CN1111600C - 杀虫蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的杀虫蛋白基因以及该基因编码的蛋白质。该杀虫蛋白基因属于Bt cryIA(a)杀虫蛋白基因，来源于苏云金芽孢杆菌Kurstaki HD-1-02，这种基因所编码的蛋白对鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用。可用于作物的虫害防治。

Description

杀虫蛋白基因及其应用

本发明涉及一种来源于苏云金芽孢杆菌的新型杀虫蛋白基因，该基因编码的蛋白质，及其应用。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称BT)是一种革兰氏阳性土壤杆菌。在不良环境下，苏云金芽孢杆菌伴随内生孢子的形成可产生一至几个伴孢晶体，该晶体含有对许多昆虫有毒杀作用的δ-内毒素(δ-endotoxin)，也称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。它们是一类分子量130-160KD的蛋白质，在昆虫中肠碱性和还原性环境下，蛋白被降解成60KD左右的活性小肽，从而导致昆虫中毒死亡。在过去的几十年中，苏云金芽孢杆菌作为一种微生物杀虫剂一直被广泛应用于防治农作物、蔬菜和森林害虫。但由于这种细菌农药存在着成本高，在植物叶面存留时间短(易受风吹、雨淋而散落)等缺点，自八十年代以来国内外纷纷开展了克隆BT杀虫蛋白基因并通过转基因技术培育抗虫植物的研究工作。到目前为止，已有100种以上的BT杀虫蛋白基因被克隆并完成测序(Peferoen，TIBTECH，1997，15：173-177)，也已有3种转BT杀虫蛋白基因的作物(棉花、玉米、马铃薯)得到商业化推广，并且是目前唯一被商业化的抗虫转基因作物(Schuler等，TIBTECH，1998，16：168-175)。从目前的研究来看，BT基因是所有抗虫基因中较为理想的一类。

BT基因应用于抗虫转基因作物经历了四个发展阶段，第一代BT转基因植物诞生于八十年代中期，几乎都使用了野生型的BT基因或3’端缺失的BT基因(Vaeck等，Nature，1987，33-37；Fischhoff等，Biotechnology，1987，5：807-803)。但由于野生型基因富含AT序列以及微生物偏爱的密码，在植物中的表达量较低，所得到的转基因植物抗虫效果并不理想。第二代转基因植物所使用的BT基因一般都经过了人工改造，在不改变氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行部分改造或重新合成，选用植物偏爱的密码，去除原序列中在植物体内的不稳定原件，使毒蛋白基因的表达水平和杀虫效果有了很大提高(Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88：3324-3328)。第三代BT转基因植物是将不同种类的、与昆虫中肠上皮细胞膜受体具有非竞争性结合关系的BT基因或将BT基因与其他来源的抗虫基因构成二价体或多价体转化植物，以期获得昆虫难以产生抗性和提高杀虫力的效果。第四代转基因植物是借助于国际上出现的一种新型基因转化技术-叶绿体转化而获得的。这种转化技术具有定点整合、高效表达、遗传稳定、原核基因无需改造等诸多优点。1995年，McBride等人(McBride等，Bio/technology，1995，13：362-365)将未经改造的BT基因转入烟草叶绿体，发现杀虫蛋白在叶片中的表达量高达3-5％(通常的细胞核转化中BT基因的表达量只有0.001-0.1％)，所得的叶绿体转化体杀虫效果极为显著。纵观BT转基因的研究历史可以看出，来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因无论是其野生型或其改造型在培育抗虫作物方面均具有重要应用价值。

BT杀虫蛋白基因的种类很多，来源于不同亚种或株系的苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白杀虫毒力和杀虫范围是不同的(Aronsn等，Microbiol.Rev，1986，50：1-24)。一般根据它们的杀虫范围和基因序列同源性划分为六大类：CryI主要作用于鳞翅目，CryII主要作用于鳞翅目和双翅目，CryIII主要作用于鞘翅目，CryIV主要作用于双翅目，CryV主要作用于鳞翅目和鞘翅目，还有一类命名为cyt，来源于BT以色列亚种，除了对双翅目昆虫有毒杀作用外，还对无脊椎和脊椎动物有溶细胞作用。同一类杀虫蛋白基因根据其蛋白质氨基酸序列的同源性差异又可分为许多亚类，例如，cryIA(a)、cryIA(b)、cryIA(c)等。筛选出具有广泛的、较强的毒杀作用的杀虫蛋白基因一直是本领域的研究人所孜孜以求的。

