CN117946863A - 罗伯茨绿僵菌及其在生防和促生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物防治技术领域，尤其是涉及罗伯茨绿僵菌及其在生防和促生中的应用。本发明提供了罗伯茨绿僵菌及将其用于生物防治的方法。该菌株是一株具有高毒力杀虫功能的绿僵菌，该菌株培养方法简单，生长迅速，产孢量大；侵染蝗虫致死率可达100.00％，且无毒无污染，不会破坏生态、不易产生抗药性、对人没有伤害，可广泛用于蝗虫的防治中。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，尤其是涉及罗伯茨绿僵菌及其在生防和促生中的应用。
背景技术
绿僵菌(Metarhizium)是一类用于生物防治的重要虫生真菌，全世界约有200多种害虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌的孢子可以附着在害虫表皮，穿透表皮入侵到害虫体内，利用害虫营养生长繁殖并分泌毒素直至害虫死亡。害虫死亡后的尸体又可以释放新的孢子，经传播感染其他害虫。绿僵菌属目前在全世界范围内拥有约30个物种(Kepler,R.M.,Humber,R.A.,Bischoff,J.F.,&Rehner,S.A.(2014).Clarification of generic andspecies boundaries for Metarhizium and related fungi through multigenephylogenetics.Mycologia,106(4),811-829.)，不同的绿僵菌属物种能侵染致死的害虫的范围不同，毒性也有差异。Metarhizium robertsii J.F.Bisch.,Rehner&Humber是属于绿僵菌属Metarhizium的一个物种，最早分离自象甲Curculio caryae的尸体(Bischoff JF,Rehner SA,Humber RA A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliaelineage Mycologia,101(4),2009,pp.512–530.)。
现有技术报道(WO2019080167A1)，通过重组广谱性绿僵菌，敲除单胺氧化酶基因，其能够显著提高广谱罗伯茨绿僵菌中色胺的浓度，进而显著提高杀虫效率，使野生型广谱绿僵菌对东亚飞蝗雄虫的半致死时间LT50从7.33±0.445天缩短到6.136±0.488天；即野生的罗伯茨绿僵菌对东亚飞蝗的LT50致死时间较长，而基因重组后的罗伯茨绿僵菌也同样存在致死时间长的问题，杀虫效率有待提高。
此外文献报道的绝大多数罗伯茨绿僵菌的致死时间LT50都大于4d，甚至有部分罗伯茨绿僵菌的致死时间LT50长达16d。
现有技术报道通过SDAY培养基培养的罗伯茨绿僵菌对易感昆虫的中位致死时间LT50比野生的型菌株的致死时间长1.4d(Adenylate cyclase orthologues in twofilamentous entomopathogens contribute differentially to growth,conidiation,pathogenicity,and multistress responses.)。因此，罗伯茨绿僵菌的杀虫效果需要进一步提高，需要开发一种致死时间短，能快速杀虫，杀虫效率相对现有的罗伯茨绿僵菌有显著性提高的新型菌株。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种罗伯茨绿僵菌，以及应用该菌防治蝗虫的方法，期望所述罗伯茨绿僵菌培养方法简单，生长迅速，产孢量大；侵染蝗虫致死率高，且无毒无污染，不会破坏生态，不易产生抗药性，对人没有伤害。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种罗伯茨绿僵菌，所述罗伯茨绿僵菌的菌株于2020年12月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC 61329，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名为Metarhizium robertsii。
第二方面，本发明提供前述实施方式所述罗伯茨绿僵菌在制备同时具有生物防治和促进生长作用的菌肥、菌剂或农药中的应用。
第三方面，本发明提供采用前述实施方式所述菌种保藏号为GDMCC61329的罗伯茨绿僵菌制备得到的菌剂。
在可选的实施方式中，所述菌剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或液体剂。
在可选的实施方式中，所述液体剂中含有罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
第四方面，本发明提供了前述实施方式所述液体剂的制备方法包括，使用SDAY平板活化菌种保藏号为GDMCC 61329的罗伯茨绿僵菌，而后使用Tween80水溶液洗脱罗伯茨绿僵菌孢子，并调整罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
在可选的实施方式中，所述Tween80水溶液中Tween80的含量为0.05％～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)。
第五方面，本发明提供采用前述实施方式进行生物防治的方法，包括喷施前述实施方式所述液体剂进行生物防治。
在可选的实施方式中，生物防治的害虫种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目昆虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；
