CN117701395A - 一种平沙绿僵菌及其应用 - Google Patents

一种平沙绿僵菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117701395A
CN117701395A CN202311190119.5A CN202311190119A CN117701395A CN 117701395 A CN117701395 A CN 117701395A CN 202311190119 A CN202311190119 A CN 202311190119A CN 117701395 A CN117701395 A CN 117701395A
Authority
CN
China
Prior art keywords
metarhizium anisopliae
plant
progeny
pests
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202311190119.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117701395B (zh
Inventor
陈娟
李书萌
颜莹
梁均钿
蒋先芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Muen Biotechnology Co ltd
Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Original Assignee
Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moon Guangzhou Biotech Co ltd filed Critical Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Publication of CN117701395A publication Critical patent/CN117701395A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117701395B publication Critical patent/CN117701395B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种平沙绿僵菌及其应用。平沙绿僵菌(Metarhizium pinghaense)MN117439，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61333，保藏时间为2020年12月1日。所述的平沙绿僵菌，具有防治害虫和促进植物生长的功效。

Description

一种平沙绿僵菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种平沙绿僵菌及其应用。
背景技术
绿僵菌(Metarhizium)是一类重要的虫生真菌，约有200多种害虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌的孢子可以附着在害虫表皮，穿透表皮入侵到害虫体内，利用害虫营养生长繁殖并分泌毒素直至害虫死亡。害虫死亡后的尸体又可以释放新的孢子，经传播感染其他害虫。绿僵菌属目前在全世界范围内拥有约30个物种，不同的绿僵菌属物种能侵染致死的害虫的范围不同，毒性也有差异。目前研究最多并且已经在多个地区注册的绿僵菌产品大多为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。此外也有报道黄绿绿僵菌(Metarhiziumflavoviride)杀烟粉虱，蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)杀蝗虫的报道。平沙绿僵菌是在1986年在广东省发现的绿僵菌属新物种，分离自甘蔗金龟子(Alissonotum sp.)幼虫体。其区别于其他绿僵菌种的特点是菌落颜色始终不变黑，分生孢子两端对称，分子孢子链连接点在同一中心轴上。
东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))直翅目，蝗科，迁飞性杂食性害虫，是导致我国蝗灾发生的首要害虫。目前，蝗虫的主要控制手段是化学防治，化学农药大量长期施用已经造成蝗区严重的环境污染，使蝗区生态平衡受到破坏,蝗虫灾害的发生与治理进入恶性循环。因此，使用环境友好的生物农药替代化学农药将成为今后控制蝗虫的重要发展方向。杀虫真菌具有资源丰富、安全、不杀伤非目标生物、可持续控制、害虫不易产生抗药性等优点。杀蝗绿僵菌生物农药作为蝗虫防治中最重要的可持续的生物防治手段，已被联合国粮农组织(FAO)推荐为环保产品推广应用，但目前仅有金龟子绿僵菌一种生物药剂。
现有技术中报道的绿僵菌多数用于林间害虫防治，如金针虫。
已经报道的通过室内分离得到的具有毒力的绿僵菌菌株很多，但是在田间实际应用的防治效果很差，致使能通过登记的绿僵菌商品制剂屈指可数，且产品集中在金龟子绿僵菌，对于其他绿僵菌，能够真正大面积推广的，且应用于田间害虫并且具有良好防效的绿僵菌商品制剂更为罕见。田间环境复杂，造成绿僵菌防效低且不稳定；
报道的平沙绿僵菌NJMP2103，1×105孢子/mL浓度的孢子悬浮液处理褐飞虱，在1×104孢子/mL,1×105孢子/mL浓度,1×106孢子/mL浓度之间的防效无显著性差异，且浓度越高呈现防效下降的趋势，在第六天仅达到60％的校正死亡率(褐飞虱生防真菌平沙绿僵菌和球孢白僵菌的筛选与评价，褚夫华，万方硕士论文数据库)。
