CN109136101B

CN109136101B - 一种真菌菌株及应用

Info

Publication number: CN109136101B
Application number: CN201811045582.XA
Authority: CN
Inventors: 秦少容; 李春峰; 卿玉玲; 陈仕江; 向剑; 陈若霓
Original assignee: Chongqing Taiji Medical Research Institute Co ltd; Southwest University
Current assignee: Chongqing Taiji Medical Research Institute Co ltd; Southwest University
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109136101A

Abstract

本发明涉及一种真菌菌株及应用，该菌株为赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)KD‑F1，传统真菌侵染虫体的方式单一(经体壁侵染)，周期较长；Bt毒蛋白近年来的应用，使得大部分昆虫产生抗性，本发明的菌株KD‑F1具有杀虫用时短、经口侵染等优势，是一种理想的生物杀虫剂。

Description

一种真菌菌株及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种杀虫真菌菌株及应用。

背景技术

我国是农业大国，农作物每年受害虫的损失较大。目前常用于农林害虫防治的方式主要是通过物理防治、化学防治和生物防治。在化学防治中常用的是农药的喷洒，其缺点是农药易残留，对环境造成污染，不利于环境的可持续发展；物理防治的方式主要是运用声波，放射能等，其缺点是费时费力，也不利于推广。害虫生物学防治是生物学的重要分支学科，进入21世纪以来、随着生命科学和生物技术的发展以及新原理、新方法的不断渗透、交叉与融合，使该分支学科在我国得到了快速发展。农林害虫生物防治是有害生物治理中最成功、最节约和环境安全的方法，其方式主要是指利用生物或生物代谢产物来控制的技术，它是害虫持续控制不可缺少的组成部分。

生物防治主要分为三大类，包括引进天敌以虫治虫、通过昆虫信息素干扰和杀虫微生物以菌治虫。引进天敌以虫治虫，如我国通过释放赤眼蜂防治玉米螟，通过昆虫信息素扰乱昆虫的习性来达到防治的目的，目前是我国生物防治的主要的手段。杀虫微生物以菌治虫，主要是利用微生物或微生物代谢产物具有杀虫的活性对害虫进行防治。按分类地位，微生物杀虫剂可分为杀虫细菌、杀虫真菌、杀虫病毒三大类。

病毒杀虫剂，利用昆虫病毒防治害虫开始于20世纪30年代，目前已有多种昆虫病毒杀虫剂应用于生产实践。迄今为止，已发现的昆虫病毒达1200多种、1690多株。昆虫病毒杀虫剂是一种新型生物农药，具有对天敌与高等动物安全、无污染、害虫不易产生抗性、在环境中滞留期短等特点，棉铃虫杆状病毒杀虫剂是我国第一个商品化生产的病毒杀虫剂，粉剂和悬浮剂都已推广应用于棉铃虫的防治。

细菌源农药目前筛选出的杀虫细菌大约有100多种，目前被开发成产品,投入实际使用的杀虫细菌主要有4种，即日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。其中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是研究最多的细菌，可对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的500多种昆虫有不同程度的杀虫活性，主要对鳞翅目昆虫进行防治。它是一种产芽孢的革兰氏阳性菌株。在芽孢内产生伴胞晶体经口进入中肠，在中肠碱性环境下溶解、酶激活，与中肠上皮细胞受体结合，在质膜上形成孔洞，破环渗透压和电势，最终导致细胞胀破裂解、中肠坏死。近年来，对BT毒素基因的克隆，并将其转到植物的应用如大量的BT毒素应用到转基因棉花，长期种植使得棉铃虫产生了抗性，这迫使科学家们寻找新的生防微生物。

目前世界上已记载的杀虫真菌大约有100个属，800多个种，其中约50％集中于半知菌亚门，研究最多的是白僵菌和绿僵菌。白僵菌是发展历史较早、普及面积大、应用最广的一种真菌杀虫剂。我国利用虫生真菌防治害虫起步较晚，始于20世纪50年代，目前所报道的真菌侵染的途径是通过宿主体壁进行主动入侵感染和经口进入中肠进行侵染了两种方式。有研究报道显示真菌能产生杀死昆虫的毒素，例如白僵菌产生的白僵菌素、绿僵菌产生的破环素、镰刀菌产生的镰红菌素、曲霉菌产生的虫曲霉素等，对昆虫具有一定的杀虫活性。但目前所开发和应用到农林害虫防治的种类较少，因此对为了减少化学农药的使用，有必要探索和研发新的天然生物杀虫剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种真菌菌株及应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种真菌菌株，所述菌株为赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)KD-F1，于2017年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017623。