所述鳞翅目害虫包括草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾或茶尺蠖中的至少一种；
所述半翅目害虫包括飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉或柑橘木虱中的至少一种；
所述双翅目昆虫包括黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇或蚊中的至少一种；
所述直翅目害虫包括东亚飞蝗；
所述蛛形纲害虫包括二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种。
第六方面，本发明提供应用前述实施方式所述液体剂促进作物生长的方法，所述方法包括，播种前使用前述实施方式所述的液体剂浸泡作物种子，和/或，播种后使用前述实施方式所述的液体剂浇灌作物种子；
所述作物包括玉米。
本发明提供了罗伯茨绿僵菌及将其用于生物防治的方法。该菌株是一株具有高毒力杀虫功能的绿僵菌，该菌株培养方法简单，生长迅速，产孢量大；侵染蝗虫致死率可达100.00％，且无毒无污染，不会破坏生态、不易产生抗药性、对人没有伤害，可广泛用于蝗虫的防治中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株15天菌落正面形态图；
图2为本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株15天菌落背面形态图；
图3为本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株GDMCC 61329的产孢结构(单位10μm)；
图4为本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株GDMCC 61329的分生孢子(单位10μm)；
图5为本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌基于多基因建立的系统发育树分型结果；
图6为温度对本发明实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株生长的影响；
图7为本发明实施例3培养基上的僵虫。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。
第一方面，本发明提供一种罗伯茨绿僵菌，所述罗伯茨绿僵菌的菌株于2020年12月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC 61329，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名为Metarhizium robertsii。
本发明所述的罗伯茨绿僵菌是通过筛选分离得到的，具体的分离方法为：采集陕西的农业土壤，晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中，用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。离心机10000rpm离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，反复离心清洗3次。按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液悬浮。用无菌水稀释10倍的上述悬浮液，用移液器吸取100μL至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，平板置于28℃黑暗培养2～7d。当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。
该菌株具有以下特征：在SDAY培养基28℃培养，5天菌落2.74cm，10天5.55cm，15天7.58cm。菌落初期为白色，质地绒毛状，过度期变成黄色，后期产生暗绿色的分生孢子。最适生长温度为25～30℃。
第二方面，本发明提供前述实施方式所述罗伯茨绿僵菌在制备同时具有生物防治和促进生长作用的菌肥、菌剂或农药中的应用。
所述应用是指所述菌肥、菌剂或农药中以本发明提供的罗伯茨绿僵菌为杀虫有效成分和其他助剂配制成菌肥、菌剂或农药上允许的任意一种剂型。
第三方面，本发明提供采用前述实施方式所述菌种保藏号为GDMCC 61329的罗伯茨绿僵菌制备得到的菌剂。
在可选的实施方式中，所述菌剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或液体剂。
在可选的实施方式中，所述液体剂中含有罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
第四方面，本发明提供了前述实施方式所述液体剂的制备方法包括，使用SDAY平板活化菌种保藏号为GDMCC 61329的罗伯茨绿僵菌，而后使用Tween80水溶液洗脱罗伯茨绿僵菌孢子，并调整罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
在可选的实施方式中，所述Tween80水溶液中Tween80的含量为0.05％～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)。
第五方面，本发明提供采用前述实施方式进行生物防治的方法，包括喷施前述实施方式所述液体剂进行生物防治。
在可选的实施方式中，生物防治的害虫种类涉及农业害虫和卫生害虫，包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目昆虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；