此外，如果需要大规模用于田间，需要产孢快且产孢量大的特定菌株；而已经报道的平沙绿僵菌菌株30°下培养48h孢子萌发率最高仅仅达到48％(一株平沙绿僵菌的鉴定及生防应用潜力评价，杨帆等)；而WP08菌株在SDA培养基上产孢量为0,在PPDA培养基上第14天为2.48±0.36×107孢子/cm2；PDA培养基上第14天为1.72±1.128×107孢子/cm2(一株绿僵菌的鉴定及其生物学特性研究，张亚波等)。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个方面，涉及平沙绿僵菌(Metarhizium pinghaense)MN117439或其变体或其后代，所述平沙绿僵菌MN117439保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61333，保藏时间为2020年12月1日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述平沙绿僵菌在SDAY培养基28℃培养，5天菌落直径可达2.67cm，10天5.12cm，15天6.65cm。菌落初期白色，质地绒毛状，成熟时产生橄榄绿色的分生孢子。最适生长温度20～30℃。
优选地，所述变体或后代与所述平沙绿僵菌MN117439具有相似或相同的功能。
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439的变体或后代与所述平沙绿僵菌MN117439具有相似或相同的生理生化特性。
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439具有选自下列的一项或多项功能：
(1)防治植物虫害；
(2)促进植物生长。
优选地，所述植物虫害为鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种引起的植物虫害。
优选地，所述植物虫害为稻飞虱、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾、茶尺蠖、飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉、柑橘木虱、黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇、蚊、东亚飞蝗、二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种引起的植物虫害。
本发明的另一个方面，还涉及一种组合物，其包含所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代；
优选地，所述组合物还包含一种或多种另外的生物防治剂，一种或多种化学药物，或其任意组合；
优选地，所述组合物还包含农业上或园艺上可接受的稀释剂，填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防腐剂、防冻剂、增稠剂、佐剂，或其任意组合；
优选地，所述另外的生物防治剂选自细菌、真菌、病毒、昆虫或线虫中的至少一种；
优选地，所述化学药物选自除草剂、杀虫剂、抗菌剂、抗病毒剂、植物生长调节剂、抗生素或肥料中的至少一种。
本发明的另一个方面，还涉及微生物菌剂，其包括所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代的孢子，和/或平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代的代谢产物。
本发明的另一个方面，还涉及杀虫剂，其包括所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或所述组合物，或所述微生物菌剂；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439 14d产孢量为0.66×108孢子/cm2；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439 24小时孢子的萌发率可达94％以上；
优选地，所述杀虫剂还包括农药上可接受的农药助剂；
优选地，所述杀虫剂被配制成可润湿的粉末、喷雾干燥的配制物或稳定的配制物；
优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；
优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括稻飞虱、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾、茶尺蠖、飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉、柑橘木虱、黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇、蚊、东亚飞蝗、二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种；
优选地，所述平沙绿僵菌对蝗虫的致死中时LT50为0.132d。
优选地，所述植物包括玉米、大豆、稻子、小麦中的至少一种。
本发明的另一个方面，还涉及促生剂，其包括所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或所述组合物，或所述微生物菌剂。
本发明的另一个方面，还涉及一种防治植物虫害的方法，将所述杀虫剂施用于植物、植物组织或植物器官。
本发明的另一个方面，还涉及一种植物促生方法，使用所述的促生剂对植物进行促生。
所述植物包括但不限于玉米、大豆、稻子和小麦。
本发明的另一个方面，还涉及所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或所述组合物，或所述微生物菌剂或所述杀虫剂在害虫防治中的应用。
本发明的另一个方面，还涉及所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或所述组合物，或所述微生物菌剂或所述杀虫剂在植物促生中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的平沙绿僵菌MN117439，营养要求简单，培养方法简单，生长迅速，产孢快且产孢能力强。
