MX2007008234A - Una nueva cepa de trichoderma atroviride, un medio de cultivo conteniendola, asi como la utilizacion de dicha cepa en particular como estimulante de la germinacion y/o del crecimiento de las plantas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere esencialmente a una nueva cepa de Trichoderma atrovide, a un clon resultante de esta nueva cepa, un ascomiceto que posee las características de esta nueva cepa, un medio de cultivo conteniéndola, un concentrado deshidratado y un polvo a base de esta nueva Trichoderma atrovide, las utilización de esta última, en particular como estimulante de la germinación y/o del crecimiento de las plantas y/o como agente de biocontrol, así como a su procedimiento de aislamiento.

Description

Una nueva cepa de Trichoderma atroviride, un medio de cultivo conteniéndola, asi como la utilización de dicha cepa en particular como estimulante de la germinación y/o del crecimiento de las plantas La presente invención se refiere esencialmente a una nueva cepa de Trichoderma atroviride, a uno o más clones resultantes de esta nueva cepa, un ascomiceto que posee las características de esta nueva cepa, un medio de cultivo, un concentrado deshidratado, un polvo a base de este nuevo Trichoderma atroviride, las utilizaciones de este último, en particular como estimulante de la germinación y/o del crecimiento de las plantas y/o como agente de biocontrol, así como a su procedimiento de aislamiento .

La clase Trichoderma es un grupo agronómicamente importante ya que incluye hongos que son agentes de biocontrol cuyo método de acción fue objeto de numerosos trabajos. Recientes estudios describen en efecto una capacidad de este hongo filamentoso para intervenir según distintos mecanismos: micoparasitismo, antagonismo (competición) , antibiosis (producción de antibióticos), estímulo de raíz, estímulo del crecimiento por solubilidad de minerales fertilizantes, estímulo de las defensas naturales de las plantas, etc.

Los hongos de la clase Trichoderma pertenecen al filo Ascomycota, clase de los Ascomicetos, a la familia de los Hypocreales. Son hongos microscópicos de los cuales existen especies terrestres y especies marinas. Se encuentra en las maderas en descomposición, los residuos vegetales y en todos los suelos (humus forestales, tierras agrícolas) (de 10 a 10000 propagules/g en los suelos moderados o tropicales). Colonizan las raíces de las plantas herbáceas y arboladas sin ningún daño. Además este hongo puede penetrar en las raíces y favorecer el desarrollo, la nutrición y la resistencia a las enfermedades. La especie atroviride es una de las especies corrientes de Trichoderma .

La colonización de las raíces por Trichoderma sp. puede aumentar el crecimiento y el desarrollo de las raíces, el rendimiento de los cultivos, la resistencia a la tensión abióticos y la absorción y la utilización de los nutrientes (Harman G.E. y cois., Nature Reviews/Microbiology, 2, 43-56, 2004) .

Cuando existen, los efectos de estímulo de crecimiento proceden de la acción directa del Trichoderma sobre las plantas y no están directamente vinculados a antagonismos con los patógenos. Estos efectos son visibles tanto sobre substrato de cultivo no desinfectado como sobre substrato estéril. Los mecanismos de estimulo de crecimiento son mal aclados y podrían ser debidos a la supresión de los daños oxidativos sobre las raíces, a la secreción de factores de crecimiento por la cepa, a la inhibición de la microflora torpe y a la mejora del transporte de los micronutrientes .

Los efectos son desiguales según las cepas. Algunas cepas poseen efectos estimulantes de crecimiento pero otros tienen efectos inhibidores (por ejemplo, Trichoderma viride RF1, J.G. Menzies, Plant Pathology, 42, 784-791, 1993) .

Las patentes FR2700542 y FR2780972 divulgan distintas alquil-lactonas producidas por las cepas de Trichoderma harzianum 1-1235 e 1-1536 para la primera patente e 1-1571 para la segunda y capaces de estimular la germinación y el crecimiento. La patente US6753295 presenta una mezcla de peptaiboles y alquil-ciclopentanonas producidos por el T. harzianum SK-5-5 (NIBH 13327) que estimula el crecimiento y la defensa de las plantas. El recurso a la fusión de protoplastos de 2 cepas mutantes permitió a A. Sivan y G.E. Harman (J. Gen . Microbiol., 137, 23-29, 1991) de producir una nueva cepa de Trichoderma harzianum 1295-22 (ATCC 20847) cuya competencia en la rizosfera se mejora y que favorece el crecimiento del maíz del 66% con relación al testigo no tratado (Bjórkman y cois., J. Am. Soc. Hort., 123, 35-40, 1998) .

Las propiedades antagónicas del Trichoderma se documentan mejor que las propiedades estimulantes. El potencial antagónico del Trichoderma frente a numerosos hongos patógenos del suelo de las plantas se descubrió en los años treinta ( eindling R. , "Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi", Phytopathology, 22, 837-845, 1932) . La aplicación más evidente es la contención biológica en agricultura (biocontrol) , incluso en agricultura biológica donde el Reglamento (CE) n° 2092/91 prevé esta utilización.

Los investigadores observaron muy pronto que las propiedades antagónicas varían significativamente de una especie a otra, y en una misma especie, de una variedad a otra.

El uso de Trichoderma como antifungico en agricultura comenzó a desarrollarse en 1976 con la lucha contra Botrytis cinérea de la vid (documento SEPPIC FR2345921 (30/03/1976), Trichoderma viride Bisby) . En consecuencia, aparecieron aplicaciones contra otros numerosos hongos patógenos tales como Armillaria mellea, Stereum purpureum, Ceratocystis ulmi, Pythium ultimum et Sclerotinia sclerotiorum et Eutypa lata: - Ricard J. GB1573850 (12/09/1977), cepa 1-030, Trichoderma viride Bisby, propriedades antifungicas contra diversas enfermedades, incluso B. cinérea , - Papavizas G. US4489161 (25/10/1982), cepa T-1-R9, T. viride Pers. ex S.F. Gray, agente de biocontrol del Fusarium oxysporum del crisantemo, - Merlier O. y cois. - ORSAN FR2545099 (28/4/1983), cepa 1-223 / ATCC 20672, Trichoderma harzianum Rifai, uso de la cepa o de peptidos ( trichorzianines ) producidos por la cepa para luchar contra Botrytis cinérea, Stereum purpureum , Ceratocystis ulmi y Sclerotinia, - Harman G. EP0285987, cepa 1295-22 (T-22) / ATCC 20847, Trichoderma sp., cepa obtenida por fusión de protoplastos destinada a la protección de las semillas contra las enfermedades del suelo, - Speakman J.B. y cois. - BASF EP0383201 (16/02/1989), cepa 35/84 / IMI 311756 / DSMZ 5067, Trichoderma sp., fungicida para las semillas en particular contra Pythium - Elad Y. - PERI DEVELOPMENT APPLICATION EP0466133 (12/07/1990), cepa T-39 / 1-952, Trichoderma harzianum, antagonista de Botrytis cinérea y Sclerotinia sclerotiorum compatible con varios fungicidas químicos - Monte Vasquez E. - Universidad de Salamanca W09716974 (07/11/1995), cepas IMI 352940, IMI 352941, CECT 20179 y CECT 20178, respectivamente tres T. harzianum Rifai y un T. viride Pers . , agentes de biocontrol contra las enfermedades de las plantas - Besnard O. - B2B WO2005068609 (07/01/2004), cepas 1-1571 y 1-3151, dos T. harzianum Rifai, agentes de lucha contra las enfermedades de la madera de la vid en particular Eutypiose y ESCA Las especies más frecuentemente utilizadas como agentes de biocontrol, son T. harzianum Rifai, G. viride Persoon y Trichoderma polysporum .

La capacidad de T. harzianum para producir metabolitos antifungicas , incluidos compuestos volátiles, explica bien este uso. Las quitinasas, glucanasas y proteasas liberadas por este Trichoderma deterioran las paredes de los hongos patógenos sin alterar las células de las raices de las plantas. Los metabolitos antibióticos, tales los peptaiboles (por ejemplo, tricorcianinas ) , actúan en sinergia con las enzimas para atacar los hongos patógenos. T. harzianum se desarrolla al contacto de las raices y los coloniza superficialmente sin ningún daño.

Se pudo demostrar que Trichoderma virens coloniza las raíces del algodón e inhibe el crecimiento de Macrophomina phaseolina (putrefacción de las raíces) aportado por el suelo (Howell C.R., Plant disease, 87, 4-10, 2003). El micoparasitismo de Pythium ultimum por T. atroviride es un fenómeno activo que se produce directamente sobre la superficie de las semillas y raíces de pepino. El micoparasitismo es un principio esencial del biocontrol que no excluye la participación de la competición trófica, del empleo del espacio, del antibiosis y del estímulo de las defensas de la planta (Lu Z. et al, Appl. Environ. Microbiol., 70, 3073-3081, 2004).

Se indicó la- capacidad particular del Trichoderma para destruir sustancias tóxicas y se propuso el uso de Trichoderma en biorremedio {Véase. Lynch J. documento WO03045596 (23/11/2001), T. harzianum para el biorremedio de los suelos contaminados por el cianuro y los hidrocarburos) . Se recuerda, con carácter informativo, que el biorremedio es un conjunto de técnicas que consisten en aumentar la biodegradación o la biotransformación, inoculando microorganismos específicos (bioaumento) o estimulando la actividad de poblaciones microbianas indígenas (biostimulation ) por contribución de nutrientes y por ajuste de las condiciones de medio (potencial de oxirreducción, humedad) . Esta capacidad particular de destrucción de las sustancias tóxicas, permite al Trichoderma destruir las toxinas secretadas por los hongos y asi proteger las plantas de los ataques de hongos fitopatógenos . La eutipina, el 4- hidroxibenzaldehido y el ácido 3-fenilláctico son fitotoxinas producidas por las cepas que causan la Eutipiosis y el ESCA, enfermedades de la madera de la vid. El Trichoderma puede deteriorar estas toxinas, y algunas cepas las metabolizan completamente (Christen D. y cois., J. Agrie. Food Chem . , 53, 7043-7051, 2005). Los Trichoderma pueden resistir a los venenos y más concretamente a los antifúngicos desvirtuando las moléculas por oxidación.

