HU220714B1

HU220714B1 - Új peszticid proteinek és törzsek

Info

Publication number: HU220714B1
Application number: HU9502466A
Authority: HU
Inventors: Brian Carr; Nalini M. Desai; N. Kristy Kostichka; Michael G. Koziel; Martha A. Mullins; Gordon J. Nye; Gregory W. Warren
Original assignee: Novartis Ag.
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2002-04-29
Also published as: RO117111B1; BG63313B1; CA2157297A1; UA52579C2; SG49845A1; SK117695A3; CN1119877A; ES2235162T3; DE69434283T2; BR9406484A; DE69434283D1; AU684068B2; BG100000A; SK283509B6; ATE290083T1; EP1471145A2; HUT73337A; EP0690916B1; CZ290301B6; NZ263445A

Abstract

A találmány tárgyát vegetatív fejlődési szakaszukban folyékonytápközegből izolálható peszticid fehérjét termelő Bacillus törzsek, újpeszticid fehérjék, módosított peszticid fehérjék és aktívfragmentumaik, a peszticid fehérjék aktivitását növelő kiegészítőfehérjék, a fehérjéket kódoló nukleotidszekvenciák és az ilyenszekvenciákkal stabilan transzformált növények képezik. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárások és készítmények növényi és nem növényi kártevők irtására.

A rovarkártevők a világ kereskedelmileg fontos mezőgazdasági terményeinek veszteségeiben az egyik legfontosabb tényezőt képezik. A mezőgazdaságilag jelentős kártevők hatásának korlátozására, illetve kiirtásukra elterjedten használnak széles spektrumú kémiai peszticideket, de továbbra is jelentős érdeklődés mutatkozik más, hatásos peszticidek kifejlesztésére.

A mikrobiológiai peszticidek a kémiai peszticidek alternatívájaként fontos szerepet játszanak. A legszélesebb körben alkalmazott mikrobiológiai termék a Bacillus thuringiensis (Bt)-baktériumon alapul. A Bt egy Gram-pozitív spóraképző bacillus, amely a spóraképzés során inszekticid (rovarölő) hatású kristályos fehérjét (ICP) termel.

A Bt-nek sok változata ismert, ezek több mint 25 különböző, de egymáshoz hasonló ICP-t termelnek. A Bt által termelt ICP-k bizonyos - a Lepidoptera, Diptera és Coleoptera rendbe tartozó - rovarok lárváira nézve mérgezők. Ha az ICP-t egy arra érzékeny rovar elfogyasztja, akkor a kristály általában szolubilizálódik, és a rovar belében található proteázok egy toxikus molekularésszé alakítják át. A coleoptera lárvákkal szemben hatásos ICP-k közül egyikről sem mutatták ki, hogy szignifikáns hatást fejtenének ki a Diabrotica genus (nem), különösen a Diabrotica virgifera virgifera, vagyis a nyugati gabonagyökér-féreg (WCRW) vagy a Diabrotica longicomis barberi, vagyis az északi gabonagyökér-féreg (WCRW) lárváival szemben.

A Bt a Bacillus cereus (Be) közeli rokona. Az egyik legfontosabb különbség köztük, hogy Bc-ben nincs jelen a parasporális kristály. A Be széleskörűen elterjedt baktérium, általában a talajban található, továbbá sokféle élelmiszerből és drogból izolálták. Ez a mikroorganizmus szennyeződés útján jut be az élelmiszerekbe.

Bár a Bt nagyon hasznosnak bizonyult a rovarkártevők leküzdésében, szükséges, hogy a hatásos biológiai irtószerek számát növeljük.

A találmány tárgyát növényi és nem növényi kártevők irtására szolgáló készítmények és módszerek képezik. A találmány tárgya közelebbről: új peszticid fehérjék, amelyek Bacillus törzsek vegetatív fejlődési szakaszában izolálhatok. A találmány oltalmi körébe tartoznak az ilyen Bacillus törzsek, fehérjék valamint a fehérjéket kódoló gének.

A találmány szerinti eljárások és készítmények sokféle, a növényi és nem növényi kártevők irtására szolgáló rendszer alakjában használhatók.

Tehát a találmány oltalmi körébe tartoznak a növényi kártevők irtására szolgáló készítmények és módszerek, közelebbről: új peszticid fehéijék, amelyeket Bacillus törzsek vegetatív fejlődési szakaszukban termelnek. Ezek a fehéijék peszticid szerként használhatók.

Vizsgálataink során felismertük, hogy a Bacillus törzsek vegetatív fejlődési szakaszukban termelik a peszticid fehéijéket. „Vegetatív fejlődés”-en a leírásban a spórázás megindulása előtti időszakot értjük. A Bt esetében ez a vegetatív fejlődés az ICP-k termelése előtt következik be. Az ilyen fehéijéket kódoló géneket izolálhatjuk, klónozhatjuk és transzformálhatjuk különböző hordozóanyagokba a kártevőirtási programokban történő felhasználásra.

A leírásban a „kártevő” többek között rovarokat, gombákat, baktériumokat, fonalférgeket, kukacokat, atkákat, protozoon kórokozókat, állatokban élősködő májmételyt és hasonlókat jelent. A „rovarkártevők” lehetnek a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anopéura, Siphonaptera, Trichoptera rendbe tartozó és hasonló rovarok.

Az 1-10. táblázatokban felsoroljuk a főbb kultúrnövények valamint az emberek és állatok kártevőit. Ezek a kártevők a találmány oltalmi körébe tartoznak.

1. táblázat Lepidoptera (lepkék)

Kukorica

Ostrinia nubilalais (európai gabonaféreg)

Agrotis ipsilon (nagy fűbagoly)

Helicoverpa zea

Spodoptera frugiperda

Diatraea grandiosella

Elasmopalpus lignosellus

Diatraea saccharalis

Cirok

Chilo partellus (rizsszárfúró rovar)

Spodoptera frugiperda

Helicoverpa zea

Elasmopalpus lignosellus

Feltia subterranea

Búza

Pseudaletia unipunctata (amerikai sereghemyó)

Spodoptera frugiperda

Elasmopalpus lignosellus

Agrotis orthogonia

Spodoptera exigua

Elasmopalpus lignosellus

Napraforgó

Suleima helianthana

Homoeosoma electellum

Gyapot

Heliothis virescens

Helicoverpa zea

Spodoptera exigua

Pectinoflora gossypiella

Rizs

Diatraea saccharalis

Spodoptera frugiperda

Helicoverpa zea Szójabab

Pseudoplusia includens

Anticarsia gemmatalis

Plathypena scabra

HU 220 714 Β1

1. táblázat (folytatás)

Ostrinia nubilalais (kukoricamoly)

Agrotis ipsilon (nagy fubagoly)

Spodoptera exigua

Heliothis virescens Helicoverpa zea

Árpa

Ostrinia nubilalais (kukoricamoly)

Agrotis ipsilon (nagy fűbagoly)

2. táblázat

Coleoptera (bogarak)

Kukorica

Diabrotica virgifera virgifera, nyugati gabonagyökér-féreg

Diabrotica longicomis barberi, északi gabonagyökér-féreg

Diabrotica undecimpunctata howardi, déli gabonagyökér-féreg

Melanotus fajták, drótférgek Cyclocephala borealis Cyclocephala immaculata Popillia japonica japán légylárva Chaetocnema pulicaria földi bolha Sphenophorus maidis

Cirok

Phyllophaga crinita

Elodes, Conoderus és Aeolus fajok, drótférgek Oulema melanopus Chaetocnema pulicaria, földi bolha Sphenophorus maidis

Búza

Oulema melanopus Hypera punctata

Diabrotica undecimpunctata howardi, déli gabonagyökér-féreg

Napraforgó

Zygogramma exclamationis Bothyrus gibbosus

Gyapot

Anthonomus grandis

Rizs

Colaspis brunnea,

Lissorhoptrus oryzophilus,

Sitophilus oryzae, rizszsizsik

Szójabab

Epilachna varivestis, mexikói babbogár

3. táblázat

Homoptera (növényi tetvek)

Kukorica

Rhopalosiphum maidis Anuraphis maidiradicis

Cirok

Rhopalosiphum maidis Sipha flava

Búza

Orosz búzalevéltetű Schizaphis graminum Macrosiphum avenae

Gyapot

Aphis gossypii, gyapotlevéltetű Pseudatomoscelis seriatus Trialeurodes abuttilonea

