CN108570442A - 一种炭疽菌的快速诱导产孢方法 - Google Patents

一种炭疽菌的快速诱导产孢方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，步骤是；A、将分离得到的炭疽菌菌株转接到PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中避光培养3‑4d，进行活化；B、在超净工作台中用无菌打孔器从PDA平板中的菌落边缘截取菌丝块；C、用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.1593μg/ml的PDA平板中央，置于28℃条件下避光或光照培养4d；D、培养4d后，在平板表面能够看见大量粉红色的分生孢子堆，每个培养皿上分生孢子产量达到1.1×105个/cm2以上。方法易行，操作简便，相比现有技术培养条件容易控制，培养时间短，能够获得特征稳定的分生孢子，且易于观察产孢表型，以便更加准确的进行炭疽菌的物种鉴定。

Description

一种炭疽菌的快速诱导产孢方法
技术领域
本发明属于植物病原真菌诱导产孢技术领域，更具体涉及一种炭疽菌的快速诱导产孢方法。
背景技术
炭疽菌属真菌(Colletotrichum spp.)是非常重要的植物病原真菌，寄主范围十分广泛，可以侵染多种草本和木本植物引起植物炭疽病，是全球十大重要病害之一。近年来关于炭疽菌的分类鉴定、致病性及致病机制等研究逐渐引起关注，而诱导产孢一直是分类鉴定研究中的关键环节，如何快速简易地获得大量孢子在很大程度上决定着研究的进展及成败。但是在现有培养技术下，炭疽菌在分离、培养过程中，人工培养时易出现不产生分生孢子或难产生分生孢子现象，导致无法顺利开展炭疽菌的鉴定研究。同时，产孢表型观察无法与分生孢子产生同时开展，往往需要多次再培养进行产孢表型观察，耗费大量时间和实验成本。
目前促进炭疽菌产孢的主要方法是利用日光或近紫外光照射、改变碳氮源、改用贫瘠的培养基等方式破坏其正常的生长环境，或在菌丝体上放置宿主植物组织等诱导其产孢，但这些方法均存在以下几个缺点：(1)促进产孢的效果不明显，产孢量少，产孢表型难于观察；(2)培养周期长，往往经过长时间的培养才会产孢；(3)诱导产孢过程繁琐。
因此，寻求一种操作方便、易于获得特征稳定的分生孢子并可以同时进行产孢表型观察的炭疽菌培养方法，对于炭疽菌的物种鉴定具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是在于提供了一种诱导炭疽菌产孢的方法，方法易行，操作简便，相比现有技术培养条件容易控制，培养时间短，能够获得特征稳定的分生孢子，且易于观察产孢表型，以便更加准确的进行炭疽菌的物种鉴定。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
1、将分离得到的炭疽菌菌株转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28 －32℃恒温培养箱中避光培养3-4d，进行活化。
所述的PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
2、在超净工作台中用无菌打孔器从PDA平板中的菌落边缘截取菌丝块；
3、用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.0319－7.9667μg/ml或咪鲜胺浓度为0.0016－0.8080μg/ml的PDA平板中央，置于26－30℃条件下避光或光照培养3－5d；
4、培养3－5d后，在平板表面能够看见大量粉红色的分生孢子堆，每个培养皿上分生孢子产量可达到1.1×105个/cm2以上。
所用的炭疽菌菌株(现有，市场上购买)，采用常规病原分离方法分离自发病草莓叶片。分离方法如下：从草莓种植户的大棚内采集萎蔫的植株，将病害样品从根颈处切开，将其中变色的组织切成0.5cm×0.5cm的小块，置于0.1％升汞中1min，然后用无菌水清洗3次，每次至少1min。将经过表面消毒的病组织置于含有乳酸的PDA平板上，置于28℃恒温培养箱中持续光照培养3—5d，从新长出的菌落边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA平板上进一步分离。
通过上述的技术措施：最关键的是步骤3，主要解决了炭疽菌在PDA等常见培养基上不产孢、产孢量少或产孢不稳定的难点。通过在培养基中添加低剂量的苯醚甲环唑、咪鲜胺等甾醇生物合成抑制剂能够显著诱导炭疽菌稳定产生大量分生孢子。
其工作机理是：申请人研究发现：低剂量的苯醚甲环唑、咪鲜胺等甾醇生物合成抑制剂(DMI)具有诱导炭疽菌产孢的作用。基于此发现利用在普通培养基中加入低剂量苯醚甲环唑、咪鲜胺等甾醇生物合成抑制剂，诱导炭疽菌产孢。
通过运用本方法与真菌常用的诱导产孢方法，对21个炭疽菌菌株(对应5种不同的炭疽菌属真菌)进行诱导产孢，基于每皿上的分生孢子产量指标，证实本方法的实用性及可靠性；炭疽菌属真菌的快速诱导产孢方法在很大程度促进了该菌的孢子形态观察、分类及致病性的相关研究，有着重要的理论学术意义和较高的经济价值。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：
1、通过低剂量DMI杀菌剂诱导炭疽菌菌丝体在4d内快速产生大量分生孢子；
2、利用低剂量DMI杀菌剂诱导的方式，能快速简易地诱导纯培养菌丝产孢用于真菌的形态鉴定，为其它真菌的诱导产孢技术开发提供了重要的实践经验；
3、用于炭疽菌的快速简易诱导产孢，将大大提高其产孢效率，缩短鉴定周期，有效节约了人力物力及科研工作者的大量宝贵时间，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。
附图说明
图1为一种炭疽菌的培养形态图。
对附图中的有关情况说明如下：Colletotrichum siamense、C.fructicola、C.aenigma,C. gloeosporioides和C.nymphaeae在含有0μg/ml、0.1593μg/ml或1.5933μg/ml苯醚甲环唑的 PDA培养基上的生长情况。当PDA培养基中的苯醚甲环唑含量为0.1593μg/ml或1.5933 μg/ml时，能用肉眼看见平板上产生大量粉红色分生孢子。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。试验地点：湖北省农业科学院经济作物研究所植物生物技术研究室
试验时间：2016年-2017年
实施例1：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是：
1、将分离得到的5个C.siamense菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28或30℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、在超净工作台中用无菌打孔器从PDA平板中的菌落边缘截取菌丝块；
3、用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.1593μg/ml的 PDA平板中央，然后将平板置于26或28或30℃条件下避光或光照培养3或4d；
4、采用孔径为0.5cm打孔器从平板上均匀截取9个菌丝块，放于5ml离心管中。加入2ml 无菌水并剧烈振荡5min，将菌丝块上的分生孢子洗下来。用血球计数板测量分生孢子悬浮液的孢子浓度，计算单位面积平板中的分生孢子产量。
所述的PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
所用的炭疽菌菌株，采用常规病原分离方法分离自发病草莓叶片。分离方法如下：从草莓种植户的大棚内采集萎蔫的植株，将病害样品从根颈处切开，将其中变色的组织切成0.5cm×0.5cm的小块，置于0.1％升汞中1min，然后用无菌水清洗3次，每次至少1 min。将经过表面消毒的病组织置于含有乳酸的PDA平板上，置于28℃恒温培养箱中持续光照培养3—5d，从新长出的菌落边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA平板上进一步分离。试验地点：湖北省农业科学院经济作物研究所植物生物技术研究室。试验时间：2016年 -2017年。
培养4d后，在平板表面看见大量粉红色的分生孢子堆。用血球计数板测得5个菌株的平均分生孢子产量为5.2×105个/cm2。
实施例2：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
1、将分离得到的4个C.fructicola菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28或30℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、除所用菌株外，其它均与实施例1相同。
培养3或4或5d后，在平板表面看见大量粉红色的分生孢子堆。用血球计数板测得4个菌株的平均分生孢子产量为2.0×105个/cm2。
不同的实施例除了所用菌株的种类不同，其它基本与发明一致。
以说明本方法可应用于不同种类的炭疽菌。
实施例3：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
1、将分离得到的4个C.aenigma菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28或32℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、除所用菌株外，其它均与实施例1相同。
培养3或4或5d后，在平板表面看见大量粉红色的分生孢子堆。用血球计数板测得4个菌株的平均分生孢子产量为1.58×106个/cm2。
不同的实施例除了所用菌株的种类不同，其它基本与发明一致。
以说明本方法可应用于不同种类的炭疽菌。
实施例4：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
1、将分离得到的5个C.gloeosporioides菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28或29或31℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、除所用菌株外，其它均与实施例1相同。
培养3或4或5d后，在平板表面看见大量粉红色的分生孢子堆。用血球计数板测得5个菌株的平均分生孢子产量为1.1×105个/cm2。
不同的实施例除了所用菌株的种类不同，其它基本与发明一致。
以说明本方法可应用于不同种类的炭疽菌。
实施例5：
一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
1、将分离得到的3个C.nymphaeae菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28或30℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、除所用菌株外，其它均与实施例1相同。
培养4d后，在平板表面看见大量粉红色的分生孢子堆。用血球计数板测得3个菌株的平均分生孢子产量为6.94×106个/cm2。
不同的实施例除了所用菌株的种类不同，其它基本与发明一致。
以说明本方法可应用于不同种类的炭疽菌。
对比例1：
1、将分离得到的5个C.siamense菌株(现有，市场上购买)，4个C.fructicola菌株(现有，市场上购买)，4个C.aenigma菌株(现有，市场上购买)，5个C.gloeosporioides菌株(现有，市场上购买)，3个C.nymphaeae菌株(现有，市场上购买)分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中避光培养3或4d，进行活化。
2、在超净工作台中用无菌打孔器从PDA平板中的菌落边缘截取菌丝块；
3、用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于PDA平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
4、采用孔径为0.5cm打孔器从平板上均匀截取9个菌丝块，放于5ml离心管中。加入2ml无菌水并剧烈振荡5min，将菌丝块上的分生孢子洗下来。用血球计数板测量分生孢子悬浮液的孢子浓度，计算单位面积平板中的分生孢子产量。
所述的PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
试验地点：湖北省农业科学院经济作物研究所植物生物技术研究室。
试验时间：2016年-2017年
对比例2：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.0319μg/ml的 PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例3：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.0797μg/ml的 PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例4：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.7967μg/ml的 PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例5：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为1.5933μg/ml的 PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例6：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为7.9667μg/ml的 PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例7：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.0016μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例8：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.0081μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例9：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.0081μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例10：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.0808μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例11：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.1620μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例12：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪鲜胺浓度为0.8080μg/ml的PDA 固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例13：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于PSA(马铃薯蔗糖琼脂培养基)固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
马铃薯蔗糖琼脂配方：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，定容至1L。
对比例14：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于咪PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃和近紫外光、日光混合光照条件下培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
对比例15：
用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于1/2浓度PDA固体平板中央。然后将平板置于28℃条件下避光或光照培养4d；
不同的对比例除了所用培养基的种类、其中添加的甾醇生物合成抑制剂种类及浓度不同，其它基本与发明一致。
以说明两种甾醇生物合成抑制剂(苯醚甲环唑、咪鲜胺)在最大效应浓度下均可诱导炭疽菌产孢，本方法所用试剂种类和浓度为最佳配比。
试验结果表：
说明：-：没有分生孢子产生；+：分生孢子产量为1×104-1×105个/cm2；++：分生孢子产量为1×105-5×105个/cm2；+++：分生孢子产量为5×105-1×106个/cm2；++++：分生孢子产量为1×106-2×106个/cm2；+++++：分生孢子产量为大于200；ND：未测试(当培养基中的甾醇生物合成抑制剂大于一定剂浓度后，炭疽菌的生长受到完全抑制，无法检测分生孢子产量) 。

Claims (1)

1.一种炭疽菌的快速诱导产孢方法，其步骤是；
(1)将分离得到的炭疽菌菌株转接到PDA培养基平板上，置于28－32℃恒温培养箱中避光培养3-4d，进行活化；
(2)在超净工作台中用无菌打孔器从PDA平板中的菌落边缘截取菌丝块；
(3)用接种针将菌丝块挑取，长有菌丝的一面朝下置于苯醚甲环浓度为0.0319－7.9667μg/ml或咪鲜胺浓度为0.0016－0.8080μg/ml的PDA平板中央，置于26－30℃条件下避光或光照培养3－5d；
(4)培养3－5d后，在平板表面能够看见大量粉红色的分生孢子堆，每个培养皿上分生孢子产量可达到1.1×105个/cm2以上；
所述的PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
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