(2)本发明提供的平沙绿僵菌MN117439，对蝗虫等害虫具有高致病力，对东亚飞蝗3龄蝗蝻杀虫毒力强，室内毒力测定发现，在1×108孢子/mL浓度下，第一天对蝗虫的校正致死率达到82.22％；致死中时LT50为0.132d天95％致死浓度为1.05*106孢子/mL；在1×108孢子/mL浓度下，6d时绿僵菌对蝗虫的累计校正致死率为100％，致死中时(LT50)为0.132d，死亡蝗虫回接僵虫率为97％，利用该菌株能有效地控制蝗虫的种群数量；该菌株且无毒无污染，不会破坏生态、不易产生抗药性、对非靶标生物无害，可广泛蝗虫的防治中。
(3)本发明提供的平沙绿僵菌MN117439，可用于植物的促生，具有较好的植物促生效果。
(4)本发明筛选的绿僵菌MN117439，产孢快且产孢量大，能大规模用于田间稻飞虱的防治，在田间应用时具有良好防治效果且稳定防效的平沙绿僵菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为平沙绿僵菌菌株GDMCC No:61333菌落形态图(正面)；
图2为平沙绿僵菌菌株GDMCC No:61333菌落形态图(背面)；
图3为平沙绿僵菌菌株GDMCC No:61333菌丝；
图4为平沙绿僵菌菌株GDMCC No:61333分生孢子；
图5为培养基上的僵虫；
图6为温度对菌株生长的影响；
图7为菌株GDMCC No:61333的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1菌株的分离、纯化与鉴定
1.实验方法
1.1分离、纯化
称土：采集到江西的农业土壤晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中。
洗土：用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。离心机10000rpm离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，反复离心清洗3次。
稀释沉淀：按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液。
涂布：用无菌水稀释10倍的上述沉淀悬浮液，用移液器吸取100μL至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，平板置于28℃黑暗培养2～7d。
真菌纯化：当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。
1.2形态学鉴定
将分离到的绿僵菌接种在SDAY培养基平板上28℃培养10～15天，观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。在培养4～5天时挑取白色菌丝做成制片，在显微镜下观察菌丝及分生孢子形态；产孢后挑取分生孢子做成制片观察分生孢子的大小及形态。鉴定结果见图1、图2、图3和图4。
1.3分子生物学鉴定
利用菌株的菌丝体提取基因组DNA，作为基因扩增的模板，对菌株进行多基因扩增及测序。需扩增的基因及引物为：
ITS:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)
BenA:Bt1F(5’-GGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCC-3’)和Bt1R(5’-CAGCCATCATGTTCTTAGGGTC-3’)
EF:983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’)和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’)
以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
模板DNA提取：根据Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux,Bioer Technology Co.,Ltd.)进行基因组DNA提取。
基因扩增反应体系：在PCR管配制反应体系2XTaq PCR Master Mix 12μL，DMSO 1μL，引物1引物2(10μmol/L)各0.6μL，ddH2O 10.8μL，模板DNA2μL。
基因扩增条件：预变性94℃4min；变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min，10℃保温5min。PCR后的样品送金唯智测序。
ITS测序结果见序列1；BenA测序结果见序列2；EF测序结果见序列3。
2.结果
该菌株在SDAY培养基上菌落初期白色，质地绒毛状，成熟时产生橄榄绿色的分生孢子。菌丝有隔；分生孢子单细胞，链状排列，长椭圆形、柱状，大小为(6.50～8.94)μm×(2.18～2.82)μm。
将测序的获得的序列与NCBI基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。经鉴定该菌株为平沙绿僵菌(Metarhizium pinghaense)，命名为MN117439。
基于多基因(ITS、BenA和EF)建立的系统发育树如图7所示，显示菌株GDMCC No:61333为Metarhizium pinghaense。
保藏信息：平沙绿僵菌(Metarhizium pinghaense)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61333，保藏时间为2020年12月1日。
实施例2绿僵菌的生物学测定
1实验方法
1.1温度对菌株生长的影响
将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃五个不同温度下恒温培养，每天测量菌落直径，每组3个重复。结果见图6。
1.2菌落生长速率测定
将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，做3个重复，每天定时测定其直径并记录数据，直到菌落长满培养基为止。
1.3产孢量测定