La protección de las plantas por el Trichoderma sp. se establece a través de numerosos mecanismos. Todos los Trichoderma no son equivalentes ya que un buen agente de contención biológica debe ser un buen colonizador y un buen antagonista pero debe también ser compatible con la rizosfera y con las plantas.

Resultó de manera sorprendente que la cepa de Trichoderma atroviride que se aislara y purificara según la invención posee excelentes propiedades estimulantes de crecimiento, propiedades antagónicas útiles en agricultura asi como una gran estabilidad en cuanto a la viabilidad.

La cepa y los clones de Trichoderma atroviride aislados y purificados por el depositante, se depositaron ante las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos (BCCM™) /Micoteca de la Universidad Católica de Lovaina (MUCL) , el 3 de mayo de 2004, bajo el número BCCM™/MUCL 45632; este organismo siendo reconocido a autoridad de depósito internacional según lo dispuesto en el Tratado de Budapest. Esta nueva cepa se denominará, en lo sucesivo, Trichoderma atroviride MUCL 45632 o, más simplemente, MUCL 45632.

En consecuencia, uno de los objetos de la invención son la cepas de Trichoderma atroviride depositadas en la Micoteca de la Universidad Católica de Lovaina bajo la referencia BCCM™/MUCL 45632.

Esta cepa de Trichoderma atroviride MUCL 45632 posee los siguientes aspectos de cultivo: - sobre medio PDA (Agar Dextrosa de Patata) , aparece rápidamente, en dos días aproximadamente, un talo corto translúcido que se vuelve blanco el tercer día con la aparición de los conidioforos; este micelio corto transfiere al verde muy oscuro al cabo de cinco días, señal de una esporulación intensa y el envés del cultivo es incoloro; - sobre medio MA (Agar Malta) , su desarrollo es ligeramente diferente y característico de la especie Trichoderma atroviride, el micelio forma los círculos concéntricos de esporulación verde intensa alrededor del punto de inoculación con un talo que sigue siendo translúcido hasta el final del cultivo; el aspecto microscópico es el mismo sobre los dos medios de cultivo, se ramifican mucho los conidióforos con células conidiógenas (fialidas) dispuestas en verticilo por 2 ó 3, dichas fialidas son ampolliformes , rectas o curvadas, de dimensiones 2,5 a 3 µ??? por 8 a 14 µ?t? y las conidias reunidas en la cumbre de la fialida, son globulosas de pared lisa, de color verde y miden alrededor de 3 µp? de diámetro; - dicha cepa se desarrolla entre 12 °C y 36 °C con un grado de crecimiento entre 20 °C y 25 °C sobre los medios gelosados clásicos de tipo PDA, MA, OA (Agar Harina de Avena) .

Otro objeto de la invención es un Ascomiceto como se deposita en la Micoteca de la Universidad Católica de Lovaina bajo la referencia BCCM™/MUCL 45632.

Otro objeto de la invención es un clon de Trichoderma atroviride obtenido a partir de la nueva cepa según la invención.

Tal clon puede ser obtenido por reproducción del hongo o por mutación. Obviamente, tal clon podrá implicar secuencias genéticas suplementarias, introducidas por manipulación genética, permitiendo por ejemplo conferir una resistencia a algunos fungicidas y/o antibióticos o sobrexpresión de una o más proteínas. Tal secuencia suplementaria podrá introducirse, por ejemplo, en la fusión de protoplastos con ayuda de vectores (vectores de expresión, vectores recombinando, transíeccion) bien conocidos como plásmidos o cósmidos .

Un objeto de la invención es también un medio de cultivo de Trichoderma atroviride BCC ™/MUCL 45632 que incluye al menos un Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632 y al menos un substrato, especialmente un substrato de origen vegetal y más concretamente un substrato rico en poliholósidos como el almidón, la hemicelulosa o la celulosa.

Preferiblemente, este medio de cultivo incluye al menos un diluyente mineral inerte.

De manera preferida, este diluyente se selecciona específicamente para diluir y/o ventilar dicho medio de cultivo, por ejemplo, se elige dicho diluyente en el grupo constituido por las arcillas calcinadas en granos como la atapulgita, las bolas de arcilla sopladas, los polvos de rocas volcánicos como la puzolana o la piedra pómez, la perlita expandida, la vermiculita expandida y la lana de roca.

Preferencialmente , el medio de cultivo según la invención incluye al menos un elemento mineral útil al crecimiento del Trichoderma atroviride como nitrato, amonio, ortofosfato, potasio, magnesio, calcio o un oligoelemento .

Según un método de realización preferido, este medio de cultivo incluye un ácido, preferiblemente mineral, permitiendo mantener el pH del medio entre 2 y 4 y preferiblemente entre 2,7 y 3,3.

Otro objeto de la invención es un concentrado deshidratado de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632, especialmente en forma de polvo.

La invención tiene también por objeto un método de obtención de un polvo a base de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632, dicho método incluyendo las etapas de fermentación del medio de cultivo según la invención, de deshidratación a baja temperatura, eventualmente seguidas de una etapa de trituración.

La invención tiene también por objeto un polvo susceptible de ser obtenido por el método antes citado.

Otro objeto de la invención se refiere a la utilización de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632 como estimulante de la germinación y/o del crecimiento de las plantas.

La invención tiene también por objeto la utilización de Trichoderma atroviride BCCM™/ UCL 45632 como agente de biocontrol, en particular, contra los hongos patógenos de las plantas .

Conviene señalar que, por lo que se refiere a las dos utilizaciones antes citadas, Trichoderma atroviride BCCM™/ UCL 45632, podrá administrarse, entre otras cosas, directamente bajo una forma conveniente y más concretamente en forma de polvo. Este polvo podrá ser el hongo en bruto pero preferiblemente el polvo se obtendrá mediante el método de obtención antes citado, es decir, después de fermentación del medio de cultivo antes citado, deshidratación a baja temperatura, luego trituración.

Otro objeto de la invención consiste en un método de aislamiento de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632, incluyendo las siguientes etapas sucesivas: a) toma de un extracto del hongo Trichoderma atroviride en un medio adecuado como un suelo cultivado o no cultivado, sobre las plantas o en la madera en descomposición resultante de cepa de vid, rama o tronco de árbol, b) dilución del extracto tomado con agua estéril, c) cultivo de este extracto sobre al menos uno medio selectivo, estando dicho medio selectivo comprendido incluso por un grupo constituido por: el medio MA2 (Agar Malta 2%) y el medio RB-S-F (McFadden y Sutton) , d) Trasplante de los hongos Trichoderma atroviride resultantes de esporas aisladas en placas de Petri llenas con medio PDA (Agar Dextrosa de Patata) , e) Cultivo de los hongos replantados en una estufa en 25°C durante una duración incluida entre dos y cinco días, preferentemente entre tres y cuatro días, f) Identificación, mediante una observación microscópica realizada sobre un fragmento de micelio tomado después de la etapa anterior y previamente coloreado con un colorante azul algodón al lactofénol, de hongos Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632.

La descripción enumerada a continuación tiene por objeto exponer la invención de manera suficientemente clara y completa, en particular, con ayuda de ejemplos, pero el alcance de la protección no debe considerarse como limitado a los métodos de realización particulares y a los ejemplos presentados.

Ejemplo de extracción de Trichoderma atroviride MUCL 45632 Según un método preferencial la extracción de Trichoderma atroviride MUCL 45632 se realiza a partir del suelo.

Las extracciones se efectúan hasta 30 a 40 cm de profundidad, correspondiendo a la rizosfera, con ayuda de utensilios previamente desinfectados con alcohol. La tierra asi recogida se filtra sobre tamiz de 2 mm. con el fin de eliminar los grandes restos (piedras, restos de raíz y hojas). Las muestras de tierra se secan a 25 °C durante 3 días. A continuación se utilizan inmediatamente para la búsqueda del hongo de la clase Trichoderma.

La extracción es realizada por la técnica de las "suspensiones-dilución". Ello consiste en poner 10 g de cada muestra en 90 mi de agua destilada estéril, luego a agitar durante 30 minutos. Este extracto corresponde a la suspensión madre. Las series de diluciones de la suspensión madre pueden llegar hasta el dilución 10~6. No es útil ir más lejos en los diluciones ya que los suelos erial no son extremadamente ricos en Trichoderma .

En este ejemplo el cultivo se realiza sobre dos tipos de medios selectivos: Medio MA2 (Agar Malta 2%) extracto de malta 20 g Agar 20 g Agua 1000 mL Medio RB-S-F (Me Fadden y Sutton) KH2P04 1 g MgS04, 7H20 0,5 g Peptona 5 g Glucosa 10 g Rosa de Bengala 17 mg sulfato de estreptomicina 30 mg Agar 20 g Agua 1000 mL Formol agregado después de la 0, 2 mL esterilización Dos series de placas de Petri reciben respectivamente volúmenes de 1 mL de las diluciones 10~4, 10~5 y 10"6 de cada muestra. Los medios selectivos se ponen en sobrefusión a 45 °C sobre los depósitos de liquido en cada serie de placas de Petri.

