CN101292035B

CN101292035B - 编码苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白的基因cry7Bal

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Publication number: CN101292035B
Application number: CN2006800386848A
Authority: CN
Inventors: M·孙; Z·于; S·陈; Z·张; L·阮; S·郭; J·戴; L·李; Z·刘
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2026-10-17
Also published as: MX2008004990A; CN100510081C; WO2007045160A1; ZA200802283B; CA2624158A1; AU2006303767A1; JP2009511075A; CN101292035A; CN1952151A; EP1937818A1; EP1937818A4; US20090130758A1; BRPI0617496A2; US7838293B2

Abstract

本发明公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因的分离、克隆及其应用。本发明从苏云金芽胞杆菌华中亚种YBt-978菌株中分离得到一个新的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal，该基因显示了对鳞翅目昆虫的杀虫活性。本发明还公开了这种新的杀虫晶体蛋白基因序列，通过合适的表达载体转化微生物以表达该基因的编码产物Cry7Bal蛋白，并使之表现出对鳞翅目害虫的杀虫活性。

Description

编码苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白的基因cry7Bal

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域。具体地说，涉及一种来自于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白基因的分离与克隆。本发明涉及生物农药基因工程。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种杆状的革兰氏染色阳性反应的能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境。在其芽胞期能形成而产生对昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(ICP)组成的伴胞晶体，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物(Protozoa)、线形动物门(Nematomorpha)、扁形动物门(Platyhelminthes)中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，Baum J，Feitelson J，Zeigler D R & DeanD H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol.Rev，62，775-806)。

在苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)野生菌株中广泛存在且一般含有多个编码杀虫晶体蛋白的基因。Schnepf等人于1981年从苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(sub sp.kurstaki Strain)HD1中克隆出第一个杀虫晶体蛋白基因，并于1985年根据DNA的碱基序列推导出第一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的氨基酸序列(Schnepf HE，Wong Hc，Whiteley HR.“The amino acid sequence of a crystal protein frOITI Bacillus thw’ingiensisdeduced from the DNA base sequence”.J.Biol.Chem.1985年5月第25期，260(10)：6264-6272)。此后，新的杀虫晶体蛋白基因一直成为苏云金芽胞杆菌研究领域中的热点，陆续有大量的杀虫晶体蛋白基因被鉴定和克隆测序。因此在1995年的无脊椎病理学会(Society for InvertebratePathology)年会上成立了由Crickmore等学者组成的杀虫晶体蛋白基因命名委员会(B.thuringiensis Pesticidal Crystal Protein NomenclatureCommittee)。1996年正式提出了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白按氨基酸序列同源性进行分类的新的分类系统，规定了命名规则和分类原则。其规定：cry基因是来自苏云金芽胞杆菌编码伴胞晶体蛋白的杀虫基因或者与已知cry基因有明显的序列相似性的基因，cyt基因是编码具有溶细胞活性的伴胞晶体蛋白或与已知编码Cyt蛋白有明显的序列相似性的基因。根据全长基因推导的氨基酸序列的同源性被分为四个等级。级与级之间的界限为同源性95％、78％和45％。杀虫晶体蛋白基因被分类为4级。截至2005年8月，苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因已累计达到48类319种(Crickmore N，D.R.Zeigler，J.Feitelson E，Schnepf J，Van RieJ，D.Lereclus，J.Baum以及Dean DH.1998年，“Revision Of thenomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.”Microbiol.Mol.Biol.Rgv 62：807-813；例如，参见互联网上的因特网网址http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。

苏云金芽胞杆菌杀虫剂最初都是使用筛选的野生型菌株进行生产的。随着分子生物学的发展，人们逐渐利用基因工程的手段对野生型菌株进行改造。同时人们不断将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治。

然而，随着B.t杀虫剂的不断发展和使用强度的不断增强，目标害虫的抗性现象不断被科学家所发现。关于目标害虫对B.t杀虫剂的抗性机制，研究人员进行了深入研究。苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白需要经过晶体的溶解与原毒素的激活、毒素片段与中肠上皮细胞膜上受体的结合、在膜上的插入和孔的形成等过程才能产生杀虫效应，其中毒素片段与昆虫中肠上皮细胞膜上特异受体的识别和相互作用在很大程度上决定了杀虫晶体蛋白的活性谱和毒性大小，而昆虫对B.t杀虫剂的抗性的产生与受体的识别与结合密切相关。因此，新的尤其是新异的杀虫晶体蛋白基因的克隆和应用已经成为预防与控制目标害虫对B.t杀虫剂抗性的关键途径，是各种防治策略的核心内容。近年来，寻找与克隆新的杀虫晶体蛋白基因一直是苏云金芽胞杆菌研究领域中最活跃的部分之一。本发明的意义即在于此。中国于1996年分离并鉴定出一株苏云金芽胞杆菌新亚种YBt-978菌株，血清型为H40，在分类上被定为华中亚种(Dai J等，1996年。“Bacillus thuringiensis subspecies huazhongensis，serotype H40，isolated from soils in the People’S Republic of China”.Letters in Applied Microbiology.22(1)：42-45)。通过提取伴胞晶体蛋白并用于生物测定，发现该伴胞晶体蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)等昆虫具有高效杀虫活性。

发明内容

本发明的目的在于从苏云金芽胞杆菌中分离并克隆具有高毒力杀虫晶体蛋白基因及其应用。

图1显示了本发明的技术路线。

为了实现上述目的，本发明从苏云金芽胞杆菌华中亚种(Bacillusthuringiensis subspecies huazhongensis，血清型H40)YBt-978菌株(菌株来源参见，Dai J等，1996年。“Bacillus thuringiensis subspecieshuazhongensis，serotype H40，isolated from soils in the People’s Republicof China”.Letters in Applied Microbiology.22(1)：42-45)中分离到一个新的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal，其编码区由3465个碱基组成，并具有如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。本发明的cry7Bal基因编码Cry7Bal蛋白，它由1154个氨基酸残基组成，并具有如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。本发明的基因cry7Bal在微生物中表达的Cry7Bal蛋白，对鳞翅目昆虫具有杀虫活性。

本发明的Cry7Bal蛋白与所有公开发表的蛋白质的同源性最高为58.2％。而且，在所有公开发表的蛋白质中，与本发明的Cry7Bal蛋白的N-末端一半的部分序列(SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列1至658的氨基酸)的同源性最高为37.1％。

本发明提供的上述基因序列是一种具有杀虫活性的新的杀虫晶体蛋白基因，所述的基因可以应用于转化微生物和/或植物，使之表现出对鳞翅目害虫的杀虫活性，并克服、延缓害虫对基因工程杀虫菌剂和转基因植物的抗药性。

在下列描述和实施例说明了更详细的技术方案：

应当指出，有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等(2002)，《分子克隆实验指南》，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。