上述一种真菌菌株的分离方法，步骤如下：

(1)土壤样品取自四川康定人工培育蝙蝠蛾幼虫基地，将土壤样品与无菌水充分混匀，制成悬浮液；

(2)吸取悬浮液制成土壤稀释液，涂布于PDA培养基中；

(3)将固体平板培养至长出新菌落，纯化，得到的培养物再次接种，培养，保存。

优选的，具体步骤如下：

(1)土壤样品取自四川康定人工培育蝙蝠蛾幼虫基地，称取土壤样品10.0g，放入含有90ml无菌水并加入少量玻璃珠，震荡20～30分钟，使土壤与水分充分混匀；

(2)用移液枪吸取1ml悬浮液于9ml无菌水试管中充分混匀，然后依次吸取1ml样品到9ml无菌水的试管中，制备成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的土壤稀释液，用200μl移液枪分别从10^-4、10^-5、10^-6三个土壤稀释液中吸取200μl，涂布于PDA培养基中；

(3)将固体平板置于25℃恒温培养箱连续2周，每12小时观察一次；平板长出新菌落后采用平板划线、顶端菌丝法纯化；获得培养物接种于PDA培养基，培养至平板的1/2时，取菌块于30％甘油保存于-80℃。

上述一种真菌菌株在制备生物杀虫剂中的应用。

优选的，所述生物杀虫剂的防治对象为鳞翅目、双翅目等昆虫。

进一步优选的，所述鳞翅目昆虫为棉铃虫，双翅目昆虫为果蝇。

一种生物杀虫剂，其有效成分为上述真菌菌株。

本发明的有益效果在于：

传统真菌侵染虫体的方式单一(经体壁侵染)，周期较长；Bt毒蛋白近年来的应用，使得大部分昆虫产生抗性，本发明的菌株KD-F1具有杀虫用时短、经口添食肠道侵染等优势，是一种理想的生物杀虫剂。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为菌株KD-F1在不同培养基下的菌落形态A，CYA；B，MEA；C，PDA；D，OA；E，CYAS；F，CREA(反面)；

图2为菌株KD-F1微观结构包括分生孢子(conidium)，分生孢子梗(conidiophore)，柄梗(stipe)等；

图3为菌株KD-F1多基因(ITS、β-tubulin、calmodulin、rpb2)系统发育树；

图4为家蚕死亡情况统计，其中，A不同侵染方式家蚕的生存曲线，B不同侵染方式家蚕的死亡率，C正常的家蚕(左)和添食孢子的家蚕(右)，D家蚕死亡形态；

图5为棉铃虫死亡情况统计，其中，A添食孢子棉铃虫的生存曲线，B添食孢子棉铃虫的死亡率，C棉铃虫死亡形态(右)；

图6为果蝇死亡情况统计，A添食孢子果蝇的生存曲线，B添食孢子果蝇的死亡率，C果蝇死亡形态，Bar＝5mm。

保藏信息

分类名词：赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)KD-F1

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)

保藏单位地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2017年11月20日

保藏号：CCTCC NO：M2017623

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

1、菌株KD-F1的形态学鉴定

菌株分离纯化：土壤样品取自四川康定人工培育蝙蝠蛾幼虫基地，编号并低温保存。称取土壤样品10.0g，放入含有90ml无菌水并加入少量玻璃珠，震荡20～30分钟，使土壤与水分充分混匀。用移液枪吸取1ml悬浮液于9ml无菌水试管中充分混匀。然后依次吸取1ml样品到9ml无菌水的试管中，制备成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的土壤稀释液，用200μl移液枪分别从10^-4、10^-5、10^-6三个土壤稀释液中吸取200μl，涂布于PDA培养基中(每个梯度3个重复)。将固体平板置于25℃恒温培养箱连续2周，每12小时观察一次。平板长出新菌落后采用平板划线、顶端菌丝法纯化。获得培养物接种于PDA培养基，培养至平板的1/2时，取菌块于30％甘油保存于-80℃。将上述方法所分离得到菌株KD-F1，进行形态学鉴定，包括菌落形态和微观结构的观察。

菌落形态观察：采用三点式接种法将菌株KD-F1在不同的培养基(MEA、PDA、CYA、OA、CYAS、CREA共6种)下进行培养，观察并记录其在不同条件下的菌落形态特征。

微观结构观察：预先准备好90mm培养皿(预先倒入PDA培养基冷却至室温)，将盖玻片放入酒精中浸泡。将菌株KD-F1接至培养皿正中心，用灼烧过的镊子夹出盖玻片于酒精灯上轻微灼烧，待其冷却至室温后以正中心为圆心，距圆心1cm左右的圆切线方向斜插入培养基(角度45°)。每天观察菌落生长情况，当菌落边缘生长至盖玻片时取出盖玻片，盖于载玻片上，显微镜下观察并记录其特征。

菌株KD-F1在不同的培养基上均能产生白色菌丝(图1)，在CYA和CYAS培养基上呈辐射状，MEA和OA菌丝呈絮状；生长到4天时，在CYAS和PDA培养基的菌落中心均由白色变为青灰色，说明产生了大量的孢子。在CREA背面观察到菌落由紫色变黄色，说明该菌株生长过程能产生酸性物质。显微结构观察结果显示(图2)，菌株KD-F1为帚状产孢对称结构的孢子梗，柄梗上有“点”状结构均匀分布，分生孢子直径为2～4μm，呈球状或椭球状。

