CN114480436B - 一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用 - Google Patents

一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用 Download PDF

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明公开了一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用，通过向罗伯茨绿僵菌ARSEF 23菌株中导入含有gpdA组成型启动子、转录因子MrTF和筛选标记bar基因的特异DNA分子，获得的重组菌株MLB2，生物测试实验显示杀虫率显著高于野生型，并且半致死时间提前两天左右，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供一种新型的杀虫菌剂，且对环境无污染、可制备性高，适合在生物防治领域推广。

Description

一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用基因工程方法改良获得一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法，还涉及该方法获得的菌株及应用。
背景技术
昆虫病原真菌可以侵染昆虫并致死，其具有药效时间长、无污染、寄主范围广并且可在昆虫种群内重复侵染等优点，是最有潜力的生物防治剂。
绿僵菌广泛存在于世界各地，是最早应用于生物防治的昆虫病原真菌，自1879年梅契尼柯夫最先从奥地利金龟子上分离到罗伯茨绿僵菌以来，在生物防治领域，已经成为微生物杀虫剂主要组成部分，国内外已注册的绿僵菌生物制剂高达一百多种。但在实际应用中，与绝大多数真菌制剂一样，存在众多问题，如野生菌株杀虫较慢、存在侵染潜伏期、生防效率低等严重限制了绿僵菌真菌制剂的广泛应用。所以如何研制出高毒力、高效率的真菌杀虫制剂一直是真菌制剂的研究重点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法；本发明的目的之二在于提供一种特异DNA分子；本发明的目的之三在于提供一种含有所述特异DNA分子的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供含有所述特异DNA分子的重组菌；本发明的目的之五在于提供所述重组菌在制备杀虫菌剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法，包含如下步骤：
通过向罗伯茨绿僵菌野生型菌株中导入特异DNA分子，从而提高罗伯茨绿僵菌的致死率，缩短半致死时间；所述特异特异DNA分子中含有gpdA组成型启动子、转录因子MrTF；所述野生型菌株为ARSEF 23菌株；所述gpdA组成型启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，转录因子MrTF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述gpdA组成型启动子启动转录因子MrTF基因的表达。
本发明优选的，所述特异DNA分子中还包含筛选标记bar基因，所述筛选标记bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明优选的，所述向罗伯茨绿僵菌野生型菌株中导入特异DNA分子的方式为：将特异DNA分子构建到双元载体上获得重组质粒，在农杆菌的介导下转化罗伯茨绿僵菌野生型菌株，获得杀虫毒力提高的罗伯茨绿僵菌突变菌株。
本发明进一步优选的，所述双元载体为pAG-H3载体，特异DNA分子通过Kpn1和Spe1酶切位点连接到pAG-H3载体上。
本发明优选的，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株AGL-1。
2、一种特异DNA分子
含有gpdA组成型启动子、转录因子MrTF和筛选标记bar基因；所述gpdA组成型启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，转录因子MrTF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，筛选标记bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述gpdA组成型启动子启动转录因子MrTF基因的表达。
3、含有所述特异DNA分子的重组表达载体
4、含有所述特异DNA分子的重组菌
是将所述的特异DNA分子导入罗伯茨绿僵菌ARSEF 23菌株所得。
5、所述重组菌在作为杀虫菌剂中的应用
所述杀虫菌剂用于杀灭大蜡螟，蝗虫，天牛，蚊，蝇。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用，通过向罗伯茨绿僵菌ARSEF 23菌株中导入含有gpdA组成型启动子、转录因子MrTF和筛选标记bar基因的特异DNA分子，获得的重组菌株MLB2，生物测试实验表明杀虫率显著高于野生型，并且半致死时间提前两天左右，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供了一种新型的杀虫菌剂，且对环境无污染、可制备性高，适合在生物防治领域推广。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为重组质粒构建示意图；
图2为MLB2突变菌株PCR验证结果；
图3为大蜡螟生物测定实验十五天存活率；
图4为大蜡螟生物测定实验大蜡螟半致死时间。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中使用的罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)ARSEF 23菌株保存在美国模式培养物集存库，菌种保藏号为ATCC MYA-3075，由中国农业科学院生物技术研究所徐玉泉课题组提供。