1.苏云金芽胞杆菌YBt-978中晶体蛋白Cry7Bal的N-末端氨基酸序列的测序

本发明以苏云金芽胞杆菌YBt-978作为杀虫晶体蛋白Cry7Bal的来源菌株，该菌株是苏云金芽胞杆菌血清型H40的标准菌株，该菌株的来源见Dai J等(1996)。该菌株能形成典型的菱形晶体，主要的晶体蛋白成分Cry7Bal的分子量约为130kDa。对Cry7Bal的N-末端氨基酸序列的测序具体步骤如下：

(1)菌株的培养和培养物的操作

将苏云金芽胞杆菌YBt-978用接种环在无菌条件下接种于5ml的LB(1％ NaCl，1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，pH7.0)，置于30℃、200rpm的摇床中过夜培养。然后在无菌条件下将350μl的培养物转移至35ml的ICPM培养基(0.6％蛋白胨，0.5％葡萄糖，0.1％ CaCO₃，0.1％ MgSO₄.7H₂O，0.05％ KH₂PO₄，pH7.0)中，置于30℃、200rpm的摇床中培养至芽胞和伴胞晶体完全脱落。将培养物收集，8000rpm离心1分钟，去掉上清，并分别用0.5％NaCl溶液和灭菌去离子水将沉淀洗涤三遍。

(2)晶体蛋白的SDS-AGE电泳和PVDF印迹膜的转移

将洗涤后的沉淀按照沉淀∶去离子水＝1∶5v/v重新在去离子水中混匀，加入等体积的2×上样缓冲液。混匀后，在沸水浴中处理3-5分钟，12000rpm离心5min，将上清液进行SDS-AGE电泳。其中2×上样缓冲液的配方和SDS-PAGE电泳操作步骤均参见Laemmli描述的方法(Laemmli，UK.1970.“Cleavage of structural proteins during the assemblyofthe head of bacteriophage T4”.Nature(伦敦)227：680-685)。

然后按照标准的方法(参见：Cook RG.1994.“Amino acid sequenceanalysis of blotted proteins”.P.207-220.In B.S.DunBar(ed.)，ProteinBlotting：A practical approach.牛津大学出版社，纽约)，利用半湿型转膜仪(BIO-RAD)，将凝胶上的蛋白质样品转移到PVDF膜。

3)晶体蛋白N-末端氨基酸序列的测定

通过蛋白质N-末端氨基酸测序仪(型号：ABI 49I Protein Sequencer，ABI Procise)测定N-末端氨基酸序列。测序结果为：N端-MDIRNQNKYEVVYPA-C端(SEQ ID NO：3)。

2.杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的5’末端DNA片段序列的获得

采用接头连接PCR(Adaptor-ligation PCR)法进行扩增。其原理和步骤参见Slebert P D.等人的描述(Slebert P D等，1995.An improved PCRmethod for walking in uncloned genomic DNA.Nucleic Acids Research23：1087-1088)。具体步骤如下：

1)苏云金芽胞杆菌YBt-978总DNA的抽提

将苏云金芽胞杆菌YBt-978用接种环在无菌条件下接种于5ml的LB培养基中，置于30℃、200rpm的摇床中培养过夜。然后在无菌条件下将50μl的培养物转移至5ml的新鲜LB培养基中，在同样条件下培养至对数生长期。然后以5000rpm，3分钟离心收集菌体。用1ml STE洗涤一次。加100μl溶液1和10μl溶菌酶(50mg/ml)，在37℃作用30分钟以上。加入200μl 2％SDS并于50-60℃水浴中作用30分钟。加入200μl5mol/L NaCl并且混合。加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1v/v)，以12000rpm离心5分钟，吸取上清液，重复抽提1-2次。将上层DNA溶液转移至Eppendorf管，加入等体积95％乙醇，在室温静置5分钟后以2000rpm离心5分钟，沉淀用200μl 70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μl TE溶液中。

2)总DNA的限制性内切酶酶切和接头的连接

(1)将事先准备好的苏云金芽胞杆菌的总DNA用HpaI酶于37℃酶切消化过夜(酶切消化体系为50μl，含有约1μg总DNA)；

(2)将50μl酶切消化产物加入250μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v)，以12000rpm离心5分钟，将上层DNA溶液转移至Eppendorf管，加入等体积95％乙醇，在室温静置5分钟后以12000rpm离心5分钟。沉淀用200μl 70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μl灭菌水中；

(3)将长短接头链(50μM)(长接头序列为：5’-GCTCGAGTCGACCGTGGTACGCGTGTGTGAGCTCCCGGGATCCGGT-3’；短接头序列为：5′-ACCGGATC-NH2-3’)按等体积混合成为4μl溶液，70℃保温10分钟：

(4)将4μl的接头溶液(25μM)、10μl总DNA酶切产物溶液(约含0.5μgDNA)、8U T4连接酶、2μl T4连接酶缓冲液，加水制成20μl体系。在16℃连接12h；

(5)在60℃将连接体系加热5分钟后，作为PCR扩增的模板使用；

3)巢式PCR以及测序

用上述的连接产物，进行两轮PCR扩增。

根据已测得的N-末端氨基酸序列，设计合成基因特异性引物，该引物简称为130P1、130P2。此外，根据长接头序列，设计简称为AP1、AP2的合成接头引物。各引物序列如下：

130P1：5’-ATGGATATHMGNAATCARAAYAARTAYG-3’(SEQ IDNO：5)

130P2：5’-AATAAATATGARGTWGTNTAYCCNGC-3’(SEQ IDNO：6)

AP1：5’-GCTCGAGTCGACCGTGGTA-3’(SEQ ID NO：7)

AP2：5’-GTACGCGTGTGTGAGCTCC-3’(SEQ ID NO：8)

(H＝A、C和T；M＝A或C；N＝A、G、C或T；R＝A或G；Y＝C和T；W＝A或T)

(A)第一轮PCR。

25μl反应体系包含：2.5μl 10×PCR反应缓冲液、1μl dNTP(各2.5mM)、0.5μl接头引物AP1(20mM)、0.5μl特异性引物130P1(20mM)、1μl模板(上述连接产物)、0.5μl ExTaq酶。加灭菌后的去离子水至25μl。PCR反应条件为：94℃，1分钟，1个循环；94℃，1分钟，52℃，1分钟，72℃，1.5分钟，25个循环；72℃，5分钟，1个循环。将第一轮PCR产物稀释50倍，作为第二轮PCR扩增模板。

(B)第二轮PCR。

50μl反应体系包含：5μl 10×PCR反应缓冲液，2μl dNTP(各2.5mM)，1μl接头引物AP2(20mM)，1μl特异性引物130P2(20mM)，1μl模板(第一轮PCR产物)，1μl ExTaq酶，加灭菌后的去离子水至50μl。PCR反应条件为：除退火温度为56℃外，其他与上同。

(C)将第二轮PCR产物通过PCR产物回收试剂盒(购自Veta-Gene公司产品)纯化回收后连接到T-载体上，转化大肠杆菌E.DH5α。以AP2和130P2为引物，以单菌落菌体为模板，通过PCR扩增对转化体进行筛选，并对阳性转化体T-载体中的外源片段进行测序。测序结果为SEQID NO：1中第19至491个核苷酸之间的序列。

根据上述测序结果，设计了简称为130S1-2、130A1-2的特异性引物，并用于后面所述的通过PCR筛选包含晶体蛋白基因的BAC基因组文库和各种阳性转化体的过程中，扩增产物大小为434bp。引物序列为：

130S 1-2：TTCTAATACAACATCAAAGTATCCACTC(SEQ ID NO：9)

130A 1-2：GGTATCGTTCCAATACTAATTCTAAAC(SEQ ID NO：10)

3.苏云金芽胞杆菌YBt-978的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的克隆

1)苏云金芽胞杆菌YBt.-978菌株基因组BAC文库的构建

参照Luo和Wing(2003)的方法(参见：Luo和Wing.2003.“Animproved method for plant BAC library construction”，p.3-19.InGrotewold，Erich，Plant functional genomic：methods and protocols.Scientific and medical publishers，/Humana Press，Totowa，美国)，利用BAC文库载体pBeloBACl 1(如图2所示)构建苏云金芽胞杆菌YBt-978菌株的基因组BAC文库。即：将苏云金芽胞杆菌YBt-978在LB培养基中生长到对数生长中期，以10000rpm离心1分钟，收集菌体于干净灭菌过的50ml离心管中。收集的菌体先加1ml TE缓冲液(1mM EDTA，10mM Trisbase，pH 8.0))放到振荡器上轻轻震散。然后再加约40ml TE缓冲液静置5分钟后，以10000rpm离心1分钟收集菌体。将装有菌体的50ml离心管静置在50℃温水中，加入1.5ml的TE25S(0.3M蔗糖，25mM EDTA，25mM Tris碱，pH 8.0)，混匀后再加入1.5ml温热的2％胶(专门做包埋块的低熔点胶，称取0.1g溶于5ml TE25S中)。用枪混匀后，逐一加到专门做包埋块的模子中，放于4℃冰箱中让包埋块冷凝。其余步骤，包括HindIII对包埋块中YBt-978基因组的部分酶切消化和酶切消化产物的回收、BAC文库载体pBeloBACll的制备、酶切消化产物与载体的连接与转化DH10B、BAC文库质量检验，都与Luo和Wing(2003)报道的方法相同。

2)BAC基因组文库的筛选和杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的克隆

(A)BAC基因组文库的筛选

以130S1和130A1为引物，以BAC文库单菌落菌体为模板进行PCR扩增。反应体系为25μl，配方同上述。反应条件中除了退火温度为55℃外，其余同上述。筛选出阳性克隆子EMB0491。参照J.萨姆布鲁克等人的方法(J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)，抽提EMB0491中重组质粒pBMB0491。酶切结果表明pBMB0491包含约60kb的YBt-978基因组片段。

(B)杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的获得

以HindIII对阳性克隆子中YBt-978基因组片段进行完全酶切消化，酶切消化产物与同样被Hind III完全酶切消化的克隆载体pUC18(如图3所示)连接，转化大肠杆菌DH5α。同样以编号为130S1-2和130A1-2的引物作为引物，并以转化的单菌落菌体为模板进行PCR扩增，筛选出阳性转化体EMB0493。从EMB0493中抽提重组质粒pBMB0492。酶切消化结果表明pBMB0492包含约16kb的YBt-978基因组片段。进一步分析表明杀虫晶体蛋白基因cry7Bal位于5kb XhoI片段中。

(C)杀虫晶体蛋白基因cry7Bal和杀虫晶体蛋白Cry7Bal的序列分析

分析杀虫晶体蛋白基因cry7Bal所在的5kb XhoI片段的核苷酸序列，得到5235bp序列，其中包括3465bp是编码区。编码序列如SEQ IDNO：1中所示。

所述的编码序列可编码由1154个氨基酸组成的多肽，即杀虫晶体蛋白Cry7Bal，推导其分子量为130558 Da。

比较此多肽与其它已知的Cry与Cyt蛋白的氨基酸序列，在GenBank基因库中(http://www.ncbi.nlm-nih.gov/)进行搜索和比较，发现在现有公开发表的所有蛋白中，与杀虫晶体蛋白Cry7Bal最相似的蛋白质为杀虫晶体蛋白Cry7Ab2(GenBank登记号：U04368)、Cry7Ab1(GenBank登记号：U04367)和Cry7Aal(GenBank登记号：M64478)，相似性分别达到了58.2％、57.9％、57.1％。其中，在N-末端一半的部分序列(SEQ ID NO：2中1至658位氨基酸)相似度很低，相似性分别为37.1％、37.0％、36.4％。所述的部分是杀虫的活性部分，并是表现杀虫活性的必需和充分部分(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，Baum J，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.“Bacillus thuringiensis and its Desticidalcrystal proteins”.Microbiol Mol Biol Rev，62：775-806)。由此看出该杀虫基因确实为一个新的杀虫基因。因此该杀虫晶体蛋白基因被国际苏云金芽胞杆菌杀虫基因命名委员会命名为cry7Bal，确定为cry7B基因的模式基因。另外，与这些已知蛋白在其C-末端一半的序列(SEQ ID NO：2中659至1154位氨基酸)非常相似，相似性分别达到了87.9％、86.9％、87.9％。这部分序列是形成伴胞晶体的功能结构域，与杀虫活性无关。

从以上序列分析可以看出，在现有所有公开的蛋白质中，与本发明的杀虫晶体蛋白Cry7Bal同源性最高的为58.2％，不超过80％。当某个蛋白质的氨基酸序列与杀虫晶体蛋白Cry7Bal的同源性超过80％时，则视为在本发明的杀虫晶体蛋白Cry7Bal的覆盖范围之内。同样，在现有所有公开的蛋白质中，与本发明的杀虫晶体蚩白Cry7Bal N-末端一半的部分序列(SEQ IDNO：2的1至658位氨基酸)同源性最高的为37.1％，不超过50％。当某个蛋白质的氨基酸序列与本发明的杀虫晶体蛋白Cry7Bal的N-末端一半的部分序列(SEQ ID NO：2的1至658位氨基酸)同源性超过50％时，则视为在本发明的杀虫晶体蛋白Cry7Bal的覆盖范围之内。

4.苏云金芽胞杆菌YBt-978的杀虫晶体蛋白Cry7Bal的杀虫活性

将cry7Bal基因所在的5kb XhoI片段转载在大肠杆菌.苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304(参见图4，载体来源见：Arantes O和Lereclus D.1991.Construction of cloning vectors for B thuringiensis.Gene108：115-119)上，获得重组质粒pBMB0495(见图5)。然后通过成熟的电转化方法(Wu Lan，Sun Ming，Yu Ziniu.A New Resolution Vector withcrylAc10 Gene Based on Bacillus thuringiensis Transposon Tn4430.ActaMicrobiologica Sinica.2000，40：264-269)将其转移到苏云金芽胞杆菌无晶体突变Cryb菌株中(菌株来源见：Wu D，Federici BA.1993.A20-kilodalton protein preserves cell viability and promotes CytA crystalformation during sporulation in Bacillus thuringiensis.J.Bacteroil，175：5276-5280)，获得重组菌BMB0502。

(1)杀虫晶体蛋白Cry7Bal的表达

将BMB0502在LB培养基(需要时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中过夜活化后，转移至ICPM培养基(需要时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中，培养至芽胞完全成熟脱落。收集菌体，分别用0.5％NaCl和灭菌后的去离子水洗涤三遍后，按照菌体∶灭菌去离子水＝1∶5的体积比重新混匀菌体，加入等体积的2×上样缓冲液并混匀。在沸水浴中处理3-5分钟，以12000rpm离心5分钟。将上清液进行SDS-PAGE电泳。对于2×上样缓冲液的配方和SDS-PAGE电泳操作步骤，参见Laemmli描述的方法(Laemmli，UK.1970，Digestion of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4.Nature(伦敦)227：680-685)。如图6所示，BMB0502能形成和出发菌株YBt-978大小相同的130kDa晶体蛋白，而阴性对照BMB0503(只含有穿梭载体pHT304)无此对应条带。

(2)杀虫晶体蛋白Cry7Bal形成的晶体形态

将BMB0502在LB培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中过夜活化后，转移至ICPM培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中，培养至芽胞即将成熟脱落的阶段。收集菌体，用灭菌去离子水洗涤一遍后，按照菌体∶灭菌去离子水＝1∶5的体积比重新混匀菌体。制备透射电镜(TEM)样品，用Epon812包埋。进行超薄切片，并于80kv进行透射观察拍照。如图7所示，BMB0502能形成双金字塔型的伴胞晶体。

(3)杀虫晶体蛋白Cry7Bal的杀虫效果评价

以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫为对象测定杀虫晶体蛋白Cry7Bal的杀虫效果。将BMB0502在LB培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中活化过夜后，转移至ICPM培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中，培养至芽胞即将成熟脱落的阶段。收集菌体，并用灭菌去离子水洗涤一遍后，获得伴胞晶体混合物。按照标准测定程序(参见Shen Ju-qun，Wang Mian-ju，Yu Zi-niu(1990).Standard Procedureand Method for Bacillus thuringiensis formulations.Chinese Journal ofBiological Control(增刊)：12-16)进行生物测定。每个样品的生物测定重复一次，计算出LC50。结果表明本发明的杀虫晶体蛋白Cry7Bal对小菜蛾表现出很高的毒性(如表1所示)。这表明本发明克隆的Cry7Bal蛋白对鳞翅目昆虫具有很高的杀虫活性。

表1本发明克隆的杀虫晶体蛋白Cry7Bal对小菜蛾生物测定实验结果

时间(天)	材料	回归方程	回归系数	LC₅₀值(95％置信度极限)(ng/ml)
					3	BMB0502	y＝0.9928x+3.0334	0.9946	95.7(93.9-97.5)
5	BMB0502	y＝1.0554x+3.3103	0.9901	39.9(38.2-41.6)

附图说明

图1：是本发明的技术流程图

图2：是本发明实施例中BAC载体pBleoBAC11的构建图

图3：是本发明的构建的克隆载体pUC18的构建图

图4：是本发明实施例构建的穿梭载体的构建图

图5：是本发明实施例构建的重组质粒pBMB0495

图6：是本发明克隆的苏云金芽胞杆菌CryTBal伴胞晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析

M：蛋白质分子量标准：

1：YBt-978菌株的伴胞晶体蛋白：

2：BMB0502菌株的伴胞晶体蛋白：

3：对照BMB0503菌株的处理。

图7：是本发明涉及的苏云金芽胞杆菌YBt-978和BMB0502菌株产生的伴胞晶体形态(内标尺为1μm)

AB：YBt-978菌株的伴胞晶体形态；

C、D：BMB0502菌株的伴胞晶体形态。

具体实施方案

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该指出的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1 苏云金芽胞杆菌YBt-978的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的克隆

参照Luo和Wing(2003)报道的方法(参见：Luo和Wing，2003。Animproved method for plant BAC library construction，p.3-19.In Grotewold，Erich，Plant functional genomic：methods and protocols.Scientific andmedical Dublishers，/Humana Press，Totowa，美国)，利用BAC文库载体pBeloBAC11构建苏云金芽胞杆菌YBt-978菌株(该菌株的来源见文献：Dai J等，1996.Bacillus thuringiensis subspecies huazhongensis，serotypeH40.isolated from soils in the People’S Republic of China.Letters inApplied Microbiology.22(1)：42-45)。以编号为130S1-2和130A1-2引物为引物，以BAC文库单菌落菌体为模板进行PCR扩增。筛选出阳性克隆EMB0491。以Hind III对阳性克隆中YBt-978基因组片段进行完全酶切消化，酶切消化产物与同样被Hind III完全酶切消化的克隆载体pUC18连接，以转化E.coli DH5α。同样以130S1-2和130A1-2为引物，以转化体单菌落菌体为模板进行PCR扩增，筛选出阳性转化体EMB0493。从EMB0493中抽提重组质粒pBMB0492。酶切结果表明：pBMB0492包含约16kb的YBt-978基因组片段。进一步分析表明杀虫晶体蛋白基因cry7Bal位于5kb XhoI片段中。

实施例2 苏云金芽胞杆菌YBT-978的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的序列分析

对杀虫晶体蛋白基因cry7Bal所在的5kb XhoI片段的核苷酸序列进行分析。结果得到5235bp序列，其中3465bp是编码序列。编码序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的编码序列可编码由1154个氨基酸组成的多肽，推导其分子量为130558Da。

比较此多肽与其它已知的Cry与Cyt蛋白的氨基酸序列，发现它与Cry7Ab2、Cry7Ab1和Cry7Aa1最相似，相似性分别达到了58.2％、57.9％、57.1％。N-末端一半的部分序列(位于SEQ ID NO：1中1至658个氨基酸序列)相似度很低，相似性分别为37.1％、37.0％、36.4％。由于与Cry7A杀虫晶体蛋白相似，此多肽已被杀虫晶体蛋白基因命名委员会建议命名为Cry7Bal。

实施例3 杀虫晶体蛋白基因cry7Bal的表达

将cry7Bal所在的5kb XhoI片段转移到在大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304(载体来源见：Arantes O和Lereclus D.1991.Construction of cloningvectors for Bacillus thuringiensis.Gene 108：115-119)上，获得重组质粒pBMB0495。然后通过成熟的电转化方法(WuLan，Sun Ming，Yu Ziniu.A New Resolution Vector with crylAc10 GeneBased on Bacillus thuringiensis Transposon Tn4430.Acta MicrobiologicaSinica.2000，40：264-269)将其转移到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株CryB菌株(菌株来源见：Wu D，Federici BA.1993.A 20-kilodalton proteinpreserves cell viability and promotes CytA crystal formation duringsporulation in Bacillus thuringiensis.J.Bacteroil，175：5276-5280)中，获得重组菌命名为BMB0502。

将上述命名为BMB0502重组菌在LB培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中活化过夜。然后转移至ICPM培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中，培养至芽胞完全成熟脱落。收集菌体，分别用0.5％NaCl和灭菌去离子水洗涤三遍。按照菌体∶灭菌去离子水＝1∶5的体积比重新混匀菌体，然后加入等体积的2倍上样缓冲液并混匀。在沸水浴中处理3-5分钟，12000rpm离心5分钟。将上清液进行SDS-AGE电泳。对于2×上样缓冲液的配方和SDS-AGE电泳操作步骤，参见Laemmli描述的方法(Laemmli，UK.1970.Digestion of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature(伦敦)227：680-685)。如图6所示，BMB0502能形成和出发菌株YBt-978大小相同的130kDa晶体蛋白，而阴性对照BMB0503(只含有穿梭载体pHT304)无此对应条带。

实施例4 杀虫晶体蛋白Cry7Bal的杀虫效果

以小菜蛾3龄幼虫为对象测定杀虫晶体蛋白Cry7Bal的杀虫效果。将BMB0502在LB培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中过夜活化。然后转移至ICPM培养基(使用时加入终浓度为20μg/ml的红霉素)中，培养至芽胞即将成熟脱落的阶段。收集菌体，并用灭菌后的去离子水洗涤一遍，以获得伴胞晶体混合物。按照标准测定程序(参见：ShenJu-qun，Wang Mian-ju，Yu Zi-niu(1990).Standard Procedure and Methodfor Bacillus thuringiensis formulations.Chinese Journal of BiologicalControl(增刊)：12-16)进行生物测定。每个样品的生物测定重复一次，计算出LC50。结果表明杀虫晶体蛋白Cry7Bal对小菜蛾表现出极高的毒性，说明Cry7Bal蛋白溶液具有很高的鳞翅目杀虫活性。该实施例的实施效果参见表1所示。

序列表

<110>华中农业大学

<120>编码苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal

<130>

<141>2005-10-13

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3465

<212>DNA

<213>苏云金芽胞杆菌

<220>

<221>基因

<222>(1)..(3465)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3465)

<223>

<400>1

atg gat ata aga aat caa a ataaa tat gaa gta gta tac cca gca ata 48

Met Asp Ile Arg Asn Gln Asn Lys Tyr Glu Val Val Tyr Pro Ala Ile

1 5 10 15

aat gaa aca act tct aat aca aca tca aag tat cca ctc gca agt gat 96

Asn Glu Thr Thr Ser Asn Thr Thr Ser Lys Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

20 25 30

cca atc aaa caa tat caa aat atg aat tat aaa gat agt ttg aat ata 144

Pro Ile Lys Gln Tyr Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Ser Leu Asn Ile

35 40 45

att gag ggg aat aac gta atc act cca gta tct gga act gct gtt ttg 192

Ile Glu Gly Asn Asn Val Ile Thr Pro Val Ser Gly Thr Ala Val Leu

50 55 60

gca act gca agg aaa att ggt ggt aag atc gtt aag gct ata ggg gaa 240

Ala Thr Ala Arg Lys Ile Gly Gly Lys Ile Val Lys Ala Ile Gly Glu

65 70 75 80

caa atc ttg tct aaa atc ttg aaa gag att ctt gat tat tta tgg ccg 288

Gln Ile Leu Ser Lys Ile Leu Lys Glu Ile Leu Asp Tyr Leu Trp Pro

85 90 95

tct tca agc tcg tcc aat tca tgg gaa gag atg atg aag gaa gta gag 336

Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Trp Glu Glu Met Met Lys Glu Val Glu

100 105 110

tat ctt att gat aaa aaa ata gag gaa tat gca aga aat aag gca ctt 384

Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu

115 120 125

gcg gtt ttg gaa gga ata gga aat gct gta gaa tcc tat tat agt gca 432

Ala Val Leu Glu Gly Ile Gly Asn Ala Val Glu Ser Tyr Tyr Ser Ala

130 135 140

tta gaa gcg tgg gaa tta gaa tct agt gaa cgt agt tta gaa tta gta 480

Leu Glu Ala Trp Glu Leu Glu Ser Ser Glu Arg Ser Leu Glu Leu Val

145 150 155 160

ttg gaa cga tat cag ttt gcg gtg cag ttt gca aga agt tca atg cca 528

Leu Glu Arg Tyr Gln Phe Ala Val Gln Phe Ala Arg Ser Ser Met Pro

165 170 175

tca ttt gcg att ata aat tat gaa att ccc tta tta gca aca tat gca 576

Ser Phe Ala Ile Ile Asn Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ala

180 185 190

aat gct gca aat gtt cat tta ctt tta atg aga gat ata caa ata tac 624

Asn Ala Ala Asn Val His Leu Leu Leu Met Arg Asp Ile Gln Ile Tyr

195 200 205

ggg gat aga tgg gga ata tct caa aat gat atg aat ctc ttc tta aaa 672

Gly Asp Arg Trp Gly Ile Ser Gln Asn Asp Met Asn Leu Phe Leu Lys

210 215 220

gaa caa gaa ata tac acg tct gaa tat tcg gaa cat tgc gta aag tgg 720

Glu Gln Glu Ile Tyr Thr Ser Glu Tyr Ser Glu His Cys Val Lys Trp

225 230 235 240

tat aat gag gga tta aat caa ttg aaa act aaa ggt ggc gca agt ggt 768

Tyr Asn Glu Gly Leu Asn Gln Leu Lys Thr Lys Gly Gly Ala Ser Gly

245 250 255

tta gtt tgg gag aat tat aac agt ttc cgt aca gaa atg aca att atg 816

Leu Val Trp Glu Asn Tyr Asn Ser Phe Arg Thr Glu Met Thr Ile Met

260 265 270

gta tta gat ctt gta gct ata ttt cca gcc tac aat atg agc aaa tat 864

Val Leu Asp Leu Val Ala Ile Phe Pro Ala Tyr Asn Met Ser Lys Tyr

275 280 285

cct ata gaa tca aca gta gaa tta aca aga aca att tat aca gat cca 912

Pro Ile Glu Ser Thr Val Glu Leu Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Asp Pro

290 295 300

ctt ggt tac aca ggg tat agc aat gat gaa cat ccc aca tat tat tct 960

Leu Gly Tyr Thr Gly Tyr Ser Asn Asp Glu His Pro Thr Tyr Tyr Ser

305 310 315 320

tct gca aaa cca ttt tca tca ata gag agt aga gcc gta cta gca ccc 1008

Ser Ala Lys Pro Phe Ser Ser Ile Glu Ser Arg Ala Val Leu Ala Pro

325 330 335

tca tta ttc aaa tgg atc act caa ctt gaa gta tat aca aaa aaa tac 1056

Ser Leu Phe Lys Trp Ile Thr Gln Leu Glu Val Tyr Thr Lys Lys Tyr

340 345 350

agc tac tct tcc caa tat act acg ttg tgg act gga cta aga gtg att 1104

Ser Tyr Ser Ser Gln Tyr Thr Thr Leu Trp Thr Gly Leu Arg Val Ile

355 360 365

gct cag cct act aaa gat ttt act gat act gta tat gat tac gga agt 1152

Ala Gln Pro Thr Lys Asp Phe Thr Asp Thr Val Tyr Asp Tyr Gly Ser

370 375 380

tct tcg ggt tct gag aac aag gat gtc ttt gac ctt tat ggc aat gat 1200

Ser Ser Gly Ser Glu Asn Lys Asp Val Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Asp

385 390 395 400

gta tat gac aca caa agt gtt gtt tca tcg tat aag cct aca ggt ggt 1248

Val Tyr Asp Thr Gln Ser Val Val Ser Ser Tyr Lys Pro Thr Gly Gly

405 410 415

ggc cat ttt ggg gtt cct cag ttt aga tta ttc tgg att act aaa tct 1296

Gly His Phe Gly Val Pro Gln Phe Arg Leu Phe Trp Ile Thr Lys Ser

420 425 430

aat ggg cta aga gaa caa att ttt aat tat gcg aat aat atg ggt tct 1344

Asn Gly Leu Arg Glu Gln Ile Phe Asn Tyr Ala Asn Asn Met Gly Ser

435 440 445

tac agt gcg tat agg ttt agt aag gac gaa tta cca ata gaa ttg ttg 1392

Tyr Ser Ala Tyr Arg Phe Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ile Glu Leu Leu

450 455 460

cag cca cct ctt ttt gga gat ata gag gaa tac agt cat agg tta agt 1440

Gln Pro Pro Leu Phe Gly Asp Ile Glu Glu Tyr Ser His Arg Leu Ser

465 470 475 480

cac gtt tca gag gta att aaa gat tat ggt gaa gga atc att cct gta 1488

His Val Ser Glu Val Ile Lys Asp Tyr Gly Glu Gly Ile Ile Pro Val

485 490 495

tta ggt tgg aca cat gta agt gta act cgt gac aat aga att tat cca 1536

Leu Gly Trp Thr His Val Ser Val Thr Arg Asp Asn Arg Ile Tyr Pro

500 505 510

gat aag att aca caa ctt cca gcg gta aaa atg tat gag tta cta agc 1584

Asp Lys Ile Thr Gln Leu Pro Ala Val Lys Met Tyr Glu Leu Leu Ser

515 520 525

tca gcc gtt gtt gta aaa gga cct gga ttt aca ggt gga gat tta gtt 1632

Ser Ala Val Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val

530 535 540

aag aga acg ggc aat ggt ggc att gga cat ttt aat gtt agt gta gag 1680

Lys Arg Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gly His Phe Asn Val Ser Val Glu

545 550 555 560

tcc cct ggt act cag agg tat cgc ctg aga ata cgt tat agt tca gag 1728

Ser Pro Gly Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Ser Ser Glu

565 570 575

gtt agt gga gta ttt cat atg caa att aac gat ata gaa act att cag 1776

Val Ser Gly Val Phe His Met Gln Ile Asn Asp Ile Glu Thr Ile Gln

580 585 590

gga gaa ttt agt agt act gct gat tca aca agt act ctg tca agc gaa 1824

Gly Glu Phe Ser Ser Thr Ala Asp Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ser Glu

595 600 605

gca ttt caa ctt aga gaa tac tcc act acc ttc acg ttt cca aca aat 1872

Ala Phe Gln Leu Arg Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Thr Phe Pro Thr Asn

610 615 620

atg aca aag ata aag gta tct tta ggt gct att gaa ggt gca gga gga 1920

Met Thr Lys Ile Lys Val Ser Leu Gly Ala Ile Glu Gly Ala Gly Gly

625 630 635 640

ttc tat tta gat aga att gaa ttc att cca gta gat gaa aat cac gat 1968

Phe Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Asn His Asp

645 650 655

aac aga gta aca cta gaa aaa gca cag aaa gcc gtg aat gcc ttg ttt 2016

Asn Arg Val Thr Leu Glu Lys Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe

660 665 670

aca gcg gga aga aac gca cta caa aca gat gtg aca gat tac aaa gta 2064

Thr Ala Gly Arg Asn Ala Leu Gln Thr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Val

675 680 685

gat cag gtt tcc att tta gtg gat tgt gta tca ggg gag tta tat cca 2112

Asp Gln Val Ser Ile Leu Val Asp Cys Val Ser Gly Glu Leu Tyr Pro

690 695 700

aat gag aaa cgc gaa cta ctc agt tta gtc aaa tac gca aaa cgt ttg 2160

Asn Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Leu Val Lys Tyr Ala Lys Arg Leu

705 710 715 720

agc tat tct cgt aat tta ctc cta gat cca aca ttc gat tct att aat 2208

Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Leu Asp Pro Thr Phe Asp Ser Ile Asn

725 730 735

tcg tca gat gag aat ggc tgg tac gga agt aat ggt att gca att gga 2256

Ser Ser Asp Glu Asn Gly Trp Tyr Gly Ser Asn Gly Ile Ala Ile Gly

740 745 750

aat ggg aac ttt gta ttc aaa gga aac tat tta att ttc tca ggt acc 2304

Asn Gly Asn Phe Val Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Ile Phe Ser Gly Thr

755 760 765

aat gat aca caa tac cca acg tat ctc tat caa aaa att gat gaa tcc 2352

Asn Asp Thr Gln Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser

770 775 780

aag ctc aaa gaa tat aca cgc tat aaa ctg aga gga ttt atc gaa aat 2400

Lys Leu Lys Glu Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Arg Gly Phe Ile Glu Asn

785 790 795 800

agt caa gat tta gaa gca tat gtg att cgc tat gat gca aaa cat gaa 2448

Ser Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Val Ile Arg Tyr Asp Ala Lys His Glu

805 810 815

aca ttg gat gta tcc aat aat cta ttg ccg gat att tct cct gta aat 2496

Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Val Asn

820 825 830

gca tgc gga gaa cca aat cgt tgt gct gca tta caa tac ctg gat gaa 2544

Ala Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Asp Glu

835 840 845

aat cca agg tta gaa tgt agt tcg ata caa gac ggt att tta tct gat 2592

Asn Pro Arg Leu Glu Cys Ser Ser Ile Gln Asp Gly Ile Leu Ser Asp

850 855 860

tcg cat tcg ttc tct ctc aat ata gat aca ggt tct att gat ttc aat 2640

Ser His Ser Phe Ser Leu Asn Ile Asp Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asn

