KR102449909B1 - 일펙스 라테우스 에이엠003 균주 및 이에 의한 농작물 병해 제어효과 및 농산업 응용 - Google Patents

일펙스 라테우스 에이엠003 균주 및 이에 의한 농작물 병해 제어효과 및 농산업 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 탄저병, 역병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 상추균핵병, 바질균핵병, 흙색썩음균핵병, 벼잎집무늬마름병의 제어효과와 식물 병원성 바이러스 및 식물 유충의 예방이 우수한 신규한 일펙스 라테우스 균주와 이의 산업적인 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 일펙스 라테우스 균주는 Irpex lacteus am003 균주로서 기탁번호가 KACC 83059BP인 균주 및 이의 산업적인 활용에 관한 것이다.

Description

일펙스 라테우스 에이엠003 균주 및 이에 의한 농작물 병해 제어효과 및 농산업 응용{Irpex lacteus am003 microorganism and crop disease control effect and agricultural industry application by the same}
본 발명은 식물 병충해 방지 효과를 가지는 일펙스 라테우스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
농작물의 탄저병과 역병, 시들음병, 균핵병, 곰팡이병, 잎짚무늬마름병 등의 주요 병해에 관한 연구 결과와 특허는 국내외적으로 아직 거의 없는 상태이다.
식물 탄저병은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 벼, 오미자, 콩, 수박, 딸기, 오이, 밤, 매화, 국화과 식물, 야채, 수목, 화초, 커피나무 등 300 여종의 농작물, 식물에 Glomerella, Colletotrichum 속에 의하여 주로 발생되고 있으며, 그 피해는 대단히 심각하다.
고추탄저병은 고추역병과 더불어 고추 생산에 커다란 저해요인 중의 하나로 5 종의 탄저병이 잎, 줄기, 가지, 종자 및 과일에 병을 일으키는데, 주로 성숙한 과일에 발생하는 과일탄저병에 의한 피해가 95 % 이상으로 가장 피해가 직접적이고 치명적이다. 탄저병은 근래 고추 재배에서 크게 문제가 되고 있으며, 푸른 과실과 붉은 과실에 모두 병을 일으키는 탄저와 주로 붉은 과실에 검은 점이 겹무늬로 생기면서 썩는 흑색 탄저가 있다.
특히, 고추탄저병(anthracnose)은 진균계의 자낭균문에 속하는 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속에 의해 발생하는데, 유묘기에는 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 고추 열매는 콜레토트리쿰 클로에오스포리오이데스(C. gloeosporioides)와 콜레토트리쿰 아큐타툼(C. acutatum)에 의해 발병된다. 이 병원균은 자낭포자와 분생포자를 형성하여 주변으로 전염시키고 균사나 분생포자 형태로 월동한다. 발병을 위한 최적 온도는 26~28℃이고 습한 환경에서 발병하기 쉽다. 탄저병은 풋고추가 생성되어 수확기까지 주로 발생하며 발생 초기에는 과실에 수침상으로 원형반점이 생기고 점차 원형으로 확대되어 간다. 병이 심하게 진전되면 담황색의 포자덩어리가 형성되어 과실이나 줄기가 말라 죽게 된다.(George N.Agrios, Plant pathology, World Science, 5th edition, p. 483-487, 2006)
상기와 같은 식물 탄저병은 다대한 농약의 처리를 통해 이루어져 왔다. 그러나, 계속적인 화학 농약의 사용은 그 동안 무차별한 남용으로 인해 농약 중독, 지하수 오염, 토양 오염, 인축에 대한 독성, 농산물 중의 잔류, 각종 병해충 및 잡초에 대한 저항성 개체 출현 등과 같은 부작용을 초래하였다. 한편, 1992년 UN 환경개발회의의 리우 선언 이후 지구 환경 보호를 위한 노력이 진행되었고, WTO가 설립되면서 환경과 무역을 연계시킨 국제 무역 다자간 협상, 즉 그린라운드가 본격적으로 진행되면서 인류에게 식량을 제공하는 농업도 환경친화적 농업으로 전환이 필요하였다. 이러한 화학 농약 사용의 문제점을 해결하기 위해 미생물 자체 또는 그 기능을 직접 및 간접적으로 이용하는 생물 농약이 최근에 주목을 받고 있다.
"생물 농약"이란 농작물의 해충 및 병원미생물, 잡초를 방제하기 위하여 자연환경에서 분리 채집된 미생물 및 천연 물질, 천적 등을 제품화한 것으로 정의하고 있다. 이러한 생물 농약은 화학 농약에 비하여 약효의 발현 및 지속기간이 길며, 농약의 개발기간 및 개발비용이 화학 농약에 비해 저렴하고, 인축에 대한 독성 및 환경파괴 등과 같은 부작용이 없다는 장점이 있다.
이에, 상기와 같은 식물 탄저병에서는 기존의 화학 농약을 사용하는 대신 생물 농약을 사용하는 시도가 이루어져 왔다. 특히, 식물탄저병의 방제를 위해 Bacillus 속 또는 Streptomycess 속에 의한 미생물 처리가 주로 이루어져 왔다.
농약의 피해를 줄이고 청정 유기농을 진행하는데 있어 Bacillus 등의 계통의 세균을 많이 검증해왔으나, 단편적인 연구에 국한되어 있었다. 이에, 제어기술의 향상과 지구생태계 미생물의 다양한 연구개발이 필요하며, 산업화의 전용단계는 아직 요원한 것으로 보인다. 더욱이 전용(專用)미생물제제의 생물농약은 아직 등록이 안 되어 있고, 시장에도 거의 없는 상태이다. 단지 몇 건의 특허와 유사 바이오 농약이 있으나, 그 효과는 미약하여 기존의 화학농약과 경쟁력이 없으며, 올바른 미생물 균형자의 개발이 아직 많이 부족하다. 대부분의 농작물은 공통적인 병원체(곰팡이 균, 세균, 바이러스 등)로 인하여 10여종 이상의 큰 병충해 질병을 갖게 되므로, 이를 바르게 대응하면, 모든 병충해는 예방 제어가 가능하다. 병충해는 특수한 조건에서 품종의 내병성, 환경, 병원균이 다 중복되는 접점에서 발생되는데, 이때 균형조정자의 역할이 중요하다. 종자, 공기, 토양, 곤충을 통하여 전파 매개되는 병원체는 미생물 균형자의 작용으로 조절이 가능한 과정이다.