将100μl孢子悬浮液涂布于SDAY上，在28℃条件下培养10～15d后，用打孔器从平板上截取直径8mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入10mL 0.1％Tween80中，用血球计数板计数测定孢子浓度，再换算为每cm2平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值,作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。
1.4孢子萌发率测定
将培养10～15d的绿僵菌平板用0.1％Tween80洗下孢子，吸取10μl接种到1/4SDAY培养基上，每皿接种3处，置于相同条件的培养箱内培养24h，用400倍的显微镜随机观察，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发数并计算萌发率。
2.结果
温度对菌株生长的影响：从图6可以看出，菌株生长的最适温度为20～30℃，其中在25～28℃时生长最好。
产孢量和孢子萌发率：在SDAY培养基上培养至第14d产孢量就可达0.66×108孢子/cm2。产孢量较高。24小时孢子的萌发率可达94％以上。上述均说明该菌株营养要求简单、生长繁殖较快、产孢快，生物学特性良好。
实施例3对稻飞虱的田间实验防效
1.实验方法：将平沙绿僵菌MN117439菌粉配制成可湿性粉剂，二次稀释至1×107孢子/mL。采用背负式喷雾器，均匀喷施在水稻中下部，15d内重复施药2次。在实验开始前和实验开始后30d统计稻飞虱的种群数量。
2.实验结果：选取1×107孢子/mL浓度的菌剂进行田间实验，对田间稻飞虱的防效可达86.38％。
实施例4对害虫的致病力测定
1.实验方法
将供筛选菌株从-80℃取出，在SDAY平板上活化，28℃培养7～15d，直到产孢。用0.1％ Tween80将绿僵菌孢子洗下，用血球计数板计数，获得具体浓度的孢子悬浮液，再经过稀释或浓缩配制成1×105孢子/mL、1×106孢子/mL、1×107孢子/mL、1×108孢子/mL、1×109孢子/mL的悬浮液。
挑选好的大小、活性一致的3龄蝗蝻。用移液枪取10μl的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。以无菌的0.1％ Tween80水作为空白对照。每日喂新鲜小麦苗。置于28℃～30℃，RH 55％±5％，16L∶8D条件下培养，连续观察10d，记录死亡情况。蝗虫死亡判断，以镊子轻轻触碰蝗虫，不动则为死亡。
死亡蝗虫回接：此步骤验证蝗虫是否由绿僵菌侵染致死。对死亡蝗虫进行表面消毒，具体方法为75％酒精15s，0.05％次氯酸钠1min，无菌水1min清洗两次，然后在灭菌滤纸上晾干，最后把蝗虫放入SDAY培养基(含氯霉素和盐酸四环素)上，观察蝗虫表面是否长出绿僵菌，结果见图5。
与市售产品的毒力比较：选取常用杀虫剂溴氰菊酯(拜耳)和金龟子绿僵菌CQMa421(聚立信)进行对照。溴氰菊酯稀释1000倍，金龟子绿僵菌CQMa421和我们的平沙绿僵菌稀释为1×108孢子/mL，移液枪取10μl的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上。每个处理3个重复。
数据计算：
防效(％)＝[1-(处理区药后活虫数×对照区药前活虫数)/(处理区药前活虫数×对照区药后活虫数)]×100％。
2.结果
结果见表1、表2、表3和表4，表5，表6；实验结果表明，平沙绿僵菌MN117439对蝗虫有显著的致病效果。在不同浓度绿僵菌孢子悬浮液处理下，6d时致死中浓度(LC50)为6.86×105孢子/mL，95％致死浓度为1.05*106孢子/mL；在1×108孢子/mL浓度下，6d时绿僵菌对蝗虫的累计校正致死率为100％，致死中时(LT50)为0.132d，死亡蝗虫回接僵虫率为97％；本发明的平沙绿僵菌MN117439对蝗虫致死时间快，防效高；进一步比对市售的绿僵菌，可以看出本发明的平沙绿僵菌MN117439对蝗虫的致死时间显著低于市售金龟子绿僵菌CQMa421菌剂；上述结果表明，平沙绿僵菌MN117439具有开发为防治蝗虫的微生物农药的潜力。
表1平沙绿僵菌MN117439用于蝗虫的校正死亡率(％)
注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)，下表同。
表2平沙绿僵菌MN117439用于蝗虫的LC50回归方程及LC50
表3平沙绿僵菌MN117439用于蝗虫的LT50回归方程及LT50
表4平沙绿僵菌MN117439对蝗虫的室内毒力测试结果(1×108孢子/mL)
表5平沙绿僵菌MN117439和市售产品对蝗虫的室内毒力测试结果(1×108孢子/mL)
表6平沙绿僵菌MN117439对害虫的防治效果
害虫种类 防效(％) 害虫种类 防效(％)
草地贪夜蛾 30.47 甜菜夜蛾 88.62
二化螟 95.74 三化螟 89.95
小菜蛾 89.68 茶尺蠖 66.18
蛴螬 92 玉米螟 93
稻飞虱 86.38 灰飞虱 86.41
白背飞虱 93.56 烟粉虱 80.14
蚜虫 79.96 叶蝉 87.59
柑橘木虱 90 黑腹果蝇 95.21
家蝇 92.55 柑橘小实蝇 95.23
蚊 94.23 东亚飞蝗 100
二斑叶螨 22.31 柑橘全爪螨 75
实施例5绿僵菌对植物促生作用测定
选取健康且大小一致的玉米种子(郑单958)进行表面消毒后，将种子于1×107孢子/mL的平沙绿僵菌孢子悬液中浸泡4～6小时后播种，每盆播种5颗种子，共3盆，播种后向每颗种子浇灌1mL处理液。以无菌水为对照组，置于25℃温室，以12L:12D的光周期进行培育，实验期间定期往育苗盆及底盘补充水，保证水分充足。盆栽培育20d后，收获植株洗净后放入70℃烘箱烘至恒重后测量植物干重。结果见表7。
表7干重生长指标
结果显示相比于对照组，平沙绿僵菌MN117439处理组的玉米植株干重提高了2.91％，说明该菌株对植物生长具有一定的促生作用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (10)