Rizs

Nephotettix nigropictus, rizslevélszöcske

Szójabab

Myzus persicae, őszibarackfa-levéltetű Empoacsa fabae, burgonyakabóca

Árpa

Schizaphis graminum Olajrepce

Brevicoryne brassicae, káposzta-levéltetű

4. táblázat

Hemiptera (félfedelesszámyú rovarok) Kukorica

Blissus leucopterus leucopterus, amerikai búzaron tó féreg

Cirok

Blissus leucopterus leucopterus, amerikai búzaron tó féreg

Gyapot

Lygus lineolaris, mezei poloska

Rizs

Blissus leucopterus leucopterus, amerikai búzaron tó féreg

Actrostemum hilare

Szójabab

Actrostemum hilare Árpa

Blissus leucopterus leucopterus, amerikai búzaron tó féreg

Actrostemum hilare Euschitus servus

5. táblázat

Orthoptera (egyenesszárnyúak)

Kukorica

Melanoplus femurrubrum Melanoplus sanguinipes

HU 220 714 Bl

5. táblázat (folytatás)

Búza

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis Melanoplus sanguinipes

Gyapot

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis

Szójabab

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis

Építészet/Háztartás

Periplaneta americana, amerikai csótány Blattella germanica, német csótány Blatta orientalis, konyhai csótány

6. táblázat

Diptera (kétszárnyúak)

Kukorica

Hylemya platura gabonalégy Agromyza parvicomis

Cirok

Contarinia sorghicola

Búza

Mayetiola destructor, hesszeni légy Sitodiplosis mosellana Meromyza americana, búzaszárlégy Hylemya coarctata

Napraforgó

Neolasioptera murtfeldtiana Szójabab

Hylemya platura, gabonalégy Árpa

Hylemya platura, gabonalégy Mayetiola destructor, hesszeni légy

Embereket és állatokat támadó rovarok és betegséghordozók

Aedes aegypti, sárgalázszúnyog Aedes albopictus Phlebotomus papatasii Musca domestica, házilégy Tabanus atratus, fekete lóbögöly Cochliomya hominivorax, csavarféreglégy

7. táblázat

Thysanoptera (hólyagoslábúak)

Kukorica

Anaphothrips obscurus

Búza

Frankliniella fusca

Gyapot

Thrips tabaci, dohánytripsz Frankliniella fusca

Szójabab

Sericothrips variábilis Thrips tabaci, dohánytripsz

8. táblázat

Hymenoptera (hártyásszámyúak)

Kukorica

Solenopsis milesta

Búza

Cephus cinctus

9. táblázat

Egyéb rendek és reprezentatív fajok

Dermaptera (Fülbemászók)

Forficula auricularia, közönséges fülbemászó

Isoptera (Termeszek)

Reticulitermes flavipes, földitermesz

Mallophaga (Rágótetvek)

Cuclotogaster heterographa Bovicola bovis, marhaszőrtetű

Anoplura (Vérszívó tetű)

Pediculus humánus, vérszívó fejtetű

Siphonaptera (Bolhák)

Ctenocephalides felis, macskabolha

10. táblázat

Acari (atkák és kullancsok)

Kukorica

Tetranychus urticae, kétpettyes babfonóatka

Cirok

Tetranychus cinnabarinus, vörös babfonóatka Tetranychus urticae, kétpettyes babfonóatka

Búza

Aceria tulipae

Gyapot

Szójabab

Tetranychus turkestani

Tetranychus urticae, kétpettyes babfonóatka

Árpa

Petrobia latens

Fontos emberi és állati atkák és kullancsok Demacentor variábilis Argas persicus, baromfikullancs

HU 220 714 Bl

10. táblázat (folytatás)

Dermatophagoides farinae

Dermatophagoides petronyssinus

Azt találtuk, hogy különböző Bacillus törzsekből a vegetatív fejlődési szakaszban peszticid fehérjék izolálhatok, továbbá más törzsek izolálhatok a szokásos eljárásokkal, és vizsgálhatók a növényi és nem növényi kártevőkkel szemben mutatott hatás szempontjából. A Bacillus törzsek általában bármilyen környezeti mintából, például talajból, növényekből, rovarokból, gabonaelevátor porából és hasonló mintákból izolálhatok a szakmában ismert módszerekkel. Ezek leírása megtalálható például az alábbi helyeken: Travers és munkatársai [Appl. Environ. Microbiol. 53, 1263-1266 (1987)]; DeLucca és munkatársai [Can J. Microbiol. 27, 865-870 (1981)]; valamint Norris és munkatársai [„The genera Bacillus and Sporolactobacillus”, Starr és munkatársai (szerkesztők), „The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria” című könyvében, Vol. II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg (1981)]. Ily módon új peszticid fehérjék és törzsek azonosíthatók.

A találmány szerinti eljárásokban a Bacillus mikroorganizmusok közül felhasználható a Bacillus cereus, a Bacillus thuringiensis valamint all. táblázatban felsorolt Bacillus fajok.

11. táblázat Bacillus fajok

1. Morfológiai csoport

B. megaterium

B. cereus*

B. cereus var. mycoides

B. thuringiensis*

B. licheniformis

B. subtilis

B. pumilus

B. firmus

B. coagulans

2. Morfológiai csoport

B. polymyxa

B. macerans

B. circulans

B. stearothermophilus

B. alvei*

B. laterosporus*

B. brevis

B. pulvifaciens

B. popilliae*

B. lentimorbus*

B. lárváé*

3. Morfológiai csoport

B. sphaericus*

B. pasteurii

Besorolatlan törzsek

A alcsoport

B. apiarus*

B. filicolonicus

B. thiaminolyticus

B. alcalophilus

B alcsoport

B. cirroflagellosus

B. chitinosporus

B. lentus

C alcsoport

B. badius

B. aneurinolyticus

B. macroides

B. freudenrechii

D alcsoport

B. pantothenticus

B. epiphytus

El alcsoport

B. aminovorans

B. globisporus

B. insolitus

B. psychrophilus

E2 alcsoport

B. psychrosaccharolyticus

B. macquariensis *=ezeket a Bacillus törzseket már korábban megtalálták baktériumokban

A csoportosítás a Parry, J. M. és munkatársai [Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, London (1983)] által leírt módon történt.

A találmány szerint Bacillus törzsekből izolálhatok a vegetatív fejlődési szakaszban termelt peszticid fehérjék. A találmány egyik megvalósításában a vegetatív fejlődési szakaszban termelt inszekticid fehérjék (a továbbiakban VIP /vegetatív inszekticid fehérjék/) izolálhatok. A fehérjék izolálására szolgáló módszerek a szakmában ismertek. A fehérjék általában tisztíthatok hagyományos kromatográfiával - mint például a gélszűrés, az ioncserés és az immunaffinitási kromatográfia -, nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) - mint például a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia, ioncserés nagynyomású folyadékkromatográfia, méretkizárásos nagynyomású folyadékkromatográfia, nagynyomású kromatofókuszálás vagy hidrofób interakciós kromatográfia és hasonlók -, elektroforézissel, például egydimenziós vagy kétdimenziós gélelektroforézissel stb. Ezek a módszerek a szakmában ismertek, leírásuk megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyen: Ausubel és munkatársai (szerkesztők) „Current Protocols in Molecular Biology”, Vol. 1-2, John Wiley & Sons, NY (1988). Ezenkívül gyakorlatilag tiszta fehérjekészítményekkel szembeni antitesteket is előállíthatunk, amint azt Radka és munkatársai [J. Immunoi. 128, 2804 (1983)] valamint Radka és munkatársai [Immunogenetics 19, 63 (1984)] leírták. A peszticid hatású fehéijék tisztítására a módszerek bármely kombinációját alkalmazhatjuk.

HU 220 714 Bl

Az eljárás végrehajtása során a peszticid aktivitást minden tisztítási lépés után meghatározzuk.

Ezekkel a tisztítási lépésekkel egy gyakorlatilag tisztított fehéijefrakciót kapunk. A „gyakorlatilag tisztított” vagy „gyakorlatilag tiszta” olyan fehérjét jelent, amely minden, a fehéije természetes állapotában általában vele együtt előforduló vegyülettől gyakorlatilag mentes. Gyakorlatilag tisztának tekinthető a fehérjekészítmény, ha vizuálisan vagy denzitometriás szkenneléssel meghatározva az SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát/-poliakrilamid gélelektroforézis) után más kimutatható fehéijesávot nem tartalmaz. A tisztaság mértékét jelezheti az is, hogy a tisztított készítményben nincs jelen más aminoterminális szekvencia vagy N-terminális maradék. A tisztaság igazolható a „tiszta” készítmények ismételt kromatorgráfiájával, ha az kimutatja, hogy más csúcsok nincsenek jelen, továbbá ioncserével, fordított fázisú vagy kapilláris elektroforézissel. Az, hogy a fehérje „gyakorlatilag tiszta” vagy „gyakorlatilag tisztított”, nem zárja ki a fehéijéknek más vegyületekkel képzett mesterséges (szintetikus) keverékeit, sem pedig azt, hogy - például a nem tökéletes tisztítás folytán - elhanyagolhatóan kis mennyiségű szennyeződések vannak jelen, amelyek a fehéije biológiai hatását nem zavaiják.

Egyes fehérjék egyetlen polipeptidláncból állnak, míg számos fehérje több polipeptidláncot tartalmaz. A tisztított fehérje a szakmában ismert módszerekkel izolálható, a fehérje vagy az azt alkotó polipeptidláncok leírhatók és szekvenálhatók. A tisztított fehérjét vagy a polipeptidláncokat, amelyek alkotják, fragmentálhatjuk például dicián-bromiddal vagy proteázokkal - mint papain, chimotripszin, tripszin, lizil-C endopeptidáz és hasonlók -, amint azt Oike és munkatársai [J. Bioi. Chem., 257, 9751-9758 (1982)], valamint Liu és munkatársai [Int. J. Pept. Protein Rés., 21, 209-215 (1983)] leírják. Az így kapott peptideket előnyösen HPLC-vel vagy gélről való leoldással és PVDF membránra eletromos úton történő átvitellel (electroblotting) elválasztjuk, és meghatározzuk az aminosavsorrendjüket (szekvencia). Ezt előnyösen úgy oldjuk meg, hogy a peptideket automatikus szekvenátorral elemezzük. Meghatározhatunk N-terminális, C-terminális vagy belső aminosavszekvenciákat. A tisztított fehérje aminosavszekvenciájából szintetizálhatunk egy olyan nukleotidszekvenciát, amely a peszticid fehérjét kódoló gén izolálásához próbaként használható.

A fehérjék különböznek egymástól molekulatömegükben, az őket alkotó peptidekben, az egyes kártevőkkel szemben mutatott aktivitásukban és más tulajdonságokban. Az itt leírt módszerekkel azonban sokféle kártevővel szemben hatásos fehérjék izolálhatok és jellemezhetők.

A fehérje az izolálás és jellemzés után különböző módokon, például aminosavszubsztúcióval, -delécióval vagy -inszercióval megváltoztatható. Az ilyen manipulációkra szolgáló módszerek a szakmában általában ismertek. Például a peszticid fehérjéknek olyan aminosavszekvencia-variánsai állíthatók elő a DNS-ben végrehajtott mutációkkal, amelyek a kívánt peszticid hatást mutatják. Nyilvánvaló, hogy a variánst kódoló DNSben végrehajtott mutációknak nem szabad eltolniuk a leolvasási keret fázisát, és előnyösen nem hoznak létre komplementer régiókat, amelyek új szekunder mRNS szerkezetet alakítanának ki. Minderről részletesebb ismertetés található a 75,444 számú európai nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben.

Tehát a találmány oltalmi köre kiterjed a peszticid fehérjékre valamint komponenseikre és fragmentumaikra is. Ez azt jelenti, hogy olyan, a fehérjéket alkotó polipeptidek vagy fragmentumok állíthatók elő, amelyek a peszticid hatást megtartják. A fragmentumok tehernek a fehérjék csonkított szekvenciái, továbbá a fehérjék N-terminális, C-terminális, belső, vagy belső delécióval kialakított aminosavszekvenciái.

A fehérjén végrehajtott deléciók, inszerciók és szubsztitúciók többségétől nem várható, hogy a peszticid fehérje jellemzőiben gyökeres változásokat hozzanak létre. A szubsztitúció, deléció vagy inszerció pontos hatását nehéz előre kiszámítani, de a szakemberek tudják, hogy a hatás a rutinszerű szkrínelési (szűrési) vizsgálatokkal meghatározható.

A leírásban szereplő fehérjék és polipeptidek használhatók külön-külön vagy együttesen. Tehát különböző rovarkártevők irtására különböző fehérjéket használhatunk. Továbbá a találmány szerinti fehérjék némelyike fokozza a peszticid fehérjék hatását. Az ilyen fehérjéket a továbbiakban „kiegészítő fehérjék”-nek nevezzük. Bár a hatásmechanizmus nem teljesen tisztázott, ha a szóban forgó kiegészítő fehérje és peszticid fehéije együtt van jelen, a peszticid fehéije inszekticid hatása a többszörösére növekszik.

A találmány szerinti peszticid fehérjék molekulatömege változó, polipeptidkomponenseik molekulatömege 30 kD vagy nagyobb, előnyösen körülbelül 50 kD vagy nagyobb.

A találmány szerinti kiegészítő fehérjék molekulatömege változó, körülbelül 15 kD vagy nagyobb, előnyösen körülbelül 20 kD vagy nagyobb. A kiegészítő fehérjéknek is tehernek polipeptidkomponenseik.

A peszticid fehéije és a kiegészítő fehérje egy multimer peszticid fehéije komponenseit képezheti. Az ilyen peszticid fehérjének - amely a kiegészítő fehéqé(ke)t egy vagy több polipeptidkomponensként tartalmazza - a molekulatömege 50 kD és legalább 200 kD közé, előnyösen körülbelül 100 és 150 kD közé esik.

A találmány szerinti peszticid fehéij ékkel együtt, aktivitásuk növelésére egy kiegészítő fehérjét alkalmazhatunk. Annak eldöntésére, hogy a kiegészítő fehérje befolyásolja-e az aktivitást, a peszticid fehérjét expresszálhatjuk önmagában és a kiegészítő fehérjével együtt, és tápanyaggal végzett biológiai vizsgálatokkal határozzuk meg a peszticid aktivitás növekedését.

Előnyös tehet a törzsek szkrínelése a peszticid hatás szempontjából oly módon, hogy a törzset egyrészt önmagában, másrészt a kiegészítő fehérjével együtt vizsgáljuk. Egyes esetekben a kiegészítő fehéije a törzs natív fehérjéivel együtt peszticid hatást eredményez, ami a kiegészítő fehéije nélkül nem lép fel.

Mint mondottuk, a kiegészítő fehéije különböző, a szakmában ismert módszerekkel módosítható. Ezért a

HU 220 714 BI leírásban a „vegetatív inszekticid fehérje” (VIP) kifejezés magában foglalja mindazokat a vegetatív fejlődési szakaszban termelt fehéijéket, amelyek önmagukban vagy együttesen mutatott peszticid hatásuk folytán használhatók. Ebbe a körbe beletartoznak a peszticid fehérjék, a kiegészítő fehéijék, azok a fehérjék, amelyek csak a kiegészítő fehéije jelenlétében fejtenek ki hatást, valamint ezen fehérjék polipeptidkomponensei.

Más módszerek is vannak arra, hogy megkapjuk a találmány szerinti nukleotid- és aminosavszekvenciákat. így például ahhoz, hogy a peszticid fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát megkapjuk, a peszticid fehérjét expresszáló kozmid klónt izolálhatjuk egy genomkönyvtárból. Nagyobb aktív kozmid kiónokból kisebb szubklónok állíthatók elő, és vizsgálhatók az aktivitás szempontjából. Ily módon egy aktív peszticid fehérjét expresszáló kiónokat szekvenálhatunk a gén nukleotidszekvenciájának meghatározására. Ebből azután levezethetjük a fehérje aminosavszekvenciáját. Az általános molekuláris módszerek leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyeken: Sambrook és munkatársai (szerkesztők): [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] valamint az ott idézett forrásmunkákban.

A találmány tárgyát képezik továbbá a Bacillustól eltérő szervezetekből származó nukleotidszekvenciák, amelyek a találmány szerinti Bacillus nukleotidszekvenciákkal végzett hibridizálással hozhatók létre, és vizsgálhatók az aktivitás szempontjából. A találmány további tárgyát képezik az ilyen nukleotidszekvenciák által kódolt fehérjék. A találmány oltalmi köre kiteljed továbbá a Bacillustól eltérő szervezetekből származó fehérjékre, amelyek a találmány szerinti fehérjékkel szemben fellépő antitestekkel (ellenanyagokkal) keresztreakcióba lépnek. Az így kapott fehérjék is vizsgálhatók az aktivitás szempontjából a leírásban ismertetett módszerekkel.

Ha a találmány szerinti peszticid fehéijét kódoló nukleotidszekvenciákat izoláltuk, ezeket manipulálhatjuk, és felhasználhatjuk a fehérje expresszálására sokféle gazdaszervezetben, például más mikroorganizmusokban vagy növényekben.

