CN103131748A - 一种用于丝状真菌观察鉴定的方法 - Google Patents

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尹静
孙建广
詹亚光
来永才
毕影东
李炜
李琬
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Abstract

一种用于丝状真菌观察鉴定的方法。其步骤如下：首先在培养皿中加入PDA培养基，待其冷凝后用手术刀沿培养基直径垂直于培养皿底部进行切割，移除一半培养基，挑取待鉴定的真菌培养物接种于培养基与培养皿底部交界中间处，盖上培养皿盖子，石蜡膜密封后标记，28℃黑暗培养。培养结束后，在有培养基的一半培养皿上，真菌生长成正常菌落的一半，可对菌落特征进行观察；无培养基的培养皿上，菌丝稀疏生长，在培养皿倒置情况下，可对菌丝显微观察。本发明方法无需制片，使真菌个体形态观察与群体形态观察相结合，操作简单，方便快捷，可同时对菌种在自然生长状态下的菌丝与菌落进行实时观察，保证丝状真菌鉴定工作准确性，又节约成本及降低工作量。

Description

一种用于丝状真菌观察鉴定的方法
技术领域
本发明属于真菌学研究领域，具体涉及一种丝状真菌个体形态与菌落形态观察相结合的方法。 
背景技术
长期以来，对丝状真菌研究鉴定的工作，主要为宏观特征观察与分子鉴定相结合的方法，而对于宏观特征鉴定方法，丝状真菌的鉴定主要根据形态特征，包括个体形态和群体形态。因此，同时获得较好的菌丝显微特征与菌落特征对真菌研究鉴定工作至关重要。然而，在研究丝状真菌形态特征的传统方法中个体形态观察与群体形态观察分开进行，在个体形态观察中主要为制片观察，包括菌丝挑取制片法，插片法，载片培养法，琼脂槽培养法，仪器设备自动制片法等，以上方法存在如下不足之处：(1)菌丝挑取制片法往往出现菌丝重叠，菌丝自然生长状态遭到破坏的现象，不能获取正常的真菌显微形态；(2)载片培养法需要制作湿室，操作过程繁琐复杂，对操作人员以及实验器材要求较高；(3)仪器设备自动制片法要求使样本在压力差作用下通过选择性过滤膜，局限于细胞、细菌、花粉等颗粒材料，无法对丝状材料进行制片，且处理过程中有外力作用，无法保持材料自然状态，同时，仪器设备较为昂贵。(4)以上方法在获取真菌显微特征的同时均不能获得菌落特征，在丝状真菌观察鉴定中增加了工作量和提高了成本。因此，在丝状真菌观察鉴定工作中需要建立一种新的方法。 
发明内容
本发明的目的是提供一种用于丝状真菌观察鉴定的方法，使丝状真菌的个体形态观察与群体形态观察相结合，即针对传统的丝状真菌显微形态制片观察与菌落特征观察方法的严重缺陷而建立的一种新的观察方法。本方法无需制片，简单易操作，即可同时对丝状真菌的个体形态与群体进行实时观察，在保证菌种鉴定工作准确性的同时，又减少了工作量，弥补了现有技术的不足。 
本发明的方法，其步骤如下，在超净工作台上，首先在无菌培养皿中加入PDA培养基，待其冷凝后用无菌手术刀沿培养基直径垂直于培养皿底部进行切割，移除一半培养基，带有一半培养基的培养皿在超净工作台内，通风条件下紫外灯照射，使其微干，然后将待鉴定的真菌培养物接种于培养基与培养皿交界中间处，盖上培养皿盖子，石蜡膜密封后标记，28℃黑暗培养。培养10～15d后，在有培养基的一半培养皿上，真菌生长为正常全培养基菌落的一半，可对菌落特征进行观察；无培养基的一半培养皿上，菌丝稀疏生长，在培养皿倒置情况下，可对菌丝进行显微观察。 
上述的培养皿为直径90mm玻璃皿，干热灭菌后使用； 
上述的培养基为PDA土豆培养基，制作方法为马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，加水定容至1000ml，pH自然，121℃×30min高温高压灭菌； 
上述的培养基加入体积为10～15ml，平板厚度2～3mm，切割时沿培养皿直径垂直于底部； 
上述的带有一半培养基的培养皿于超净工作台紫外照射10～15min； 
上述的接种方法接种时在培养基与培养皿交界中间处； 
上述的菌丝显微观察时培养皿倒置； 
本专利具有以下优点： 
本发明的方法，无需制片即可对丝状真菌进行实时显微观察，同时，可对真菌菌落群体形态特征进行观察，在保证菌种鉴定工作准确性的同时，降低了成本，减少了工作量及鉴定效率。 
具体实施方式
本发明具体的实施步骤： 
1.配置PDA培养基，灭菌后备用，使用前融化，在无菌干燥培养皿中加入PDA培养基，体积为10～15ml，待其冷凝后制成平板厚度2～3mm； 
2.用无菌手术刀沿培养基直径垂直于培养皿底部进行切割，移除一半培养基，并用刀片清理干净培养基碎片； 
3.带有一半培养基的培养皿正面开口朝上于超净工作台内，通风条件下紫外灯照射10～15min，蒸发多余水分使其微干，同时杀死可能污染的杂菌； 
4.用接种针挑取待鉴定的真菌培养物接种于培养基与培养皿交界中间处，盖上培养皿盖子，石蜡膜密封后标记，28℃黑暗培养。 
5.根据丝状真菌的生长特点，选取培养时间如1天、2天、4天、8天、16天等不同时间段进行观察，在有培养基的一半培养皿上，真菌生长成正常培养基菌落的一半，可对菌落特征进行观察，获得不同生长时期的菌落特征；无培养基的一半培养皿上，菌丝稀疏生长，在培养皿倒置情况下，可对菌丝显微观察，获得菌丝，子实体，孢子的正常生长状态下不同时期的特征。 
上述步骤1～4需在无菌状态下操作。 
本发明方法，在无需制片的情况下，即可对丝状真菌的菌丝特征、孢子着生方式等进行显微实时观察，由于在自然生长状态下，可以真实准确的获得个体形态显微特征；在有培养基的一半培养皿上，真菌生长成正常菌落的一半，可对菌落特征进行观察，获得不同生长时期的菌落特征，包括大小，表面纹饰，质地，基面着色以及外渗物情况等。本方法简单易行，在保证菌种鉴定工作准确性的同时，又降低了成本，减少了工作量，提高了微生物菌种鉴定的效率。 
附图说明
图1是真菌接种在培养基中的位置示意图，其中图1中A为正常培养基培养的菌落特征；B为半培养基培养的菌落特征(箭头所指点为接种处) 
图2是单菌落接种培养15天时半培养基与正常培养生长特征比较图 
图3是接种后2天的真菌菌丝生长图(4×10倍) 
图4是接种15天时菌丝生长状况及其显微结构图(4×10倍) 
图5真菌菌丝由密到疏(4×4倍) 