이에 보다 더 정확하고 강력한 친환경 농업의 유기농을 견인할 미생물 전용 바이오 제제 즉 키스톤 미생물종과 마이크로바이옴에 대한 필요성이 중요해지고 있다. 현재 시장은 친환경 전용 바이오 농약을 고대하고 있다.
중국특허 CN 112899171 A 미국특허 US201800200224A1 한국등록특허 제10-2235096호
J. Mushrooms 2021 September, 19(3):115-125 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2021.19.3.115 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자는 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 주름버섯 강의 white rot fungi로서 바람직한 전용 미생물 농약 제제를 제공하고자 한다. 본 발명의 일측면에서, 생태계 생물권의 항상성(homeostasis)을 조절할 수 있는 균형자 미생물을 제공하고자 하며, 본 발명은 새로운 획기적인 키스톤 종의 균주를 자연계에서 분리 규명하여, 식물 탄저병을 비롯한 식물 병해의 발생을 근원적으로 치유, 예방하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 일측면은 식물 탄저병과 같이 세계적으로 900 여종의 식물에 피해를 주고 있고, 한국에서도 사과, 고추, 토마토, 마늘, 양파, 상추, 벼 등 대부분의 농작물에서 탄저병과 같이 발생되는 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 일측면은 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병 및/또는 벼잎집무늬마름병 중 어느 하나 이상을 방제할 수 있는 미생물 제제를 제공하고자 한다.
상기 9종 병해를 동시에 제어 가능한 관련특허는 전무한 상태이다. 또한, 본 발명의 일측면은 이러한 어려운 문제를 천적 방식으로 해결할 수 있고, 생태계의 균형조정자가 될 수 있는 획기적인 키스톤 종의 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 83059 BP로 기탁된 일펙스 라테우스 am003 (Irpex lacteus am003) 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 일펙스 라테우스 am003 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 일펙스 라테우스 am003 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 일펙스 라테우스 am003 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 토양의 정화 복원 방법으로 농토의 지력향상을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은 9종의 농작물 병해제어 및 식물 병원성 바이러스에 항균력을 갖는 일펙스 라테우스 am003(Irpex lacteus am003) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균계), Basidiomycota (담자균문), Agaricomycetes(주름버섯강), Polyporales(구멍장이버섯목), Meruliaceae(아교버섯과), Irpex(기계충버섯속), I.lacteus종의 목재부후균(white rot fungi)의 strain으로서 경기도 산악산림지역에서 순수분리한 신규의 야생종이며, white rot fungi균주는 목질소 분해와 약용물질의 생성, 유해독성물질의 생분해 및 토질의 개량 등에 작용이 이미 많이 알려져 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 농작물 탄저균 Glomerella sp., Colletotrichum sp. 및 고추, 토마토, 사과, 마늘, 양파, 상추, 벼 등 대부분의 농작물에서 발생되는 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주에 관한 기술로서 9종의 병해에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 30 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 탄저균은 Glomerella속 및 Colletotrichum속 탄저균, 9종 병해 병원균에서 선택된 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 ITS 1,2의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 일펙스 라테우스 am003(Irpex lacteus am003)인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 일펙스 라테우스 am003(Irpex lacteus am003) 로 KACC 83059BP인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, Glomerella, Colletotrichum 탄저균 및 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주에 관한 기술로서, 9종의 식물병해에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병 등 9종의 병해방제 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 식물은 고추, 상추, 벼, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병과 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주에 관한 기술로서, 9종의 식물 병해 제어방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병 등 9종의 병해방제 방법 외에 토양의 정화 복원방법으로 농토 토양 지력향상에 기여한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균계), Basidiomycota (담자균문), Agaricomycetes(주름버섯강), Polyporales(구멍장이버섯목), Meruliaceae(아교버섯과), Irpex(기계충버섯속), I.lacteus종의 목재부후균(white rot fungi)의 strain으로서 경기도 산악산림지역에서 순수분리한 신규의 야생종이며, white rot fungi균주는 목질소 분해와 약용물질의 생성, 유해독성물질의 생분해 및 토질의 개량 등이 이미 많이 알려져 있다. 반면 농작물의 질병제어는 아직 연구된 바가 거의 없었으나, 본 발명에서는 농작물 탄저균 Glomerella sp.와 Colletotrichum sp. 등과 사과탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추 균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병의 병원체의 병해에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 실험실과 공장에서 25℃PDA(potato dextrose agar, pda), PDB(potato dextrose broth, pdb)배지에서 용이하게 배양할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 대규모 생산이 조기에 가능하며, 사과, 고추, 마늘, 양파, 상추, 벼 등 농작물의 탄저병, 역병, 시들음병, 균핵병, 잿빛곰팡이병, 잎집무늬마름병 등의 병해에 다양하게 적용할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 전용 미생물 제제로서 친환경 및 유기농 농작물 재배에 혁신적인 기여를 할 수 있다. 전용 순수미생물제제의 천연농약 등록과 국내외 바이오 제제를 현저히 앞서가는 획기적인 친환경 농업 향상의 우수 상품이 될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 고내열성으로 고추 및 각 농사 절기상 3월초 내지 10월 사이에 시비함이 적합하다. 이는 각기 다른 농작물 절기에도 기온이 높은 경우에 더 효율적인 기능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주에 관한 기술로서, 9종 병해균의 감염부위를 선택 제어하는 균사의 복개 증식 및 감염원의 균사를 분해 사멸시켜 탄소원으로 활용하는 분자 신호전달 과정의 선택적인 물질대사를 보여준다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본원발명 실시예 1에서 대한민국 경기도 산악지역에서 분리한 균주를 PDA 배지에서 순수계대 배양 2주와 1주 후의 사진이다.
도 2는 본원발명 균주의 pdb액상배양 1주후 순수분리 사진이다.
도 3은 am003 균주의 ITS시퀀스 도면이다.
도 4a 및 4b는 본원발명 Irpex lacteus am003 균주 각 콜로니(동일배지)의 ITS서열분석 결과이다.
