CN103931476A - 培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法 - Google Patents

培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，取新鲜发病的十字花科植物的根组织制成根肿菌菌液，在石英砂中播下十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，并在光照强度为100μmolphotons/(m2.s)、光照时间为16～18h、温度为20～22℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株；在每株植株的根部施加根肿菌菌液进行侵染，然后分阶段将侵染的植株根系用生物显微镜观察，直至侵染阶段结束。本发明操作简便且观察结果清晰，占用空间小，试验成本低，具有操作安全、简单、重复性强，观察方便、结果清晰的优点。

Description

培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法
技术领域
本发明涉及一种植物培养方法，尤其是一种培养被根肿菌侵染的十字花科植株的方法，以用于观察根肿菌对十字花科植株侵染的过程，属于植物病理学研究技术领域。
背景技术
十字花科根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的一种土传真菌病害，在十字花科植物中危害严重。芸薹根肿菌在侵染植株的过程中分为两个阶段，初侵染阶段（或根毛侵染，即土壤中休眠孢子变成初级游动孢子到达根毛表面后，穿过细胞壁侵入根毛内部，这个阶段被称为初侵染阶段）和再侵染阶段（或皮层侵染，即病原菌在根毛内部形成次生原生质团，一部分细胞核裂解形成多核的游动孢子囊，每个游动孢子囊产生4～16个次游动孢子，侵入主根皮层，这个过程叫做再侵染阶段），整个侵染过程主要在根部进行，因此可通过对根毛部位的观察对根肿菌的侵染过程进行研究。
目前，国内根肿病方面的研究多集中于根肿病发病规律的调查与防治，而对根肿菌侵染过程的研究报道较少。在已有研究中，用于观察根肿菌侵染过程的植物的培养主要采用土壤培养或水培养的方法，土壤培养法观察时对植株破坏性大，干扰因素多，操作繁杂，观察结果不清晰，且容易造成病害的传播和污染，而用水培法则存在培养液容易污染，植株根系不发达等问题，且根部容易腐烂，不利于观察；在培养方法上存在不足，亟需改进。
发明内容
为解决现有技术中干扰因素多、操作繁杂、观察结果不清晰等问题，本发明提供一种培养被根肿菌侵染的十字花科植株的方法，并在培养过程中，取样观察根肿菌对十字花科植株侵染的过程。
本发明通过下列技术方案实现：一种培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）取新鲜的被根肿菌侵染而发病的十字花科植物的根组织并搅碎，经孔径为25μm的纱布过滤，将滤液于3000r/min的转速下离心分离9min，去上清液，然后在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，再在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸馏水悬浮沉淀物，直至得到1×107CFU/mL的根肿菌菌液，保存于4℃下备用；
（2）在消毒石英砂中播下消毒十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，在光照强度为100μmol photons/ (m2.s)、光照时间为16～18h、温度为20～22℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株，其间每2天补加1次MS基本培养液，以保持石英砂及种子的湿润；
（3）在步骤（2）的每株植株的根部施加0.5mL步骤（1）的根肿菌菌液进行侵染；
（4）从侵染后的第4天开始，随机取出部分步骤（3）所得的植株，并洗去植株根部的沙子，从根部选取大小均匀的根系，剪下1～2cm的包括根尖部分的须根，置于载玻片上，于生物显微镜下观察，如此每隔2天取出部分步骤（3）所得植株，进行一次显微观察，直至侵染阶段结束。
所述步骤（2）的消毒石英砂是：用质量浓度为20%的盐酸浸泡24h，再用水冲洗至石英砂接近中性后，用高压蒸汽灭菌处理15～30min的石英砂。
所述步骤（2）的消毒十字花科种子是：经质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10min的种子。
所述步骤（2）的MS基本培养液是：经常规高温高压灭菌后，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液将其pH值调节为6.2的MS基本培养液。
所述根肿菌为芸薹根肿菌。
本发明应用沙子-培养液体系对十字花科植株进行培养和根肿菌侵染，侵染植株拔出冲洗后，即可进行观察，对根毛部位基本没有损伤，根毛透明度高、通透性强，可清晰观察到根肿菌在寄主根毛部位的整个发育过程，观察后的植株仍可继续存活，与传统方法相比操作简单、观察方便且清晰，能较早地观察到病害的发生，对十字花科及其他植物对芸薹根肿菌的抗性研究具有重要意义。
本发明操作简便且观察结果清晰，且应用常用用品和试剂，占用空间小，试验成本低，具有操作安全、简单，可操作性、可重复性强，观察方便、结果清晰的优点，能够广泛应用于十字花科植物对芸薹根肿菌的抗性鉴定中，从而加快根肿病抗性品种的筛选和应用。
附图说明
图1为侵染后第4天根毛的显微观察结果；
图2为侵染后第8天根毛的显微观察结果；
    图3为侵染后第10天根毛的显微观察结果；
    图4为侵染后第12天根毛显微观察结果；
    图5 为侵染后第14天根毛显微观察结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）取新鲜的被芸薹根肿菌侵染而发病的十字花科植物的根组织并搅碎，经孔径为25μm的纱布过滤，将滤液于3000r/min的转速下离心分离9min，去上清液，然后在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，再在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸馏水悬浮沉淀物，直至得到1×107CFU/mL的芸薹根肿菌菌液，保存于4℃下备用；
（2）在消毒石英砂中播下消毒十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，在光照强度为100μmol photons/ (m2.s)、光照时间为16h、温度为22℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株，其间每2天补加1次MS基本培养液，以保持石英砂及种子的湿润；
所述消毒石英砂是：用质量浓度为20%的盐酸浸泡24h，再用水冲洗至石英砂接近中性后，用高压蒸汽灭菌处理15min的石英砂；
所述消毒十字花科种子是：经质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10min的种子；
所述MS基本培养液是：经常规高温高压灭菌后，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液将其pH值调节为6.2的MS基本培养液；
（3）在步骤（2）的每株植株的根部施加0.5mL步骤（1）的芸薹根肿菌菌液进行侵染；
（4）从侵染后的第4天开始，随机取出部分步骤（3）所得的植株，并洗去植株根部的沙子，从根部选取大小均匀的根系，剪下1cm的包括根尖部分的须根，置于载玻片上，于生物显微镜下观察，结果见图1，由图1中可见根毛细长，根毛管腔内中空；如此每隔2天取出部分步骤（3）所得植株，进行一次显微观察，直至侵染阶段结束，结果见图2-5，由图2中可见根毛肿大，根毛管腔内出现原生质团和游动孢子囊，由图3中可见根毛内的游动孢子囊开始产生游动孢子，由图4中可见游动孢子从游动孢子囊中游出，由图5中可见根毛肿大，根毛管腔内中空。
实施例2
（1）取新鲜的被芸薹根肿菌侵染而发病的十字花科植物的根组织并搅碎，经孔径为25μm的纱布过滤，将滤液于3000r/min的转速下离心分离9min，去上清液，然后在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，再在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸馏水悬浮沉淀物，直至得到1×107CFU/mL的芸薹根肿菌菌液，保存于4℃下备用；
（2）在消毒石英砂中播下消毒十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，在光照强度为100μmol photons/ (m2.s)、光照时间为18h、温度为20℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株，其间每2天补加1次MS基本培养液，以保持石英砂及种子的湿润；
所述消毒石英砂是：用质量浓度为20%的盐酸浸泡24h，再用水冲洗至石英砂接近中性后，用高压蒸汽灭菌处理20min的石英砂；
所述消毒十字花科种子是：经质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10min的种子；
所述MS基本培养液是：经常规高温高压灭菌后，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液将其pH值调节为6.2的MS基本培养液；
（3）在步骤（2）的每株植株的根部施加0.5mL步骤（1）的芸薹根肿菌菌液进行侵染；
（4）从侵染后的第4天开始，随机取出部分步骤（3）所得的植株，并洗去植株根部的沙子，从根部选取大小均匀的根系，剪下1.5cm的包括根尖部分的须根，置于载玻片上，于生物显微镜下观察，如此每隔2天取出部分步骤（3）所得植株，进行一次显微观察，直至侵染阶段结束，从而可清晰地观察到芸薹根肿菌在寄主根毛部位的整个发育过程，其结果同图1～图5。
实施例3
（1）取新鲜的被芸薹根肿菌侵染而发病的十字花科植物的根组织并搅碎，经孔径为25μm的纱布过滤，将滤液于3000r/min的转速下离心分离9min，去上清液，然后在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，再在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸馏水悬浮沉淀物，直至得到1×107CFU/mL的芸薹根肿菌菌液，保存于4℃下备用；
（2）在消毒石英砂中播下消毒十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，在光照强度为100μmol photons/ (m2.s)、光照时间为17h、温度为21℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株，其间每2天补加1次MS基本培养液，以保持石英砂及种子的湿润；
所述消毒石英砂是：用质量浓度为20%的盐酸浸泡24h，再用水冲洗至石英砂接近中性后，用高压蒸汽灭菌处理30min的石英砂；
所述消毒十字花科种子是：经质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10min的种子；
所述MS基本培养液是：经常规高温高压灭菌后，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液将其pH值调节为6.2的MS基本培养液；
（3）在步骤（2）的每株植株的根部施加0.5mL步骤（1）的芸薹根肿菌菌液进行侵染；
（4）从侵染后的第4天开始，取出步骤（3）所得部分植株，并洗去植株根部的沙子，从根部选取大小均匀的根系，剪下2cm的包括根尖部分的须根，置于载玻片上，于生物显微镜下观察，如此每隔2天取出部分步骤（3）所得植株，进行一次显微观察，直至侵染阶段结束，从而可清晰地观察到芸薹根肿菌在寄主根毛部位的整个发育过程，其结果同图1～图5。