本发明的一个目的是提供一种新的杀虫蛋白基因，它属于Bt cryIA(a)杀虫蛋白基因，来源于苏云金芽孢杆菌Kurstaki HD-1-02，这种基因所编码的蛋白对鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用。可用于作物的虫害防治。本发明的Bt杀虫蛋白基因全序列见图2，该基因共3531个核苷酸，其中编码毒性肽的部分是1-1935核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种杀虫蛋白质。本发明的蛋白质的序列见图1，该蛋白质共1176个氨基酸，分子量135KD，其中具有杀虫活性的毒性肽的部分是1-645氨基酸。

本发明的Bt杀虫蛋白基因能够在大肠杆菌中进行表达，其表达产物对鳞翅目昆虫有毒杀作用。利用全长的野生型基因或只用其5’端1935bp的毒性区序列，均可进行植物细胞核转化。对基因序列进行人工改造，使其密码子更适合于在植物中表达，可显著提高表达量或杀虫效果。

本发明的再一个目的是提供一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将本发明的杀虫蛋白基因导入植物的叶绿体中的步骤。

本发明的Bt杀虫蛋白基因可以不经改造可直接用于叶绿体转化。在进行叶绿体转化时，可将该基因(在叶绿体基因启动子的驱动下)定点插入植物叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间。油菜中这两个基因已被克隆，其核苷酸序列见图3和图4。rps7基因的编码区是从29至496核苷酸，ndhB基因是一个不连续编码基因，从85-861核苷酸为外显子1，862-1539核苷酸为内含子，1540-2295为外显子2。

本发明中的Bt杀虫蛋白基因用于植物细胞核转化时，所有常规方法均可使用。在进行叶绿体转化时，基因枪转化法和微束激光穿刺转化法效果较好。

附图简要说明图1是本发明的BT杀虫蛋白的氨基酸序列；图2是本发明的BT杀虫蛋白基因全序列；图3是油菜叶绿体rps7基因全序列；图4是油菜叶绿体ndhB基因全序列；图5是油菜的叶绿体转化载体P：叶绿体基因启动子，T：叶绿体基因终止子。

                            实施例下文将通过实施例对本发明做进一步说明

实施例1新型Bt cryIA(a)杀虫蛋白基因的克隆、原核表达及杀虫实验。

一、细菌培养和质粒提取：采用SPY液体培养基(Spizizen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1958，44：1072-1078)在37℃培养苏云金芽孢杆菌kurstaki HD-1-02至OD₆₀₀＝0.7，按Kronstad等人的方法提取质粒DNA..(Kronstad等，J.Bacteriol.1983，154；419-428)

二、BT杀虫蛋白基因cryIA(a)的克隆：设计并合成如下两个引物，

         5’ CCATGG ATAAC AATCC GAACA TCAATG 3’

         5’ GTCGAC CTATT CCTCC ATAAG AAGTA  3’在两引物5’端分别添力NcoI和SalI酶切位点(下划线部分)。以苏云金芽孢杆菌的质粒DNA为模板，利用上面两引物按PCR方法扩增BT杀虫蛋白基因。Tag DNA聚合酶选用上海生工生物工程公司的适于扩增大片段和高保真的Tag plusI DNA聚合酶。扩增程序为：94℃5分钟；94℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环；72℃10分钟降至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，将会发现有一条3.5kb主带，此带就是扩增到的杀虫蛋白基因。切出这一主带，Glassmilk纯化回收，与克隆载体PGEM-TVector连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在附力AMP 50μg/ml以及X-gal和IPTG的平板上筛选重组克隆，并提取质粒(Sambrook等，Molecular cloning，cold spring harbor laboratory，1989)进行酶切鉴定。