도 4c는 본원발명 Irpex lacteus am003 균주의 계통도이다.
도 5는 pda배지에서 Irpex lacteus am003 균주가 각 병원체를 제어하는 사진이며, 병원체(가운데 자리)와 am003균주(양측면 자리)를 접종하여 재배양시 나타난 병원체 성장억제 및 사멸과 am003의 복개(覆蓋)증식 형태 (흰부분 균사) 이다(5a 내지 5e). 구체적으로, 도 5a는 고추역병균, 잿빛곰팡이병, 상추균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다. 도 5b는 고추역병균, 고추시들음병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다. 도 5c는 벼잎집무늬마름병, 바질균핵병, 상추균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다. 도 5d는 사과탄저병, 흙색썩음균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다. 도 5e는 바질균핵병, 잿빛곰팡이병, 사과탄저병, 벼잎집무늬마름병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다. 도 5f는 Irpex lacteus am003균주를 고추화분 묘종에 접종후의 고추묘종에서 am003균주의 병원성 발생 여부를 확인한 결과이며, 묘종이 더욱 튼튼하게 성장하여 병원성이 없었음을 확인하였다. 도 5g는 Irpex lacteus am003균주를 고추화분 묘종에 접종후의 고추묘종에서 am003균주의 병원성 발생 여부를 고추식물 줄기표피를 절개하여 내부를 확인한 결과이며, 묘종이 더욱 튼튼하게 성장하여 병원성이 없었음을 확인하였다.
도 6은 노지 고추밭 시험포에서 am003 배양균주를 사용하여 무농약 청정고추생산 과정을 요약한 사진이다. 구체적으로, 도 6a는 Irpex lacteus am003의 배양균주 원액이다. 도 6b는 am003 원액 배양균주의 균사 균질화를 위한 블렌딩 작업사진이다. 도 6c는 균질화된 am003 배양균주의 200배~400배 희석과정이다. 도 6d는 균질화 및 희석된 am003 배양균주의 노지 고추밭 분무살포 준비사진이다. 도 6e는 am003 희석된 배양균주의 노지 고추밭의 분무살포 과정사진이다. 도 6f는 am003 균주의 정기적(10~20일 단위)인 투여처리에 의한 노지 고추밭의 무농약 청정고추의 생산물이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들 뿐 만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 균주는 한국 산악 산림지역에서 분리한 Irpex lacteus am003 균주이며, 상기 균주는 노지(露地)의 고추밭 시험포에서 토양 지력향상 및 탄저균을 선택적으로 제어하고 예방하는 효과를 고추생산과정에서 확인하였다. 또한, 본 발명의 균주는 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는 Irpex lacteus am003 균주에 관한 기술로서, 9종 병해균의 감염부위를 선택 제어하는 균사의 복개 증식 및 감염원의 균사를 분해사멸 시키면서 탄소원으로 재활용하는 분자 신호전달의 물질대사과정을 보여준다.
본 발명의 균주는 섭씨 121도 30분 멸균에서도 죽지 않고 살아남는 고 내열성 균주로 확인되었으며, 그러한 기능은 농작물의 고온 성숙 환경에서 탄저병을 포함하는 9종의 병해를 효율적으로 제어하는 작용으로 보고 있다.
고추역병 발병시기와 증상
고추에서 가장 피해가 큰 병해인데 탄저병과 함께 고추의 2대 병해로 꼽히고 있다. 포장 정식 직후 5월 중·하순부터 발생하여 7월의 장마 이후에 급격히 만연한다. 난균류에 속하는 Phytophthora capsici (Leonian) 곰팡이의 침입으로 병이 발생, 12종의 역병균이 알려져 있지만 앞으로 발생할 가능성이 있는 것을 포함하면 약 20여종이 된다. 역병균은 격막이 없는 실같은 균사와 여러 모양의 포자를 형성한다. 그 중 중요한 것은 분생포자인데, 원형 혹은 타원형으로 그 안에는 두 개의 헤엄털이 달린 유주자가 들어 있으며 이 유주자들이 물을 따라 유영하여 기주체에 도달, 식물체를 침입하게 된다. 작물의 생육후기에 주위환경이 악화되면 유주자는 헤엄털이 떨어져 후막화되며 서로 다른 종류의 후막포자가 결합하여 겹둥근 모양의 난포자를 형성한다. 역병균은 난포자의 형태로 토양속에서 월동하여 다음해의 전염원이 되는데 난포자는 주위환경에 대한 저항력이 대단히 강하여 토양내에서 2∼년간 생존이 가능하다. 병원균은 물과의 원천적인 관련성 때문에 다습한 곳과 약산성 토양에서 발육이 좋다.
7월초, 고추 성화초과기(盛花初果期)에 지표 1~3cm에 드러난 근경부(根莖部)의 체부가 병균의 감염을 받는다. 발병 초기에 암녹색 수침형(水浸形)의 병반이 생긴다. 병반부분은 약간 함몰된다. 발병 후기에는 점차 흑갈색으로 변해 식주와 엽신이 푸르게 마르고 고추가 시들시들해진다. 발병하고 병의 경과는 5~6일이 필요하다. 일주일 후이면 병든 그루가 완전히 말라버려 고추는 수확을 거두지 못한다.
고추역병균은 고온, 고습 환경에서는 신속하게 발병하여 병균량이 높아지고 건조하고 통풍이 잘되는 상황에서는 생존가능율이 비교적 낮아 2~4일 후에는 병원(病原)이 전부 죽는다.
사과탄저 병원균( Glomerella cingulata )
자낭균에 속하며, 주로 분생포자를 형성하나 드물게는 자낭포자도 형성한다.
분생포자는 무색 단세포이고 타원형 또는 원통형이며, 습할 때에는 담홍색을 띠며 점액이 되어 누출한다. 자낭각은 흑색, 구형 내지 후라스크형이고 그속의 자낭은 곤봉형이다. 사과 탄저병(Anthracnose)은 열매에 주로 발생하지만, 때로는 나뭇가지나 나무줄기에도 발생한다.