实施例1、gpdA-TF-bar-pAG重组质粒的构建
(1)各基因片段扩增
根据黑曲霉(Aspergillus niger)组成型启动子gpdA的基因序列，设计引物序列，上游引物为SEQ ID NO.1所示，下游引物为SEQ ID NO.2所示，扩增得到的启动子gpdA核苷酸序列如SEQ ID NO.3；罗伯茨绿僵菌毒力基因MrTF转录因子序列设计PCR引物，MrTF的上游引物为SEQ ID NO.4所示，下游引物为SEQ ID NO.5所示，扩增得到的MrTF的gDNA序列为SEQ ID NO.6所示；筛选基因bar的上游引物为SEQ ID NO.7所示，下游引物为SEQ ID NO.8所示,扩增得到的筛选基因bar的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
(2)酶切载体质粒
提取带有载体质粒pAG的大肠杆菌质粒，pAG载体由pAG-H3载体(购自广州拓飞生物技术有限公司)构建而来，由本实验室保存，将pAG-H3用Kpn1和Spe1进行双酶切，与步骤(1)得到的三个DNA片段使用超快速克隆试剂盒ClonExpress Ultra One Step CloningKit连接，得到重组表达载体，重组质粒构建示意图如图1所示。用EcoRV酶切验证pAG载体质粒并纯化线性质粒，测序得到线性质粒全序列如SEQ ID NO.10所示。
(4)重组产物转化
将克隆用的大肠杆菌DH10B感受态细胞至于冰上解冻，取5μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min，42℃热激45s后，立即至于冰上冷却2-3min，加入900μL LB液体培养基，37℃ 200rpm摇菌1h。取50μL菌液涂布于含有卡那青霉素的LB培养基上，37℃培养18h，挑取单菌落进行PCR验证。
实施例2、表达载体验证引物构建
(1)表达载体验证引物设计
取gpdA启动子以及MrTF部分序列，使用Primier 5，设计回复引物MLB2-CF/CR，MLB2-CF为SEQ ID NO.11所示，MLB2-CR为SEQ ID NO.12所示，引物设计原则是上游引物CF在MrTF基因ATG上游1000bp-2500bp，且不破坏相邻基因编码区，下游引物CR位于MrTF基因终止密码子之前。
(2)PCR扩增，反应体系：
PCR程序：预变性(98℃，30s)，1个循环；变性-退火-延伸(98℃，10s；57℃，20s；72℃，3min)，35个循环；再延伸(72℃，10min)，1个循环；16℃，10min。
取5μLPCR扩增产物，于1％的琼脂糖琼脂糖凝胶上进行电泳验证，条带正确后使用纯化试剂盒回收PCR产物。
实施例3、农杆菌转化以及与罗伯茨绿僵菌共培养
(1)化学法转化农杆菌
将保存于-80℃的根癌农杆菌菌株AGL-1感受态取出，置于冰上10min。加0.5～1μg表达载体，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。液氮速冻5min，37℃温育5min，立即冰浴2min。加入1ml液体YEB，28℃，150rpm培养3h。8000rpm离心2min收集菌体。去掉上清后用100μl液体YEB重悬菌体并均匀涂布在YEB平板上(含50μg/ml Kan和50μg/ml Carb)，28℃培养2～3天。
(2)农杆菌与罗伯茨绿僵菌共培养
1.接种含相应载体的农杆菌单菌落到3ml液体YEB中(含50μg/ml Kan和50μg/mlCarb)，28℃，220rpm摇床培养过夜。
2.12000rpm离心2min收集菌体，去上清用适量的IM液体培养基重悬菌体，并将菌液浓度调到在OD660为0.15。一般用50ml锥形瓶，液体不少于15ml。
3.28℃，220rpm摇床培养6h左右，使得菌液浓度到OD660为0.5～0.8。在此培养期间可以制备罗伯茨绿僵菌分生孢子孢悬液，用无菌刀刮取培养14天绿僵菌表面的分生孢子，用10mL 0.1％的triton x-100悬浮孢子，在250mL无菌锥形瓶中加入玻璃珠30℃ 200rpm搅拌30min，摇匀后，用无菌粗棉布过滤悬浮液，使用血球计数板测定孢子浓度，用无菌蒸馏水将孢子浓度稀释至1×107CFU/mL。
4.取上述根癌农杆菌菌液及制备好的孢悬液各100μl到一无菌的1.5ml离心管中，充分混和均匀。
5.后涂布于IM平板，28℃共培养48h。
6.加入2～3ml无菌水到上述培养皿中，用涂布器洗涤共培养物。
7.将洗涤下来的培养物按每板200～300μl均匀涂布在M-100(含300μg/ml噻孢霉素和200μg/ml PPT)培养基上，25℃培养7～10天至抗性菌落(疑似转化子)出现。
实施例4、罗伯茨绿僵菌转化子MLB2菌株筛选
分别用牙签将疑似转化子边缘部分挑取些许并转移到同样的抗性培养基平板上，进行第二次筛选。从二筛平板上挑出抗性菌落(转化子)分别用SDB液体培养基(含200μg/mlPPT)摇菌，并在平板背面上相应的位置做好标记。摇好菌后将菌丝用于基因组抽提并进行PCR验证MLB2突变菌株PCR验证结果如图2所示。
PCR反应体系：
Phusion DNA聚合酶 0.2μL
5×Phusion buffer 4μL
MLB2-CF/CR 各1μL
Temlate 1μL
dNTPs 0.5μL
ddH2O 12.5μL
终体积 20μL
实施例5、大蜡螟生物测定实验
将罗伯茨绿僵菌野生型和MLB2突变株的孢子悬浮液(浓度为107CFU/ml)与45头大腊螟震荡混匀3min，吸干大腊螟体表水份，分别放置在带有通气孔的小培养皿中，每个培养皿放一头，于26℃，湿度90％的培养箱中黑暗培养15天，每天统计虫子的死亡数。每次试验每个样品设置三个重复，以triton x-100为空白对照，实验重复三次。
按照上述实验方法进行大蜡螟毒力测定实验，如大蜡螟生物试验十五天内大蜡螟存活率(图3)和大蜡螟生物测定实验蝗虫半致死时间(图4)所示，施加MLB2孢子悬浮液的大蜡螟半致死时间相较于野生型提前两天左右，结果表明：MLB2突变菌株毒力相较于野生型显著提高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州科技大学