La homogeneización es hecha manualmente por un movimiento circular de las cajas. Las cajas se dejan bajo la campana extractora a flujo laminar hasta su completo endurecimiento. Se colocan a continuación en una estufa a 25 °C y se observan diariamente hasta la aparición de los micelios sin confluencia.

Aislamiento monoesporal y identificación A partir de los micelios no confluentes aparecidos sobre los dos medios de selección, se trasplantan solamente los hongos resultantes de esporas aisladas en placas de Petri con medio PDA (Agar Dextrosa de Patata) luego se cultivan las placas en una estufa a 25 °C.

PDA (Agar Dextrosa de Patata) Extracto de patatas 1000 mL glucose 20 g agar 20 g Después de 3 a 4 días de cultivo, cuando las hifas han comenzado a cubrir la superficie de la caja, se procede a su identificación por observación microscópica por la técnica de la cinta adhesiva: Bajo una campana extractora a flujo laminar, la cara pegajosa de un pequeño pedazo de cinta adhesiva transparente se aplica ligeramente sobre el micelio con el fin de recuperar algunos fragmentos. La cinta adhesiva se deposita sobre una cuchilla resbalón sobre la cual previamente se puso una gota de colorante azul algodón al lactofenol. Se pone otra gota de colorante sobre la cinta adhesiva luego él se coloca una lámina arriba. La observación del montaje se efectúa bajo microscopio a los aumentos 100 ó 400.

Colorante azul algodón al lactofenol 50 mg de azul algodón (o azul de metilo, acid blue 93, C.I. n° 42780) disuelto en 100 mi de lactofenol de Amann (25 g de fenol puro cristalizado disuelto por calor en 25 mi de agua destilada, 25 g de ácido láctico 85 % y 50 g de glicerol anhidro) Gracias a este método, se identificara la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632. Resultó que esta cepa posee propiedades especialmente ventajosas, en particular, en cuanto a la competición con los patógenos, la viabilidad, la resistencia a los venenos, etc.

Identificación genética de Trichoderma atroviride MUCL 45632 La técnica empleada para la identificación genética de la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632 fue el triplete de los espaciadores internos transcritos 1 y 2 (ITS 1 y 2) . Esta técnica, ampliamente extendida y frecuentemente utilizada, permite caracterizar algunas especies animales o vegetales en función de la variabilidad genética de estas secuencias. En este caso concreto, el triplete de los ITS 1 y 2 de esta nueva cepa permitió confirmar que pertenecía a la especie Trichoderma atroviride debido a la identidad de sus secuencias nucléotidicas ITS con las de otros Trichoderma atroviride (como las cepas ATCC 36042, n° de acceso (Genbank) de la secuencia del ITSs: AF278796) .

Identificación bioquímica de la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632 y comparación con otras Trichoderma Identificación bioquímica Las cepas de Trichoderma pueden ser identificadas y comparadas cultivándolas sobre distintos medios y en distintas condiciones. El análisis se hace según dos criterios: el aspecto de los micelios y el efecto del medio de cultivo (inhibición o estímulo del crecimiento y/o de la esporulación de las cepas). Los cultivos duran 12 días. Las condiciones de cultivo utilizadas para la comparación son: (1) medio PDA a 25 °C (Agar Dextrosa de Patata Sigma 39 g/L) (2) medio mínimo a 4 °C, (glucosa 5 g/L + peptona 5 g/L + Mg S04, 7 H20 0,5 g/L + KH2P04 1 g/L + Rosa de Bengala 25 mg/L + agar 15 g/L) (3) medio mínimo a 25 °C (idem) (4) medio mínimo a 37 °C (idem) (5) medio mínimo con 1 % glucosa a 25 °C (la glucosa a 5 g/L del medio mínimo es aumentada a 10 g/L) (6) medio mínimo con 1 % etanol a 25 °C (la glucosa a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por etanol a 10 mL/L) (7) medio mínimo con 1 % ácido cítrico a 25 °C (la glucosa a 5 g/L del medio mínimo es reemplazado por ácido cítrico a 10 g/L) (8) medio mínimo con 1 % ácido láctico a 25 °C (la glucosa a 5 g/L del medio mínimo es reemplazado por ácido láctico a 10 g/L) (9) medio mínimo con 0,2 % glicina a 25 °C (la peptona a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por glicina a 2 g/L) (lO)medio mínimo con 0,2 % oxalato de amonio a 25 °C (la peptona a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por oxalato d' amonio a 2 g/L) (11) medio mínimo con 1 % oxalato de amonio a 25 °C (la peptona a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por oxalato de amonio a 10 g/L) (12) medio mínimo con 0,2 % de urea a 25 °C (la peptona a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por urea a 2 g/L) (13) medio mínimo con 0,2 % de nitrito de sodio a 25 °C (la peptona a 5 g/L del medio mínimo es reemplazada por nitrito de sodio a 2 g/L) (14) medio mínimo con cristal violeta a 10 mg/L a 25 °C (15) medio mínimo con cristal violeta a 50 mg/L a 25 °C (16) medio malt-sulfato de cobre a 25 °C a la luz (extracto de malta 10 g/L + CuS04, 5 H20 200 mg/L + agar 15 g/L) (17) medio malta-sulfato de cobre a 25 °C a la oscuridad (ídem) (18) medio Czapek-amonio a 25 °C (sacarosa 30 g/L + NaNÜ3 3 g/L + K2HP04 1 g/L + MgS04, 7 H20 0,5 g/L + KC1 0,5 g/L + FeS04, 7 H20 10 mg/L + (NH4)2S04 5 g/L + agar 15 g/L) (19) medio nitrito-sacarosa a 25 °C (sacarosa 10 g/L + NaN02 2 g/L + agar 15 g/L) (20) medio glicerol-nitrato a 25 °C (glicerol 5 mi/ L + NaN03 3g/L + agar 15 g/L) perfil bioquímico de la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632 resumido en el cuadro siguiente. Medio de cultivo Velocidad de Aspecto de la crecimiento esporulación (1) medio de referencia PDA Muy veloz verde intenso 25°C Velocidad de crecimiento Aspecto de Medio de cultivo con relación al medio PDA la esporulación con relación al medio PDA (2) medio mínimo 4°C Muy lenta ausente (3) medio mínimo 25°C Aminorada muy ligeramente Verde intenso a beige (4) medio mínimo 37°C Ausencia de crecimiento Ausencia de esporulación (5) medio mínimo 1% glucosa 25 Aminorada Mas débil °C (6) medio mínimo 1 % etanol 25 Micelio mas extenso pero Mas débil °C menos denso (7) medio mínimo 1 % acido Micelio menos denso ausente cítrico 25 °C (8) medio mínimo 1 % acido Ligeramente aminorada Mas débil láctico 25 °C (9) medio mínimo 0,2 % glicina Ligeramente aminorada Mas débil 25 °C (10) medio mínimo 0,2 % Ligeramente aminorada igual oxalato d' ammonio 25 °C (11) medio mínimo 1 % oxalato Muy aminorada ausente d' ammonio 25 °C (12) medio mínimo 0,2% urea 25 Micelio mas extenso pero Mas débil °C menos denso (13) medio mínimo 0,2% nitrito Micelio mas extenso pero Igual de sodio 25 °C menos denso (14) medio mínimo 10 mg/1 Muy aminorada igual cristal violeta 25 °C (15) medio mínimo 50 mg/1 Muy aminorada ausente cristal violeta 25 °C (16) medio malta-sulfato de Micelio menos denso igual cobre luz 25 °C (17) medio malta-sulfato de Micelio menos denso igual cobre oscuridad 25 °C (18) medio Czapek-amonio 25 °C Micelio mas extenso menos Un poco mas denso en parte central débil (19) medio nitrito-sacarosa 25 Micelio mucho menos denso Mucho mas °C débil (20) medio glicerol-nitrato 25 Micelio mucho menos denso Mucho mas °C débil El perfil es único. Está influenciado por el genero, la especie y la variedad del hongo. Permite identificar específicamente cada cepa de hongo Trichoderma.

Comparación con varias cepas de Trichoderma : En este ejemplo, las cepas de Trichoderma estudiadas son : - MUCL 45632 ( T. atroviride, identificado por el triplete de los ITS-1 y caracterizado con pruebas bioquímicas ; cepa aislada por la solicitante en un suelo erial) CNCM 1-1571 ( T. atroviride, identificado por el triplete de los ITS-1, Patente FR2780972) - T-39 (CNCM 1-952) (Trichoderma harzianum Rifai, identificado por el triplete de los ITS-1, Patente EP0466133) - T-22 (1295-22, ATCC 20847) {Trichoderma harzianum Rifai, identificado por el triplete de los ITS-1, Patente EP0285987) - TV1 (Nixe 13602A) ( T. harzianum, identificado por el triplete de los ITS-1, cepa del producto commercial Agribiotec, Italia) Nixe 00401A ( T. atroviride, identificado por el triplete de los ITS-1, cepa aislada por la solicitante en un cultivo de hongo Pleurotus ostreatus) Nixe 30301E (Trichoderma sp., cepa aislada por la solicitante en un cultivo sin suelo de Allium porum) Control de las semejanzas de aspecto de las colonias sobre placas de Petri: Las cajas obtenidas con cada condición de cultivo se comparan de dos en dos. Para cada condición de cultivo, asigna la nota 1 cuando dos cepas dan colonias de aspecto similar para una condición de cultivo dada. Cuando el aspecto es diferente, la nota es 0. Hay 20 pruebas de cultivo en total. Para cada par, se añade el conjunto de las notas. La nota máxima es 20.