고추 탄저병균으로 Colletotrichum acutatum, C. cocodes, C. dematium, C. gloeosporioides 등, C. acutatum은 다범성으로 고추 뿐 아니라 사과, 배, 포도, 감, 복숭아 등 주요 과수와 많은 작물에 탄저병을 일으킨다. 생육 적온은 26~30℃정도이며 지난해에 버려진 병든 과실에서 월동한다. 과실에 형성된 병반의 크기가 1.0cm 이상이면 2차 전염원인 분생포자의 수가 수천만 개 이상이며 간혹 한 개의 병반에 1억 개 이상 형성되는 경우도 있다.
고추 - 시들음병(萎黃病)
불완전균류 총생균목에 속하는 곰팡이로 Fusarium oxysporum이다. 병원균은 다량의 소형 포자(계란 혹은 콩팥 모양, 주로 단세포)와 대형 포자(낫 모양, 3∼세포) 그리고 내구체인 후막포자를 형성한다. 배양기상 (PDA)에서 흰색의 기중균사를 많이 형성하며 잘 자라는데, 균총이 오래될수록 자줏빛의 색소를 형성하고 균핵이 많이 형성된 부분에는 진한 잉크빛을 띠기도 한다. 식물세포 조직 내부와 병든 조직 외부에 다량의 포자를 형성한다.
벼 잎집무늬마름병 (紋枯病, Sheath blight) 병원체 Thanatephorus cucumeris
토양이나 볏짚, 그루터기에서 겨울을 지난 균핵이 모내기 전 물을 대고 경운 및 써레질을 하면 물위로 떠오르게 되고 모내기가 끝나면 잎과 잎집사이에 붙게 된다.
본 병의 발생과 피해는 병원균의 밀도, 생육 기간 중의 기상조건, 특히, 온도와 습도, 비배관리와 경종적인 방법에 의하여 크게 달라진다.
병원균이 벼의 조직으로 침입 가능한 온도는 22 내지 35℃이고 최적온도는 30 내지 32℃이며, 습도는 포기사이의 습도가 96%이상의 상태로 지속되면 발병이 많아진다.
잿빛곰팡이병 (灰色黴病, Gray mold)
잿빛곰팡이병 (灰色黴病, Gray mold) 주로 하우스 풋고추 재배에서 문제로 되는 병이다. 노지재배를 위하여 냉상육묘할 경우 육묘기 초기에 어린묘에 발생하는 경우도 있다. 피해는 꽃과 과실썩음, 줄기마름 현상으로 나타난다. 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)라는 불완전균류에 속하는 곰팡이의 침입으로 일어난다. 병반에는 갈색의 분생자경이 직립 밀생하고 분생자경의 끝은 약간 부풀어져 있으며 작은 돌기가 있다.
상추균핵병(菌核病, Sclerotinia rot) 병원체 Sclerotinia sclerotiorum
병원균은 병든 식물체의 조직 및 토양내에서 균핵의 형태로 혹은 감염된 식물체내에서 균사상태로 겨울을 지난 다음, 발아하여 자낭반과 자낭포자를 형성한다.
자낭포자는 식물체의 약한 부위에 부착하여 침입하며, 균핵 및 균사체로부터 발아하여 뻗어 나온 균사가 식물체를 직접 침해하기도 한다.
습도가 높고, 기온이 15 내지 25℃의 서늘한 상태에서 병 발생이 심하다.
병원체 Sclerotinia minor 병원균은 병든 식물체의 조직 및 토양내에서 균핵의 형태로 겨울을 지내거나 감염된 식물체내에서 균사상태로 겨울을 지낸 다음, 발아하여 자낭반과 자낭포자를 형성한다.
자낭포자는 식물체의 약한 부위에 부착하여 침입하며, 균핵 및 균사체로부터 발아하여 뻗어 나온 균사가 식물체를 직접 침해하기도 한다. 습도가 높고, 기온이 15～25℃의 서늘한 상태에서 병 발생이 심하다. (시설재배작물 상추의 Sclerotinia sclerotiorum와 Sclerotinia minor에 의한 균핵병)
바질 균핵병
바질 균핵병은 포장에서 채집한 병든 잎과 줄기의 병반으로부터 병원균을 순수 분리하여 균학적인 특징과 병원성을 검정하였고, 또한 rDNA의 internal transcribed spacer (ITS) 염기서열을 분석하여 병원균을 동정하였다. 전 세계적으로 바질에 발생하는 병해는 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 탄저병(Colletotrichum gloeosporioides), 시들음병(Fusarium oxysporum), 줄기썩음병(Rhizoctonia solani), 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum), 모잘록병(Pythium ultimum)이 보고되었다(Garibaldi 등, 1997).
바질(Ocimum basilicum)은 아프리카, 열대 아시아지역이 원산지로 한국을 포함하여 유럽 등 전 세계에서 재배되는 1년생 초본으로 주로 4~5월에 파종하여 6월에 이식한다(Groom, 1992). 잎, 줄기는 건조하여 요리의 향신료로 쓰이며, 방향유는 음료, 화장품, 향수, 치약, 비누의 향기를 내는 데 이용하며(Karawya 등, 1974), 분류학적으로 Ocimum basilicum 이다.
흑색썩음 균핵병
흑색썩음 균핵병은 마늘이 연작되는 밭마늘 재배지대에서 문제가 되며, 병원균(Sclerotium cepivorum)은 토양 전염성 병원균의 일종으로 흑색의 구형 또는 편구형 균핵을 형성한다. 균핵의 크기는 보통 0.5∼0.6㎜로서 다른 균핵병의 균핵보다 매우 작다. 기주범위는 파, 양파, 쪽파 등 Allium속 식물을 침입하는데 우리나라 남부지방의 양파 재배지에도 발생하여 큰 피해를 주고 있다.
상기의 농작물의 질병들은 병원체는 대부분 곰팡이 진균류로서 농약 및 생물제제로서 제어하기가 대단히 어려운 미생물 종이며, 이러한 특성과 여건에서 본원발명은 생태계의 균형자가 될 수 있는 Keystone species의 신 균주를 찾아내어 근원적인 대책을 확립하고자 한다. 농업, 자연 생태계의 균형자로서 기능과 작용을 할 수 있는 미생물 균주를 자연계에서 찾아내어 생태 순리에 맞게 활용하고자 한다. 농업의 청정유기농 향상과 지구환경의 복원에 역할을 할 수 있을 것이다.