865 870 875 880

gag aac gta gga att tgg gtg ttg ttt aaa att tcc aca ccg gaa ggg 2688

Glu Asn Val Gly Ile Trp Val Leu Phe Lys Ile Ser Thr Pro Glu Gly

885 890 895

tat gcg aaa ttt gga aac cta gaa gtg att gaa gat agc cca gtc att 2736

Tyr Ala Lys Phe Gly Asn Leu Glu Val Ile Glu Asp Ser Pro Val Ile

900 905 910

gga gaa gca tta gcc cgt gta aaa cgc caa gaa acg aag tgg cga aac 2784

Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Gln Glu Thr Lys Trp Arg Asn

915 920 925

aag ttg aca caa ctg cga acg gaa aca caa gcg att tat aca cga gca 2832

Lys Leu Thr Gln Leu Arg Thr Glu Thr Gln Ala Ile Tyr Thr Arg Ala

930 935 940

aaa caa gcc att gat aat gta ttc aca aat gca cag gac tct cac tta 2880

Lys Gln Ala Ile Asp Asn Val Phe Thr Asn Ala Gln Asp Ser His Leu

945 950 955 960

aaa ata ggt acg aca ttt gcg gca att gtg gct gcg cga aag att gtc 2928

Lys Ile Gly Thr Thr Phe Ala Ala Ile Val Ala Ala Arg Lys Ile Val

965 970 975

caa tcc ata cgc gaa gcg tat atg tca tgg tta tca atc gtt cca ggt 2976

Gln Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Met Ser Trp Leu Ser Ile Val Pro Gly

980 985 990

gta aat tat cct att ttt aca gag ttg aat gag aga gta cag cga gca 3024

Val Asn Tyr Pro Ile Phe Thr Glu Leu Asn Glu Arg Val Gln Arg Ala

995 1000 1005

ttt caa tta tat gat gta cgg aat gtc gtg cgt aat ggc cga ttc 3069

Phe Gln Leu Tyr Asp Val Arg Asn Val Val Arg Asn Gly Arg Phe

1010 1015 1020

ctg aat gga gta tcg gat tgg att gtg aca tct gat gta aag gta 3114

Leu Asn Gly Val Ser Asp Trp Ile Val Thr Ser Asp Val Lys Val

1025 1030 1035

caa gaa gaa aat ggg aac aat gta tta gtt ctt tcc aat tgg gat 3159

Gln Glu Glu Asn Gly Asn Asn Val Leu Val Leu Ser Asn Trp Asp

1040 1045 1050

gcg caa gta tta caa tgt ctg aag ctc tat caa gat cgc gga tat 3204

Ala Gln Val Leu Gln Cys Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Arg Gly Tyr

1055 1060 1065

atc ttg cgt gta acg gca cgt aaa gaa gga ttg gga gaa gga tat 3249

Ile Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly Leu Gly Glu Gly Tyr

1070 1075 1080

att aca att acg gat gaa gaa ggg cat aca gat caa ttg aca ttt 3294

Ile Thr Ile Thr Asp Glu Glu Gly His Thr Asp Gln Leu Thr Phe

1085 1090 1095

ggc aca tgt gag gaa ata gat gca tct aac acg ttc gta acc aca 3339

Gly Thr Cys Glu Glu Ile Asp Ala Ser Asn Thr Phe Val Thr Thr

1100 1105 1110

ggt tat att aca aaa gaa cta gaa ttt ttc cca gat aca gag aaa 3384

Gly Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Glu Phe Phe Pro Asp Thr Glu Lys

1115 1120 1125

gtg cgt ata gaa att ggg gaa aca gaa gga acc ttc cag gta gaa 3429

Val Arg Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Gln Val Glu

1130 1135 1140

agt ata gag tta ttt ttg atg gaa gat cta tgt taa 3465

Ser Ile Glu Leu Phe Leu Met Glu Asp Leu Cys

1145 1150

<210>2

<211>1154

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌

<400>2

Met Asp Ile Arg Asn Gln Asn Lys Tyr Glu Val Val Tyr Pro Ala Ile

1 5 10 15

Asn Glu Thr Thr Ser Asn Thr Thr Ser Lys Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

20 25 30

Pro Ile Lys Gln Tyr Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Ser Leu Asn Ile

35 40 45

Ile Glu Gly Asn Asn Val Ile Thr Pro Val Ser Gly Thr Ala Val Leu

50 55 60

Ala Thr Ala Arg Lys Ile Gly Gly Lys Ile Val Lys Ala Ile Gly Glu

65 70 75 80

Gln Ile Leu Ser Lys Ile Leu Lys Glu Ile Leu Asp Tyr Leu Trp Pro

85 90 95

Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Trp Glu Glu Met Met Lys Glu Val Glu

100 105 110

Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu

115 120 125

Ala Val Leu Glu Gly Ile Gly Asn Ala Val Glu Ser Tyr Tyr Ser Ala

130 135 140

Leu Glu Ala Trp Glu Leu Glu Ser Ser Glu Arg Ser Leu Glu Leu Val

145 150 155 160

Leu Glu Arg Tyr Gln Phe Ala Val Gln Phe Ala Arg Ser Ser Met Pro

165 170 175

Ser Phe Ala Ile Ile Asn Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ala

180 185 190

Asn Ala Ala Asn Val His Leu Leu Leu Met Arg Asp Ile Gln Ile Tyr

195 200 205

Gly Asp Arg Trp Gly Ile Ser Gln Asn Asp Met Asn Leu Phe Leu Lys

210 215 220

Glu Gln Glu Ile Tyr Thr Ser Glu Tyr Ser Glu His Cys Val Lys Trp

225 230 235 240

Tyr Asn Glu Gly Leu Asn Gln Leu Lys Thr Lys Gly Gly Ala Ser Gly

245 250 255

Leu Val Trp Glu Asn Tyr Asn Ser Phe Arg Thr Glu Met Thr Ile Met

260 265 270

Val Leu Asp Leu Val Ala Ile Phe Pro Ala Tyr Asn Met Ser Lys Tyr

275 280 285

Pro Ile Glu Ser Thr Val Glu Leu Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Asp Pro

290 295 300

Leu Gly Tyr Thr Gly Tyr Ser Asn Asp Glu His Pro Thr Tyr Tyr Ser

305 310 315 320

Ser Ala Lys Pro Phe Ser Ser Ile Glu Ser Arg Ala Val Leu Ala Pro

325 330 335

Ser Leu Phe Lys Trp Ile Thr Gln Leu Glu Val Tyr Thr Lys Lys Tyr

340 345 350

Ser Tyr Ser Ser Gln Tyr Thr Thr Leu Trp Thr Gly Leu Arg Val Ile

355 360 365

Ala Gln Pro Thr Lys Asp Phe Thr Asp Thr Val Tyr Asp Tyr Gly Ser

370 375 380

Ser Ser Gly Ser Glu Asn Lys Asp Val Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Asp