2、菌株KD-F1的分子生物学鉴定

以菌株KD-F1的基因组为模板，进行ITS(internal transcribed spacer)、BenA(β-tubulin)、rpb2(RNA polymerase II)、CaM(calmodulin)相关基因的PCR扩增，引物共4对，如SE Q ID NO.1～8所示：

ITS5:5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′，SEQ ID NO.1；

ITS4R:5′-tcctccgcttattgatatgc-3′，SEQ ID NO.2；

BenA-F:5′-ggtaaccaaatcggtgctgctttc-3′，SEQ ID NO.3；

BenA-R:5′-accctcagtgtagtgacccttggc-3′，SEQ ID NO.4；

CaM-F:5′-ccgagtacaaggargccttc-3′，SEQ ID NO.5；

CaM-R:5′-ccgatrgaggtcatracgtgg-3′，SEQ ID NO.6；

rpb2-F:5′-gaygaycgkgaycayttcgg-3′，SEQ ID NO.7；

rpb2-R:5′-cccatrgcytgyttrcccat-3′，SEQ ID NO.8；

扩增条件为94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环。将扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并送至华大基因公司进行测序。获得的基因序列在GenBank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比较，分析目的菌株的相似度信息，确定菌株的分类地位。根据比对结果选取相关序列，通过Clustal X2.0程序进行多重序列比对，利用Mega 6.0N-J法计算，构建系统发育树。多基因联合系统发育树结果(图3)显示菌株KD-F1与Penicillium ochrochloron(赭绿青霉)同源性较高(99％)；结合微观结构观察显示菌株KD-F1被鉴定为Penicillium ochrochloron。

3、菌株KD-F1的杀虫活性

先将菌株于平板上活化，待菌落生长至7天左右，用接种针挑取约1cm²菌块于装有300ml PDA液体培养基的三角瓶中25℃进行发酵，分别收取5天、10天、15天、20天样品，通过离心或过滤获得菌丝和发酵液。同时接种于PDA固体平板进行发酵，用0.05％tween-20从培养基上收取孢子悬液，于血球计数板计数并稀释至1×10⁷。分别将收取的菌丝，发酵液和孢子悬液对饲养至3龄家蚕(Bombyx mori，使用品种为多化品种305)幼虫进行添食和浸渍，对照用0.05％tween-20进行添食，每组3个平行，每个平行10头家蚕。分析并记录其死亡率。家蚕添毒结果显示，发酵液和和菌丝没有致死效果，孢子悬液的死亡率较高，且经口添食的方式使得家蚕死亡率高达100％，因此该菌株杀虫用时短，死亡率高(图4)，经口添食为该菌株的主要致病方式。

采用同样的方式对同为鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpa armigera)进行添毒(分析家蚕的实验结果后对棉铃虫仅采用孢子悬液进行添毒)，将菌株KD-F1接种于PDA培养基，生长至7天左右，用0.05％tween-20收取孢子，制成悬液。用0.05％tween-20作为对照，孢子悬液和对照分别经口添食，每组3个平行，每个平行10头棉铃虫，分析并记录死亡率。实验结果显示(图5)，菌株KD-F1能快速地使棉铃虫致死，死亡率高达83.33％。同样的采取孢子悬液对双翅目昆虫果蝇(Drosophila melanogaster)进行添毒，将菌株KD-F1培养7d，用含有0.05％的tween-20将孢子洗下，制成孢子悬液。通过经口添食的方式进行添毒，每组3个平行，每个平行10头果蝇，分析并记录其死亡率。实验结果显示(图6)，菌株KD-F1也能快速的将双翅目的果蝇杀死，终死亡率高达100％。以上实验结果说明菌株KD-F1对鳞翅目类昆虫家蚕，棉铃虫；双翅目的果蝇等具有较强的杀虫活性，且农林害虫的大多数为鳞翅目昆虫，菌株KD-F1具有被开发为生物杀虫剂的可能性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 重庆太极医药研究院有限公司

西南大学

<120> 一种真菌菌株及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accctcagtg tagtgaccct tggc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgagtacaa ggargccttc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgatrgagg tcatracgtg g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaygaycgkg aycayttcgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccatrgcyt gyttrcccat 20

Claims

1.一种真菌菌株，其特征在于，所述菌株为赭绿青霉(Penicilliumochrochloron)KDF1，于2017年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017623。

2.权利要求1所述一种真菌菌株在制备生物杀虫剂中的应用,所述生物杀虫剂的防治对象为鳞翅目、双翅目昆虫。

3.一种生物杀虫剂，其有效成分为权利要求1所述的真菌菌株。