본원발명은 Irpex lacteus am003 균주 strain으로서 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 제어할수 있는, 질병에 획기적인 제어기능을 하는 미생물제제를 제공한다.
본원발명의 Irpex lacteus am003 은 고추 이외 대부분 농작물(감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 상추, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 등)의 탄저병과 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병의 질병에 사용가능한 미생물제제이다.
본원발명은 PDB(potato dextrose broth) 배지와 기타 조성 배지에서 배양한 본원발명 균주의 배양액 또는 멸균 처리된(121℃) 배양액을 이용한 고추 및 기타 농작물의 탄저병 등, 9종 질병감염의 제어방제 방법을 제공한다.
본원발명은 PDB 배지와 기타 조성된 배지에서 배양한 본원발명의 균주의 생균 배양액을 이용한 사과탄저병, 고추탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병을 질병의 제어방제 방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Irpex lacteus am003 배양액 생균, 그 배양액 멸균체와 배양액 생균을 원심분리한 후 순수 상등액 및 멤브레인 등의 여러 여과방식에 의한 여과를 한 후 순수 여과액 그리고 이들 여과액, 상등액, 순수배양액을 재공정하여 만든 분말, 과립, 균질화된 액상배양 희석제 등의 형태로 9종의 질병의 병충해 방제와 토양개량, 지력향상 등에 사용하는 방법과 제품을 제공한다.
본원발명은 기탁번호가 KACC 83059 BP인 Irpex lacteus am003 야생분리 신 균주 및 이를 포함한 미생물 제제를 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Irpex lacteus am003 및 이를 포함한 미생물 제제를 사전 분무 살포하는 단계를 포함하는, 고추밭 주변 별꽃 등의 풀밭 꽃노랑 총채벌레 매개충의 유충제어(am003의 특성상 유충침투 균사기능 및 균사증식으로 유충사멸)로 TSWV 감염의 근원적인 방제방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Irpex lacteus am003 및 이를 포함한 미생물 제제를 대상 식물에 공급되는 토양 및 수분 중 어느 한 곳 이상에 분무 살포하는 단계를 포함하는, 농작물 9종 질병의 예방방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Irpex lacteus am003 및 이를 포함한 미생물 제제를 분무 살포하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충을 포함한 기타 농작물의 곤충, 나방 등의 유충을 방제하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은 식물 병원성 미생물 및 식물 병원성 바이러스에 항균력을 갖는 일펙스 라테우스 (Irpex lacteus ) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균계), Basidiomycota (담자균문), Agaricomycetes(주름버섯강), Polyporales(구멍장이버섯목), Meruliaceae(아교버섯과), Irpex(기계충버섯속), I.lacteus종의 strain으로서 경기도 산악산림지역에서 순수분리한 신규의 야생종이며, 농작물 탄저균 Glomerella, Colletotrichum sp. 등과 사과탄저병, 고추역병, 고추시들음병, 흙색썩음 균핵병, 상추 균핵병, 바질 균핵병, 잿빛곰팡이병, 벼잎집무늬마름병의 병원체의 병해에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 30 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 미생물은 식물 탄저균, 식물 역병균, 식물 시들음병 유발균, 식물 균핵병 유발균, 식물 곰팡이병 유발균 및 잎집무늬마름병 유발균 중 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 탄저균은 글로메렐라(Glomerella)속 탄저균 및 콜레토트리쿰(Colletotrichum)속 탄저균 중에서 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 식물 역병균은 피토포토라(Phytophotora)속 균이고, 상기 식물 시들음병 유발균은 푸사리움(Fusarium)속 균이며, 상기 식물 균핵병 유발균은 스케로티니아(Scerotinia)속 균이고, 상기 식물 곰팡이병 유발균은 보트리티스(Botrytis) 속 균이며, 상기 잎집무늬마름병 유발균은 타나테포러스(Thanatephorus) 속 균인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 서열목록 1의 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 ITS 1 및 2의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 일펙스 라테우스 am003인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KACC 83059BP인, 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 두번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 두번째 측면에 있어서, 상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 상추, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무 및 잣나무 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 두번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 탄저병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 세번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 역병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 세번째 측면에 있어서, 상기 식물 역병은 피토포토라(Phytophotora)속 균에 의해 유발되며, 상기 식물 역병은 고추 역병인, 식물 역병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 세번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 역병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 네번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 시들음병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 네번째 측면에 있어서, 상기 식물 시들음병은 푸사리움(Fusarium)속 균 균에 의해 유발되며, 상기 식물 시들음병은 고추 시들음병인, 식물 시들음병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 네번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 시들음병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다섯번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 균핵병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다섯번째 측면에 있어서, 상기 식물 균핵병은 스케로티니아(Scerotinia)속 균에 의해 유발되며, 상기 식물 균핵병은 흙색썩음 균핵병, 상추 균핵병 및 바질 균핵병 중 어느 하나 이상인, 식물 균핵병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다섯번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 균핵병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 여섯번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 곰팡이병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 여섯번째 측면에 있어서, 상기 식물 곰팡이병은 보트리티스(Botrytis) 속 균에 의해 유발되며, 상기 식물 곰팡이병은 잿빛곰팡이병인, 식물 곰팡이병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 여섯번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 곰팡이병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일곱번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 잎집무늬마름병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 일곱번째 측면에 있어서, 상기 잎집무늬마름병은 타나테포러스(Thanatephorus) 속 균에 의해 유발되며, 상기 잎집무늬마름병은 벼잎집무늬마름병인, 잎집무늬마름병의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 일곱번째 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 잎집무늬마름병 방제용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 농작물 병충해 제어 미생물 am003 균주의 분리
주름버섯 강에 속하는 담자균은 그 종과 생태계의 기능이 여타 곰팡이에 비하여 인간의 약용과 토양복원에 밀접하고 형태적으로도 좀 더 용이하게 식별이 되는 희소한 가치를 지닌 유용 담자계통의 곰팡이 균이다. 이런 담자균을 탐색하던 중 이들의 기능이 단순한 환경정화, 약용뿐만 아니라, 병충해의 원인 병원체도 대사적으로 충분히 제어 및 생태 진화적인 연관이 되 있을 것으로 사료되었다. 대개의 경우 신규의 야생종은 인체의 구성예와 같이, 또 원석의 혼합물체와 같이 수많은 생물 종의 공생체로서 복합 복잡계 구조로 구성되어 있다. 따라서 그 순수한 특정한 종을 분리하는 것은 대단히 어려운 경우가 대부분이다.