所述鳞翅目害虫包括草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾或茶尺蠖中的至少一种；
所述半翅目害虫包括飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉或柑橘木虱中的至少一种；
所述双翅目昆虫包括黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇或蚊中的至少一种；
所述直翅目害虫包括东亚飞蝗；
所述蛛形纲害虫包括二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种。
第六方面，本发明提供应用前述实施方式所述液体剂促进作物生长的方法，所述方法包括，播种前使用前述实施方式所述的液体剂浸泡作物种子，和/或，播种后使用前述实施方式所述的液体剂浇灌作物种子；
所述作物包括玉米。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1罗伯茨绿僵菌的分离、纯化与鉴定
1.1分离、纯化
称土：采集陕西的农业土壤，晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中。
洗土：用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。离心机10000rpm离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，反复离心清洗3次。
稀释沉淀：按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液。
涂布：用无菌水稀释10倍的上述沉淀悬浮液，用移液器吸取100μL至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，平板置于28℃黑暗培养2～7d。
真菌纯化：当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。
1.2形态学鉴定
将分离到的绿僵菌接种在SDAY培养基平板上28℃培养15天观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。在4～5天后挑取白色菌丝做成制片，在显微镜下观察菌丝及分生孢子梗形态；10～12天挑取分生孢子做成制片观察分生孢子的大小及形态。15天观察记录菌落形态特征，其正面和背面分别如图1和图2所示，该菌株在SDAY培养基上初期为白色，而向淡黄色或黄色过度，形状为絮状或绒毛状突起，后期出现绿色的孢子。菌丝有隔，产孢结构如图3所示，分生孢子单细胞，柱状。分生孢子长椭圆形、链状排列，大小为(5.17～6.55)μm×(2.56～3.43)μm，如图4所示。
1.3分子生物学鉴定
利用菌株的菌丝体提取基因组DNA，作为基因扩增的模板，对菌株进行多基因扩增及测序。需扩增的基因及引物为：
ITS:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′SEQ ID No：1)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′SEQ ID No：2)
BenA:Bt1F(5’-GGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCC-3’SEQ ID No：3)和Bt1R(5’-CAGCCATCATGTTCTTAGGGTC-3’SEQ ID No：4)
EF:983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’SEQ ID No：5)和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’SEQ ID No：6)
RPB1:Mz1F1(5’-CGRACMYTRCCYCATTTCACAA-3’SEQ ID No：7)和Mz1R1(5’-TTGAGCGGAAGYTGCATCATCTCC-3’SEQ ID No：8)
RPB2:5F(5’-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3’SEQ ID No：9)和7CR(5’-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3’SEQ ID No：10)
以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
模板DNA提取：根据Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux,Bioer Technology Co.,Ltd.)进行基因组DNA提取。
对于每种基因扩增反应体系：在PCR管配制反应体系2×Taq PCR Master Mix 12μL，DMSO 1μL，引物1和引物2(10μmol/L)各0.6μL，ddH2O 10.8μL，模板DNA 2μL。
基因扩增条件：预变性94℃4min；变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min，10℃保温5min。PCR后的样品送金唯智测序。
将测序的获得的序列与NCBI基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。经鉴定表明，如图5所示，该菌株为罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)。