Ejemplos: nota 7/20 - se encuentra la cepa 1-1571 7 veces asociada con la cepa MUCL 45632, es decir dan colonias de aspecto similar en siete condiciones de cultivo diferentes; nota 0/20 - no se asocia nunca la cepa T-39 a la cepa MUCL 45632.

Cuadro de puntuaciones comparadas de las semejanzas de aspecto (sobre 20) : MUCL 45632 7 1-1571 0 0 T-39 0 0 6 T-22 1 1 18 4 TV1 5 15 1 0 2 00401A 0 2 5 11 5 2 30301E La cepa MUCL 45632 se vincula con las cepas 1-1571 (7/20) y 00401A (5/20) . Las cepas 1-1571 y 00401A son cercanas (15/20) . Estas 3 cepas son T. atroviride, genéticamente cercanas como eso fue confirmado por triplete de los ITS-1 (INRA Versailles), pero todavía son diferentes y diferenciables .

Las cepas T. harzianum T-39 y TV1 son muy cercanas una del otra (18/20) lo que sugiere un origen común. La cepa 30301E, aislada de un cultivo de Allium porum, no secuenciada, es próxima a la cepa T- 22 y en consecuencia de un Trichoderma harzianum . Las cepas T-39, TV1, T-22 y 30301E forman a otro grupo de tipo T. harzianum en el seno del cual las cepas T- 22 y T-39 se distinguen bien entre ellas.

Control del efecto de los medios sobre las cepas: Para cada condición de cultivo, las cepas se compararon para los efectos de estimulo o inhibición por los medios de cultivo e intensidad de esporulación . Las variaciones de crecimiento y esporulación se consideran con relación a la referencia: medio PDA a 25°C. Hay 20 pruebas de cultivo en total. Para cada condición de cultivo, asigna la nota 1 a un par cuando el comportamiento es idéntico y 0 cuando el comportamiento es diferente .

El cuadro siguiente recapitula todas las asociaciones realizadas. Como anteriormente, la nota total corresponde a la suma de las respuestas para cada par. La nota máxima es 20.

Cuadro de las notaciones comparadas del efecto de los medios (sobre 20 ) : MUCL 45632 12 1-1571 7 9 T-39 7 7 13 T-22 7 8 13 9 TVl 11 13 9 8 11 00401A 6 8 9 8 8 10 30301E Las notas son medias y cercanas unas a las otras. Esta prueba pone de manifiesto que las cepas son todas Trichoderma sp.r pero diferentes unas de otras. Las cepas MUCL 45632, 1-1571 y 00401A forman a un grupo heterogéneo y las cepas T-39, T-22 y TVl otro grupo heterogéneo. Las cepas TVl y 00401A pueden acercarse.

Media geométrica de las notaciones de las pruebas: La media geométrica de las notas de cada uno de los pares permite distinguir claramente las cepas entre ellas. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de las dos notas obtenidas anteriormente.

Cuadro de las medias geométricas de las notaciones comparadas de los aspectos de colonias y efectos de los medios: MUCL 45632 9 1-1571 0 0 T-39 0 0 9 T-22 3 3 15 6 TV1 7 14 3 0 5 00401A 0 4 7 9 6 4 30301E Los resultados muestran una reagrupación de las cepas por especie, pero no hay nunca identidad completa en un par.

Las cepas 1-1571 y 00401A son bastante cercanas. Lo mismo ocurre con las cepas T-39 y TVl .

La cepa G. atroviride MUCL 45632 se distingue claramente de todas las otras y más concretamente de las cepas T. harzianum Rifai .

Condiciones de cultivo del hongo Trichoderma atroviride MUCL 45632 Elección del método de cultivo En el medio natural, los hongos son microorganismos que se desarrollan sobre substratos sólidos y húmedos. Para la producción industrial, existe dos opciones: el cultivo sumergida en medio liquido o aéreo sobre medio sólido. La elección puede hacerse, en particular, a partir de nuestras pruebas en laboratorio y de los trabajos de G.A. Muñoz, y cois. ( FEMS Microbioloqy Letters, 125, 63-70, 1995) y de A. Durand. (Les colloques de l'INRA, 18, 263-277, 1983 y Biofutur, 181, 41-43, 1998) .

El cultivo debe dar un producto concentrado que conserva bien su actividad. Las formas de conservación de Trichoderma atroviride son las conidioesporas y las clamidoesporas . El micelio no sobrevive mucho tiempo a la desecación y a la falta de nutrientes.

Las pruebas de cultivo sumergido en medio liquido en fermentador agitado, en coctelera o citocultor no permiten una buena producción de esporas en medios específicos de los hongos. El hongo T. atroviride se desarrolla en superficie y esporula mal. El cultivo en medio líquido da esencialmente el micelio y las clamidoesporas. Las esporas de T. atroviride obtenidas en medio líquido tienen paredes finas e incompletas. Son menos resistentes a la tensión a pesar de su riqueza en trehalosa. Su poder germinativo disminuye al menos de 15% después de 45 días de almacenamiento bajo una humedad relativa (HR) del 75% (aw 0,75). Estas son absorbentes y poco adherentes. Son poco resistentes a las fuertes dosis de UV. Las esporas cultivadas en medio líquido obran recíprocamente más fácilmente con el medio (agua y nutrientes) lo que permite una respuesta rápida con un tiempo de germinación más corto que para las esporas aéreas. Pero eso las vuelve también mucho más sensible a los deterioros.

El cultivo sumergido en medio liquido no se adapta bien a la producción del hongo Trichoderma .

El cultivo sobre medio sólido reproduce las condiciones naturales. Se adapta a los hongos filamentosos, en particular, Trichoderma. Para desarrollarse, los hongos necesitan aire y de una humedad sin exceso, contrariamente a las bacterias y las mejores condiciones están del aire húmedo que contiene 61 al 94% de humedad relativa (a„ de 0,61 a 0,94) . Estas condiciones, poco favorables a los contaminantes bacterianos que necesitan una elevada humedad (aw 0,91 a 1,0), permiten trabajar con medidas de esterilidad simplificadas.

Los estudios estructurales y bioquímicos ponen de manifiesto que las esporas de G. atroviride son de mejor calidad en cultivo en medio sólido. Ofrecen una mayor resistencia a la tensión y se mantiene plenamente su viabilidad durante 45 días de almacenamiento bajo una humedad relativa del 75% (aw 0,75) . Además, son capaces de resistir a fuertes dosis de UV, lo que parece ser en relación con el grosor de su pared y con los pigmentos verde oscuro que se encuentran a la superficie de las esporas. El Índice de trehalosa de las esporas aéreas es más escaso que el de las esporas sumergidas (0,5% contra un 5,6% según G.A. Muñoz, 1995, supra) . Aunque la trehalosa es conocida como agente estabilizador de las esporas, no parece jugar sobre la calidad de las esporas sumergidas y la subida del índice de trehalosa es más la característica de una tensión en el cultivo que una ventaja particular de conservación. Las esporas aéreas presentan un estado durmiente natural que las vuelve resistentes.

Las pruebas ponen de manifiesto que los niveles de producción por unidad de volumen pueden ser más importantes en medio sólido que en cultivo sumergido.

El principal inconveniente que presenta el cultivo en medio sólido sobre grandes volúmenes es la regulación de la temperatura ya que durante su crecimiento, los microorganismos producen el calor metabólico que no puede ser evacuado por circulación del medio de cultivo. Sin embargo, la inserción de superficies de intercambio de calor en la cama de cultivo y el desglose de la masa de substrato permiten el control de la temperatura y evitan la muerte del hongo por recalentamiento.

La producción de esporas en medio sólido conduce a mejores productos con un mejor rendimiento pero pide un equipamiento de manutención más complejo que en medio líquido. El rendimiento y la calidad de las esporas son criterios esenciales en la producción de G. atroviride MUCL 45632 y así se prefiere el cultivo en medio sólido a en medio liquido, a pesar de los problemas vinculados a la manipulación de los sólidos.

Método operatorio para la producción del Trichoderma en termentador en medio sólido El medio de cultivo está constituido esencialmente por un substrato de origen vegetal rico en poliholosidos como el almidón, la hemicelulosa y la celulosa. Este substrato podrá constituirse de manera no restrictiva, de semillas de cereales (cebada, avena) o leguminosas (soja, altramuz, habas), de subproductos de la industria de los cereales (salvado de cereales, gérmenes de trigo, cascos de arroz), de hogazas de extracción de oleaginosas (girasol, algodón) , de residuos de la industria del azúcar y la industria del almidón (pulpa de remolacha, bagazo de caña de azúcar), paja o virutas de madera. El substrato vegetal debe machacarse groseramente para formar una masa permeable al agua y al aire.

A las sustancias vegetales, se podrán añadir diluyentes mineral inertes destinados a diluir y ventilar el medio. Estos diluyentes podrán elegirse de manera no restrictiva entre las arcillas calcinadas en granos (atapulgita) , sopladas las bolas de arcilla, los polvos de rocas volcánicas (puzolana, piedra pómez) , la perlita expandida, la vermiculita expandida, la lana de roca.

El medio podrá complementarse con elementos minerales útiles para el crecimiento de la hongo: nitrato, amonio, ortofosfato, potasio, magnesio, calcio y oligoelementos .

El pH se acidificará ventajosamente con ayuda de un ácido preferiblemente mineral, como el ácido cloridrico, el ácido sulfúrico u ortofosfórico, entre pH 2,7 y pH 4 y preferiblemente entre 2,7 y 3,3.

