CN105441332A - 一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物农药制剂，具体的涉及一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用。发明人首次从柞蚕僵蚕中分离出一种白僵菌，进一步的致病性结果显示，从柞蚕僵蚕上分离出的白僵菌具有很好的杀虫效果。本发明提供了一株新的白僵菌菌株，具有很好的实际应用价值。

Description

一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物农药制剂，具体的涉及一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用，更具体的涉及从柞蚕中分离的白僵菌、白僵菌的分离方法及其在制备生物农药制剂中的应用。

背景技术

白僵菌(Beauveriabassiana)是一种半知菌类的虫生真菌，具有营养器官-菌丝和繁殖器官-分生孢子，菌丝有横隔有分枝。白僵菌的分布范围很广，从海拔几米至2000多米的高山均发现过白僵菌的存在，可侵入15个目149个科521个属的700多种昆虫及螨类的虫体内大量繁殖，同时不断产生白僵素和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，使体液机能发生变化，打乱新陈代谢以致死亡。所谓白僵虫就是白僵菌的分生孢子落在昆虫体上，在合适温湿条件下，即可发芽直接侵入昆虫体内，以昆虫体内的血细胞及其他组织细胞作为营养，大量增殖，以后菌丝穿出体表，产生白粉状分生孢子，从而使害虫呈白色僵死状，称为白僵虫。

由于白僵菌具有符合生物制剂的一些基本要求、即对温血动物和植物无害、容易培养、致病力强、防治害虫效果好和广谱等优点，寄主广泛，高度致病性与适应性，使得其菌种在农、林害虫的生物防治中得到广泛运用。

蛴螬是金龟甲的幼虫，别名白土蚕、核桃虫。成虫通称为金龟甲或金龟子。危害多种植物和蔬菜。按其食性可分为植食性、粪食性、腐食性三类。其中植食性蛴螬食性广泛，危害多种农作物、经济作物和花卉苗木，喜食刚播种的种子、根、块茎以及幼苗，是世界性的地下害虫，危害很大。

发明人首次从柞蚕僵蚕中分离出一种白僵菌，经测序显示其与菌株Beauveriabassiana(GenBank:KM205065.1)的相识度为99％。进一步的致病性结果显示，从柞蚕僵蚕上分离出的白僵菌具有很好的杀虫效果。本发明提供了一株新的白僵菌菌株，具有很好的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种从柞蚕僵蚕中分离出的白僵菌菌株[Beauveriavuillemin]，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏日期：2015年8月24日，保藏编号：CGMCCNo.11272。

进一步，所述白僵菌菌株ITS序列为序列表SEQIDNO.3。

本发明的目的在于提供一种微生物制剂，所述微生物制剂中含有上述白僵菌菌株。

进一步，所述微生物制剂中含有上述白僵菌的菌丝和/或分生孢子和/或白僵素和/或纤细素和/或卵孢素。

白僵菌是一种半知菌类的虫生真菌，具有营养器官(菌丝)和繁殖器官(分生孢子)，菌丝有横隔有分枝。白僵菌分生孢子在寄主表皮或气孔、消化道上，遇适宜条件开始萌发，出生芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶溶解昆虫的表皮，由芽管入侵虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主体内养分，形成大量菌丝和孢子，布满虫体全身。同时产生各种毒素，如白僵菌素(Beauvericin)，纤细素(Tenellin)和卵孢素(Oosporein)等。白僵菌素是从球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌丝体内纯化出来的。该毒素是一环状三羧酸肽，由3个相同的D2α2羟异戊基-L-N-苯基组成的环状化合物。该毒素为白色针状晶体，耐热、较稳定，100℃下1h仍保持毒性。该毒素可致细胞核变形、组织崩解。

更进一步，述微生物制剂中含有辅料或助剂。优选的，所述的助剂是润湿剂、分散剂或稳定剂。

本发明的目的在于提供一种从柞蚕僵蚕中分离白僵菌的方法，具体步骤为：

1)采集被白僵菌侵染后的柞蚕僵蚕，消毒后用无菌水冲洗；

2)采用无菌操作取出僵虫体内组织放置到固体培养基上，置于5-30℃恒温培养箱中培养1-7d；

3)待长出菌落，挑取少量菌丝体制片观察，进行初步鉴定。

优选的，一种从柞蚕僵蚕中分离白僵菌的方法，具体步骤为：

1)野外采集到的被白僵菌侵染后的柞蚕僵蚕，用升汞溶液浸泡10-120s，倒去升汞溶液后用无菌水冲洗；

2)用无菌镊子夹取，放置于灭过菌的培养皿中，用无菌解剖刀将僵虫切开，取出体内组织放置到固体PDA培养基上，最后将平板放置于5-30℃恒温培养箱中培养1-7d；

3)待长出菌落，挑取少量菌丝体制片观察，进行初步鉴定。将平板放置于23-28℃恒温培养箱中培养。

优选的，所述升汞溶液为0.1％m/v升汞溶液。

进一步，从白僵菌的菌落边缘挑取菌丝块转接于另一PDA培养基平板继续培养观察，待培养至产生分生孢子时，取少量分生孢子粉用0.05％v/vTween80溶液配成低浓度的孢子悬浮液，再用划线培养法进行纯化。

本发明的目的在于提供一种微生物制剂的制备方法，具体步骤为：在无菌条件下，取权利要求1所述白僵菌菌株的分生孢子粉，配制成浓度为1×10⁶-3×10⁸个孢子/mL的孢子悬浮液，振荡混匀。优选5×10⁷个孢子/mL的孢子悬浮液。

优选的，所述一种微生物制剂的制备方法，具体步骤为：

1.取500μL的Tween80加水定容至1000mL，配制成0.05％v/vTween80溶液，混匀后灭菌。

2.在无菌条件下，分别取少量白僵菌菌株分生孢子粉，加适量的0.05％v/vTween80溶液配制成孢子悬浮液，振荡混匀后用血球计数板测定悬浮液中分生孢子浓度，并适当调整使之达到10⁷个/mL。

3.通过喷施白僵菌孢子悬浮液来获得致病的蛴螬。

本发明的目的在于提供上述的白僵菌菌株和/或微生物制剂的使用方法，所述使用方法为喷雾法或喷粉法或土壤处理法。所述喷雾法是指，将菌粉配制成浓度为1×10⁶-3×10⁸孢子\ml菌液，用喷雾器将菌液均匀喷洒于虫体和枝叶上；所述喷粉法：将菌粉加入填充剂，稀释到1g含1×10⁶-3×10⁸个孢子的浓度，用喷粉器喷菌粉；所述土壤处理法：防治地下害虫，将“菌粉+细土”制成菌土，按每公顷用菌粉55kg，用细土450kg，混拌均匀制成菌土，含孢量在1×10⁶-3×10⁸亿\g左右。

本发明的目的在于提供上述的白僵菌菌株在制备微生物制剂中的应用。

本发明的目的在于提供上述微生物制剂在防治害虫中的应用。

进一步，所述害虫为下列中的几种或一种：蛴螬、松毛虫、玉米螟、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫。优选蛴螬。

附图说明

图1白僵菌提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳图

图2ITS序列的PCR扩增图，泳道1：MarkerDL2000；泳道2：空白对照；泳道3-6：白僵菌DNA的PCR

图3白僵菌感染蛴螬图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

本发明所述的白僵菌为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏日期：2015年8月24日，保藏编号：CGMCCNo.11272。

实施例1菌株的分离纯化

1.野外采集到的被虫生真菌侵染后的柞蚕僵蚕，用0.1％升汞溶液浸泡30-60s，倒去0.1％升汞溶液后用无菌水冲洗3次；

2.用无菌镊子夹取，放置于灭过菌的培养皿中，用无菌解剖刀将僵虫切开，取出体内组织约0.5cm²放置到固体PDA培养基上，最后将平板放置于28℃恒温培养箱中培养3-5d；

3.待长出菌落，挑取少量菌丝体制片观察，进行初步鉴定。

4.从鉴定为白僵菌的菌落边缘挑取菌丝块转接于另一培养基平板继续培养观察，待培养至产生分生孢子时，取少量分生孢子粉用0.05％Tween80溶液配成低浓度的孢子悬浮液，再用划线培养法进行纯化。

实施例2菌株的初步鉴定结果

纯化后获得的白僵菌进行液体培养，培养36小时左右，收集菌体进行DNA提取，提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳确定DNA的完整性和浓度，结果见图1。

在rDNA基因中5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为(ITS)，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行RFLP或序列分析，可用于对细菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。甚至用于区分关系非常近的种。因为核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。故而发明进一步采用引物F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQIDNO.1)和引物R：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQIDNO.2)进行ITS序列的PCR扩增，扩增结果见图2，扩增序列送往公司进行测序，测序结果为：

TTCCTCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTCGAGGTCAACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGGTTAGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTAACTTCC(SEQIDNO.3)

进而将上述序列与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其与菌株Beauveriabassiana(GenBank:KM205065.1)的相识度为99％。显示本发明所述的白僵菌菌株属于球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。

实施例3白僵菌致病性的测定

一、实验材料：

共两种白僵菌：白僵菌A是本发明提供的白僵菌；白僵菌B是购自中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所。辽宁省庄河蓝莓主栽地捕捉蛴螬，放入饲养缸内进行人工饲养。

二、实验方法：

1.取500μL的Tween80加水定容至1000mL，配制成0.05％Tween80溶液，混匀后灭菌。

2.在无菌条件下，分别取少量白僵菌菌株分生孢子粉，加适量的0.05％Tween80溶液配制成孢子悬浮液，振荡混匀后用血球计数板测定悬浮液中分生孢子浓度，并适当调整使之达到10⁷个/mL。

3.通过喷施白僵菌孢子悬浮液来获得致病的蛴螬。

三、实验结果：

结果显示白僵菌A感染蛴螬成功，白僵菌B感染蛴螬失败(具体见图3)，显示本发明提供的白僵菌菌株对蛴螬具有很好的防治效果。

Claims (10)

1.一种白僵菌菌株，其特征在于，所述白僵菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏日期：2015年8月24日，保藏编号：CGMCCNo.11272。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有权利要求1所述的白僵菌菌株。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有权利要求1所述的白僵菌的菌丝和/或分生孢子和/或白僵素和/或纤细素和/或卵孢素。

4.根据权利要求2或3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有辅料或助剂。

5.一种权利要求1所述的白僵菌菌株的分离方法，具体步骤为：

1)采集被白僵菌侵染后的柞蚕虫尸，消毒后用无菌水冲洗；

2)采用无菌操作取出僵虫体内组织放置到固体培养基上，置于26℃恒温培养箱中培养7d左右；

3)待长出菌落，挑取少量菌丝体制片观察，进行初步鉴定。

6.一种权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，具体步骤为：在无菌条件下，取权利要求1所述白僵菌菌株的分生孢子粉，配制成浓度为5×10⁷个孢子/mL的孢子悬浮液，振荡混匀。

7.权利要求1所述的白僵菌菌株和/或权利要求2-4所述的微生物制剂的使用方法，其特征在于，所述使用方法为喷雾法或喷粉法或土壤处理法。

8.一种权利要求1所述的白僵菌菌株在制备微生物制剂中的应用。

9.权利要求2-4所述的微生物制剂在防治害虫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述害虫为下列中的几种或一种：蛴螬、松毛虫、玉米螟、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫。