CN111662828B - 一株莱氏绿僵菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株莱氏绿僵菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株保藏编号为CGMCC No.18552。本发明所述莱氏绿僵菌不仅对草地贪夜蛾幼虫致病力强，而且还具有杀卵作用，可有效控制草地贪夜蛾的种群数量，能够解决现有技术中采用化学农药防治玉米草地贪夜蛾污染环境，易产生抗药性的技术问题。

Description

一株莱氏绿僵菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株莱氏绿僵菌及其应用。
背景技术
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)属鳞翅目夜蛾科，可为害玉米、水稻、大豆等100多种重要农作物。现阶段草地贪夜蛾防治困难，在长期的药剂选择压力下已对有机磷类、氨基甲酸盐类、拟除虫菊酯类中的多种农药产生了抗药性。探求安全、高效、持续的防治草地贪夜蛾的措施已势在必行。杀虫真菌具有种类多、易流行、对环境安全和不易产生抗药性等特点，因此利用杀虫真菌进行草地贪夜蛾的防治已成为一个重要的发展方向。
莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)是一种广泛分布的昆虫病原真菌，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对甜菜夜蛾、大豆夜蛾、斜纹夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，并且能引起害虫的田间流行病。莱氏绿僵菌主要通过产生附着胞、芽管等特殊结构侵入害虫体壁。之后在昆虫体内快速生长、繁殖，破坏害虫生理机能最终导致害虫死亡。目前的研究表明，莱氏绿僵菌具有一定的遗传多样性，不同的莱氏绿僵菌菌株对同一靶标害虫毒力差别很大，即使是分离自同一种寄主昆虫的不同菌株毒力也有显著差异。目前并没有一种对草地贪夜蛾高毒力的莱氏绿僵菌菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株莱氏绿僵菌及其应用。本发明所述莱氏绿僵菌不仅对草地贪夜蛾幼虫致病力强、而且还具有杀卵作用，可有效控制草地贪夜蛾的种群数量，能够解决现有技术中采用化学农药防治玉米草地贪夜蛾污染环境，易产生抗药性的技术问题。
本发明提供了一株莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株，保藏编号为CGMCC No.18552。
本发明还提供了上述技术方案所述的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1在防治玉米草地贪夜蛾中的应用。
优选的是，所述莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1在应用时的孢子浓度范围为1.00×107～1.00×108个/mL。
本发明提供了一株莱氏绿僵菌及其应用。本发明从野外自然侵染的草地贪夜蛾僵虫上直接分离筛选得到莱氏绿僵菌FJMR1，该菌培养简单，产孢能力强，孢子萌发率高；本发明的莱氏绿僵菌FJMR1不仅对草地贪夜蛾幼虫致病力强、而且还具有杀卵作用，可有效控制草地贪夜蛾的种群数量；本发明莱氏绿僵菌FJMR1环保无污染，不易产生抗药性，可广泛用于玉米草地贪夜蛾防治。
生物保藏说明
莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1。本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18552，保藏时间为2019年09月23日。
附图说明
图1为本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR1的菌丝体和孢子形态的显微照片；
图2为本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR1侵染草地贪夜蛾后的菌丝定殖及虫体内部结构改变图；
图3为本发明提供的健康草地贪夜蛾幼虫及感染莱氏绿僵菌FJMR1后的草地贪夜蛾幼虫。
具体实施方式
本发明提供了一株莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株，保藏编号为CGMCC No.18552。本发明所述莱氏绿僵菌菌株属于子囊菌门，粪壳菌纲，肉座菌目，麦角菌科，绿僵菌属，莱氏绿僵菌FJMR1的菌丝体和孢子形态的显微照片如图1所示。本发明从野外自然侵染的草地贪夜蛾僵虫上分离获得多株致病真菌菌株，经室内毒力筛选获得其中致病力较高的菌株FJMR1。经形态鉴定并结合26S rDNA(如SEQ ID NO.1所示)和EF-1α序列比对，将其鉴定为莱氏绿僵菌。本发明菌株在PDA培养基上26℃培养7天，菌落直径5～8mm，白色，凸起；质地丝绒状；反面土黄色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。菌丝缠绕分枝分隔，壁平滑透明，直径1.2～4.0μm；分生孢子梗发生于气生菌丝，瓶梗轮生，每轮3～5个，基部明显膨大，向上有明显细颈，大小2.5～5.5×1.5～3.0μm；分生孢子椭圆形或卵圆形，大小2.5～4.0×1.5～2.5μm，壁平滑。本发明菌株可用于防治草地贪夜蛾幼虫和卵，效果显著。