A találmány szerinti peszticid gének optimalizálhatok, hogy növényekben nagyobb legyen az expressziójuk. Ennek leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyeken: az 5 625 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; az EP 0359472 és a EP 0385962 számú európai szabadalmi leírás; Perlak és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3324-3328 (1991)]; valamint Murray és munkatársai [Nucleic Acid Research 17, 477-498 (1989)]. Ily módon a gének a növény számára előnyös kodonok (triplettek) alkalmazásával szintetizálhatók. Egy adott gazdaszervezet számára előnyös az a kodon, amely a szóban forgó aminosavat a gazdaszervezetben a legnagyobb gyakorisággal kódolja. Például a kukorica számára egy adott aminosavra vonatkozóan előnyös kodon meghatározható a kukorica ismert génszekvenciáiból. Murray és munkatársai [Nucleic Acid Research 17, 477-498 (1989)] 28, kukoricából származó gén kodonjainak működését ismertetik. Szintetikus géneket annak alapján is elő lehet állítani, hogy egy adott gazdaszervezet egy adott aminosavhoz milyen megoszlásban használja a kodonokat.

Tehát a nukleotidszekvenciák az expresszió szempontjából bármely növényre optimalizálhatok. A génszekvenciának bármely része lehet optimalizált vagy szintetikus. Ez azt jelenti, hogy szintetikus vagy részlegesen optimalizált szekvenciákat is használhatunk.

A nukleotidszekvenciák hasonlóképpen optimalizálhatok az expresszió szempontjából bármely mikroorganizmusra is. A Bacillus előnyös kodonműködésének leírása megtalálható például az 5,024,837 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban valamint lohansen és munkatársai közleményében [Gene 65, 293-304 (1988)].

A szakirodalomban találhatók módszerek növényi expressziós kazetták felépítésére valamint idegen DNSnek növényekbe történő bevitelére. Az ilyen expressziós kazetták tartalmazhatnak promotereket, terminátorokat, a transzkripciót fokozó enhancereket, bevezető szakaszt, (leader szekvenciák), intronokat és más, a peszticid fehérjét kódoló szekvenciához génsebészeti úton kapcsolt szabályozószekvenciákat.

Az idegen DNS-t a növényekbe általában Ti-plazmid vektorok alkalmazásával, továbbá közvetlen DNSfelvétellel, liposzómák, elektroporáció, mikroinjektálás vagy mikroprojektilek (mikrolövedékek) alkalmazásával viszik be. Az ilyen módszerek leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyeken: Guerche és munkatársai [Plánt Service 52, 111-116 (1987)]; Neuhause és munkatársai [Theor. Appl. Génét. 75, 30-36 (1987)]; Klein és munkatársai [Natúré 327, 70-73 (1987)]; Howell és munkatársai [Science 208, 1265 (1980)]; Horsch és munkatársai [Science 227, 1229-1231 (1989)]; DeBlock és munkatársai [Plánt Physiology 91, 694-701 (1989); Methods fór Plánt Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, szerkesztők), Academic Press, Inc. (1989)]; továbbá a 08/008,374 számú amerikai egyesült államokbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben valamint a 0193259 és a 0451878A1 számú európai nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben. Nyilvánvaló, hogy a transzformáció (vagyis a DNS bevitelének) módszere függ a transzformálandó növényi sejttől.

Az expressziós kazetta komponensei az expresszió növelése érdekében módosíthatók. E célra alkalmazhatunk például csonkított szekvenciákat, nukleotidhelyettesítéseket vagy hasonló módosításokat, amint azt például Perlak és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3324-3328 (1991)]; Murray és munkatársai [Nucleic Acid Research 17, 477-498 (1989)] valamint a 91/16432 számú PCT szabadalmi leírás ismerteti.

A szerkezet tartalmazhat még soféle más szabályozót is, így például a Guerinau és munkatársai [Mól. Gén. Génét, 226, 141-144 (1991)], Proudfoot [Cell, 64, 671-674 (1991)], Sanfacon és munkatársai [Genes Dev., 5, 141-149 (1991)], Mogen és munkatársai [Plánt Cell, 2, 1261-1272 (1990)], Munroe és munkatársai [Gene, 91, 151-158 (1990)], Ballas és munkatár7

HU 220 714 Bl sai [Nucleic Acids Rés., 17, 7891-7903 (1989)] valamint Joshi és munkatársai [Nucleic Acids Rés., 15, 9617-9639 (1987] által leírt terminátorokat, a Joshi [Nucleic Acids Rés., 15, 6643-6653 (1987)] által ismertetett növényi transzlációs (leolvasási) konszenzus szekvenciákat, továbbá intronokat - amelyeknek leírása megtalálható például Luehrsen és Walbot [Mól. Gén. Génét, 225, 81-93 (1991)] közleményében - és hasonló, a nukleotidszekvenciához génsebészeti úton kapcsolt szabályozókat. Előnyös lehet, ha az expressziós kazettában 5’ bevezetőszakasz (leader) van jelen. Ezek a bevezetőszekvenciák, amelyek elősegíthetik a transzlációt, a szakmában ismertek, közéjük tartoznak például a Picomavirus leaderek, így az EMCV leader (Enchephalomyocarditis 5’ nem kódoló régió), amelyet Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R és Moss, B. [PNAS USA, 86, 6126-6130 (1989)] írt le;

a Potyvirus leaderek, így a TEV (Tobacco Etch Vírus) leader, amelyet Allison és munkatársai írtak le „MDMV leader (Maize Dwarf Mosaic Vírus)” című cikkükben [Virology 154, 9-20 (1986)];

a humán immunglobulin H-lánc- (nehéz lánc) kötőfehérje (binding protein, BiP), amelyet Macejak, D. G. és Samow, P. [Natúré, 353, 90-94 (1991)] ismertet;

az alfa-alfa mozaikvírust (AMV RNA 4) burkoló fehérje mRNS-éből származó transzlatálatlan leader, amelyet Jobling, S. A. és Gehrke, L. [Natúré, 325, 622-625 (1987)] ír le;

a dohány-mozaikvírus (TMV) leader, amelyet Gallie, D. R. és munkatársai [Molecular Biology of RNA, pp 237-256 (1989)] ismertetnek; és a Maize Chlorotic Mottle Vírus (MCMV) leader, amelyet Lömmel, S. A. és munkatársai [Virology 81, 382-385 (1991)] valamint Della-Cioppa és munkatársai [Plánt Physiology 84, 965-968 (1987)] írtak le.

Rosenberg és munkatársai [Gene, 56, 1125 (1987)], Guerinau és munkatársai [Mól. Gén. Génét, 226, 141-144 (1991)], Proudfoot [Cell, 64, 671-674 (1991)], Sanfacon és munkatársai [Genes Dev., 5, 141-149 (1991)], Mogen és munkatársai [Plánt Cell, 2, 1261-1272 (1990)], Munroe és munkatársai [Gene, 91, 151-158 (1990)], Ballas és munkatársai [Nucleic Acids Rés., 17, 7891-7903 (1989)] valamint Joshi és munkatársai [Nucleic Acids Rés., 15, 9617-9639 (1987)] leírják, hogy az expressziós kazettában egy növényi terminátor is alkalmazható.

Szövetspecifikus expresszió céljából a találmány szerinti nukleotidszekvenciákat szövetspecifikus promoterekhez kapcsolhatjuk, például az 5 625 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt módon.

A peszticid fehérjéket kódoló gének felhasználhatók rovarok patogén organizmusainak - így például a Baculovírusok, gombák, protozoonok, baktériumok és nematódák - transzformálására.

A találmány szerinti Bacillus törzsek felhasználhatók mezőgazdasági terményeknek és termékekének a kártevőkkel szembeni védelmére. Egy másik módszer szerint egy, a peszticidet kódoló gént valamilyen alkalmas vektor útján beviszünk egy mikrobiális gazdaszervezetbe, majd ezt a szervezetet alkalmazzuk a környezetre vagy növényekre vagy állatokra. A gazdaszervezetként használt mikroorganizmusokat választhatjuk azok közül, amelyek egy vagy több szóban forgó termék „fitoszféráját” (levélsík, levélszféra, gyökérszféra és/vagy gyökérsík) elfoglalják. Ezeket a mikroorganizmusokat úgy kell megválasztani, hogy az adott környezetben képesek legyenek sikeresen versenyezni a vadon tenyésző mikroorganizmusokkal, a polipeptidpeszticidet expresszáló gént stabilan megtartsák és expresszálják, és a peszticidnek a környezet lebontó és inaktiváló hatásával szemben lehetőleg hatásos védelmet nyújtsanak.

Az ilyen mikroorganizmusok lehetnek baktériumok, algák vagy gombák. A baktériumok közül előnyösen alkalmazhatók például a Pseudomonas, Erwinia, Klebsiella, Xantomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthtrobacter, Leuconostoc és az Alcaligenes; a gombák közül előnyösen alkalmazható az élesztő, például a Saccharomyces, Cryptococcus, Klyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula és az Aureobasidium. A fitoszféra baktériumfajai közül előnyösen alkalmazható például a Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinium, az Agrobacterium fajok, a Rhodopseudomonas spheroides, Xantomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli és az Azotobacter vinlandii; a fitoszféra élesztőfajai közül pedig például a Rhodotorula rabra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odoras, Klyveromyces veronae és az Aureobasidium pollulans. Előnyösen alkalmazhatók a pigmentált mikroorganizmusok.

Sokféle módszer van arra, hogy a peszticid fehéijét expresszáló gént olyan körülmények között juttassuk be a gazdaszervezetként használt mikroorganizmusba, amelyek lehetővé teszik a gén stabil fennmaradását és expresszióját. Például felépíthetünk expressziós kazettákat, amelyek a szóban forgó DNS-t tartalmazzák mesterségesen hozzákapcsolva a DNS-szerkezetek expressziójához szükséges transzkripciós és transzlációs szabályozó szignálokhoz és egy, a gazdaszervezetnek valamelyik szekvenciájával homológ DNS-szekvenciához, ezáltal megtörténik az integráció és/vagy kialakul egy replikációs rendszer, amely a gazdaszervezetben működőképes, ezáltal megtörténik a beépülés, vagyis a gén stabil fennmaradása.

A transzkripciós és transzlációs szabályozó szignálok közé tartoznak többek között a promoterek, a transzkripciós iniciációs starthely, az operátorok, aktivátorok, enhancer szekvenciák, egyéb szabályozó elemek, riboszóma kötőhelyek, egy iniciációs kodon, terminátorszignálok és hasonlók. Ezeknek leírása megtalálható például az alábbi helyeken: az 5,039,523 és a 4,853,331 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; a 0480762A2 számú európai szabadalmi

HU 220 714 Β1 leírás; Sambrook és munkatársai fent idézett műve; Maniatis és munkatársai (szerkesztők): [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]; Davis és munkatársai [Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980)] valamint az ott idézett forrásmunkákban.

Ha a peszticidtartalmú sejtet kezeljük, hogy a benne termelt toxin aktivitása kiteijedjen arra az időszakra, amikor a kezelt sejtet a megcélzott kártevő(k) környezetében alkalmazzuk, az e célra alkalmas gazdasejtek lehetnek eukarióták vagy prokarióták, de általában csak olyan sejteket alkalmazunk, amelyek a magasabb rendű szervezetekre, például emlősökre nézve toxikus anyagot nem termelnek. Alkalmazhatunk azonban a magasabb rendű szervezetekre toxikus anyagokat termelő sejteket is, ha a toxin instabil vagy olyan kis mennyiséget kell felhasználni, hogy az emlősökre nézve a toxicitás veszélye nem áll fenn. Gazdasejtként előnyösen alkalmazhatók a prokarióták és a kisebb eukarióták, például a gombák. Az ilyen Gram-negatív vagy Gram-pozitív prokarióták közé tartoznak az Enterobacteriaceae baktériumcsalád tagjai - mint például az Escherichia, Erwlnia, Shigella, Salmonella és Proteus -; a Bacillaceae család; a Rhizobiceae család tagjai, mint például a Rhizobium; a Spirillaceae család tagjai - mint például a fotobaktérium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillium -; a Lactobacillaceae család; a Pseudomonadaceae család tagjai, mint például a Pseudomonas és az Acetobacter; valamint az Azotobacteraceae és a Nitrobacteraceae család. Az eukarióták közé tartoznak a gombák, például a Phycomycetes és az Ascomycetes - ezek közé tartoznak az élesztők, például a Saccharomyces és a Schisosaccharomyces -; továbbá a Basidiomiycetes élesztők, így például a Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces és hasonlók.

A termelés céljára szolgáló gazdasejtek kiválasztásában többek között az alábbi fontos jellemzők játszanak szerepet: könnyű legyen bevinni a fehérjegént a gazdasejtbe, az expressziós rendszer hozzáférhető, az expresszió hatásos, a fehéije stabil legyen a gazdasejtben, valamint további járulékos genetikai képességek jelenléte is szükséges. Ha a gazdasejtet egy peszticid mikrokapszulaként akarjuk felhasználni, ennek fontosabb jellemzői: a peszticidet védő tulajdonságok, például vastag sejtfal, pigmentáltság, valamint a sejten belüli burkoltság vagy zárványtestek képződése; a levéllel szembeni affinitás; emlősökre nézve ne legyen toxikus; a kártevők számára vonzó táplálék legyen; könnyű legyen elpusztítani és ártalmatlanná tenni a toxin károsodása nélkül; és hasonlók. Egyéb számbaveendő tényezők például a könnyű formulálás, kezelhetőség, gazdaságosság, tárolási stabilitás stb.

Különösen előnyösen alkalmazható gazdasejtek például az élesztők - így a Rhodotorula, a Saccharomyces és a Sporobolomyces fajok -, a phylloplane (levélen élő) organizmusok - például a Pseudomonas, az Erwinia és a Flavobacterium fajok -; és más olyan organizmusok, mint például az Escherichia, a Lactobacillus fajok és Bacillus fajok. Különösen előnyösen alkalmazható specifikus organizmusok például a Pseudomonas aeurginosa, a Pseudomonas fluorescens, a

Saccharomyces cerevisiae, a Bacillus thuringiensis, az

Escherichia coli, a Bacillus subtilis és hasonlók.

Vannak a szakmában ismert általános módszerek arra, hogy a találmány szerinti törzseket akár peszticidként, akár más, peszticid szerként szolgáló organizmusok tervezéséhez felhasználjuk. Ilyeneket ismertet például az 5,039,523 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 0480762A2 számú európai szabadalmi leírás.

A találmány szerinti Bacillus törzsek vagy a genetikai módosítás következtében peszticid gént és fehérjét tartalmazó mikroorganizmusok felhasználhatók mezőgazdasági termények és termékek megvédésére a kártevőkkel szemben. A találmány egyik megvalósításában egy toxint (peszticidet) termelő organizmus teljes, vagyis megbontatlan sejtjeit kezeljük olyan reagensekkel, amelyek kiterjesztik a sejtben termelt toxin aktivitását arra az időszakra, mikor a sejtet a megcélzott kártevőik) környezetében alkalmazzuk.

Egy másik módszer szerint a peszticideket úgy állítjuk elő, hogy egy gazdasejtbe egy heterológ (idegen) gént viszünk be. A heterológ gén expressziója közvetve vagy közvetlenül a peszticid sejten belüli termelését és ennek a folyamatnak a fenntartását eredményezi. Ezeket a sejteket azután olyan körülmények között kezeljük, amelyek kiterjesztik a sejtben termelt toxin aktivitását arra az időszakra, mikor a sejtet a megcélzott kártevő(k) környezetében alkalmazzuk. Az így kapott termék megőrzi a toxin toxicitását. Ezeket a természetes úton kapszuláit peszticideket azután a hagyományos módszerekkel formulálhatjuk a megcélzott kártevő környezetében - például talajban, vízben, növényekhez használt fóliákban - történő felhasználásra. Ennek ismertetése megtalálható például a 0192319 számú európai nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben valamint az ott idézett forrásmunkákban.

A találmány szerinti hatóanyagokat általában készítmények alakjában alkalmazzuk a vetésterületen vagy a kezelendő növényen, adott esetben más vegyületekkel együtt vagy egymás után. Ezek lehetnek műtrágyák vagy tápanyagként szolgáló mikroelemeket leadó vagy más, a növény fejlődését befolyásoló vegyületek. Lehetnek továbbá szelektív herbicid (gyomirtó), inszekticid, fungicid, baktericid, nematicid, mollusicid (puhatestű állatokat irtó) készítmények vagy ezek keverékei, kívánt esetben további mezőgazdasági hordozóanyagokkal, felületaktív anyagokkal vagy a szokásosan használt, az alkalmazást elősegítő adalék anyagokkal összekeverve. A hordozó- és adalék anyagok lehetnek szilárdak vagy folyékonyak, és megegyeznek a formulálási technológiában általában használatos anyagokkal, például természetes vagy regenerált ásványi anyagok, oldószerek, diszpergáló-, nedvesítőszerek, tapadásfokozók, kötőanyagok vagy műtrágyák.

A találmány szerinti hatóanyagokat vagy olyan agrokémiai készítményeket, amelyek legalább egy, a ta9

HU 220 714 Bl lálmány szerinti baktériumtörzsek által termelt peszticid fehéijét tartalmaznak, előnyösen a leveleken, magbevonó anyagként vagy a talajban alkalmazzuk. Az alkalmazások száma és mértéke a kártevővel való fertőzöttség erősségétől függ. 5

A találmány egyik megvalósításában egy Bacillus cereus mikroorganizmust izoláltunk, amely elpusztítja a Diabrotica virgifera virgifera-t és a Diabrotica longicomis barberit. Az új B. cereus AB78 törzset az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél 10 (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA) NRRL B-21058 számon deponáltuk.