Claims (1)

1.一种用于丝状真菌观察鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在无菌培养皿中加入PDA培养基，待其冷凝后用无菌手术刀沿培养基直径垂直于培养皿底部进行切割，移除一半培养基，带有一半培养基的培养皿在超净工作台内，通风条件下紫外灯照射，使其微干；将待鉴定的真菌培养物接种于培养基与培养皿交界中间处，盖上培养皿盖子，石蜡膜密封后标记，28℃黑暗培养。培养结束后，在有培养基的一半培养皿上，真菌生长成正常菌落的一半，可对菌落特征进行观察；无培养基的培养皿上，菌丝稀疏生长，在培养皿倒置情况下，可对菌丝进行显微观察。
2)根据权利要求书1所述的方法，其中的培养皿为直径90mm，121℃灭菌30min后使用；
3)根据权利要求书1所述的方法，其中的培养基为PDA土豆培养基，制作方法为马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，加水定容至1000ml，pH自然，121℃×30min灭菌；
4)根据权利要求书1所述的方法，其中培养基加入体积为10～15ml，平板厚度2～3mm，切割时沿培养皿直径垂直于底部；
5)根据权利要求书1所述的方法，其中带有一半培养基的培养皿干燥照射10～15min；
6)根据权利要求书1所述的方法，其中的接种方法接种时在培养基与培养皿交界中间处；
7)根据权利要求书1所述的方法，其中的菌丝显微观察时培养皿倒置。
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