本发明还提供了上述技术方案所述的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1在防治玉米草地贪夜蛾中的应用。本发明的莱氏绿僵菌FJMR1不仅对草地贪夜蛾幼虫致病力强、而且还具有杀卵作用，可有效控制草地贪夜蛾的种群数量。
在本发明中，所述莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1在应用时的孢子浓度范围优选为1.00×107～1.00×108个/mL。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株莱氏绿僵菌及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
FJMR1菌株的分离和鉴定
1.1菌株分离纯化及致病性测定
将从福建漳州和三明玉米地采集到的罹病草地贪夜蛾僵成虫置于5mL无菌EP管中带回实验室，在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL)上轻轻抖动僵虫至少量体表分生孢子落于PDA培养基上，于26℃，16L/8D光暗交替，湿度75％的培养箱中培养，产孢后将分生孢子转接到新的PDA培养基上进行纯化。纯化得到的菌株采用黑麦斜面培养基保存于13℃培养箱，采用孢子悬浮液浸渍接种法进行菌株致病性测定。试虫接种6～7d后开始死亡，初期虫体表面长满白色菌丝，后期虫体表面密布绿色孢子，且从罹病虫体分离获得的菌株与保存菌株形态特征一致。
1.2FJMR1形态鉴定
将分离并纯化得到的菌株FJMR1接于PDA培养基上，26℃培养箱中培养7天，发现菌落直径5～8mm，白色，凸起；质地丝绒状；反面土黄色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。显微观察发现：菌丝缠绕分枝分隔，壁平滑透明，直径1.2～4.0μm；分生孢子梗发生于气生菌丝，瓶梗轮生，每轮3-5个，基部明显膨大，向上有明显细颈，大小2.5～5.5×1.5～3.0μm；分生孢子椭圆形或卵圆形，大小2.5～4.0×1.5～2.5μm，壁平滑。初步鉴定菌株FJMR1为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。
1.3FJMR1分子鉴定
将分离并纯化得到的菌株FJMR1接于PDA培养基上，26℃恒温培养7d。用吸水纸吸干菌丝上的培养基并将菌丝转入研钵，倒入液氮，加入少量灭菌石英砂，研磨菌丝至细粉状，依据改良CTAB法提取DNA。采用26S rDNA引物扩增26S rDNA序列。PCR反应体系总体积25μL，包括:2×PCR Buffer 12.5μL，引物(20μmo1/L)各1.0μL，DNA模板1.0μL(50ng/μL)。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min。扩增后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。将纯化后的PCR产物送往上海生工生物技术有限公司测序。将26S rDNA基因片段的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。FJMR1的26S rDNA基因序列与Metarhizium rileyi CBS806.71(MH872111)有99.9％的同源性。系统发育分析表明，菌株与绿僵菌属菌株聚集在一个进化支上。综合菌株的培养和形态学特征以及分子鉴定，明确菌株FJMR1为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。
26S rDNA基因序列：481bp(SEQ ID NO.1)
Figure BDA0002562685550000041
实施例2
莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾幼虫的侵染致死效果
2.1供试昆虫
草地贪夜蛾室内种群采自福建省漳州市云霄县附近的玉米田，幼虫以人工饲料进行饲养至化蛹。成虫羽化后交尾产卵，取下一代2龄幼虫作为供试虫。草地贪夜蛾饲养条件为湿度75％，温度26℃，光周期L:D＝14:10。
2.2FJMR1孢子悬浮液制备
将分离得到的菌株FJMR1接种到SMAY培养基(麦芽糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，琼脂1.8％)上，置于26℃光照培养箱培养(16L/8D，光暗交替)，待其产生大量分生孢子后，用无菌水洗脱分生孢子并用四层纱布过滤，用无菌毛细管取一滴滴于血细胞计数板上在显微镜下统计孢子数量并计算孢子浓度，再用含0.05％吐温-80的无菌水依次稀释成1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105个/mL四个浓度梯度的孢子悬浮液。以0.05％吐温-80无菌水作空白对照。
2.3室内致死效果测定
挑选大小一致、健康的草地贪夜蛾2龄幼虫，采用浸渍法进行接种。将草地贪夜蛾幼虫置于孢子悬浮液中浸渍5s，取出晾干后将其置于加有人工饲料的透明带盖的直径为3cm，高为3cm的塑料盒中(1只虫/盒)，置于26℃，16L/8D光照培养箱中饲养。每处理设3次重复，每个重复20头幼虫，连续观察9天，统计幼虫死亡率。饲料每隔3天更换一次，死亡幼虫放入培养皿中26℃保湿培养，观察记录虫体变化情况。
2.4试验结果