1.平沙绿僵菌(Metarhizium pinghaense)MN117439或其变体或其后代，所述平沙绿僵菌MN117439保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61333，保藏时间为2020年12月1日。
2.权利要求1所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，其特征在于，其中，所述变体或后代与所述平沙绿僵菌MN117439具有相似或相同的功能；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439的变体或后代与所述平沙绿僵菌MN117439具有相似或相同的生理生化特性；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439具有选自下列的一项或多项功能：
(1)防治植物虫害；
(2)促进植物生长；
优选地，所述植物虫害为鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种引起的植物虫害；
优选地，所述植物虫害为稻飞虱、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾、茶尺蠖、飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉、柑橘木虱、黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇、蚊、东亚飞蝗、二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种引起的植物虫害。
3.一种组合物，其包括权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代；
优选地，所述组合物还包含一种或多种另外的生物防治剂，一种或多种化学药物，或其任意组合；
优选地，所述组合物还包含农业上或园艺上可接受的稀释剂，填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防腐剂、防冻剂、增稠剂、佐剂，或其任意组合；
优选地，所述另外的生物防治剂选自细菌、真菌、病毒、昆虫或线虫中的至少一种；
优选地，所述化学药物选自除草剂、杀虫剂、抗菌剂、抗病毒剂、植物生长调节剂、抗生素或肥料中的至少一种。
4.微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，所述平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代的孢子，和/或平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代的代谢产物。
5.杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439 14天的产孢量为0.66×108孢子/cm2；
优选地，所述平沙绿僵菌MN117439 24小时孢子的萌发率可达94％以上；
优选地，所述杀虫剂还包括农药上可接受的农药助剂；
优选地，所述杀虫剂被配制成可润湿的粉末、喷雾干燥的配制物或稳定的配制物；
优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目害虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；
优选地，所述杀虫剂防治害虫的种类包括稻飞虱、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾、茶尺蠖、飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉、柑橘木虱、黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇、蚊、东亚飞蝗、二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种；
优选地，所述平沙绿僵菌对蝗虫的致死中时LT50为0.132d；
优选地，所述植物包括玉米、大豆、稻子或小麦中的至少一种。
6.促生剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂。
7.一种防治植物虫害的方法，其特征在于，将权利要求5所述的杀虫剂施用于植物、植物组织或植物器官。
8.一种植物促生方法，其特征在于，使用权利要求6所述的促生剂对植物进行促生。
9.权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂或权利要求5所述的杀虫剂在害虫防治中的应用。
10.权利要求1或2所述的平沙绿僵菌MN117439或其变体或其后代，或权利要求3所述的组合物，或权利要求4所述的微生物菌剂或权利要求6所述的促生剂在植物促生中的应用。
CN202311190119.5A 2022-09-15 2023-09-14 一种平沙绿僵菌及其应用 Active CN117701395B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022111249169 2022-09-15
CN202211124916 2022-09-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117701395A true CN117701395A (zh) 2024-03-15
CN117701395B CN117701395B (zh) 2024-06-04