<120> 一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattcgagct cggtaccttg cgacggcgta ttgct 35
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggggcgtt gatttccatt ctgaagggga ggattga 37
<210> 3
<211> 734
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 3
ttgcgacggc gtattgctta tccttagtag gactccctaa tggattccga gcaagaaaag 60
actgtttggc gtgtaccaat ggctcatagt accagcaaga gaagaatttt ctctctcgct 120
tcgagaaagc aatcaaaaaa aaatcctatc ctaccctacc ctaccctaat acttccattg 180
ccacccgatt cctcccgata gtagagcggg cgactgccat tggcgggcgg gccagcggat 240
tcccgccgat agataacggg cagattctgt gacctcaaac tatcgactaa cagcccgaac 300
ttcggcgcca ccgccaaacc cgccccggaa gccggcctca tttgccgttt ggggcgtgcc 360
aggaaatgcc cgcctgcagc ggagactccc tagtgtggtc tgtgttgcct gtgtcgtctg 420
tgtagtatac tagttactag tctactactg tacagtggat ggcctgaggg ggggacttta 480
tgtccgactc cggctgttct cctccctcta tccactctac cctcttccct ctcttctgtc 540
tttctccccg ctctcgcccc tcccctcctc gaaaacataa atcggccttt ccccctcgcc 600
atcttcttct tcttctccct ctcctttctc tttcttcttc agactacttc tctttctttc 660
atcttttctc tatattcctg ttttcctaga taccccagtt aaaaaagttc tctcaatcaa 720
tcctcccctt caga 734
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaaatca acgcccccg 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctatgcataa cgcagtaaaa ccgc 24
<210> 6
<211> 1018
<212> DNA
<213> 罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii )
<400> 6
atggaaatca acgcccccga atggaggggc ttccatgcgc atcagatgga tgccctgctg 60
gtatgtgttc ttggatgctt tggatatcct cggcctctga ctgtaaacag atgggttgtt 120
tagatccaag ctctgccgat gtagatgatg cctccaacgc cacagggctc atctacaccg 180
cgagttcatc gcaatactct ctgcctccgt ctgtggcact gcccgttccg cagaggcagc 240
cgctctttga agatgcccac cacctacgca gccccttgtc ctcttcccgc tgtcgacagc 300
catgtgcgtc ttgcgactgc ctgcaacaac tggcggctct gtttgtgcag ctcaaagtcc 360
acgcccgacg tggcgggccc ctacaggcag ccgtggccat ctcccacgtc cgcgagggcg 420
tgtcggcatg gaagcgccat ttacagtgcg ccgcctgcat ggaatcggct gacagcgaca 480
cgctcctcct gtgcatcgtc gagatccgca tggtactgcc catgatggaa tggataagca 540
ataatctgga tctgagcggc caggttgcct tttctctcca ggcgaccccc gtgagtggct 600
catgtcaaat gcccgtggct tacgagctgg cccggggcga atcccaagcc attatgcgca 660
ctctgctctt gcgcagcatg gactctgtcg ttgatgtcct ggctgagatt caagagcgca 720
cctctccaat gaaacggccc ggcgggttgc cccctgcgtt tgagttgcac acccctcaac 780
cgtcaccctc atctctatca agtccgggtt gtagccagct actttcagtt ttagagcccc 840
caggaggaac gcagggcctt tttggacagc cgttgcaaag tttgttagag tcggcagaga 900
atctgcaaaa gagaattgcc atagagtagt agcgaagcac tgaatagcaa aattcctgtg 960
tacaacaata ttcaaacagc tgagaagaca tgtcgcggtt ttactgcgtt atgcatag 1018
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttttactgcg ttatgcatag tcgacagaag atgatatt 38
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggccgcgatc gcgcactagt cctaaatctc ggtgacggg 39
<210> 9
<211> 935
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgacagaag atgatattga aggagcactt tttgggcttg gctggagcta gtggaggtca 60
acaatgaatg cctattttgg tttagtcgtc caggcggatc acaaaatttg tgtcgtttga 120
caagatggtt catttaggca actggtcaga tcagccccac ttgtaagcag tagcggcggc 180
gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacgaggac attattatca tctgctgctt 240
ggtgcacgat aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt gaacgacccg gtcatacctt 300
cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa 360
gcgcttcgat taggaagtaa ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc 420
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ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct 540
gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta 600
cgcgggtccc tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgaatcga ccgtgtacgt 660
ctccccccgc caccagcgga cgggactggg ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc 720
cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag 780
cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt 840
caagcacggg aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg gacttcagcc tgccggttcc 900
gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat ttagg 935
<210> 10
<211> 6577
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actagtgcgc gatcgcggcc ggccggcgcg ccgtttaaac ggatttaaat taattaatgt 60
cgacctgcag gcatgcaagc ttcgtgactc ccttaattct ccgctcatga tcagattgtc 120
gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta 180
agagaaaaga gcgtttatta gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc 240
gttcgtccat ttgtttgttc atgccaacca cagggttcca gatccgacga gcaaggcaag 300
accgagcgcc tttgcgacgc tcaccgggct ggttgccctc gccgctgggc tggcggccgt 360
ctatggccct gcaaacgcgc cagaaacgcc gtcgaagccg tgtgcgagac accgcggccg 420
ccggcgttgt ggatacctcg cggaaaactt ggccctcact gacagatgag gggcggacgt 480
tgacacttga ggggccgact cacccggcgc ggcgttgaca gatgaggggc aggctcgatt 540
tcggccggcg acgtggagct ggccagcctc gcaaatcggc gaaaacgcct gattttacgc 600
gagtttccca cagatgatgt ggacaagcct ggggataagt gccctgcggt attgacactt 660
gaggggcgcg actactgaca gatgaggggc gcgatccttg acacttgagg ggcagagtgc 720
tgacagatga ggggcgcacc tattgacatt tgaggggctg tccacaggca gaaaatccag 780
catttgcaag ggtttccgcc cgtttttcgg ccaccgctaa cctgtctttt aacctgcttt 840
taaaccaata tttataaacc ttgtttttaa ccagggctgc gccctgtgcg cgtgaccgcg 900
cacgccgaag gggggtgccc ccccttctcg aaccctcccg gcccgctaac gcgggcctcc 960
catcccccca ggcgtacgcc actggagcac ctcaaaaaca ccatcataca ctaaatcagt 1020
aagttggcag catcacccat aattgtggtt tcaaaatcgg ctccgtcgat actatgttat 1080
acgccaactt tgaaaacaac tttgaaaaag ctgttttctg gtatttaagg ttttagaatg 1140
caaggaacag tgaattggag ttcgtcttgt tataattagc ttcttggggt atctttaaat 1200
actgtagaaa agaggaagga aataataaat ggctaaaatg agaatatcac cggaattgaa 1260
aaaactgatc gaaaaatacc gctgcgtaaa agatacggaa ggaatgtctc ctgctaaggt 1320
atataagctg gtgggagaaa atgaaaacct atatttaaaa atgacggaca gccggtataa 1380
agggaccacc tatgatgtgg aacgggaaaa ggacatgatg ctatggctgg aaggaaagct 1440
gcctgttcca aaggtcctgc actttgaacg gcatgatggc tggagcaatc tgctcatgag 1500
tgaggccgat ggcgtccttt gctcggaaga gtatgaagat gaacaaagcc ctgaaaagat 1560
tatcgagctg tatgcggagt gcatcaggct ctttcactcc atcgacatat cggattgtcc 1620
ctatacgaat agcttagaca gccgcttagc cgaattggat tacttactga ataacgatct 1680
ggccgatgtg gattgcgaaa actgggaaga agacactcca tttaaagatc cgcgcgagct 1740
gtatgatttt ttaaagacgg aaaagcccga agaggaactt gtcttttccc acggcgacct 1800
gggagacagc aacatctttg tgaaagatgg caaagtaagt ggctttattg atcttgggag 1860
aagcggcagg gcggacaagt ggtatgacat tgccttctgc gtccggtcga tcagggagga 1920
tatcggggaa gaacagtatg tcgagctatt ttttgactta ctggggatca agcctgattg 1980
ggagaaaata aaatattata ttttactgga tgaattgttt tagtacctag atgtggcgca 2040
acgatgccgg cgacaagcag gagcgcaccg acttcttccg catcaagtgt tttggctctc 2100
aggccgaggc ccacggcaag tatttgggca aggggtcgct ggtattcgtg cagggcaaga 2160
ttcggaatac caagtacgag aaggacggcc agacggtcta cgggaccgac ttcattgccg 2220
ataaggtgga ttatctggac accaaggcac caggcgggtc aaatcaggaa taagggcaca 2280
ttgccccggc gtgagtcggg gcaatcccgc aaggagggtg aatgaatcgg acgtttgacc 2340
ggaaggcata caggcaagaa ctgatcgacg cggggttttc cgccgaggat gccgaaacca 2400
tcgcaagccg caccgtcatg cgtgcgcccc gcgaaacctt ccagtccgtc ggctcgatgg 2460
tccagcaagc tacggccaag atcgagcgcg acagcgtgca actggctccc cctgccctgc 2520
ccgcgccatc ggccgccgtg gagcgttcgc gtcgtctcga acaggaggcg gcaggtttgg 2580
cgaagtcgat gaccatcgac acgcgaggaa ctatgacgac caagaagcga aaaaccgccg 2640
gcgaggacct ggcaaaacag gtcagcgagg ccaagcaggc cgcgttgctg aaacacacga 2700
agcagcagat caaggaaatg cagctttcct tgttcgatat tgcgccgtgg ccggacacga 2760
tgcgagcgat gccaaacgac acggcccgct ctgccctgtt caccacgcgc aacaagaaaa 2820
tcccgcgcga ggcgctgcaa aacaaggtca ttttccacgt caacaaggac gtgaagatca 2880
cctacaccgg cgtcgagctg cgggccgacg atgacgaact ggtgtggcag caggtgttgg 2940
agtacgcgaa gcgcacccct atcggcgagc cgatcacctt cacgttctac gagctttgcc 3000
aggacctggg ctggtcgatc aatggccggt attacacgaa ggccgaggaa tgcctgtcgc 3060
gcctacaggc gacggcgatg ggcttcacgt ccgaccgcgt tgggcacctg gaatcggtgt 3120
cgctgctgca ccgcttccgc gtcctggacc gtggcaagaa aacgtcccgt tgccaggtcc 3180
tgatcgacga ggaaatcgtc gtgctgtttg ctggcgacca ctacacgaaa ttcatatggg 3240
agaagtaccg caagctgtcg ccgacggccc gacggatgtt cgactatttc agctcgcacc 3300
gggagccgta cccgctcaag ctggaaacct tccgcctcat gtgcggatcg gattccaccc 3360
gcgtgaagaa gtggcgcgag caggtcggcg aagcctgcga agagttgcga ggcagcggcc 3420
tggtggaaca cgcctgggtc aatgatgacc tggtgcattg caaacgctag ggccttgtgg 3480
ggtcagttcc ggctggatct gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg 3540
tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca 3600
ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact taataacaca ttgcggacgt 3660
ttttaatgta ctggggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag cggcgccatt 3720
cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 3780
gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 3840
cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcga gctcggtacc ttgcgacggc 3900
gtattgctta tccttagtag gactccctaa tggattccga gcaagaaaag actgtttggc 3960
gtgtaccaat ggctcatagt accagcaaga gaagaatttt ctctctcgct tcgagaaagc 4020
aatcaaaaaa aaatcctatc ctaccctacc ctaccctaat acttccattg ccacccgatt 4080
cctcccgata gtagagcggg cgactgccat tggcgggcgg gccagcggat tcccgccgat 4140
agataacggg cagattctgt gacctcaaac tatcgactaa cagcccgaac ttcggcgcca 4200
ccgccaaacc cgccccggaa gccggcctca tttgccgttt ggggcgtgcc aggaaatgcc 4260
cgcctgcagc ggagactccc tagtgtggtc tgtgttgcct gtgtcgtctg tgtagtatac 4320
tagttactag tctactactg tacagtggat ggcctgaggg ggggacttta tgtccgactc 4380
cggctgttct cctccctcta tccactctac cctcttccct ctcttctgtc tttctccccg 4440
ctctcgcccc tcccctcctc gaaaacataa atcggccttt ccccctcgcc atcttcttct 4500
tcttctccct ctcctttctc tttcttcttc agactacttc tctttctttc atcttttctc 4560
tatattcctg ttttcctaga taccccagtt aaaaaagttc tctcaatcaa tcctcccctt 4620
cagaatggaa atcaacgccc ccgaatggag gggcttccat gcgcatcaga tggatgccct 4680
gctggtatgt gttcttggat gctttggata tcctcggcct ctgactgtaa acagatgggt 4740
tgtttagatc caagctctgc cgatgtagat gatgcctcca acgccacagg gctcatctac 4800
accgcgagtt catcgcaata ctctctgcct ccgtctgtgg cactgcccgt tccgcagagg 4860
cagccgctct ttgaagatgc ccaccaccta cgcagcccct tgtcctcttc ccgctgtcga 4920
cagccatgtg cgtcttgcga ctgcctgcaa caactggcgg ctctgtttgt gcagctcaaa 4980
gtccacgccc gacgtggcgg gcccctacag gcagccgtgg ccatctccca cgtccgcgag 5040
ggcgtgtcgg catggaagcg ccatttacag tgcgccgcct gcatggaatc ggctgacagc 5100
gacacgctcc tcctgtgcat cgtcgagatc cgcatggtac tgcccatgat ggaatggata 5160
agcaataatc tggatctgag cggccaggtt gccttttctc tccaggcgac ccccgtgagt 5220
ggctcatgtc aaatgcccgt ggcttacgag ctggcccggg gcgaatccca agccattatg 5280
cgcactctgc tcttgcgcag catggactct gtcgttgatg tcctggctga gattcaagag 5340
cgcacctctc caatgaaacg gcccggcggg ttgccccctg cgtttgagtt gcacacccct 5400
caaccgtcac cctcatctct atcaagtccg ggttgtagcc agctactttc agttttagag 5460