由表1可知，莱氏绿僵菌FJMR1能有效侵染草地贪夜蛾2龄幼虫，但不同孢子浓度处理下的侵染致死效果存在明显差异。其中1.00×107个/mL和1.00×108个/mL两个孢子浓度下的侵染致死效果较好，接种第10d的校正死亡老分别为61.34％和67.32％，两者存在显著差异；其后依次是1.00×106个/mL、1.00×105个/mL，侵染致死效果相对偏低。由此可见，莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾具有较好的致死效果，推荐使用1.00×107个/mL或者更高的孢子浓度。
表1莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾的侵染致死效果
Figure BDA0002562685550000061
肉眼观察发现，幼虫被莱氏绿僵菌FJMR1感染后生长发育变慢，接种后第6d开始出现死亡(孢子浓度1.00×107个/mL)，死亡初期身体僵硬，在室内保湿培养，初期虫体表面长出有大量的白色菌丝；电镜观察发现虫体内部也附有大量的菌丝，并且内部的结构有极显著的改变(图2为莱氏绿僵菌FJMR1侵染草地贪夜蛾后的菌丝定殖及虫体内部结构改变图，其中，A为没有侵染FJMR1的草地贪夜蛾外表无菌丝(对照)，B为没有侵染FJMR1的草地贪夜蛾内部无菌丝(CK)，C为FJMR1侵染过的外表和内部有菌丝)。死亡后期，虫体表面覆盖绿色的分生孢子粉(图3为健康草地贪夜蛾幼虫及感染莱氏绿僵菌FJMR1后的草地贪夜蛾幼虫，其中，A为健康草地贪夜蛾幼虫，B为感染莱氏绿僵菌FJMR1的草地贪夜蛾幼虫死亡3天后的的症状图)。由此表明，莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾具有较好的致死效应。
实施例3
莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾卵孵化率及初孵幼虫的影响
3.1试验方法
将当日产的卵块分散剥离平铺为一层卵，每个卵块大概60粒卵左右。采用浸渍法进行接种。将卵块置于孢子悬浮液中浸渍5s，取出后放入直径为10cm，高为5cm的塑料盒中，置于26℃，16L/8D光照培养箱中饲养。每个处理设3个重复，以清水处理组作为空白对照。处理后进行连续观察，记录孵化情况，孵化后将幼虫置于装有人工饲料的养虫盒中，观察幼虫生长状况，并计算卵粒孵化率和幼虫死亡率。
3.2试验结果
菌株FJMR1接种卵后，卵期为4.13d，显著高于对照组的3.00d；卵孵化率为81.80％，显著低于对照处理组的孵化率(97.26％)，说明菌株FJMR1对卵孵化有不利影响；进一步调查了幼虫孵化后的存活率，结果发现，FJMR1处理组孵化出来的幼虫4d后的存活率为20.58％，显著低于对照处理组幼虫的存活率(86.45％)，表明莱氏绿僵菌FJMR能降低卵的孵化率，并使初孵幼虫快速死亡(表2)。
表2莱氏绿僵菌FJMR1对草地贪夜蛾卵孵化率及初孵幼虫的影响
处理 卵期(d) 卵孵化率(％) 孵化后4d幼虫存活率(％)
FJMR1 4.13±0.25a 81.80±6.21b 20.58±8.27b
对照 3.00±0.00b 97.26±4.33a 86.45±10.84a
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一株莱氏绿僵菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 481
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagaggatg cttttggcga ggcgccttcc gagttccctg gaacgggacg ccatagaggg 60
tgagagcccc gtctggttgg atgccgagcc tctgtaaagc tccttcgacg agtcgagtag 120
tttgggaatg ctgctctaaa tgggaggtat atgtcttcta aagctaaata ccggccagag 180
accgatagcg cacaagtaga gtgatcgaaa gatgaaaagc actttgaaaa gagggttaaa 240
tagtacgtga aattgttgaa agggaagcgc ttatgaccag acttgggccc ggtgaatcat 300
ccagcgttct cgctggtgca ctttgccggg ctcaggccag catcagtttg ccccggggga 360
taaaggcttt gggaatgtgg ctccctcggg agtgttatag cccattgcac aataccctgg 420
ggcggactga ggttcgcgca tctgcaagga tgctggcgta atggtcatca gcgacccgtc 480
t 481

Claims (3)

1.一株莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株，保藏编号为CGMCC No.18552。
2.权利要求1所述的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株在防治玉米草地贪夜蛾幼虫和卵中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR1菌株在应用时的孢子浓度范围为1.00×107～1.00×108个/mL。
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