Family

ID=88884880

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410405403.8A Pending CN118383389A (zh) 2022-09-15 2023-02-28 一种复合型微生物组合物及其应用
CN202310178138.XA Active CN117136968B (zh) 2022-09-15 2023-02-28 一种复合型微生物组合物及其应用
CN202311190119.5A Active CN117701395B (zh) 2022-09-15 2023-09-14 一种平沙绿僵菌及其应用

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410405403.8A Pending CN118383389A (zh) 2022-09-15 2023-02-28 一种复合型微生物组合物及其应用
CN202310178138.XA Active CN117136968B (zh) 2022-09-15 2023-02-28 一种复合型微生物组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN118383389A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117736877A (zh) * 2022-09-20 2024-03-22 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种绿僵菌菌株及其应用
CN117701395B (zh) * 2022-09-15 2024-06-04 湖南慕恩生物科技有限公司 一种平沙绿僵菌及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274007A (zh) * 2015-07-27 2016-01-27 华南农业大学 一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用
CN106479904A (zh) * 2016-11-30 2017-03-08 南京农业大学 一株平沙绿僵菌及其应用
CN110551637A (zh) * 2019-09-03 2019-12-10 黑龙江省农业科学院植物保护研究所 一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用
CN110669676A (zh) * 2019-10-25 2020-01-10 云南农业大学 莱氏绿僵菌mrjcbt190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用
CN110684669A (zh) * 2019-03-07 2020-01-14 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株壳青霉及其应用
US20200170259A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-04 Advanced Biological Marketing, Inc. Compositions and methods for inducing plant gene expression and altering plant microbiome composition for improved crop performance
CN112646735A (zh) * 2021-01-21 2021-04-13 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用
CN117136968A (zh) * 2022-09-15 2023-12-01 慕恩（北京）生物科技有限公司 一种复合型微生物组合物及其应用
CN117187078A (zh) * 2023-09-04 2023-12-08 中国农业科学院茶叶研究所 一株平沙绿僵菌及其在防治茶丽纹象甲中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107793263B (zh) * 2017-10-24 2021-05-14 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株高效解磷菌的应用
CN109022292B (zh) * 2018-08-16 2021-03-16 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株木霉及其在农业领域的应用
CN114287447A (zh) * 2021-11-25 2022-04-08 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种竹林金针虫的生物防治方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274007A (zh) * 2015-07-27 2016-01-27 华南农业大学 一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用
CN106479904A (zh) * 2016-11-30 2017-03-08 南京农业大学 一株平沙绿僵菌及其应用
US20200170259A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-04 Advanced Biological Marketing, Inc. Compositions and methods for inducing plant gene expression and altering plant microbiome composition for improved crop performance
CN110684669A (zh) * 2019-03-07 2020-01-14 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株壳青霉及其应用
CN110551637A (zh) * 2019-09-03 2019-12-10 黑龙江省农业科学院植物保护研究所 一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用
CN110669676A (zh) * 2019-10-25 2020-01-10 云南农业大学 莱氏绿僵菌mrjcbt190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用
CN112646735A (zh) * 2021-01-21 2021-04-13 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用
CN117136968A (zh) * 2022-09-15 2023-12-01 慕恩（北京）生物科技有限公司 一种复合型微生物组合物及其应用