Un medio de cultivo especialmente conveniente está compuesto por : Medio Pulpa de remolacha Pulpa de remolacha deshidratada 25,7 kg Perlita expandida 25,7 kg Acido sulfúrico 92 % 1,2 kg Agua 47,4 L Este medio es mezclado cuidadosamente, luego es desinfectado por calefacción a 100 °C durante 2 horas directamente en el fermentador. El pH final después de enfriamiento es próximo a 3.

El medio es sembrado en frió con ayuda de una suspensión de espora de T. atroviride en el agua estéril titulando entre 106 y 107 esporas/mL. El volumen de suspensión utilizado es 10 1 para 100 kg de medio desinfectado. La fermentación dura de 2 a 3 semanas. El termentador es alimentado en aire estéril con un gasto constante de 12 L/mn para 100 kg de medio. La temperatura del medio se mantiene entre 12 y 35°C, preferiblemente por debajo de 34 °C, de manera especialmente preferida de 20 a 25°C. Al final de cultivo la concentración en esporas viables alcanza de 1 a 5.109 esporas viables/g. El substrato fermentado se deshidrata a continuación a baja temperatura antes de machacarse para obtener el polvo. El tamaño de los granos que compone este polvo es variable. Se podrá preparar un polvo fino (granulometria inferior a 100 µp?) o un polvo más grueso (diámetro medio de 1 a 3 mm. ) , en función de los usos.

Este polvo podrá dispersarse, previamente a su administración, en un liquido tal como el agua, luego se aplicará por pulverización o aspersión sobre las partes aéreas y/o las raíces de las plantas.

Alternativamente, este polvo puede incorporarse directamente en el apoyo de cultivo de las plantas antes o después de la plantación .

Alternativamente, este polvo puede mezclarse al mantillo o se depositará sobre cualquier otro apoyo de cultivo, entonces se depositará la mezcla al pie de la planta.

Según un método de realización especialmente preferido, el polvo se filtra y/o se tamiza con el fin de retirar las partículas grandes. A continuación, el polvo así filtrado puede incorporarse en la tierra o en el mantillo, como previamente mencionado, o aplicarse directamente sobre el follaje de las plantas que deben tratarse. Obviamente, este polvo fino podría dispersarse y también ser aplicado sobre las plantas por aspersión .

Los polvos antes citados podrán tener distintas utilizaciones. Podrán, en particular, aplicarse a las plantas con fines fitosanitarios . Tal aplicación puede encontrar un interés, en particular, en la contención biológica y, en particular, la lucha contra algunos hongos patógenos.

Según un método de realización especialmente preferido, estos polvos podrán utilizarse para estimular la germinación y/o el crecimiento de las semillas y/o de las plantas. En efecto, se obtuvieron excelentes resultados para tales utilizaciones.

Estudio de la estabilidad de conservación de las esporas de MUCL 45632 a temperatura ambiente La estabilidad de la viabilidad es una propiedad notable de la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632.

En las condiciones habituales de fabricación, el hongo MUCL 45632 se multiplica sobre un substrato de cultivo sólido. Después del periodo de fermentación, el substrato encargado en esporas se seca a baja temperatura. El producto terminado deshidratado contiene alrededor un 8,5% (peso) de esporas de hongo. La viabilidad de las esporas de la cepa MUCL 45632 en el producto terminado se estudió sobre varios lotes de producción de prueba durante varios meses. Las esporas viables se cuentan según la norma NF ISO 7954. Los resultados se obtuvieron sobre 5 lotes sucesivos en las mismas condiciones de producción.

Los lotes se almacenaron a temperatura ambiente (de 18 a 28 °C) , a la luz natural y en bolsos transparentes sellados.

Esporas viables por gramo de producto seco: Duración del almacenamiento lotes (fecha 0 mes 1 mes 2 meses 3 meses 4 meses producción) B26 (verano 2005) 3,0. ??" 2,8. 10' 1,6. 10' 1,0. 10' 2,3. ,10" B27 (verano 2005) 2,0. ??' 1,5. 10' 1,6. 10' 2, 6. 10" 1,0. B28 (otoño 2005) 1,4. 10" 2,5. 10' 1,9. 10' 2, 6. 10' 2,1. o" B29 (otoño 2005) 2,0. 10s 1,5. 10' 1,9. 10' 2,3. 10' 3,0.lo""""' B30 (otoño 2005) 3,2. 10' 2,6. 10' 2,2. 10' 1,6. 10" 1,0. 'ios Medio 2,3. 10' 2,2. 10' 1,8. 10' 2,0. 10' 1,9. 10' desviación típica 0,7. 10" 0, 6. 10' 0,3. 10' 0, 6. 10' 0,8. Yo5' Los lotes conservan todos una viabilidad superior o igual a 109 esporas/g después de 4 meses. Por término medio, la concentración en esporas viables no cambia durante los 4 meses de observación .

El producto terminado a base de T. atroviride MUCL 45632 conserva toda su viabilidad durante al menos 4 meses sin astucia, contrariamente a productos similares que reclaman un almacenamiento en refrigerador o en congelador o la adición de reguladores osmóticos.

La estabilidad de la viabilidad de la cepa MUCL 45632 es una propiedad especialmente notable que responde a las demandas de los usuarios que buscan productos que se pueden transportar y almacenar sin riesgo de pérdida a temperatura ambiente y sin el problema de respeto de la cadena de frió.

Efecto de la temperatura sobre el crecimiento de la cepa MUCL 45632 Los hongos Trichoderma se utilizan en la rizosfera o sobre el follaje de las plantas. Se someten a temperaturas variables. Es importante conocer la gama de temperaturas de crecimiento y es preferible que ésta sea lo más amplia posible.

El estudio del efecto de la temperatura consiste en poner tapones miceliales de Trichoderma sobre placas de Petri gelosadas con PDA. Las cajas se depositan a continuación en incubadoras a 4, 14, 20, 25, 30 y 37 °C. El cultivo dura 15 días. A continuación, se les observa para comparar su estado de desarrollo y esporulación .

En este ejemplo, las cepas de Trichoderma estudiadas son: MUCL 45632 (G. atroviride, identificado por el triplete de los ITS-1 ; cepa aislada por la solicitante en un suelo erial) T-39 (CNCM 1-952) {Trichoderma harzianum Rifai, identificado por el triplete de los ITS-1, Patente EP0466133) T-22 (1295-22, ATCC 20847) ( T. harzianum Rifai, identificado por el triplete de los ITS-1, Patente EP0285987) - Nixe 30301E {Trichoderma sp., cepa aislada por la solicitante en un cultivo hidropónico de Allium porum) Inra AP {Trichoderma sp . , colección Mme Dubos, INRA, UMR Salud Vegetal, Villenave d'Ornon, Francia) - Inra APS {Trichoderma sp., colección Mme Dubos, INRA, UMR Salud Vegetal, Villenave d'Ornon, Francia) Inra Bll {Trichoderma sp colección Mme Dubos, INRA, UMR Salud Vegetal, Villenave d'Ornon Francia) Inra Pl {Trichoderma sp. colección Mme Dubos, INRA, UMR Salud Vegetal, Villenave d'Ornon Francia) Notación del crecimiento y de la esporulacion a diferentes temperaturas : temperatura de incubación Cepa 4 °C 14 °C 20 °C 25 °C 30 °C 37 °C MUCL 45632 0 2 2 2 2 0 T-39 0 1 1 2 2 0 T-22 0 1 1 2 2 0 0 1 1 2 2 2 AP 0 1 2 2 2 0 APS 0 1 2 2 2 0 BU 0 1 2 2 2 0 Pl 0 1 2 2 2 0 Notación: 0 no hay crecimiento; 1 crecimiento del micelio; 2 crecimiento y esporulacion La esporulacion de la cepa MUCL 45632 es muy intensa a 20°C, lo que corresponde a su grado de crecimiento. A 14 °C, su desarrollo es correcto pero su esporulacion no es máxima. A 4 °C, el micelio no se desarrolló pero no se murió. En efecto, una vez el tapón picado de nuevo sobre PDA y puesto a incubar a 20 °C, este último crece muy bien. Por el contrario a 37 °C, el tapón micelial no crece de nuevo lo que significa que la hongo MUCL 45632 se murió. La falta de viabilidad del micelio a 37 °C no es engorrosa ya que los hongos patógenos no se desarrollan a esta temperatura .

La cepa MUCL 45632 se comporta mejor a baja temperatura que las otras cepas probadas. La cepa MUCL 45632 se retuvo para su capacidad para desarrollarse y para actuar cuando las temperaturas se elevasen en la primavera. La gama de temperatura activa de la cepa MUCL 45632 es bastante amplia para abarcar el periodo de crecimiento de las plantas y garantizar una protección durante los periodos de riesgo.

Estudio del estimulo del crecimiento de las plantas.

La cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632 que se multiplica en el suelo, a proximidad o en simbiosis con las raices posee propiedades de estimulo del crecimiento de las plantas. Eso fue demostrado por varias pruebas sobre distintas plantas.

A. Estimulo de crecimiento de los pepinos (primer ejemplo) : Cultivo de pepino Cucumis sativa, de variedad "Verde largo de los hortelanos" en tubo cónico de 50 mi sobre perlita expandida esterilizada bajo focos luminosos de 6000 lux durante 21 días. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta en la perlita a las dosis del 1% (vol.) y del 3% (vol.) . Se midieron el peso fresco y el peso seco de las raices.

Los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : modalidad peso coefficient peso seco coefficient fresco e de por planta e de por variación variación planta del peso del peso fresco seco MUCL 45632 1 % 370 mg 3,6 15,4 mg 2,6 MUCL 45632 3 % 380 mg 3,7 16,5 mg 2,8 Testigo sin 100 mg - 5,9 mg - tratamiento aumento del peso seco, según el cuadro aqui arriba, prueba que hay un aumento de la producción de biomasa.