이런 특성을 활용하여 먼저 포자 및 균사 수준에서 특정 배지 PDA 등에서 백색부후균의 자실체 형태로부터 균사, 포자분리를 200여회 이상 1년간 실시하였다. 그 후 형태적으로 순수해 보이는 균사 포자의 시작점을 확인하고, 이를 100회이상 계대배양을 통하여 그 순수성을 확보하였다.
그 분리지역은 경기도 산악산림지역에서부터 white rot fungi 흰 곰팡이에서 순수분리 하였다. 도 1은 분리된 균주의 PDA 배지에서 1 내지 2주 배양후의 사진이다.
실시예 2. am003 균주의 형태생리적 파악
상기 실시예 1에서 분리된 균주는 격막의 포자와 희고 긴 나선형의 막대모양의 균사를 가지고 있었다. 도 2를 보면 PDB 배지에서 상기 실시예 1의 균주를 1~2주 배양한 사진 및 균사의 조직사진을 확인할 수 있다. 배양초기 pda 절편은2~4일이 지나면서 엷은 균사를 이루고 7일이 경과하면서 두꺼운 균사복합체의 흰 덩어리 모양의 원형균사 돌기들을 장기간 형성한다.
이런 형태적인 변화는 병원체의 활동을 공간적으로 제어하면서 상기 실시예1에서 분리된 균주의 세포가 만드는 항균 길항물질들이 병원체의 기능을 원천 차단하는 것으로 사료된다. 상기와 같은 균사에는 격막세포가 있는데, 상기 격막세포가 식물 역병, 탄저균 등의 9종의 병해 병원체를 감지하는 신호전달 과정과 제어 길항물질을 분비하는 기능을 수행하는 것으로 파악된다.
실시예 3. am003 균주의 동정 (genomic marker인 ribosomal RNA operon에 의한 균주 동정분류)
상기 실시예 1에서 분리하고 실시예 2에서 생리형태적 특성을 파악한 균주를 동정한 결과, 주름버섯강에 속하는 Irpex lacteus의 백색부후균 strain을 가짐을 확인하였다. 구체적으로 하기와 같은 과정을 거쳤다.
경기도 산악산림지역에서 분리한 흰 곰팡이를 상기 실시예 1과 같이 순수 계대 한 후, 그 플레이트 배양배지 균주를 목원대 미생물생태자원연구소(IMER)에 분석을 의뢰하였다. ITS rRNA sequence의 분석에 의한 균주동정을 목원대 미생물생태자원연구소(IMER)에서 실시하였다.
ITS region 유전자 염기서열 분석 및 상동성 비교
Colony PCR법에 의한 ITS region 유전자 염기서열 PCR 증폭
ITS region 증폭에 사용된 Primer
ITS1(5` -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3` )
ITS4(5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3` )
PCR정제산물은 Genetic Analyzer 3730(Applied Biosystems)을 사용하여 약 558~609 bp의 ITS 1 region 염기서열을 비교 분석함.
ITS region 유전자 염기서열 상동성 검색
〔NCBI BLAST Search: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi〕
계통수 작성은 유효미생물 am003의 ITS region 유전자 염기서열을 SeqMan software(DNAStar)와 BioEdit program을 이용하여 상동성을 확인하고, MEGA 5.2 program으로 계통수를 작성함.
18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence
ITS sequence는 곰팡이 균주를 분류 동정하기 위한 universal DNA barcode marker이다. 진핵세포의 곰팡이는 일반적인 박테리아 균주의 16S rRNA 분석을 하지 않는다. 진핵세포의 곰팡이들은 공통적으로 포함하는 rRNA는 5.8S, ribosomal RNA 와 large subunit(26, 28S) ribosomal RNA를 포함하고 있으며, 이들 rRNA 들의 특정 부위의 18 S RNA 서열인 ITS(internal transcribed spacer) 1 및 2 을 분석하고 있으며 그 중에서 ITS 1 region을 비교하였다. 이는 도 3과 같다.
ITS 서열 분석을 위해, 상기 실시예 1의 곰팡이균 배양체에서 DNA를 추출한 후, ITS 시퀀스를 추적할 수 있는 universal primer를 PCR로 증폭시켜서, DNA sequence를 결정하였다(PCR 증폭→ 전기영동→ barcode sequencing→ sequence editing→ Barcode library). 그 후 그 시퀀스를 NCBI data base에 접목하여 상동성의 비교로 분류 동정을 실시하였다. 시퀀스는 DNA로 나타나지만 그 origin은 ribosomal RNA이다. 즉 ITS1, 2를 universal barcode marker로 사용하여 동정하는 것이다.
더 자세히 보면, ITS rDNA(DNA sequence that code for ribosomal RNA)를 추출하고, 여기에 관련된 PCR nucleotide(Universal primer)를 사용하여 유전자를 증폭시키고 이를 전기영동 및 해독기로 읽으면 DNA시퀀스가 나타나 그 서열을 표시한 것이 아래의 시퀀스이다.
그 다음 이 시퀀스를 NCBI data base에 접목하면 기존 균주와 상동성이 대비되어 속, 종을 추정할 수 있게 되며, 이미 표준화된 글로벌 표준 동정 분류법이다. 상기 실험에 따라 분석된 am003균주의 ITS 1 sequence는 하기 서열목록 1의 서열과 같았다.
[실시예 1 균주의 동정 분류]
서열목록 1 : ITS region sequence Irpex lacteus am003 ITS 시퀀스
Irpex lacteus am003strain 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1
GGCCTCTCACGAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTTAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAGAAAAAAATGGTGGAAGCTTCCAGGATCTCGCGAGAGGTCTTCGGTTGAACAAGCCGTTTTTCTTTCTTATGTTTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTCAACTGTGTATAACACATTTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGTATTCTCAACCCCTAAATTTTTGTAATGAAGGTTTAGCGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCCCTTGTCGGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATGGTGTTCATGCTTCGAACCGTCTCCTTGCCGAGACAATCATTTGACAATCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT
Irpex lacteus 표준균주 FD-9과 am003 균주의 재검증 과정
상기의 003균주의 its 시퀀스를 분석후, 표준균주 Irpex lacteus FD-9(서열목록2)와 분자계통학적인 비교 분석시 99.3%의 유연관계를 나타내었으며, Irpex lacteus 균주의 strain으로 동정하였다(도 4c 계통도).
서열목록 2 : ITS region sequence Irpex lacteus FD-9 ITS 시퀀스
Irpex lacteus strain FD-9 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1
GenBank: KP135026
CAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTCTCA
CGAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTTAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAGAAAAAAATGGTG
GAAGCTTCCAGGATCTCGCGAGAGGTCTTCGGTTGAACAAGCCGTTTTTCTTTCTTATGTTTTACTACAA
ACGCTTCAGTTATAGAATGTCAACTGTGTATAACACATTTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGG
CTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG
AATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGTATTCTC
RACCCCTAAATTTTTGTAATGAAGGTTTAGCGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCCCTCGCYGGTCG
ACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTG
TTGAAGTATTTATGGTGTTCATGCTTCGAACCGTCTCCTTGCCGAGACAATCATTTGACAATCTGAGCTC
AAATCAGG
상기 서열 목록 1과 순수동일성 테스트를 위한 같은 pda플레이트 배지내상의 am003균주의 균사 콜로니 2곳을 임의선정 am003 균주의 ITS 1 sequence를 분석 비교하였다.
분석 결과 서열목록 1의 균주는 도 4a 및 도 4b와 같이 ITS 1 region sequence가 100% 일치되어 균주의 순수동일성이 재확인 검증되었다.
(Internal transcribed spacer 1의 partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene 및 internal transcribed spacer 2의 complete sequence; 및 large subunit ribosomal RNA gene의 partial sequence와 동일한 것으로 거듭 확인하였다.)
이에 분리된 균주를 Irpex lacteus의 strain인 것으로 확인하였고, am003으로 명명 확인하였다. 분리된 균주의 계통도는 도 4c와 같았다.
한편, 상기 균주를 국립농업과학원에 2022년 2월 9일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KACC 83059 BP로 결정되었다.
실시예 4. am003 균주의 PDA(potato dextrose agar)배지상의 9종 식물 병원체 억제효과 확인
상기 am003이 9종(사과, 고추 탄저, 고추역병, 고추시들음, 잿빛곰팡이병, 상추균핵병, 바질균핵병, 흙색썩음균핵병, 벼잎집무늬마름병)의 식물 병해에 효과가 있는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
실험 방법은 충남 농업기술원(농진청 지역연구기관)의 표준균주 병원체와 am003균주를 각기 액상 초기배양 하였다. 그 다음 pda 고체 배양을 한 후, 고체배지의 각각 그 절편을 1~2mm로 취하여(병원체의 생균수를 제어균주 보다 약 5~10배정도 더 많은 상태로 접종), 새로운 pda 고체배지의 가운데 자리(병원체)와 양측면(am003)에 접종하였다. 25 ℃ 인큐베이터에 pda배지에서 먼저 3일~14일간 배양을 정치하면서 반응변화를 관찰하였다.
실험 결과는 도 5a 내지 5e와 같았다.
도 5a는 고추역병균, 잿빛곰팡이병, 상추균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다.
도 5b는 고추역병균, 고추시들음병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다.
도 5c는 벼잎집무늬마름병, 바질균핵병, 상추균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다.
도 5d는 사과탄저병, 흙색썩음균핵병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다.
도 5e는 바질균핵병, 잿빛곰팡이병, 사과탄저병, 벼잎집무늬마름병의 병원체와 Irpex lacteus am003균주의 상호 반응결과이다.
병원체의 표준균주와 am003 균주의 상호반응은, am003의 흰균사 증식으로 나타난 것과 같이 3일부터 14일동안 am003의 흰균사가 표준균주를 복개증식하면서 농업기술원 병원체 표준균주의 점차적인 억제 내지 사멸과 am003의 탄소원으로 활용되는 현상을 공통적으로 확인하였다.
실시예 5. am003 균주의 고추화분 묘종에서의 고추 식물체에 관한 병원성 여부확인 테스트
도 5f와 도 5g에서와 같이 고추 묘종이 심어진 화분에 pdb 액상 배양이 된 am003 균주를 106~107 cfu/ml의 농도 상태로 3~5일 단위로 5회 이상 분무하여 고추묘종의 성장 상태를 관찰확인 하였다.
실험 결과는 도 5f 및 5g와 같았다.
도 5f는 Irpex lacteus am003균주를 고추화분 묘종에 접종후의 고추묘종에서 am003균주의 병원성 발생 여부를 확인한 결과이며, 묘종이 더욱 튼튼하게 성장하여 병원성이 없었음을 확인하였다. 도 5g는 Irpex lacteus am003균주를 고추화분 묘종에 접종후의 고추묘종에서 am003균주의 병원성 발생 여부를 고추줄기 표피를 절개하여 줄기내부를 확인한 결과이며, 묘종이 더욱 튼튼하게 성장하여 병원성이 없었음을 확인하였다.
도 5f 및 5g와 같이 고추 묘종은 병원성의 현상이 전혀 없었으며, am003 균주로 인하여 더 활발한 생육상태를 나타내었다. 그 결과 am003 균주는 병원체 제어효과의 능력이 탁월하면서도 기주식물인 고추 작물에는 전혀 위해가 없음을 확인하였다. 즉 병원체에만 선택적으로 천적과 같은 방식으로 작용하는 기전을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 6. am003 균주의 노지(露地) 시험포 현장 테스트
상기 실시예 4 내지 5에서 확인한 바와 같이 실험실 단위에서 본원발명 am003 균주는 9종(사과, 고추 탄저, 고추역병, 고추시들음, 잿빛곰팡이병, 상추균핵병, 바질균핵병, 흙색썩음균핵병, 벼잎집무늬마름병)의 식물 병해에 제어효과가 있음을 확인하였다.