CN117187078A (zh) * 2023-09-04 2023-12-08 中国农业科学院茶叶研究所 一株平沙绿僵菌及其在防治茶丽纹象甲中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRIYANKA J. CHAUDHARY等: "Plant Growth-Promoting Potential of Entomopathogenic Fungus Metarhizium pinghaense AAUBC-M26 under Elevated Salt Stress in Tomato", 《AGRONOMY》, 11 June 2023 (2023-06-11) *
TAE YOUNG SHIN等: "The complete mitogenome of the entomopathogenic fungus Metarhizium pinghaense 15R", 《MITOCHONDRIAL DNA PART B: RESOURCES》, 18 December 2023 (2023-12-18) *
吴盼盼;吴小双;舒金平;徐天森;张亚波;王浩杰;: "平沙绿僵菌wp08菌株固态发酵条件的优化", 林业科技开发, no. 01, 15 January 2013 (2013-01-15) *
杨帆;刘春来;王爽;刘亮;李新民;: "一株平沙绿僵菌的鉴定及生防应用潜力评价", 植物保护, no. 05, 8 October 2018 (2018-10-08) *
蒋先芝;杨恩策;刘杏忠;: "真菌和昆虫的互作关系及协同进化", 前沿科学, no. 01, 28 March 2009 (2009-03-28) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117701395B (zh) * 2022-09-15 2024-06-04 湖南慕恩生物科技有限公司 一种平沙绿僵菌及其应用
CN117736877A (zh) * 2022-09-20 2024-03-22 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种绿僵菌菌株及其应用
CN117736877B (zh) * 2022-09-20 2024-06-11 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种绿僵菌菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN118383389A (zh) 2024-07-26
CN117136968B (zh) 2024-05-24
CN117701395B (zh) 2024-06-04
CN117136968A (zh) 2023-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Clifton et al. Effects of endophytic entomopathogenic fungi on soybean aphid and identification of Metarhizium isolates from agricultural fields
CN111187726B (zh) 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的稻瘟病杀菌剂
CN117701395B (zh) 一种平沙绿僵菌及其应用
CN111100805B (zh) 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的水稻纹枯病杀菌剂
CN108315267B (zh) 短密木霉gsaamlshu-1及其应用
Shi et al. Antifungal and plant growth-promoting activities of Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259
CN112646735B (zh) 一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用
CN114410484B (zh) 一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用
CN110200016B (zh) 防治马铃薯疮痂病并能促进马铃薯生长的链霉菌菌株pbsh9及其应用
CN106591157A (zh) 一株防病促生的塔宾曲霉及其代谢产物的制备和应用
CN108148765B (zh) 一株耐酸拟康宁木霉及其在抑制立枯丝核菌上的应用
CN108641989A (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN114032182B (zh) 一株兼具拮抗大蒜根腐病病原菌和促生功能的真菌
CN101875906A (zh) 一种简便的稻曲病菌快速分离法
CN113862156B (zh) 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018-1418及其应用
CN105441332A (zh) 一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用
CN117946863A (zh) 罗伯茨绿僵菌及其在生防和促生中的应用
CN110129242B (zh) 一种抗重茬的复合微生物制剂及其制备方法
CN116590199A (zh) 一种皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在玉米穗腐病防治中的应用
CN117736877B (zh) 一种绿僵菌菌株及其应用
CN109207489B (zh) 一种膨大弯颈孢菌株及其应用
CN108624514B (zh) 一株m5-2佩立金平脐蠕孢Bipolaris peregianensis及其应用
KR101785099B1 (ko) 뷰베리아 바시아나 Bb18 균주 또는 이를 이용한 진딧물 및 균핵병균의 동시방제용 조성물
CN113925064B (zh) 耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用
CN118421485B (zh) 一株鳞腮绿僵菌菌株xmc及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240419

Address after: 415000 No. 21 Xujiahu Road, High tech Industrial Development Zone, Jiashan Street, Jinshi City, Changde City, Hunan Province

Applicant after: Hunan Muen Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Applicant after: MOON (GUANGZHOU) BIOTECH Co.,Ltd.

Address before: 3 / F, building B5, 11 Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong 510000

Applicant before: MOON (GUANGZHOU) BIOTECH Co.,Ltd.

Country or region before: China

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant