JP2014523245A - 蚊の生物学的コントロールのための新規細菌株 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蚊の幼虫(家蚊属)に対する生物学的コントロールにおいて使用することができる新規細菌株に関する。
蚊は、多数の疾患、例えば、蚊媒介性アルボウイルス、マラリア、フィラリア症および日本脳炎の媒介動物である。一般的に、蚊駆除は、世界中で、生物農薬よりも化学農薬で行う。これらの化学農薬は、ジクロロジフェニルトリクロロエタン(DDT)、ガンメキサン(gammaxane)、マラチオン、クロルデンおよび有機リン酸化合物(organophosphate)として知られている。これらの全ては、ヒトの健康および環境に対して高い毒性を有する。化学農薬と比較して、微生物殺虫剤は、しばしば種特異的であり、環境を汚染せず、したがって、自然において非標的生物体に安全である。種々の微生物農薬中で、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thrungiensis)およびバチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)が広く使用されている。殺蚊剤用細菌は、水中の蚊を抑制するための化学農薬に代わる環境的に優しい代替物である。
本発明の目的は、生物学的コントロールにおける幼虫駆除剤として使用することができる新規細菌株を提供することである。
本発明の目的を果たすために開発された「蚊の生物学的コントロールのための新規細菌株」は、図面において説明されている。
新たに単離された細菌株ならびにBti 4Q4、Bti ATCC 35646およびバチルス・スファエリクスの単一のコロニーを、NYSM(栄養酵母塩培地(Nutrient Yeast Salt Medium))寒天上に培養し、30℃で48時間インキュベートした。それぞれの株の細菌培養物を回収し、10mlの蒸留水に再懸濁した。吸光度(Absorbance)を水で0.2に調整し、次に、1mlの懸濁液を100匹の家蚊属の幼虫(3または4齢の段階)を含む250mlフラスコ中の100mlの新鮮な水/汚染された水に加えた。接種フラスコを研究室の椅子上に維持し、室温で48時間観察した。幼虫の90%を殺すことができた殺幼虫細菌株を決定するために、参照株および滅菌水のそれぞれで処理されたポジティブおよびネガティブコントロールフラスコを、接種フラスコとして同じ条件を維持した。毒性試験後、バチルス・スファエリクス(MBI5、6、7)の3つの株を高い毒性の蚊の細菌として選択し、さらなる試験のために使用した。バイオアッセイ試験結果によると、MBI5,6,7は、家蚊属の幼虫に対して毒性である可能性を有する。3つの細菌の殺幼虫特性の研究が、100匹の幼虫を含む新鮮な水および汚染された水中で行われた(表1参照)。Bti ATCC 35646、Bti 4Q4および市販のバチルス・スファエリクスを、ポジティブコントロールとして使用した。
表現型診断試験
方法の全てを、バチルスの3つの新規株の細胞特性を理解するために提供する。MBI5、MBI6およびMBI7は、好気性グラム陽性細菌であった。MBI5、MBI6、MBI7およびバチルス・スファエリクスの電子顕微鏡像によると、それらは、桿菌(図6、図7、および図8)であり、バチルス・スファエリクス(図5)と同様である。
それぞれのMBI株を、BIOLOG、FAMEプロフィールおよび16S rRNA配列データに関して、唯一(unique)かつ新規として特徴付けた。
細菌株からのDNA抽出:
いくつかの修飾と共にJimenezにより記載された方法論にしたがって、全ゲノムDNAを細菌株から抽出した。純粋な株を27Cで16−20時間ニュートリエント寒天(Nutrient Agar)(NA)固形培地で培養し、1つの単一コロニーを、660nmで最大1の吸光度まで、27Cで3−4時間10mlのニュートリエントブロス(Nutrient Broth)(NB)に汚染した。2000g遠心分離で10分後、細菌細胞を培地から回収した。細胞を1mlのTris−EDTAバッファー(10mM Tris Base、1mM EDTA、0.05% Tween 20、pH 9.0)で懸濁し、2mlマイクロ遠心チューブに移し、14000gで2分間遠心し、上清をチューブから捨て、1mlのTris−EDTAバッファーを加え、適用を3回繰り返した。最後に、300μlのTris−EDTAバッファーを加え、水浴で94Cで30分間沸騰した。14000gで2分間遠心し、200μlのDNAを上清から回収し、さらなるPCR適用のために−20で貯蔵した。
細菌DNA単離物(MBI5、MBI6、MBI7およびコントロールのためのバチルス・スファエリクス血清型H)の16S rRNA遺伝子を、精製されたDNAおよびプライマー 27fおよび1492r(Lane、1991)を使用して、PCR(BIORAD、Italy)により増幅した。全16Sに対する0.2mMの27fおよび1492rプライマー、1Uのpfu DNAポリメラーゼ(Fermentas、USA)、0.2mMのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、1mM MgSO4、10mM Trisおよび50ng 鋳型DNAを含む50ulの反応混合物の全容量で、PCR増幅を行った。PCR条件は以下のとおりであった:前増幅 94℃5分:変性 94℃30秒:アニーリング 55℃40秒:伸長 72℃2分 34サイクル繰り返し、次に最後の伸長のための後増幅 72℃10分。
純粋な増幅産物を、Prism ABI 3100 Genetic Analyzer 16 caillaries, dideoxy terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems)でシーケンシングした。使用したプロトコールは、製造業者の推奨によった。配列を自動DNAシーケンサー(model: Prism ABI 3100; Applied Biosystems)で決定した。両方の鎖を、プライマー27f、1492r、FAM1およびFAM2を使用して、シーケンシングした(Lane, 1991; Nakamura, 1996)。clustal w program(Higginsら, 1992)を使用して、GenBank NCBIからのバチルス・スファエリクス様メンバーの配列で生成された16S DNA配列をアラインした(Larsenら, 1993)。16s rDNA遺伝子の配列を得た(図9、図10、図11)。
Nishiwakiらにより記載された方法論にしたがって毒素遺伝子を調べた。細菌DNA単離物(MBI5、MBI6、MBI7およびコントロールのためのバチルス・スファエリクス血清型H)の毒素遺伝子のPCRを、殺蚊バイナリー毒素(51および42kDa)であるMtx1およびMtx2をコードする遺伝子に対して行った。PCRは、以下の条件にしたがって構築した:前増幅 94℃2分 次に変性 94℃15秒、アニーリング 55℃30秒、および伸長 72℃1分30秒 30サイクル繰り返し。マスターミックスは、50ulの全容量の反応混合物中、1UのTSGポリメラーゼ(Biobasic,Canada)、1mM MgSO4、0.2mMのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、20ngの鋳型DNA、および5pmolのそれぞれのプライマーからなった。
Claims (10)
- バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)細菌の亜種であり、生物学的コントロールにおいて使用される、MBI5、MBI6、MBI7細菌株。
- NRRL B−50199番号で寄託されている、請求項1に記載の生物学的コントロールのためのMBI5細菌株。
- NRRL B−50200番号で寄託されている、請求項1に記載の生物学的コントロールのためのMBI6細菌株。
- NRRL B−50201番号で寄託されている、請求項1に記載の生物学的コントロールのためのMBI7細菌株。
- 蚊の幼虫に対して有効である、請求項1−4に記載の生物学的コントロールのための細菌株。
- タンパク質を単離することなしに、幼虫が存在する培地(medium)に直接与えられるときに、有効である、請求項5に記載の生物学的戦い(fight)のための細菌株。
- 新鮮な水および汚染された水中で幼虫駆除効果を示す、請求項6に記載の生物学的コントロールのための細菌株。
- 好気性細菌、グラム陽性細菌、桿菌である、請求項7に記載の生物学的コントロールのための細菌株。
- バチルス種ZYMおよびバチルス種BD−95と99%近接性(closeness)を有する、請求項8に記載の生物学的コントロールのための細菌株。
- Bin51およびBin42毒素遺伝子を含む、請求項9に記載の生物学的コントロールのための細菌株。
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