A B. cereus-törzsből gyakorlatilag tisztán kivontunk egy fehérjét. A fehérje tisztaságát SDS-PAGE 15 elektroforézissel és a biológiai aktivitás mérésével igazoltuk. A fehérje molekulatömege körülbelül 60 és körülbelül 100 kD, előnyösen körülbelül 70 és körülbelül 90 kD közötti, még előnyösebben körülbelül 80 kD. 20

Aminoterminális szekvenálással megállapítottuk, hogy az N-terminális aminosavszekvencia: NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-AsxGly-Asp-Ser-Ile-Pro- (szekvenciaazonosító: 8), ahol Asx jelentése Asp vagy Asn. A teljes aminosav- 25 szekvenciát a 7-es szekvenciaazonosító számon adjuk meg.

Az NH₂-vég 3-9 aminosavait kódoló génszakaszra egy oligonukleotidpróbát készítettünk. A próbát egy Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoxin gén kodonmű- 30 ködése alapján szintetizáltuk. A Southem-hibridizációkhoz használt oligonukleotidpróba nukleotidszekvenciája a következő volt:

5’-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3’ (szekvenciaazonosító: 9), 35 ahol N tetszőleges bázist jelent.

A fentieken kívül a leírásban szereplő, a Be AB78 VIP-1 génhez készített próba lehetővé teszi bármely Bacillus törzs vagy más organizmus szkrínelését annak eldöntésére, hogy a VIP-1 (vagy hozzá hasonló) 40 gén természetes módon jelen van-e benne, vagy hogy egy transzformációval átalakított organizmus tartalmazza-e a VIP-1 gént.

Az alábbi példák a találmány általános leírása után annak részletesebb ismertetésére szolgálnak, a talál- 45 mány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. ábra: A pCIB 6022 jellemzése.

1. példa

Az AB78 izolálása és jellemzése

A Bacillus cereus-törzset a laboratóriumban Petricsésze szennyezőanyagaként izoláltuk T3 közegben, amely literenként 3 g triptont, 2 g triptózt, 1,5 g élesztőkivonatot, 0,05 M nátrium-foszfátot (pH = 6,8) és 0,005 g mangán(II)-kloridot tartalmaz, leírását R. S. Travers adta meg 1983-ban. Az AB78 a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben jelentős aktivitást mutatott. A Gram-pozitív Bacillus fajokkal szembeni antibiotikus aktivitást is kimutattuk, amint a 12. táblázaton látható.

12. táblázat

Antibiotikus aktivitás az AB78 tenyészet felülúszójában

Vizsgált baktérium	Inhibíciós zóna (cm)
AB78	Streptomycin
E. coli	0,0	3,0
B. megaterium	1,1	2,2
B. mycoides	1,3	2,1
B. cereus CB	1,0	2,0
B. cereus 11950	1,3	2,1
B. cereus 14579	1,0	2,4
B. cereus AB78	0,0	2,2
Bt var. israelensis	1,1	2,2
Bt var. tenebrionis	0,9	2,3

Az AB78 morfológiai jellemzői:

Vegetatív, egyenes, 3,1-5,0 mm hosszúságú és 0,5-2,0 mm szélességű pálcikák. A sejtek végei lekerekítettek, egyedi sejtek, rövid láncokban. Sejtenként 1 hengeres-ovális endospóra képződik. Parasporális kristály nem képződik. Átlátszatlan, erodált, lebenyes, lapos kolóniák. Pigmentet nem termel. A sejtek mozgásra képesek. Flagellumok (ostorok) vannak jelen.

Az AB78 tenyésztési jellemzői:

Fakultatív anaerob szaporodás, optimális hőmérséklete 21-30 °C. 15, 20, 30 és 37 °C-on szaporodik, 40 °C felett nem szaporodik. 5-7%-os nátrium-kloridoldatban szaporodik.

A 13. táblázat az AB78 biológiai profilját mutatja.

13. táblázat

A B. cereus AB78 törzs biokémiai jellemzői

sav, L-arabinózból	-	visszaoxidált metilénkék	+
gáz, L-arabinózból	-	redukált nitrát	+
sav, D-xilózból	-	NO₂-dá redukált NO₃	+
gáz, D-xilózból	-	VP	+
sav, D-glükózból	+	elbontott H₂O₂	+
gáz, D-glükózból	-	indol	-
sav, laktózból	-	lebontott tirozin	+

HU 220 714 Β1

13. táblázat (folytatás)

gáz, laktózból	-	dihidroxi-aceton	-
sav, szacharózból	-	lakmusztej, savas	-
gáz, szacharózból	-	lakmusztej, koagulált	-
sav, D-mannitból	-	lakmusztej, lúgos	-
gáz, D-mannitból	-	lakmusztej, peptonizált	-
propionáthasznosítás	+	lakmusztej, redukált	-
citráthasznosítás	+	hidrolizált kazein	+
hippurát-hidrolízis	w	hidrolizált keményítő	+
redukált metilénkék	+	lecitináztermelés	w

W=gyenge reakció

2. példa

Baktériumtenyészet

A Be AB78 törzsnek egy szubkultúrájával (másodlagos tenyészet) beoltottuk az alábbi, TB tápoldat néven ismert közeget:

tripton	12 g/1
keményítőkivonat	24 g/1
glicerin	4 ml/liter
kálium-dihidrogén-foszfát	2,1 g/1
dikálium-hidrogén-foszfát	14,7 g/1
pH=7,4
A kálium-foszfátot lehűlés után adtuk hozzá az au-

toklávban kezelt tápoldathoz. A lombikokat forgató rázógépen 250/perc sebességgel forgatva 30 °C-on 24-36 órán át inkubáltuk.

A fenti eljárás a szakmában ismert módszerekkel könnyen átvihető nagy méretű erjesztőtartályokba.

A vegetatív szaporodás során, általában a tenyésztés kezdetétől számított 24-36 óra elteltével az AB78 baktériumokat centrifugálással elválasztottuk a felülúszó folyadéktól. Az aktív fehérjét tartalmazó felülúszót használtuk a biológiai vizsgálatokhoz.

3. példa

Rovarok biológiai vizsgálatai

A B. cereus AB78 törzset az alábbi rovarokkal szemben vizsgáltuk:

Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi és Diabrotica undecimpunctata howardi (nyugati, északi, illetve déli gabonagyökér-féreg): a 24-36 órán át szaporított AB78 tenyészet felülúszójából hígításokat készítettünk, ezeket a Marrone és munkatársai [J. of Economic entomology, 78, 290-293 (1985)] által leírt, megolvasztott mesterséges tápanyaggal összekevertük, majd hagytuk megszilárdulni. A megszilárdult tápanyagot felvágtuk, és tálkákba raktuk. A tápanyagra frissen kikelt lárvákat helyeztünk, és 30 °C-os hőmérsékleten tartottuk. Hat nap múlva feljegyeztük a mortalitást.

Az E. coli-klón biológiai vizsgálata: E. colit tenyésztettünk L-Amp 100-ban egy éjszakán át 37 °C-on. A tenyészetből 10 ml-t háromszor 20 másodpercen át ultrahanggal kezeltünk. Az így kezelt tenyészetből 500 ml-t hozzáadtunk a nyugati gabonagyökér-féreg megolvasztott tápanyagához.

Leptinotarsa decemlineata (burgonyabogár): a 24-36 órán át szaporított AB78 tenyészet felülúszójából olyan hígításokat készítettünk Triton Χ-100-ban, hogy végső koncentrációjuk a ΤΧ-100-ra vonatkoztatva 0,1% legyen. Ezekbe a hígításokba 5 cm²-es burgonyalevél-darabokat beáztattunk, majd a levéldarabokat levegőn megszárítottuk, és megnedvesített szűrőpapíron műanyag tálkákba helyeztük. A levéldarabokra frissen kikelt lárvákat helyeztünk, és 30 °C-os hőmérsékleten tartottuk. 3-5 nap múlva feljegyeztük a mortalitást.

Tenebrio molitor (lisztbogár): a 24-36 órán át szaporított AB78 tenyészet felülúszójából hígításokat készítettünk, megolvasztott mesterséges tápanyaggal (Bioserv #F9240) összekevertük, majd hagytuk megszilárdulni. A megszilárdult tápanyagot felvágtuk, és műanyag tálkákba raktuk. A tápanyagra frissen kikelt lárvákat helyeztünk, és 30 °C-os hőmérsékleten tartottuk. 6-8 nap múlva feljegyeztük a mortalitást.