Además a la dosis 1 %, el peso fresco de las raices es multiplicado por 2,7 con relación al testigo y el peso seco de las mismas raices por 1,6. Para la dosis 3% los valores obtenidos son superiores lo que demuestra la eficacia de la cepa.

B. Estimulo de crecimiento de los pepinos (segundo ejemplo): Cultivo de pepino Cucumis sativa, de variedad "Marketer" en pote sobre mantillo en un Fitotrón. La intensidad luminosa es de 10000 lux, la temperatura de 22 °C y el fotoperiodo de 16 h durante 45 días. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta al mantillo a la dosis del 2% (vol.). Se mide el peso fresco de las raices y partes aéreas.

Los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valor calculado con relación al testigo) : raíces parte aérea modalidad peso fresco por variación peso fresco variación planta por planta MUCL 45632 2% 9,6 g 35,2 % 7,5 g 15,4 % Testigo sin 7,1 g - 6,5 g - tratamiento El estimulo de crecimiento a la dosis del 2% es importante en las raices con un 35,2% de aumento. En las partes aéreas es de 15,4 %.

C. Estimulo de crecimiento de las lechugas: Cultivo de ensalada Lactuca sativa, de variedad "Grand Rapids" sobre placa multitiestos sobre mantillo. La intensidad luminosa es de 3000 lux, la temperatura de 25 °C y el fotoperiodo de 16 h durante 21 días. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta al mantillo a la dosis del 5% (vol.). Se midieron el peso fresco y el peso seco de las partes aéreas.

Los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : modalidad peso fresco coeficiente peso seco coeficiente por planta de variación por planta de variación del peso del peso fresco seco MUCL 45632 5% 144,6 mg 2,0 8, 4 mg 2,1 Testigo sin 72,5 mg - 4,0 mg - tratamiento El estimulo de crecimiento a la dosis del 5% es eficaz. Los coeficientes de aumento de materia son elevados que demuestran un excelente estimulo de crecimiento por parte de Trichoderma MUCL 45632. La observación del peso seco pone de manifiesto que ésta fue creada por la biomasa. .Trichoderma MUCL 45632 no indujo un turgencia de las células vegetales sino una multiplicación organizada de células vegetales.

D. Estimulo de crecimiento del arroz: Cultivo de arroz Oriza sativa, de variedad "Ruille" en tubo cónico de 50 mi sobre perlita esterilizada durante 15 dias. La intensidad luminosa es de 6000 lux, la temperatura de 25 °C y el fotoperiodo de 16 h. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta en la perlita expandida a la dosis del 1% (vol.). Se midieron el peso fresco y el peso seco de los troncos.

Los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : modalidad peso fresco coeficiente peso seco coeficiente por planta de por planta de variación variación del peso del peso fresco seco MUCL 45632 1% 43, 7 mg 2,0 6,0 mg 2,0 Testigo sin 22,1 mg - 3,0 mg - tratamiento El aumento del peso fresco se acompaña del aumento de materia seca prueba que Trichoderma atroviride MUCL 45632 favoreció la producción de biomasa del arroz en cultivo sumergido.

E. Estimulo de crecimiento de tomates (primer ejemplo): Cultivo de tomates Solanum lycopersicum, variedad "Saitn Pierre" en maceta (7 x 7 x 6 cm) sobre mantillo. La intensidad luminosa es de 10000 lux, la temperatura de 22 °C y el fotoperiodo de 16 h durante 45 días. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta con el mantillo a la dosis del 2% (vol.) . Se midieron el peso fresco y el peso seco de los troncos.

Los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : Raices Parte aérea modalidad Peso fresco variación Peso seco variación por planta por planta MUCL 45632 2% 1,88 g 34 % 4,12 g 60 % Testigo sin 1,40 g - 2,58 g - tratamiento Una vez más, aparece un aumento tanto del peso fresco sobre las raíces como sobre las partes aéreas gracias a la acción del Trichoderma MUCL 45632.

F. Estímulo de crecimiento de tomates (segundo ejemplo) : Cultivo de tomates Solanum lycopersicum, variedad "Saint Pierre" en tubo cónico de 50 mi sobre perlita esterilizada durante 1 mes. La intensidad luminosa es de 6.000 lux, la temperatura de 25 °C y el fotoperíodo de 16 h. La preparación de Trichoderma MUCL 45632 (109 esporas/g) se aporta en la Perlita a la dosis del 3% (vol.). Se midieron el peso fresco y el peso seco de las raíces y partes aéreas.

Para las raíces, los resultados se aportan en el cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : modalidad peso fresco coeficiente peso seco de coeficiente de las de variación las raíces de variación raíces por del peso por planta del peso planta fresco seco MUCL 45632 3% 117, 7 mg 9,1 7, 6 mg 9,5 Testigo sin 12,9 mg - 0,8 mg - tratamiento Para las partes aéreas, los resultados se aportan en cuadro siguiente (valores calculados con relación al testigo) : modalidad peso fresco coeficiente peso seco de coeficiente de las de variación las partes de variación partes del peso aéreas por del peso aéreas por fresco planta seco planta MUCL 45632 3% 170,3 mg 8,5 14,7 mg 7,7 Testigo sin 20,1 mg 1,9 mg -tratamiento Los resultados de esta experiencia demuestran una vez más el efecto estimulante de la cepa Trichoderma MUCL 45632. Las plantas obtenidas son más vigorosas con una raíz frondosa muy extendida y las partes aéreas más densas.

Conclusión: Se puso de relieve el efecto estimulante de Trichoderma MUCL 45632 en los 6 ejemplos anteriores y eso tanto sobre las raices como las partes aéreas. Este hongo estimula significativamente la síntesis de biomasa por la planta que se caracteriza por una mejora del crecimiento, una mejor precocidad y un mejor rendimiento.

Como se menciona anteriormente, Trichoderma atroviride MUCL 45632 tiene también propiedades antagónicas respecto a hongos patógenos y constituye pues un buen agente de contención biológica.

Estudio comparativo del efecto estimulante de las diferentes Trichodermas sobre el crecimiento de las plantas.

Algunas cepas de champiñones del suelo Trichodermas son conocidas para favorecer el crecimiento de las plantas y otras para desfavorecerlo. La expresión de las propiedades estimuladoras o inhibidoras no es característica del género Trichoderma , ni de una especie particular en ese género. Hay variedades en el seno de algunas especies que pueden mostrarse más o menos favorables o desfavorables al crecimiento de las plantas o al desarrollo de las raíces.

La identificación de las especies por los criterios morfológicos no es confiable ya que las Trichodermas son muy polimorfas. Para identificarlas con exactitud, es necesario utilizar un método molecular comúnmente admitido a partir de 1998, la secuenciación de los ITS-1 e ITS-2 (infernal transcribed spacers) del ADN ribosomal (Gams W. , Meyer . , Mycologia, 90_ (5), 904-915, 1998).

Este método permite la identificación por comparación de las secuencias ITS-1 y 2 con aquellas de las cepas de referencia depositadas en colecciones públicas, por ejemplo las cepas ATCC 28036 (ITSs : Genbank Z48817) y ATCC 36042 (ITSs : Genbank Z48812) para Trichoderma atroviride.

La cepa de Trichoderma atroviride MUCL 45632, asi como otras cepas que se pueden encontrar en las colecciones y en los productos comerciales han sido identificadas por técnicas bioquímicas y moleculares, y luego comparadas entre ellas. La cepa MUCL 45632 es una variedad de Trichoderma. atroviride cuyas propiedades estimuladoras del crecimiento son particularmente intensas. El ejemplo siguiente muestra que la cepa MUCL 45632 posee propiedades de estimulación del crecimiento de las plantas superiores a aquellas de otras Trichoderma atroviride y de otras especies de Trichoderma.

En este ejemplo, las cepas de Trichoderma estudiadas son : - MUCL 45632 (T. atroviride, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2 del ADNr y caracterizada con la ayuda de pruebas bioquímicas ; cepa aislada por la solicitante de un suelo no cultivado) Nixe 00401A (T. atroviride, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2, cepa aislada por la solicitante de un cultivo de champiñones Pleurotus ostreatus) CNCM 1-1571 ( T. atroviride, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2, Patente FR2780972, presentada como una cepa que produce alquil-gamma-lactonas que estimulan el desarrollo vegetal) T-22 o 1295-22 (ATCC 20847) ( T. harzianum Rifai, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2, Patente EP0285987, distribuida bajo el nombre Trianum P por Koppert BV, Países Bajos, conocida por sus propiedades estimuladoras del desarrollo de las raíces, cf. Harman G.E. et al., Nature Reviews / Microbiology, 2, 43-56, 2004) T-39 (CNCM 1-952) (Trichoderma harzianum Rifai, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2, Patente EP0466133) TV1 (Nixe 13602A) (G. harzianum, identificada por secuenciación de los ITS-1 e ITS-2, cepa del producto comercial Agribiotec, Italia) - Nixe 30301E {Trichoderma sp., identificada morfológicamente pero no genéticamente, cepa aislada por la solicitante de un cultivo fuera del suelo de Allium porum) El estudio es realizado en un cultivo de pepino Cucumis sativa variedad « Marketer ». En cada tubo cónico de 50 mL, se coloca 1 grano en 45 mL de perlita expandida en autoclave. Las plantas no reciben ningún aporte de abono. El alumbrado de 10000 lux con un foto-periodo de 16 horas es obtenido por lámparas fluorescentes. La temperatura varia entre 20 et 25 °C. El cultivo dura 21 días.