三、BT杀虫蛋白基因在大肠杆菌中表达：用NcoI和SalI从克隆载体上切出杀虫蛋白基因，连接到用同样酶切的原核表达载体PBV221上，转化大肠杆菌并在AMP平板上筛选重组子，然后提取质粒进行酶切鉴定。经过鉴定的含有BT杀虫蛋白基因的重组细菌在42℃培养诱导基因表达，具体方法参照文献(曾庆等，病毒学报，1992，8：205-209)，诱导培养后的细菌按文献(杨远征等，微生物学报，1996，36；173-180)所述方法分离提纯杀虫蛋白，该杀虫蛋白经SDS-PAGE电泳，可以发现其为大约135KD的蛋白质分子。

四、杀虫实验：各500ml重组细菌和非重组细菌的诱导培养物经离心收集菌体，蒸馏水洗涤抽干，再用30ml蒸馏水重悬，超声波处理，稀释两倍后均匀涂布于洗净的烟草叶片上，同时设置清水作对照。待叶面自然晾干后饲喂二铃棉铃虫(Heliothis armigera)，25℃喂养72小时后统计死亡率并求出校正死亡率。[校正死亡率＝(处理的平均死亡率-对照的平均死亡率)/对照的平均存活率×100％]。每个处理重复三次，会发现含有这一新型BT杀虫蛋白基因cryIA(a)的重组细菌对棉铃虫有较强的杀伤力(表1-1)。对其他鳞翅目害虫如小菜粉蝶(Pieris rapae L.)、小菜蛾(Plutellaxylostella)等也有同样的毒杀作用。

表1-1，杀虫蛋白基因表达产物对棉铃虫的杀虫活性

处理            接种幼虫数       死亡幼虫数      死亡率％      校正死亡率％

对照            45               1               2.2           -

非重组菌        45               3               6.7           4.6

重组菌          45               43              95.6          95.5

实施例2新型Bt cryIA(a)杀虫蛋白基因用于叶绿体转化和培育抗虫油菜

一、载体构建：构建的适于在油菜叶绿体中表达的、可进行定点转化的载体包含了以下几个元件：①基本质粒，选用pBluescript SK(+)(购于Stratagene公司)作为基本质粒，在此基础上添加其他元件。②定位片段：此处选用油菜叶绿体的rps7和ndhB基因作为转基因的定位片段。③筛选标记：选用aadA基因(可产生壮观霉素抗性)作为筛选标记基因，该基因由叶绿体基因的启动子所驱动。④杀毒蛋白基因：为本发明中的BTcryIA(a)基因，由叶绿体基因启动子所驱动。整个载体11.7kb，见图5。

二、转化受体：供试材料为甘蓝性油菜的优质品种“H165”，将油菜种子灭菌消毒后在MS培养基上萌发4-5天，切下子叶柄作为转化受体。

三、基因转化：采用基因枪和微束激光穿刺两种方法转化油菜叶绿体。按常规方法制备微粒子弹，用Bio-Rad PDS-1000/He基因枪对高渗处理4小时的子叶柄进行轰击，然后高渗处理16小时。转入分化培养基培养2天，再转入含壮观霉素的筛选培养基上进行分化和筛选。进行激光转化时，先对子叶柄进行高渗处理25分钟，然后利用Nd-YAG激光细胞显微照射系统对子叶柄基部进行穿刺，采用波长0.355μm，脉宽15ns，每个子叶柄进行15个脉冲的照射。然后转入分化培养基培养2天，再转入含有壮观霉素的筛选培养基进行分化和筛选。

四、叶绿体转化体的获得：在筛选培养基上得到的绿苗经进一步培养长大，移栽到花盆中。然后，提取叶绿体DNA进行PCR检测，PCR引物为扩增BT杀虫蛋白基因的两个引物。对PCR检测为阳性植株的叶绿体DNA进行适当的内切酶切割、电泳、转膜，然后进行Southern杂交，杂交探针为地高辛标记的BT杀虫蛋白基因cryIA(a).Southern杂交显示阳性信号者，被确定为叶绿体转化体。

五、叶绿体转化体的抗虫实验：取叶绿体转化体(T₀代)的叶片饲喂小菜蛾幼虫，四天后统计幼虫死亡率。结果表明油菜叶绿体转化体具有很高的抗虫性。此结果证明了本发明中的BT杀虫蛋白基因在叶绿体中能够高效表达，并且杀虫效果显著。