385 390 395 400

Val Tyr Asp Thr Gln Ser Val Val Ser Ser Tyr Lys Pro Thr Gly Gly

405 410 415

Gly His Phe Gly Val Pro Gln Phe Arg Leu Phe Trp Ile Thr Lys Ser

420 425 430

Asn Gly Leu Arg Glu Gln Ile Phe Asn Tyr Ala Asn Asn Met Gly Ser

435 440 445

Tyr Ser Ala Tyr Arg Phe Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ile Glu Leu Leu

450 455 460

Gln Pro Pro Leu Phe Gly Asp Ile Glu Glu Tyr Ser His Arg Leu Ser

465 470 475 480

His Val Ser Glu Val Ile Lys Asp Tyr Gly Glu Gly Ile Ile Pro Val

485 490 495

Leu Gly Trp Thr His Val Ser Val Thr Arg Asp Asn Arg Ile Tyr Pro

500 505 510

Asp Lys Ile Thr Gln Leu Pro Ala Val Lys Met Tyr Glu Leu Leu Ser

515 520 525

Ser Ala Val Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val

530 535 540

Lys Arg Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gly His Phe Asn Val Ser Val Glu

545 550 555 560

Ser Pro Gly Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Ser Ser Glu

565 570 575

Val Ser Gly Val Phe His Met Gln Ile Asn Asp Ile Glu Thr Ile Gln

580 585 590

Gly Glu Phe Ser Ser Thr Ala Asp Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ser Glu

595 600 605

Ala Phe Gln Leu Arg Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Thr Phe Pro Thr Asn

610 615 620

Met Thr Lys Ile Lys Val Ser Leu Gly Ala Ile Glu Gly Ala Gly Gly

625 630 635 640

Phe Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Asn His Asp

645 650 655

Asn Arg Val Thr Leu Glu Lys Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe

660 665 670

Thr Ala Gly Arg Asn Ala Leu Gln Thr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Val

675 680 685

Asp Gln Val Ser Ile Leu Val Asp Cys Val Ser Gly Glu Leu Tyr Pro

690 695 700

Asn Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Leu Val Lys Tyr Ala Lys Arg Leu

705 710 715 720

Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Leu Asp Pro Thr Phe Asp Ser Ile Asn

725 730 735

Ser Ser Asp Glu Asn Gly Trp Tyr Gly Ser Asn Gly Ile Ala Ile Gly

740 745 750

Asn Gly Asn Phe Val Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Ile Phe Ser Gly Thr

755 760 765

Asn Asp Thr Gln Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser

770 775 780

Lys Leu Lys Glu Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Arg Gly Phe Ile Glu Asn

785 790 795 800

Ser Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Val Ile Arg Tyr Asp Ala Lys His Glu

805 810 815

Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Val Asn

820 825 830

Ala Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Asp Glu

835 840 845

Asn Pro Arg Leu Glu Cys Ser Ser Ile Gln Asp Gly Ile Leu Ser Asp

850 855 860

Ser His Ser Phe Ser Leu Asn Ile Asp Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asn

865 870 875 880

Glu Asn Val Gly Ile Trp Val Leu Phe Lys Ile Ser Thr Pro Glu Gly

885 890 895

Tyr Ala Lys Phe Gly Asn Leu Glu Val Ile Glu Asp Ser Pro Val Ile

900 905 910

Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Gln Glu Thr Lys Trp Arg Asn

915 920 925

Lys Leu Thr Gln Leu Arg Thr Glu Thr Gln Ala Ile Tyr Thr Arg Ala

930 935 940

Lys Gln Ala Ile Asp Asn Val Phe Thr Asn Ala Gln Asp Ser His Leu

945 950 955 960

Lys Ile Gly Thr Thr Phe Ala Ala Ile Val Ala Ala Arg Lys Ile Val

965 970 975

Gln Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Met Ser Trp Leu Ser Ile Val Pro Gly

980 985 990

Val Asn Tyr Pro Ile Phe Thr Glu Leu Asn Glu Arg Val Gln Arg Ala

995 1000 1005

Phe Gln Leu Tyr Asp Val Arg Asn Val Val Arg Asn Gly Arg Phe

1010 1015 1020

Leu Asn Gly Val Ser Asp Trp Ile Val Thr Ser Asp Val Lys Val

1025 1030 1035

Gln Glu Glu Asn Gly Asn Asn Val Leu Val Leu Ser Asn Trp Asp

1040 1045 1050

Ala Gln Val Leu Gln Cys Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Arg Gly Tyr

1055 1060 1065

Ile Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly Leu Gly Glu Gly Tyr

1070 1075 1080

Ile Thr Ile Thr Asp Glu Glu Gly His Thr Asp Gln Leu Thr Phe

1085 1090 1095

Gly Thr Cys Glu Glu Ile Asp Ala Ser Asn Thr Phe Val Thr Thr

1100 1105 1110

Gly Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Glu Phe Phe Pro Asp Thr Glu Lys

1115 1120 1125

Val Arg Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Gln Val Glu

1130 1135 1140

Ser Ile Glu Leu Phe Leu Met Glu Asp Leu Cys

1145 1150

<210>3

<211>15

<212>PRT

<400>3

MDIRNQNKYEVVYPA 15

<210>4

<211>46

<212>DNA

<400>4

GCTCGAGTCGACCGTGGTACGCGTGTGTGAGCTCCCGGGATCCGGT 46

<210>5

<211>28

<212>DNA

<223>H＝A，C，或T；M-A或C；N＝A，G，C，或T；R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T

<400>5

ATGGATATHMGNAATCARAAYAARTAYG 28

<210>6

<211>26

<212>DNA

<400>6

AATAAATATGARGTWGTNTAYCCNGC 26

<210>7

<211>19

<212>DNA

<400>7

GCTCGAGTCGACCGTGGTA 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<400>8

GTACGCGTGTGTGAGCTCC 19

<210>9

<211>28

<212>DNA

<400>9

TTCTAATACAACATCAAAGTATCCACTC 28

<210>10

<211>27

<212>DNA

<400>10

GGTATCGTTCCAATACTAATTCTAAAC 27

Claims

1.一种从苏云金芽胞杆菌分离的杀虫晶体蛋白基因，其中所述的基因编码Cry7Bal蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的从苏云金芽胞杆菌分离的杀虫晶体蛋白基因，其中所述的基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID：1所示。

3.包含权利要求1或2的杀虫晶体蛋白基因的重组DNA构建体。

4.包含权利要求4的重组DNA构建体的微生物。

5.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.被编码权利要求5所述的氨基酸序列的核苷酸序列所转化的植物细胞。