이에 본 발명자는 노지 밭에서 본원발명 균주가 효과가 있는지를 고추 탄저병을 surrogate probe로 하여 다음과 같이 실험하였다.
면천 노지(露地) 시험포 : 충남 당진시 면천면 자개리 603-2, (1,200m2 )
지역 기상조건: 기상청 기상자료개방포털(대전지방 기상청) 자료
일시
2021.4.26~8.26		 평균기온(℃) 일강수량(mm) 평균풍속(m/s)
2021년4월26일 14.4 0 1.4
2021년5월13일 19.5 0 1.2
2021년6월7일 20.4 0 1
2021년6월22일 22 0 1
2021년7월6일 23.7 9 0.7
2021년7월13일 26.6 0 0.8
2021년7월23일 27.8 0 0.8
2021년8월3일 26.8 0 0.8
2021년8월16일 25.5 0 0.9
2021. 4월중순부터 위 지번의 노지 고추 시험포에 도 6a 내지 6f의 사진과 같이 10~20일 단위로 정기적으로 분무 살포하였으며, 고추 묘종을 심기전에도 1회 정도 am003 배양균주를 토양에 살포하여 토양자체의 질병원 제어와 토양 지력을 향상시켰다.
이런 기상 조건에서 1 내지 3월에 실험실에서 검증된 Irpex lacteus am003 균주를 pdb 액상배지에 배양시킨 후, 수질기준이 통과된 지하수에 200배 내지 400배 희석하여 시험포의 고추열매, 잎, 줄기, 토양에 정기적으로 8~9회 분무 살포하였다(4.26~8.26).
현장 사진은 도 6a 내지 도 6f와 같았다.
도 6a는 Irpex lacteus am003의 배양균주 원액이다.
도 6b는 am003 원액 배양균주의 균사 균질화를 위한 블렌딩 작업사진이다. 도 6c는 균질화된 am003 배양균주의 200배~400배 희석과정이다. 도 6d는 균질화 및 희석된 am003 배양균주의 노지 고추밭 분무살포 준비사진이다. 도 6e는 am003 희석된 배양균주의 노지 고추밭의 분무살포 과정사진이다. 도 6f는 am003 균주의 정기적(10~20일 단위)인 투여처리에 의한 노지 고추밭의 무농약 청정고추의 생산물이다.
2021. 8.26 이후 고추를 수확하였으며, 도 6f와 같이 고추의 품질도 우수하고, 탄저병 및 기타 질병이 거의 나타나지 않음을 확인하였다. 농사절기상 묘종하기전 토양에서부터 am003 균주를 시비하고 난 후 묘종 식재를 하고, 정기적으로 분무 살포하면 화학농약이 전혀 없는 친환경 순수미생물로서 청정 농산물을 생산할 수 있음을 거듭 관찰하였다. 또한 화학농약이나, 일반 생물농약은 독한 악취도 심각한 문제인데, am003 균주의 순수미생물 제제는 농토에 분무 살포시 아주 좋은 향기가 퍼지는 것도 추가적인 농사효과로서 좋은 기능으로 확인되었다.
농업생명공학연구원 KACC83059BP 20220209
<110> LEE, sunggie LEE, seongho <120> Irpex lacteus am003 microorganism and crop disease control effect and agricultural industry application by the same <130> DP-2022-0066 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 1 region sequence of am 003 <400> 1 ggcctctcac gaggcatgtg cacgcctggc tcatccactc ttaacctctg tgcactttat 60 gtaagagaaa aaaatggtgg aagcttccag gatctcgcga gaggtcttcg gttgaacaag 120 ccgtttttct ttcttatgtt ttactacaaa cgcttcagtt atagaatgtc aactgtgtat 180 aacacattta tatacaactt tcagcaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg 240 cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 300 gcaccttgca ctccttggta ttccgaggag tatgcctgtt tgagtctcat ggtattctca 360 acccctaaat ttttgtaatg aaggtttagc gggcttggac ttggaggttg tgtcggccct 420 tgtcggtcga ctcctctgaa atgcattagc gtgaatctta cggatcgcct tcagtgtgat 480 aattatctgc gctgtggtgt tgaagtattt atggtgttca tgcttcgaac cgtctccttg 540 ccgagacaat catttgacaa tctgagctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag 600 catatcaat 609 <210> 2 <211> 638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 1 region sequence of Irpex lacteus FD-9 <400> 2 caaggtttcc gtaggtgaac ctgcggaagg atcattatcg agttttgaac gggttgtagc 60 tggcctctca cgaggcatgt gcacgcctgg ctcatccact cttaacctct gtgcacttta 120 tgtaagagaa aaaaatggtg gaagcttcca ggatctcgcg agaggtcttc ggttgaacaa 180 gccgtttttc tttcttatgt tttactacaa acgcttcagt tatagaatgt caactgtgta 240 taacacattt atatacaact ttcagcaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac 300 gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 360 cgcaccttgc actccttggt attccgagga gtatgcctgt ttgagtctca tggtattctc 420 racccctaaa tttttgtaat gaaggtttag cgggcttgga cttggaggtt gtgtcggccc 480 tcgcyggtcg actcctctga aatgcattag cgtgaatctt acggatcgcc ttcagtgtga 540 taattatctg cgctgtggtg ttgaagtatt tatggtgttc atgcttcgaa ccgtctcctt 600 gccgagacaa tcatttgaca atctgagctc aaatcagg 638

Claims (27)

  1. 식물 병원성 미생물 및 식물 병원성 바이러스에 항균력을 갖고, 기탁번호가 KACC 83059BP인, 일펙스 라테우스 (Irpex lacteus ) am003 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 30 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식물 병원성 미생물은 식물 탄저균인, 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 균주.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 식물 탄저균은 글로메렐라(Glomerella)속 탄저균 및 콜레토트리쿰(Colletotrichum)속 탄저균 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열목록 1의 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 18S의 ITS 1의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 상추, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무 및 잣나무 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병 방제 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 식물 탄저병 방제용 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
KR1020220038674A 2022-03-29 2022-03-29 일펙스 라테우스 에이엠003 균주 및 이에 의한 농작물 병해 제어효과 및 농산업 응용 KR102449909B1 (ko)

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