Claims (4)

1.一种培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）取新鲜的被根肿菌侵染而发病的十字花科植物的根组织并搅碎，经孔径为25μm的纱布过滤，将滤液于3000r/min的转速下离心分离9min，去上清液，然后在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，再在沉淀物中加入适量蒸馏水，于4000r/min的转速离心分离12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸馏水悬浮沉淀物，直至得到1×107CFU/mL的根肿菌菌液，于4℃下保存备用；
（2）在消毒石英砂中播下消毒十字花科种子，用MS基本培养液浸湿石英砂及种子，在光照强度为100μmol photons/ (m2.s)、光照时间为16～18h、温度为20～22℃、湿度为75%以上的条件下，培养至种子萌发，再生长至长出2片真叶的植株，其间每2天补加1次MS基本培养液，以保持石英砂及种子的湿润；
（3）在步骤（2）的每株植株的根部施加0.5mL步骤（1）的根肿菌菌液进行侵染；
（4）从侵染后的第4天开始，随机取出部分步骤（3）所得的植株，并洗去植株根部的沙子，从根部选取大小均匀的根系，剪下包括根尖部分在内的1～2cm的侧根，置于载玻片上，于生物显微镜下观察，如此每隔2天随机取出部分步骤（3）所得的植株，进行一次显微观察，直至侵染阶段结束。
2.根据权利要求1所述的培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于：所述步骤（2）的消毒石英砂是：用质量浓度为20%的盐酸浸泡24h，再用水冲洗至石英砂接近中性后，用高压蒸汽灭菌处理15～30min的石英砂。
3.根据权利要求1所述的培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于：所述步骤（2）的消毒十字花科种子是：经质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10min的种子。
4.根据权利要求1所述的培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于：所述步骤（2）的MS基本培养液是：经常规高温高压灭菌后，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液将其pH值调节为6.2的MS基本培养液。
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