Los champiñones de ensayo son cultivados en PDA. Las esporas son colectadas en agua estéril y son contadas con célula de Malassez. Las esporas de Trichoderma son aportadas en la dosis de 2,2.108 esporas por 45 mL de perlita, o sea 5.106 esporas/mL de soporte de cultivo. Los tubos son rociados con 28 mL de agua estéril a la partida, y luego se aporta agua según las necesidades.

Al final del cultivo, el aspecto de las plantas, los pesos frescos y los pesos secos de las partes aireadas y de las raices son medidos .

Observaciones después de 21 días de cultivo Granos Plantas Plantas Número Longitu índice índice germina marchit nórmale medio d media de de -dos as s de de los biomasa biomasa Modalidades % % % hoj as tallos fresca seca por cm media / media / planta testigo testigo (1) NT (2) NT (3) T. a.troviride 100 0 100 2 3,5 1,9 1,4 MUCL 45632 T. atroviride 75 0 75 1 2,7 1,4 1,2 Nixe 00401A T. atroviride 75 0 75 0,33 2,5 0,8 0,7 1-1571 T. arzianum 100 0 100 1 3,0 1,2 0,9 T-22 / ATCC 20847 T. harzianum 75 0 75 1 3,1 1,0 0,9 T-39 / 1-952 T. harzianum 100 25 75 0,33 2,8 0,9 0,9 TV1 / Nixe 13602A Trichoderma 100 0 100 1 2,4 0,7 0, 6 sp. Nixe 30301E Plan tas 75 0 75 1 2,7 1,0 1,0 testigos no tratada (NT) Notas : (1) número medio de hojas verdaderas por planta, cotiledones no comprendidos ; (2) relación entre el peso medio de las plantas frescas recogidas (raices comprendidas) y el peso medio de las plantas testigos no tratadas (NT) / (3) relación entre el peso medio de las plantas secas recogidas (raices comprendidas) y el peso medio de las plantas testigos no tratadas (NT) .

La germinación de los granos no es obstaculizada por la cepa MUCL 45632. En este ensayo, es difícil saber si las variaciones de las tasas de germinación provienen de los granos o del efecto de la Trichoderma. Se observó que una concentración excesiva en Trichoderma provoca una destrucción de los granos, pero no es el caso en este dispositivo.

El cultivo no comprende ninguna fertilización para poner en evidencia los efectos estimulantes vinculados a la interacción entre la planta y el champiñón. El sustrato de cultivo es totalmente inerte y no interfiere en el proceso de estimulación del crecimiento. Las fuentes nutritivas provienen integralmente del grano y no tienen ningún impacto sobre dicho proceso.

Las plantas tratadas por MUCL 45632 se desarrollan más rápidamente que las otras con más hojas y un tamaño más grande. El T. atroviride 1-1571 y el T. harzianum T-22, conocidos por sus efectos favorables, son menos eficaces que MUCL 45632. Después de tres semanas, las plantas tratadas por MUCL 45632 poseen al menos una semana de avance sobre las plantas no tratadas. Las mismas se desarrollaron armoniosamente, sin alargamiento anormal.

Otro aspecto característico del efecto estimulante es el aumento de biomasa obtenido con la ayuda de MUCL 45632. La producción media de biomasa fresca por planta es 1,9 veces superior a aquella de una planta media no tratada a pesar de la ausencia de aporte de nutrimentos exteriores. La production ¡-de biomasa seca sigue la misma tendencia. El intervalo es aún más importante por comparación directa con las plantas tratadas por T. atroviride I-1571. El efecto de la cepa de T. atroviride Nixe 00401A es bueno pero es inferior a aquel de MUCL 45632. Se notará el efecto depresivo de las cepas T. atroviride 1-1571 y Trichoderma sp. Nixe 30301E.

El efecto estimulante de la Trichoderma atroviride MUCL 45632 es superior en todos los puntos a aquel de otras Trichoderma , tanto sobre las raíces que sobre las partes airadas. El champiñón estimula significativamente la síntesis de biomasa por la planta que se caracteriza por una mejora del crecimiento, una mejor precocidad y un mejor rendimiento. Las propiedades remarcables de la variedad MUCL 45632 de T. atroviríde son confirmadas.

Propiedades antagónicas Pruebas in vitro : La cepa MUCL 45632 fue objeto de pruebas al laboratorio contra distintos hongos patógenos del suelo y de las partes aéreas. Estas pruebas se hicieron a distintas temperaturas en la gama de desarrollo de la cepa MUCL 45632.

En una placa de Petri gelosada con PDA, coloca a la periferia un tapón micelial de la cepa de Trichoderma atroviríde MUCL 45632 y al contrario, un tapón micelial del hongo patógeno. Después de 15 días de cultivo a la temperatura elegida, el comportamiento de la cepa de Trichoderma ante el patógeno se analiza sobre la base de los criterios: micelio cubierto o no, con o sin esporulación . La viabilidad del tapón de patógeno se analiza tomándolo, depositándolo sobre una placa con PDA y cultivándolo a 25 °C. Eso permite determinar si, después de confrontación con Trichoderma , es siempre capaz de dar nacimiento a un micelio o si se destruyó enteramente.

Resultado de las pruebas de competición in vitro contra distintos hongos patógenos: Hongos patógenos 15 °C 25 °C 30 °C >30 °C Aspergillus n.d. destruid destruid destruid carbonarius o o o Botrytis cinérea destruid destruid destruid destruid o o o o Fusarium oxysporum n . d. destruid destruid destruid o o o Phytophthora n.d. destruid destruid destruid infestans o o o Sclerotinia minor destruid destruid destruid destruid o o o o Sclerotinia destruid destruid destruid destruid sclerotiorum o o o o n.d.: no determinado La cepa es notable en el sentido de que, a partir de 15 °C, mata Botrytis cinérea, Sclerotinia minor y Sclerotinia sclerotiorum que son patógenos activos a baja temperatura. Para Aspergillus carbonarius, Fusarium oxysporum y Phytophthora infestans, la cepa UCL 45632 los erradica a su temperatura óptima de crecimiento entre 25 y 30 °C.

Se probaron las propiedades antagónicas destinadas a luchar específicamente contra las enfermedades de la madera de la vid. Para ello las pruebas de competición siguientes se realizaron: La cepas MUCL 45632 se enfrentó in vitro contra distintas hongos patógenos de las enfermedades de la madera de la vid (ITV Nimes Francia) .

Esca : Phaeomoniella chlamydospora (Pe LR47 y Pe LR 81), Phaeoacremonium aleophilum (Pa LR3 y Pa LR23) et Fomitiporia punctata (Fp LR14 y Fp LR30) .

Eutipiosis : Eutypa lata (Elcc260 y El MT 247) - Deterioro del syrah : Botryosphaeria obtusa (Bo F98-1 y Bo F99-8) Black Dead Arm (Brazo muerto) : Botryosphaeria parva (Bd 021) Injertos soldados: Botryosphaeria stevensii (Bs 001) En una placa de Petri gelosada con Agar Malta, se coloca en la periferia un tapón micelial de las cepas de Trichoderma atroviríde MUCL 45632 y al contrario, un tapón micelial del hongo patógeno. Se hacen tres repeticiones para cada prueba. Las placas se cultivan a 25 °C. El crecimiento del único hongo patógeno sirve de testigo. La distancia de inhibición I, expresada en mm. , corresponde a la diferencia entre el rayo medio Rl de la colonia de la placa testiga y el rayo medio R2 que se sitúa sobre la derecha que conecta el centro de los dos protagonistas en confrontación (I = Rl - R2) . El tipo de inhibición se calcula al cabo de: 4 dias para Botryosphaeria parva (Bd 021), 5 dias para Botryosphaeria obtusa (Bo F98-1 y Bo F99-8) y Botryosphaeria stevensii (Bs 001), 7 dias para Eutypa lata (Elcc260 y EL MT 247) y Fomitiporia punctata ( Fp LR14 y Fp LR30), 9 dias para Phaeomoniella chlamydospora (Pe LR47 y Pe LR 81) , 12 días para Phaeoacremonium aleophilum (Pa LR3 y Pa LR23) .

El comportamiento de la cepa de Trichoderma ante el patógeno se analiza sobre la base de los criterios de recaudación del micelio, esporulación y zona de melanización .

La viabilidad del tapón del patógeno después de la prueba se analiza tomándolo, depositándolo sobre una placa Agar Malta y cultivándolo a 25 °C. Eso permite determinar si, después de confrontación con Trichoderma , se ha destruido o es siempre viable .

La cepa MUCL 45632 se compara a la cepa de Trichoderma I-3151 que sufrió las mismas pruebas cuyos resultados se publican en la patente FR2864832.

Resultado de las pruebas de confrontación "in vitro" contra distintas hongos patógenos de la madera de la vid: Distancia de inhibición (mm) Hongos patógenos MUCL 45632 1-3151 Phaeomoniella chlamydospora Pe LR47 4,3 3 Phaeomoniella chlamydospora Pe LR81 2,4 4,2 Phaeoacremonium aleophilum Pa LR3 7,5 10,7 Phaeoacremonium aleophilum Pa LR23 1,9 3,5 Fomitiporía punctata Fp LR14 7,3 7,7 Fomitiporia punctata Fp LR30 9,7 10, 7 Eutypa lata Elcc260 5 9 Eutypa lata El MT 247 10,4 12 Botryosphaeria obtusa Bo F98-1 29,2 28,2 Botryosphaeria obtusa Bo F99-8 25,2 24,6 Botryosphaeria parva Bd 021 23,9 21,7 Botryosphaeria stevensii Bs 001 35, 7 32, 7 La cepa MUCL 45632 presenta una eficacia innegable contra las enfermedades debidas al Botryosphaeria: deterioro del Syrah, Black Dead Arm y los "injertos soldados". Los diámetros de inhibición son elevados, demostrando asi la acción positiva de MUCL 45632. A la observación con microscopio, cubre enteramente los patógenos y prospera fructifica matándolos irremediablemente.