cccccaggag gaacgcaggg cctttttgga cagccgttgc aaagtttgtt agagtcggca 5520
gagaatctgc aaaagagaat tgccatagag tagtagcgaa gcactgaata gcaaaattcc 5580
tgtgtacaac aatattcaaa cagctgagaa gacatgtcgc ggttttactg cgttatgcat 5640
agtcgacaga agatgatatt gaaggagcac tttttgggct tggctggagc tagtggaggt 5700
caacaatgaa tgcctatttt ggtttagtcg tccaggcgga tcacaaaatt tgtgtcgttt 5760
gacaagatgg ttcatttagg caactggtca gatcagcccc acttgtaagc agtagcggcg 5820
gcgctcgaag tgtgactctt attagcagac aggaacgagg acattattat catctgctgc 5880
ttggtgcacg ataacttggt gcgtttgtca agcaaggtaa gtgaacgacc cggtcatacc 5940
ttcttaagtt cgcccttcct ccctttattt cagattcaat ctgacttacc tattctaccc 6000
aagcgcttcg attaggaagt aaccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt 6060
gccaccgagg cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc 6120
acggtcaact tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt 6180
ctgcgggagc gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc 6240
tacgcgggtc cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgaatc gaccgtgtac 6300
gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag 6360
tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg 6420
agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc 6480
ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggtt 6540
ccgccccgtc cggtcctgcc cgtcaccgag atttagg 6577
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgcgacggc gtattgct 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgacatgagc cactcacggg 20

Claims (7)

1.一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法，其特征在于，包含如下步骤：通过向罗伯茨绿僵菌野生型菌株中导入特异DNA分子，从而提高罗伯茨绿僵菌的致死率，缩短半致死时间；所述特异DNA分子由gpdA组成型启动子、转录因子MrTF和筛选标记bar基因组成；所述野生型菌株为ARSEF 23菌株；所述gpdA组成型启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，转录因子MrTF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述筛选标记bar基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述gpdA组成型启动子启动转录因子MrTF基因的表达。
2.根据权利要求1所述的提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法，其特征在于，所述向罗伯茨绿僵菌野生型菌株中导入特异DNA分子的方式为：将特异DNA分子构建到双元载体上获得重组质粒，在农杆菌的介导下转化罗伯茨绿僵菌野生型菌株，获得杀虫毒力提高的罗伯茨绿僵菌突变菌株。
3.根据权利要求2所述的提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株AGL-1。
4.一种特异DNA分子，其特征在于，由gpdA组成型启动子、转录因子MrTF和筛选标记bar基因组成；所述gpdA组成型启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，转录因子MrTF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，筛选标记bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述gpdA组成型启动子启动转录因子MrTF基因的表达。
5.含有权利要求4所述的特异DNA分子的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述的特异DNA分子的重组菌，其特征在于，是将权利要求4所述的特异DNA分子导入罗伯茨绿僵菌ARSEF 23菌株得到的。
7.权利要求6所述的重组菌在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述杀虫菌剂用于杀灭大蜡螟或蝗虫。
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