实施例2绿僵菌的生物学测定
1.1温度对菌株生长的影响
将培养好的罗伯茨绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃五个不同温度下恒温培养，每天测量菌落直径，每组3个重复，结果如图6所示，从图可以看出，温度在20～30℃时菌株都能生长，在28℃时生长速率比其他温度都高；在低温(20℃)时的生长速率低于25℃和30℃时的生长速率。菌株生长的最适温度为25～30℃。
1.2菌落生长速率测定
将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，做3个重复，每天定时测定其直径并记录数据，直到菌落长满培养基为止。菌落生长速率：由下表可以看出
表1菌落生长速率
| 天数 | 0d | 1d | 2d | 3d | 4d | 5d | 6d |
| 菌落直径(cm) | 0.93 | 1.14 | 1.55 | 2.00 | 2.44 | 2.88 | 3.26 |
第1d时，菌株生长缓慢，未能形成肉眼可见的形态，从第2d开始，菌株开始快速生长并在第四天达到最快；第4d时，由于菌株开始产孢，菌落的生长速度也相应下降。
1.3产孢量测定
将100μl孢子悬浮液涂布于SDAY上，在28℃条件下培养10～15d后，用打孔器从平板上截取直径8mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入10ml 0.1％Tween80中，用血球计数板计数测定孢子浓度，再换算为每cm2平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值,作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。结果显示，在SDAY培养基上培养至第15天产孢量就可达0.53×108孢子/cm2。产孢量较高。
1.4孢子萌发率测定
将培养10～15d的绿僵菌平板用0.1％Tween80洗下孢子，吸取10μl接种到1/4SDAY培养基上，每皿接种3处，置于相同条件的培养箱内培养24h，用400倍的显微镜随机观察，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发数并计算萌发率。结果显示，24小时孢子的萌发率可达80％以上。
上述实验结果均说明该菌株营养要求简单、生长繁殖较快、产孢快，生物学特性良好。
实施例3对害虫的致病力测定
将实施例1分离得到的罗伯茨绿僵菌菌株从-80℃取出，在SDAY平板上活化，28℃培养7～15d，直到产孢。用0.1％ Tween80将罗伯茨绿僵菌孢子洗下，用血球计数板计数，获得具体浓度的孢子悬浮液，再经过稀释或浓缩配制成1×105孢子/ml、1×106孢子/ml、1×107孢子/ml、1×108孢子/ml、1×109孢子/ml的悬浮液。
挑选好的大小、活性一致的3龄蝗蝻。用移液枪取10μl的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上，继续饲养，每日喂新鲜小麦苗。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。以无菌的0.1％ Tween80水作为空白对照。置于28℃～30℃，RH 55％±5％，16L∶8D条件下培养，连续观察10天，记录死亡情况。蝗虫死亡判断，以镊子轻轻触碰蝗虫，不动则为死亡。
死亡蝗虫回接：此步骤验证蝗虫是否由绿僵菌侵染致死。对死亡蝗虫进行表面消毒，具体方法为75％酒精15s，0.05％次氯酸钠1min，无菌水1min清洗两次，然后在灭菌滤纸上晾干，最后把蝗虫放入SDAY培养基(含氯霉素和盐酸四环素)上，观察蝗虫表面是否长出绿僵菌，结果如图7所示。
与市售产品的毒力比较：选取常用杀虫剂溴氰菊酯(拜耳)和金龟子绿僵菌CQMa421(聚立信)进行对照。溴氰菊酯稀释1000倍，金龟子绿僵菌CQMa421和我们的绿僵菌GDMCC 61331稀释为1×108孢子/mL，移液枪取10μl的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。
数据计算：
防效(％)＝[1-(处理区药后活虫数×对照区药前活虫数)/(处理区药前活虫数×对照区药后活虫数)]×100％。
实验结果表明，罗伯茨绿僵菌对蝗虫有显著的致病效果。在不同浓度绿僵菌孢子悬浮液处理下，10d时致死中浓度(LC50)为1.37×105孢子/ml；在1×108孢子/ml浓度下，10d时绿僵菌对蝗虫的累计校正致死率为100％，致死中时(LT50)为1天，死亡蝗虫回接僵虫率为100％。上述结果表明，罗伯茨绿僵菌具有开发为防治蝗虫的微生物农药的潜力。
表2罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329对蝗虫的校正死亡率(％)
注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)，下表同。
表3罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329对蝗虫的LC50回归方程及LC50
表4罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329对蝗虫的LT50回归方程及LT50
表5罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329对蝗虫的室内毒力测试结果(1×108孢子/ml)
表6罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329和市售产品的室内毒力测试结果(1×108孢子/ml)