Contra el ESCA de Phaeomoniella chlamydospora y de Fomitiporia punctata, muestra una buena eficacia ya que cubre enteramente los patógenos y fructifica matándolos completamente. Su eficacia se limita contra el ESCA debida a las cepas PA LR3 y PA LR23, en el sentido donde inhibe el crecimiento de los patógenos pero no los mata, de la misma manera que la cepa I-3151.

Contra la eutipiosis (Elcc260 y EL MT 247), la cepa MUCL 45632 muestra diámetros de inhibiciones aceptables.

En conclusión, la cepa Trichoderma atroviride MUCL 45632 posee una buena capacidad de lucha contra las enfermedades de la madera: es muy eficaz contra el deterioro del Syrah, el Black Dead Arm y los "injertos soldados" y equivalente a la cepa Trichoderma 1-3151 en el caso de las otras enfermedades.

Pruebas en campo y bajo invernadero: A. Estudio sobre rábano (Raphanus sativus) contra Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani del suelo.

El producto formulado Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 esporas/g) se aplicó según dos modalidades sobre un cultivo de rábano en un suelo infectado por F. oxysporum y R. solani. El número de plantas es 130.000 sobre 500 ra2. En esta prueba, el Trichoderma es aportado por aspersión.

Producto testado Modalidad Plantas enfermas Preparación 1 aplicación 2 g/m2 al 24 % MUCL 45632 siembra y 1 aplicación 1 g/m2 15 días después Preparación 1 aplicación 2 g/m2 al 0 % MUCL 45632 siembra y 2 aplicaciones 2 g/ m2 7 y 14 días después Tratamiento condiciones estándar 0 % convencional Laicon-L (Polyoxin B) El tratamiento por la preparación de Trichoderma atroviride MUCL 45632 ofrece una protección comparable a la del producto antibiótico Laicon-L (Polyoxin B) .

B. Prueba sobre tomate (Solanum lycopersicum) bajo invernadero contra Botrytis cinérea.

El producto formulado Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 esporas/g) se aplicó sobre plantas de tomates cuyas 4 hojas se dividieron. Después del secado de la aplicación de Trichoderma , las plantas son infectadas artificialmente por una suspensión de Botrytis cinérea. El número de plantas es 48 (4 parcelas de 12) .

La evolución de la enfermedad sobre las heridas de sección de las hojas se observa después de 13 días.

Producto testado Modalidad Indice de Indice de infección de infección de las heridas las heridas libres ensacadas Preparación i 1,07 / 4 2,65 / 4 MUCL 45632 pulverización a 1 g/m2 Tratamiento í ?7"?474 27787 convencional Scala pulverización (Pyrimethanil) a 0,2 mL/m2 Testigo sin 2,3C 74 376574 tratamiento El tratamiento por la preparación de Trichoderma MUCL 45632 ofrece una protección comparable a la del tratamiento químico convencional .

Cuando las heridas están al aire libre, esta protección es buena .

C. Prueba sobre pimiento (Capsicum annuum) bajo invernadero contra Phytophthora capsici.

El producto formulado Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 esporas/g) se aplicó sobre las plantas de pimiento un mes después de la siembra en febrero luego todos los 15 a 30 días, hasta el mes de agosto. Las siembras se hicieron bajo túnel en terreno desinfectado y se trasplantaron las jóvenes plantas en campo en mayo. El número de plantas es 1800 (aproximadamente 800 m2 ) . La infección por Phytophthora capsici es natural. Los síntomas de la enfermedad se miden a partir de su aparición en el mes de agosto.

Producto Modalidad Tipo de Tipo de testado plantas plantas enfermas enfermas 16/08 28/08 Preparación 3 pulverizaciones de 1,5 % 7,6 % MUCL 45632 la siembra a 33, 20 y 10 g/m2 , 1 pulverización en campo a 20 kg/ha, 5 pulverizaciones en campo a 4,5 kg/ha Testigo sin 3,8 % 18,2 % tratamiento El tratamiento por la preparación de Trichoderma MUCL 45632 reduce significativamente el tipo de plantas enfermas.

Otros aspectos de la invención, en particular otras utilizaciones del Trichoderma atroviride según la invención o de sus productos derivados, serán evidentes al experto en la técnica y están comprendidos dentro del alcance de la protección.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de Trichoderma atroviride, caracterizada porque se trata de la cepa Trichoderma atroviride depositada en la Micoteca de la Universidad Católica de Lovaina bajo la referencia BCCM™/MUCL 45632.

2. Cepa de Trichoderma atroviride según la reivindicación 1 caracterizada porque posee los siguientes aspectos de cultivo: - sobre medio PDA (Agar Dextrosa de Patata) , aparece, en dos días aproximadamente, un talo translúcido corto que se vuelve blanco al tercer día con la aparición de los conidióforos ; este micelio corto vira al verde muy oscuro al cabo de cinco días, señal de una esporulación intensa. El envés del cultivo es incoloro; - sobre medio MA (Agar Malta) , su desarrollo es ligeramente diferente y característico de la especie Trichoderma atroviride, el micelio forma de los círculos concéntricos de esporulación verde intensa alrededor del punto de inoculación con un talo que sigue siendo translúcido hasta el final del cultivo; el aspecto microscópico es el mismo sobre los dos medios, se ramifican los conidióforos con células conidiógenas (fialidas) dispuestas en verticilo por 2 ó 3, dichas fialidas son ampolliformes , derechas o curvadas, de dimensiones 2,5 a 3 µp? por 8 a 14 µp? y las conidias reunidas en la cumbre de la fialida, son globulares de pared lisa, de color verde y miden alrededor de 3 µp? de diámetro; - dicha cepa se desarrolla entre 12 °C y 36 °C con un grado óptimo de crecimiento entre 20 °C y 25 °C sobre los medios gelosados clásicos de tipo PDA, MA, OA (Agar Harina de Avena) .

3. Ascomiceto tal como el depositado en la Micoteca de la Universidad Católica de Lovaina bajo la referencia BCCM™/MUCL 45632.

4. Clon de Trichoderma atroviride caracterizado porque se obtiene a partir de la nueva cepa según la reivindicación 1 ó 2.

5. Medio de cultivo de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 caracterizado porque incluye al menos un Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632 y al menos un substrato, especialmente un substrato de origen vegetal y más concretamente un substrato rico en polyholosides como el almidón, la hemicelulosa o la celulosa.

6. Medio de cultivo según la reivindicación 5 caracterizado porque incluye al menos un diluyente mineral inerte.

7. Medio de cultivo según la reivindicación 6 caracterizado porque dicho diluyente se selecciona específicamente para diluir y/o ventilar dicho medio de cultivo, por ejemplo, dicho diluyente se elige en el grupo constituido por las arcillas calcinadas en granos como la atapulgita, las bolas de arcilla sopladas, los polvos de rocas volcánicas como la puzolana o la piedra pómez, la perlita expandida, la vermiculita expandida y la lana de roca.

8. Medio de cultivo según una de la reivindicación 5 a 7 caracterizado porque incluye al menos un elemento mineral útil al crecimiento del Trichoderma atroviríde como nitrato, amonio, ortofosfato, potasio, magnesio, calcio o un oligoelemento .

9. Medio de cultivo según una de las pretensiones 5 a 8 caracterizado porque incluye un ácido, preferentemente mineral, permitiendo mantener el pH del medio entre 2 y 4 y preferentemente entre 2,7 y 3,3.

10. Concentrado deshidratado de Trichoderma atroviríde BCCM™/MUCL 45632, especialmente en forma de polvo.

11. Método de obtención de un polvo a base de Trichoderma atroviríde BCCM™/MUCL 45632 caracterizado porque incluye las etapas de fermentación del medio de cultivo según las pretensiones 5 a 9, de deshidratación a baja temperatura, eventualmente seguidas de una etapa de trituración.

12. Polvo susceptible obtenerse por el método según la reivindicación

13. Utilización de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632 como estimulante de la germinación y/o del crecimiento de las plantas.

14. Utilización de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632 como agente de biocontrol, en particular, contra los hongos patógenos de las plantas.

15. Método de aislamiento de Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632, caracterizado porque incluye las siguientes sucesivas etapas : a. toma de un extracto del hongo Trichoderma atroviride en un medio adecuado como un suelo cultivado o no cultivado, sobre las plantas o en la madera en descomposición resultante de cepa de vid, rama o tronco d1 árbol, b. dilución del extracto tomado con agua estéril, c. cultivo de este extracto sobre al menos uno medio selectivo, dicho medio selectivo siendo incluso en un grupo constituido por: el medio MA2 (Agar Malta 2%) y el medio RB-S-F (McFadden y Sutton) , Trasplante de los hongos Trichoderma atroviride resultantes de esporas aisladas en placas de Petri llenas con medio PDA (Agar Dextrosa de Patata) , Cultivo de los hongos replantados en una estufa en 25°C durante una duración incluida entre dos y cinco días, preferentemente entre tres y cuatro días, Identificación, mediante una observación microscópica realizada sobre un fragmento de micelio tomado después de la etapa anterior y previamente coloreado con un colorante azul algodón al lactophénol, de hongos Trichoderma atroviride BCCM™/MUCL 45632.