Claims (7)

1.一种杀虫蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列：1  MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGGRIETGYTPIDISLSLTQFLLSEFVPGAGFVLGL61  VDIIWGIFGPSQWDTFLVQIEQLINQRIEEFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEAD121 PTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLLAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQ181 RWGFDAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERVWGPDSRDWVRYNQFRRELTLTV241 LDIVALFSNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGMAQRIEQNIRQPHLMDIL301 NSITIYTDVHRGFNYWSGHQITASPVGFSGPEFAFPLFGNAGNAAPPVLVSLTGLGIFRT361 LSSPLYRRIILGSGPNNQELFVLDGTEFSFASLTTNLPSTIYRQRGTVDSLDVIPPQDNS421 VPPRAGFSHRLGHVTMLSQAAGAVYTLRAPTFSWQHRSAEFNNIIPSSQITQIPLTKSTN481 LGSGTSVVKGPGFTGGDILRRTSPGQISTLRVNITAPLSQRYRVRIRYASTTNLQFHTSI541 DGRPINQGNFSATMSSGSNLQSGSFRTVGFTTPFNFSNGSSVFTLSAHVFNSGNEVYIDR601 IEFVPAEVTFEAEYDLERAQKAVNELFTSSNQIGLKTDVTDYHIDQVSNLVECLSDEFCL661 DEKQELSEKVKHAKRLSDERNLLQDPNFRGINRQLDRGWRGSTDITIQGGDDVFKENYVT721 LLGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAYTRYQLRGYIEDSQDLEIYLIRYNAKHETVNVPGTG781 SLWPLSAQSPIGKCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDLNE841 DLGVWVIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKIAEKKWRDKREKLEWETNIVY901 KEAKESVDALFVNSQYDQLQADTNIAMIHAADKRVHSIREAYLPELSVIPGVNAAIFEEL961 EGRIFTAFSLYDARNVIKNGDFNNGLSCWNVKGHVDVEEQNNQRSVLVVPEWEAEVSQEV1021 RVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTIHEIENNTDELKFSNCVEEEIYSNNTVTCNDYTVN1081 QEEYGGAYTSRNRGYNEAPSVPADYASVYEEKSYTDGRRENPCEFNRGYRDYTPLPVGYV1141 TKELEYFPETDKVWIEIGETEGTFIVDSVELLLMEE。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列。

3.按照权利要求2所述的核苷酸序列，它具有如下的序列：   1 atggataaca atccgaacat caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa61 gtagaagtat taggtggagg aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg121 tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta181 gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acacatttct tgtacaaatt241 gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta301 gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat361 cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc421 cttacaaccg ctattcctct tttggcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta481 tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa541 aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt601 ggcaactata cagattatgc tgtgcgctgg tacaatacgg gattagagcg tgtatgggga661 ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa gagagctaac acttactgta721 ttagatatcg ttgctctatt ctcaaattat gatagtcgaa ggtatccaat tcgaacagtt781 tcccaattaa caagagaaat ttatacgaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt841 cgtggaatgg ctcagagaat agaacagaat attaggcaac cacatcttat ggatatcctt901 aatagtataa ccatttatac tgatgtgcat agaggcttta attattggtc agggcatcaa961 ataacagctt ctcctgtagg gttttcagga ccagaattcg cattcccttt atttgggaat1021 gcggggaatg cagctccacc cgtacttgtc tcattaactg gtttggggat ttttagaaca1081 ttatcttcac ctttatatag aagaattata cttggttcag gcccaaataa tcaggaactg1141 tttgtccttg atggaacgga gttttctttt gcctccctaa cgaccaactt gccttccact1201 atatatagac aaaggggtac agtcgattca ctagatgtaa taccgccaca ggataatagt1261 gtaccacctc gtgcgggatt tagccatcga ttgggtcatg ttacaatgct gagccaagca1321 gctggagcag tttacacctt gagagctcca acgttttctt ggcagcatcg cagtgctgaa1381 tttaataata taattccttc atcacaaatt acacaaatac ctttaacaaa atctactaat1441 cttggctctg gaacttctgt cgttaaagga ccaggattta caggaggaga tattcttcga1501 agaacttcac ctggccagat ttcaacctta agagtaaata ttactgcacc attatcacaa1561 agatatcggg taagaattcg ctacgcttct actacaaatt tacaattcca tacatcaatt1621 gacggaagac ctattaatca gggtaatttt tcagcaacta tgagtagtgg gagtaattta1681 cagtccggaa gctttaggac tgtaggtttt actactccgt ttaacttttc aaatggatca1741 agtgtattta cgttaagtgc tcatgtcttc aattcaggca atgaagttta tatagatcga1801 attgaatttg ttccggcaga agtaaccttt gaggcagaat atgatttaga aagagcacaa1861 aaggcggtga atgagctgtt tacttcttcc aatcaaatcg ggttaaaaac agatgtgacg1921 gattatcata ttgatcaagt atccaattta gttgagtgtt tatcagatga attttgtttg1981 gatgaaaaac aagaattgtc cgagaaagtc aaacatgcga agcgacttag tgatgagcgg2041 aatttacttc aagatccaaa cttcagaggg atcaatagac aactagaccg tggctggaga2101 ggaagtacgg atattaccat ccaaggaggc gatgacgtat ttaaagagaa ttacgttacg2161 ctattgggta cctttgatga gtgctatcca acgtatttat atcaaaaaat agatgagtcg2221 aaattaaaag cctatacccg ttatcaatta agagggtata tcgaagatag tcaagactta2281 gaaatctatt taattcgcta caatgcaaaa catgaaacag taaatgtgcc aggtacgggt2341 tccttatggc cgctttcagc ccaaagtcca atcggaaagt gtggagagcc gaatcgatgc2401 gcgccacacc ttgaatggaa tcctgactta gattgttcgt gtagggatgg agaaaagtgt2461 gcccatcatt cgcatcattt ctccttagac attgatgtag gatgtacaga cttaaatgag2521 gacctaggtg tatgggtgat ctttaagatt aagacgcaag atgggcacgc aagactaggg2581 aatctagagt ttctcgaaga gaaaccatta gtaggagaag cgctagctcg tgtgaaaata2641 gcggagaaaa aatggagaga caaacgtgaa aaattggaat gggaaacaaa tatcgtttat2701 aaagaggcaa aagaatctgt agatgcttta tttgtaaact ctcaatatga tcaattacaa2761 gcggatacga atattgccat gattcatgcg gcggataaac gtgttcatag cattcgagaa2821 gcttatctgc ctgagctgtc tgtgattccg ggtgtcaatg cggctatttt tgaagaatta2881 gaagggcgta ttttcactgc attctcccta tatgatgcga gaaatgtcat taaaaatggt2941 gattttaata atggcttatc ctgctggaac gtgaaagggc atgtagatgt agaagaacaa3001 aacaaccaac gttcggtcct tgttgttccg gaatgggaag cagaagtgtc acaagaagtt3061 cgtgtctgtc cgggtcgtgg ctatatcctt cgtgtcacag cgtacaagga gggatatgga3121 gaaggttgcg taaccattca tgagatcgag aacaatacag acgaactgaa gtttagcaac3181 tgcgtagaag aggaaatcta ttcaaataac acggtaacgt gtaatgatta tactgtaaat3241 caagaagaat acggaggtgc gtacacttct cgtaatcgag gatataacga agctccttcc3301 gtaccagctg attatgcgtc agtctatgaa gaaaaatcgt atacagatgg acgaagagag3361 aatccttgtg aatttaacag agggtatagg gattacacgc cactaccagt tggttatgtg3421 acaaaagaat tagaatactt cccagaaacc gataaggtat ggattgagat tggagaaacg3481 gaaggaacat ttatcgtgga cagcgtggaa ttacttctta tggaggaata g 。

4.一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将权利要求2所述的核苷酸序列导入植物的叶绿体中的步骤。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列被定点插入植物叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间。

6.一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将权利要求3所述的核苷酸序列导入植物的叶绿体中的步骤。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列被定点插入植物叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间。