接到新的PDA平板中纯化，如此反复直到得到纯的青霉菌落。

通过根系研磨液的平板稀释涂布法，从其中发现了一株具有高抑菌活性的真菌，在它的周围其它菌很难生长，从而形成其特定的“势力范围”。对该菌进行平板划线分离纯化，得到一株内生青霉菌(见图1)。

实施例2

内生青霉菌的鉴定

1.菌落特征和菌体形态特征

(1)菌落特征

在PDA平板上，菌落平坦或近于平坦，质地绒状，菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子易脱落，分生孢子结构大量产生，分生孢子面深橄榄绿色；渗出液缺乏；反面近于无色；可溶性色素缺乏。在CA平板上，菌落平坦，菌落周围有一圈白色菌丝，质地绒状，菌丝体白色，分生孢子易脱落，分生孢子结构大量产生，分生孢子面深绿色；渗出液缺乏；反面近于无色；可溶性色素缺乏(见图1)。

(2)菌体形态特征

显微镜下观察菌株的菌丝体，营养菌丝有隔膜，分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝通常双轮生，偶有三轮生或单轮生；梗基每轮2-3个，13-20×3.2-3.7um，彼此通常较紧贴；瓶梗每轮5-8个或更多，10-15×2.5-3.2um，幼龄时呈现瓶状或披针状，充分成熟时近圆柱状，梗颈通常明显；分生孢子典型的椭圆形，4.5-5.5×3.0-4.0um，壁平滑；分生孢子链圆柱状(见图2)。

2.ITS rDNA序列及同源性分析

提取内生青霉菌的基因组DNA，以提取到的DNA为模板，PCR扩增真菌rDNA-ITS全序列。PCR引物为上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(如SEQ.ID.NO.3所示)，下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(如SEQ.ID.NO.4所示)；

PCR反应体系：12.5ul Taq mix、模板DNA 1.0μL、上下游引物各1.0μL、ddH₂O 9.5μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，循环34次；72℃后延伸10min，4℃保温；利用引物ITS1/ITS4扩增得到的A1菌株ITS rDNA序列长度约为550bp(图3)，符合常规的ITS rDNA序列长度，测序序列长度为588bp，其ITS rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

将内生青霉菌的的ITS rDNA测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，从结果中选取10株与测定菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，用Mega 5.05软件采取Neighbor-joining法构建系统进化树(见图4)。由图可以看出，内生青霉菌与青霉属的遗传进化距离最近，与已知菌株草酸青霉菌(Penicillium oxalicum KF152942.1)的ITS rDNA同源性达到99％。结合其菌体形态和菌落特征观察结果，将其鉴定为内生草酸青霉A1(Penicillium oxalicum)。

3.β-tubulin序列及同源性分析

为了验证ITS鉴定的准确性，又以上述提取到的内生青霉菌的基因组DNA为模板，PCR扩增真菌β-tubulin全序列。上游引物Bt2a：GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC(如SEQ.ID.NO.5所示)；下游引物Bt2b：ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC(如SEQ.ID.NO.6所示)；

PCR反应体系：12.5ul Taq mix、模板DNA 1.0μL、上下游引物各1.0μL、ddH₂O 9.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火40s，72℃延伸40s，循环30次；72℃后延伸10min，4℃保温；利用引物Bt2a/Bt2b扩增得到的A1菌株β-tubulin序列长度约为500bp(图5)，符合常规的β-tubulin序列长度，测序序列长度为504bp，其β-tubulin的DNA序列如SEQ.ID.NO.2所示。

将A1菌株的β-tubulin测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，从结果中选取9株与测定菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，用Mega 5.05软件采取Neighbor-joining法构建系统进化树(见图6)。由图可以看出，A1菌株与青霉属的遗传进化距离最近，与已知菌株草酸青霉菌(Penicillium oxalicum KC344990.1)的β-tubulin同源性达到99％。结合其菌体形态和菌落特征观察结果，将其鉴定为内生草酸青霉A1(Penicillium oxalicum)。

实施例3

内生草酸青霉A1与四种镰孢属真菌的拮抗作用

1.平板对峙试验

试验所用串珠、腐皮、尖孢和层出镰孢属真菌是本课题组植保学院于金凤教授于2013年在环渤海湾地区的连作果园土壤及感病苹果植株上分离得到并保存的。

(1)将培养好的内生草酸青霉A1和串珠、腐皮、尖孢和层出镰孢属真菌，分别用直径0.5cm的打孔器打取成直径为0.5cm的菌饼。

(2)将内生草酸青霉A1与串珠、腐皮、尖孢和层出四种镰孢属真菌菌饼分别同时接入PDA培养基和玉米粉培养基(培养皿直径9cm)，内生草酸青霉A1分别与串珠、腐皮、尖孢和层出镰孢菌组成四个试验组进行对峙试验，即1组为内生草酸青霉A1与串珠镰孢菌；2组为内生草酸青霉A1和腐皮镰孢菌；3组为内生草酸青霉A1和尖孢镰孢菌；4组为内生草酸青霉A1和层出镰孢菌；每个试验组中两菌饼(如A1和层出镰孢菌)相距5cm；每个试验组处理重复3次，28℃恒温培养；对照组为四种镰孢属真菌(串珠、腐皮、尖孢和层出镰孢菌)和内生草酸青霉A1在PDA上的单独培养物，28℃恒温培养；试验组和对照组培养7d后分别测量培养得到的菌落直径，并观察记录内生草酸青霉A1的抑制作用。

(3)一直观察到对照组中真菌菌落覆盖满满培养皿，测量并记录处理真菌菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-对峙菌落直径)/对照菌落直径]×100％

培养7d后，采用拮抗指数评价竞争作用强弱。拮抗指数分级标准为去掉参考文献(Bell et al.,1982)：

Ⅰ级，青霉菌菌丝占据平皿100％，真菌菌落萎缩；

Ⅱ级，青霉菌菌丝占据平皿大于2/3，真菌菌落边缘萎缩；

Ⅲ级，青霉菌菌丝占据平皿大于1/3，小于2/3，真菌停止生长，菌落边缘凹陷；

Ⅳ级，青霉菌菌丝占据平皿小于1/3，青霉菌停止生长；

Ⅴ级，真菌占据平皿100％。

2.内生草酸青霉A1的拮抗能力

试验组中将内生草酸青霉A1与四种病原镰孢菌同时接入同一培养皿中对峙培养，结果见表1。从结果中可以看出，供试的内生草酸青霉A1对四种镰孢属真菌的生长都有一定的抑制作用，且抑制作用有显著性差异。与串珠镰孢菌的对峙试验结果表明，在PDA和玉米粉培养基上均表现为内生草酸青霉A1对串珠镰孢菌的抑制率较高，在玉米粉培养基上抑制率达到80％以上，与PDA培养基上的抑制率有显著性差异。培养7d后，测量内生草酸青霉A1对串珠镰孢菌的拮抗系数，内生草酸青霉A1对串珠镰孢菌的拮抗系数为Ⅰ级，即能够将串珠镰孢菌覆盖(表1)。将内生草酸青霉A1和串珠镰孢菌接入培养皿中后，内生草酸青霉A1的分生孢子大量产生，迅速将串珠镰孢菌包围，内生草酸青霉A1与串珠镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，内生草酸青霉A1的菌丝在两者接触后继续生长，直到菌丝长满全皿。

与腐皮镰孢菌的对峙培养结果表明，内生草酸青霉A1对腐皮镰孢菌也存在一定的抑制作用，在PDA和玉米粉培养基上抑制率均达到50％以上，在两种培养基上抑制率差异不显著。培养7d，测量内生草酸青霉A1对腐皮镰孢菌的拮抗系数，内生草酸青霉A1对腐皮镰孢菌的拮抗系数为Ⅱ级，即不能将腐皮镰孢菌全部覆盖(表1)。将内生草酸青霉A1和腐皮镰孢菌接入培养皿中后，内生草酸青霉A1的生长速度快于腐皮镰孢菌，两菌落接触后，在两菌落交界处出现一条透明的抑菌带(图7)。

表1内生草酸青霉A1对四种镰孢菌的抑制率

与层出镰孢菌的对峙培养结果表明，在玉米粉培养基上内生草酸青霉A1对其抑制率较高，达到了68.4％，与PDA培养基上的抑制率有显著性差异。内生草酸青霉A1对层出镰孢菌的拮抗系数达到Ⅰ级，即将层出镰孢菌的菌落全部覆盖(表1)。内生草酸青霉A1与层出镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，内生草酸青霉A1的菌丝在两者接触后继续生长，直到铺满整个培养皿(图8)。在PDA培养基上，内生草酸青霉A1对层出镰孢菌的抑制率达到了42％，拮抗系数达到Ⅱ级，内生草酸青霉A1与层出镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，内生草酸青霉A1的菌丝在两者接触后继续生长，内生草酸青霉A1的菌丝占领层出镰孢菌的生长空间(图7)。

与尖孢镰孢菌的对峙培养结果表明，在玉米粉培养基上内生草酸青霉A1对其抑制率较高，达到了60.5％，与PDA培养基上的抑制率有显著性差异。内生草酸青霉A1对尖孢镰孢菌的拮抗系数达到Ⅰ级，即将尖孢镰孢菌的菌落全部覆盖(表1)。内生草酸青霉A1与尖孢镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，内生草酸青霉A1的菌丝在两者接触后继续生长，直到铺满整个培养皿(图8)。在PDA培养基上，内生草酸青霉A1对尖孢镰孢菌的抑制率达到了47％，拮抗系数达到Ⅱ级，内生草酸青霉A1与尖孢镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，内生草酸青霉A1的菌丝在两者接触后继续生长，内生草酸青霉A1的菌丝占领尖孢镰孢菌的生长空间(图7)。

本实施例中对峙试验说明内生草酸青霉A1对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，在PDA培养基上菌丝生长抑制率分别为42.0％、74.0％、47.0％、54.5％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级，在玉米粉粉培养基上菌丝生长抑制率分别为60.5％、82.2％、68.4％、53.4％，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级。说明内生草酸青霉A1对引起苹果连作障碍的腐皮镰孢菌、层出镰孢菌、串珠镰孢菌和尖孢镰孢菌有很强的拮抗作用，对苹果连作障碍有一定的生防作用；一般的对峙试验是在PDA培养基上进行，本研究设置玉米粉培养基的对峙试验的目的是探讨一下内生草酸青霉A1在玉米粉为营养源的培养基上能否快速生长，能否继续发挥强有力的拮抗作用，为玉米粉下一步作为内生草酸青霉A1的菌肥载体提供参考依据。

实施例四

内生草酸青霉A1对根皮苷的降解能力测定

1.根皮苷标准曲线的制备

根皮苷标准使用液：取根皮苷10mg溶解于80ml的超纯水，加热使其溶解完全，将该溶液转到100ml的容量瓶中，加超纯水定容至100ml，得到浓度为0.1mg/ml的根皮苷标准使用液。分别取根皮苷标准使用液1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml和10.0ml于50ml的容量瓶中，加超纯水至50ml定容，摇匀，即得六种不同根皮苷浓度的系列外标溶液。

2.根皮苷降解能力测定

本发明中所涉及到的内生草酸青霉A1的种子液制备方法如下：

用接种环从PDA平板上刮取2环内生草酸青霉A1菌丝接种到100ml PD培养基中，28℃200r/min摇瓶培养24h作为种子液。将种子液以体积比2％的接种量接种到浓度为1000mg/L根皮苷的无机盐培养基(MBM)中，28℃200r/min摇瓶培养48h，将摇瓶培养48h后的培养液稀释50倍进行吸光度的测定，使其吸光度处于0.2～0.8之间，根据根皮苷标准曲线和建立的根皮苷浓度和吸光度回归方程(见图9)，得出培养液中根皮苷的浓度，经计算，内生草酸青霉A1对根皮苷的降解率为13.60％。同时用纱布将菌丝滤出80℃烘箱恒温烘干称重，测定添加根皮苷后内生草酸青霉A1的干重增加率。与不加根皮苷对照(MBM+A1)相比，内生草酸青霉A1的干重增加率为9.55％(见表2)。

表2内生草酸青霉A1对根皮苷的降解率及其干重增加率

Claims (3)

1.一株保藏号为CGMCC No. 11111的内生草酸青霉（Penicillium oxalicum）A1，于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其ITS rDNA 序列如 SEQ.ID.NO.1 所示；其β-tubulin 的序列如 SEQ.ID.NO.2 所示。

2.如权利要求1所述的内生草酸青霉A1在抑制引起苹果连作障碍的腐皮、层出、串珠和尖孢四种镰孢属真菌中的应用。

3.如权利要求1所述的内生草酸青霉A1在减轻由根皮苷引起的苹果连作障碍中的应用。