此外，本发明还考察了罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329菌粉对草地贪夜蛾、二化螟和蛴螬等多种害虫的毒力，具体实验如下：
将罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329菌粉配成可湿性粉剂，用水稀释为1×108个孢子/ml的菌液。使用喷雾器喷施5ml菌液于表7所示害虫上(每种害虫30只左右)，继续饲养。每个处理3个重复。以无菌的0.1％(v/v)Tween80水作为空白对照。连续观察10天，记录死亡情况，选取最优次结果计算出下表7防治效果。
表7罗伯茨绿僵菌GDMCC 61329对害虫的防治效果
| 害虫种类 | 防效(％) | 害虫种类 | 防效(％) |
| 草地贪夜蛾 | 28.67 | 甜菜夜蛾 | 85.67 |
| 二化螟 | 80.74 | 三化螟 | 88.39 |
| 小菜蛾 | 75.37 | 茶尺蠖 | 86.67 |
| 蛴螬 | 91.33 | 玉米螟 | 89.93 |
| 褐飞虱 | 79.36 | 灰飞虱 | 82.57 |
| 白背飞虱 | 78.33 | 烟粉虱 | 91 |
| 蚜虫 | 88.67 | 叶蝉 | 80.23 |
| 柑橘木虱 | 90.57 | 黑腹果蝇 | 72.67 |
| 柑橘小实蝇 | 92.32 | 东亚飞蝗 | 100 |
| 二斑叶螨 | 72.33 | 柑橘全爪螨 | 80.26 |
实施例4罗伯茨绿僵菌对植物促生作用测定
选取健康且大小一致的玉米种子(郑单958)进行表面消毒后，将种子于1×107孢子/ml的罗伯茨绿僵菌孢子悬液中浸泡半小时后播种，每盆播种5颗种子，共3盆，播种后向每颗种子浇灌1mL处理液。以无菌水为对照组，置于25℃温室，以12L:12D的光周期进行培育，实验期间定期往育苗盆及底盘补充水，保证水分充足。盆栽培育20d后，收获植株洗净后放入70℃烘箱烘至恒重后测量植物干重。
表8干重生长指标
结果显示相比于对照组，罗伯茨绿僵菌处理组的玉米植株干重提高了2.33％，说明该菌株对植物生长具有一定的促生作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.罗伯茨绿僵菌，其特征在于，所述罗伯茨绿僵菌的菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC 61329。
2.权利要求1所述罗伯茨绿僵菌在制备同时具有生物防治和促进生长作用的菌肥、菌剂或农药中的应用。
3.采用权利要求1所述菌种保藏号为GDMCC 61329的罗伯茨绿僵菌制备得到的菌剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或液体剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述液体剂中含有罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
6.权利要求5所述液体剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，使用SDAY平板活化菌种保藏号为GDMCC 61329的罗伯茨绿僵菌，而后使用Tween80水溶液洗脱罗伯茨绿僵菌孢子，并调整罗伯茨绿僵菌孢子浓度为1.37×105～1×108个孢子/mL。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述Tween80水溶液中Tween80的含量为0.05％～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)。
8.应用权利要求5所述液体剂进行生物防治的方法，其特征在于，包括喷施权利要求5所述液体剂进行生物防治。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，生物防治的害虫种类包括鳞翅目害虫、半翅目害虫、双翅目昆虫、直翅目害虫、鞘翅目害虫或蛛形纲害虫中的至少一种；
所述鳞翅目害虫包括草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾或茶尺蠖中的至少一种；
所述半翅目害虫包括飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉或柑橘木虱中的至少一种；
所述双翅目昆虫包括黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇或蚊中的至少一种；
所述直翅目害虫包括东亚飞蝗或蝗蝻中的至少一种；
所述蛛形纲害虫包括二斑叶螨或柑橘全爪螨中的至少一种。
10.应用权利要求5所述液体剂促进作物生长的方法，其特征在于，所述方法包括，播种前使用权利要求5所述的液体剂浸泡作物种子，和/或，播种后使用权利要求5所述的液体剂浇灌作物种子；
所述作物包括玉米。
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|---|---|---|---|---|
| CN117736877A (zh) * | 2022-09-20 | 2024-03-22 | 慕恩（广州）生物科技有限公司 | 一种绿僵菌菌株及其应用 |
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- 2022-10-31 CN CN202211351793.2A patent/CN117946863A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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