Ostrinia nubilalis (kukoricamoly), Agrotis ipsilon (nagy fubagoly), Heliothis virescens, Manduca sexta és Spodotera exigua: a 24-36 órán át szaporított AB78 tenyészet felülúszójából olyan hígításokat készítettünk TX-100-ban, hogy végső koncentrációjuk a ΤΧ-100-ra vonatkoztatva 0,1% legyen. A hígításokból a megszilárdult Bioserv #F9240 mesterséges tápanyag 18 cm²-es felületére 100 ml-t pipettával kimértünk, és levegőn hagytuk megszáradni. Ezután a tápanyag felületére frissen kikelt lárvákat helyeztünk, és 30 °C-os hőmérsékleten tartottuk. 3-6 nap múlva feljegyeztük a mortalitást.

Culex pipiens (dalosszúnyog): a 24-36 órán át szaporított AB78 tenyészet felülúszójából hígításokat készítettünk, és ezekből 10 ml vizet tartalmazó 30 ml-es csészékbe 100 ml-t pipettáztunk. A vízhez harmadik fejlődési állapotú lárvákat adtunk, és szobahőmérsékleten tartottuk. 24-48 óra múlva feljegyeztük a mortalitást. Az AB78-nak a rovarokkal szemben mutatott aktivitási spektrumát a 14. táblázatban adjuk meg.

HU 220 714 Β1

14. táblázat

Az AB78 tenyészet felülúszójának aktivitása különböző rovarfajokkal szemben

Az eddig vizsgált rovarfajok	Rend	Aktivitás
Diabrotica virgifera virgifera (nyugati gabonagyökér-féreg)	Col	+ + +
Diabrotica longicomis barberi (északi gabonagyökér-féreg)	Col	+ + +
Diabrotica undecimpunctata howardi (déli gabonagyökér-féreg)	Col	-
Leptinotarsa decemlineata (burgonyabogár)	Col	-
Tenebrio molitor (lisztbogár)	Col	-
Ostrinia nubilalis (kukoricamoly)	Lep	-
Heliothis virescens	Lep	-
Manduca sexta	Lep	-
Spodotera exigua	Lep	-
Agrotis ipsilon (nagy fűbagoly)	Lep	-
Culex pipiens (dalosszúnyog)	Dip	-

Az újonnan felfedezett B. cereus AB78 törzs a Btből származó - a fedelesszámyúakkal (coleoptera) szemben hatásos - ismert δ-endotoxinokhoz viszonyítva jelentősen eltérő aktivitási spektrumot mutatott a rovarokkal szemben. Nevezetesen: az AB78-naknagyobb a szelektív aktivitása a bogarakkal szemben, mint a fedelesszámyúakkal szemben hatásos, ismert Bt-törzseké, amennyiben az AB78 Diabrotica fajokkal szemben specifikus aktivitást mutatott. Közelebbről: igen erősen aktívnak találtuk a Diabrotica virgifera virgiferával és Diabrotica longicomis barberivel szemben, viszont a Diabrotica undecimpunctata howardival szemben nem mutatott aktivitást.

Egy sor Bacillus törzset megvizsgáltunk vegetatív szaporodásuk időszakában a nyugati gabonagyökérféreggel (WCRW) szemben mutatott aktivitás szempontjából. A 15. táblázaton látható eredmények azt mutatják, hogy az AB78 különleges törzs, mert a nyugati gabonagyökér-féreggel szembeni aktivitás egyáltalán nem általános jelenség.

15. táblázat

Különböző Bacillus törzs-tenyészetek felülúszójának aktivitása a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben

Bacillus törzs	A WCRW mortalitása, %
B. cereus AB78 (Bat. 1)	100
B. cereus AB78 (Bat. 2)	100
B. cereus (Carolina Bio.)	12
B. cereus ATCC 11950	12
B. cereus ATCC 14579	8
B. mycoides (Carolina Bio.)	30
B. popilliae	28
B. thuringiensis HD135	41
B. thuringiensis HD191	9
B. thuringiensis GC91	4
B. thuringiensis israeliensis	24
Vizes kontrollminta	4

Az AB78 specifikus aktivitása a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben a 16. táblázaton látható.

16. táblázat

Az AB78 tenyészet felülúszójának aktivitása frissen kikelt nyugati gabonagyökér-féreggel szemben

A tenyészet felülúszójának koncentrációja (μΐ/ml)	A WCRW mortalitása, %
100	100
25	87
10	80
5	40
2,5	20
1	6
0	0

A számított LC₅₀ érték 6,2 pl felülúszó a nyugati ga40 bonagyökér-féreg tápanyagának 1 ml-ére vonatkoztatva.

4. példa

A gabonagyökér-féreggel szemben aktív fehérje izolálá45 sa AB78-ból és tisztítása

A tenyésztőközegből az ép és roncsolt sejteket eltávolítottuk oly módon, hogy szilárd ammónium-szulfátot 70%-os telítettségig (472 g/1) szobahőmérsékleten feloldottunk benne, azután jégfürdővel lehűtöttük, majd a kicsapódott fehérjék elválasztására 30 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk.

A felülúszót elöntöttük, az üledéket az eredeti térfogat 1/10-ének megfelelő 20 mM, pH=7,5-ös TRISHCl-ben [TRIS=trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] fel55 oldottuk.

A feloldott üledékből a sókat 20 mM TRIS-HC1ben pH=7,5-ön végzett dializálással vagy sómentesítő oszlopon történő áteresztéssel eltávolítottuk.

A sómentesített anyag pH-ját 20 mM, pH=2, 5-ös 60 nátrium-citráttal végzett titrálással 3,5-re állítottuk.

HU 220 714 Bl percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után az oldatot 10 percig 3000 g-vel centrifugáltuk. Az így kapott felülúszó tartalmazta a legnagyobb mennyiséget az aktív fehéréből.

A felülúszót pH=7-re semlegesítettük, majd egy 20 mM, pH=7,5-ös TRIS-HCl-lel kiegyenlített MonoQ anioncserélő oszlopon 300 ml/perc sebességgel áteresztettük. Az oszlopot lineáris gradienssel, 20 mM, pH=7,5-ös TRIS-HCl-ben 400 mM nátrium-klorid alkalmazásával eluáltuk.

Az aktív frakciókat biológiai vizsgálatokkal és SDS-PAGE elemzéssel választottuk ki. Az SDS-PAGE elemzéssel meghatároztuk, hogy a biológiailag aktív fehérje molekulatömege a 80 kD-os tartományba esik.

5. példa

A gabonagyökér-féreggel szemben aktív fehérje szekvenciaelemzése

Az SDS-PAGE elektroforézissel izolált 80 kD-os fehérjét PVDF-membránra vittük át, és az aminoterminális szekvenálást ismételt Edman-degradációs ciklusokban, ABI470 impulzusrendszerű folyadékszekvenátor alkalmazásával hajtottuk végre. Az átvitelt (transzfer) 10 mM CAPS-pufferben, 10% metanol jelenlétében a következőképpen végeztük:

Az elektroforézis után a gélt a transzfer pufferben 5 percig inkubáltuk.

ProBlott PVDF membránt 100%-os metanollal gyorsan megnedvesítettünk, majd a transzfer pufferben kiegyenlítettük.

A „szendvicset” habszivacsok és négyszögletes szűrőpapírdarabok közé a következőképpen rendeztük el:

katód - gél - membrán - anód.

Az átvitelt 70 V-os állandó feszültséggel 1 órán át végeztük.

Az átvitel után a membránt vízzel leöblítettük, majd 2 percen át 50%-os metanolban 0,25% Coomassie Blue R-250-et tartalmazó színezékkel festettük.

A membránt 50% metanol, 40% víz és 10% ecetsav elegyével néhányszor leöblítve elszíntelenítettük.

Az elszíntelenítés után a membránt levegőn megszárítottuk, majd a sávokat a szekvenciaelemzéshez kivágtuk. A maximális hatékonyság és kitermelés eléréséhez egy BlottCartridge-t és megfelelő ciklusokat alkalmaztunk. Az adatok kiértékelését az egyes szekvenálási ciklusokban a PTH-aminosavszármazékok azonosítására és mennyiségi meghatározására a „610 Sequence Analysis” szoftverrel végeztük.

Az N-terminálisra a következő szekvenciát kaptuk: NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-AsxGly-Asp-Ser-Ile-Pro- (szekvenciaazonosító: 8), ahol Asx jelentése Asp vagy Asn.

6. példa

DNS-próba előállítása

Az 5. példában meghatározott N-terminális szekvencia 3-9 aminosavát kódoló génszakaszhoz egy oligonukleotidpróbát készítettünk. A próbát egy Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoxin gén kodonműködése alapján szintetizáltuk. Az

5’-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3’ (szekvenciaazonosító: 9) nukleotidszekvenciát próbaként használtuk fel Southemhibridizációkhoz. Az oligonukleotidot a szokásosan használt eljárásokkal és berendezéssel állítottuk elő.

7. példa

A gabonagyökér-féreggel szemben aktív fehérje izoelektromos pontjának meghatározása

Az 5. példában kapott tisztított fehérjét egy 3-9 pl izoelektromos fókuszálógélen, Phastgel elektroforézisrendszerrel (Pharmacia) elemeztük. Mind az elválasztáshoz, mind pedig az ezüstszínezéssel végzett előhívási eljárásokhoz a berendezésnél előírt módszereket alkalmaztuk. Az izoelektromos pontot körülbelül 4,9-nél értük el.

8. példa

Az AB 78 PCR-vizsgálatának eredményei

Annak igazolására, hogy B.cereus AB78 törzs nem tartalmaz semmiféle, a B. thuringiensisben vagy a B. sphaericusban található inszekticid kristályosfehérjegént, PCR elemzést végeztünk, amelynek leírása megtalálható például az 5 506 099 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, továbbá Carozzi és munkatársai [Appl. Environ. Microbiol., 57(11), 3057-3061 (1991)] közleményében. Az eredmények a 17. táblázaton láthatók.

17. táblázat

AB78 DNS-sel szemben PCR-rel vizsgált Bacillus inszekticid kristályosfehérje-gén primerek

Vizsgált primerek	Kapott termék
két, a CrylIIA-ra specifikus szét	negatív
CrylIIB	negatív
két, a CrylA-ra specifikus szét	negatív
CrylA(a)	negatív
CrylA(b) specifikus	negatív
CrylB	negatív
CrylC specifikus	negatív
CrylE specifikus	negatív
két, a B. sphaericusra specifikus szét	negatív
két, a CrylV-re specifikus szét	negatív
Bacilluskontroll (PI-PLC)	pozitív

9. példa

A B. cereus AB78 törzsből származó teljes DNS klónozása kozmidban

A VIP-1 gént az AB78 törzsből kinyert teljes DNSből a következőképpen klónoztuk:

Az AB78 DNS-ét az alábbi lépésekben izoláltuk:

1. Baktériumtenyésztés 10 ml L-táptoldatban egy éjszakán át, 50 ml-es steril centrifugacső alkalmazásával.

2. 25 ml friss L-táptalaj és 30 mg/ml ampicillin hozzáadása.

HU 220 714 Bl

3. Sejttenyésztés 2-6 órán át, 30 °C-on, rázással.

4. A sejtek lecentrifugálása 50 ml-es, narancssárga védővel ellátott polipropiléncsőben IEC asztali klinikai centrifugában, 3/4-es sebességgel.

5. Az üledék szuszpendálása 10 ml TES-ben (TES=50 mM pH=8 trisz, 100 mM etilén-diamintetraecetsav és 15 mM nátrium-klorid).

6. 30 mg lizozim hozzáadása, és inkubálás 2 órán át 37 °C-on.

7. 200 ml 20%-os SDS és 400 ml, 20 mg/ml koncentrációjú proteináz K hozzáadása; inkubálás 37 °C-on.

8. 200 ml friss proteináz K hozzáadása; inkubálás 1 órán át 55 °C-on, majd újabb 5 ml TES hozzáadásával a TES összes térfogatának kiegészítése 15 ml-re.

9. Kétszeri extrahálás fenollal (10 ml fenol, centrifugálás szobahőmérsékleten IEC asztali klinikai centrifugában, 3/4-es sebességgel). A felülúszó áttöltése hasas pipettával egy tiszta csőbe.

10. Egyszeri extrahálás kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyének fenollal képzett 1:1 térfogatarányú keverékével.

11. A DNS kicsapása azonos térfogatú hideg izopropilalkohollal; a DNS lecentrifugálása.

12. Az üledék szuszpendálása 5 ml TE-ben.

13. A DNS kicsapása 0,5 ml 3M nátrium-acetáttal (pH = 5,2) és 11 ml 95%-os etanollal. Tárolás -20 °C-on 2 órán át.

14. A DNS kiemelése a csőből egy műanyag kaccsal, áthelyezés egy mikrocentrifúgacsőbe, centrifugálás, az etanol feleslegének leszívása pipettával, szárítás vákuumban.

15. Szuszpendálás 0,5 ml TE-ben. Inkubálás 90 percig 65 °C-on, hogy a DNS ismét feloldódjék.

16. A koncentráció meghatározása a szokásos eljárásokkal.

Az AB78 klónozása kozmidban

Minden eljárást - hacsak másképp nem említjük - a

251301 katalógusszámú „Supercos 1 Instruction Manual Stratagene Protocol” szerinti módon hajtottunk végre.

Az elvégzett lépések általában a következők voltak:

A. Az AB78 DNS részleges emésztése Sau 3A restrikciós enzimmel.

B. A DNS vektor előállítása

C. A DNS ligálása és pakolása

D. A kozmid könyvtár titrálása

1. HB101 sejtek tenyésztésének elindítása oly módon, hogy egy 1 éjszakás tenyészetből 50 ml-t hozzáadunk 0,2% maltózt tartalmazó 5 ml TB-hez Inkubálás 3,5 órán át 37 °C-on.

2. A sejtek lecentrifugálása és szuszpendálása 0,5 ml 10 mM magnézium-szulfátban.

3. Összekeverünk

100 ml sejtszuszpenziót,

100 ml hígított pakolókeveréket,

100 ml 10 mM magnézium-szulfátot és 30 ml TB-t.

4. Adszorpció szobahőmérsékleten 30 percig, rázás nélkül.

5. 1 ml TB hozzáadása és enyhe keverés. Inkubálás 30 percig 37 °C-on.

6. 200 ml-t L-amp lemezekre oltunk. Inkubálás egy éjszakán át 37 °C-on.

Legalább 400 kozmid kiónt szkríneltünk a nyugati gabonagyökér-féreggel szembeni aktivitásra a 3. példa szerinti módon. 5 aktív és 5 nem aktív kiónból származó DNS-sel Southem-hibridizációkat végeztünk. A 18. táblázaton látható adatok azt mutatják, hogy a fenti oligonukleotidpróbát alkalmazó hibridizálás eredményei összhangban állnak a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben mutatott aktivitással.

A P3-12 és a P5-4 kozmid kiónt az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL) B-21061, illetve B-21059 számon deponáltuk.

18. táblázat

AB78 kozmid kiónok aktivitása a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben

Kiónok	Átlagos mortalitási % (N=4)
A próbával hibridizáló kiónok
Pl-73	47
Pl-83	64
P2-2	69
P3-12	85
P5-4	97
A próbával nem hibridizáló kiónok
Pl-2	5
P3-8	4
P3-9	12
P3-18	0
P4-6	9

10. példa

Egy 6 kilobázispárból (kb) álló, a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben aktív régió azonosítása

A P3-12 klón DNS-ét Sau 3A restrikciós enzimmel részlegesen emésztettük, az E. coli pUC19 vektorba ligáltuk, majd E. coli-ba transzformáltuk. Egy, a 80 kDos fehérjére nézve specifikus próbát szintetizáltunk oly módon, hogy a P3-12 DNS egy részét PCR technikával amplifikáltuk. A VIP-1 gén részeivel hibridizáló MK113 és MK117 oligonukleotidot a 80 kD-os fehérje részleges aminosavszekvenciájának alkalmazásával szintetizáltuk. Plazmid szubklónokat azonosítottunk a PCR próbához történő telephibridizálással, és vizsgáltuk ezeket a nyugati gabonagyökér-féreggel szembeni aktivitásra. Az egyik ilyen klón, a PL2 hibridizál a PCR ffagmenttel, és a fenti vizsgálat alapján a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben hatásos.

A PL2-ből egy 6 kb mérteű Clal restrikciós ffagmentet építettünk be (klónoztunk) az E. coli és a Bacillus között ingázó, a Lereclus és munkatársai [FEMS Microbiology letters, 60, 211-218 (1989)] által leírt

HU 220 714 Bl pHT 3101 shuttle vektor Smal helyére, így megkaptuk a pCIB6201 nukleotidszekvenciát. Ez a szekvencia akár a Bacillus, akár az E. coli-törzsekben helyezkedik el, mindegyiküketet aktívvá teszi a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben. A pCIB6022 ugyanezt a 6 kb-os Clal fragmentet tartalmazza pBluescript SK(+)-ban (leírása megtalálható a fenti Stratagene kézikönyvben), Westem-blot vizsgálattal kimutatható, hogy ekvivalens VIP-1 fehérjét termel, és szintén hatásos a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben.

A pCIB6022 nukleotidszekvenciát a Sanger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] által leírt láncterminációs, vagyis didezoxiszekvenálással, PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kitek és PRISM Seuqenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing kit alkalmazásával határoztuk meg, és AB1 373 típusú automatikus szekvenátorral elemeztük. Szekvenciaazonosító száma: 1. A pCIB6022-t az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA) NRRL B-21222 számon deponáltuk.

11. példa

A VIP-1 DNS-szakasz funkcionális elemzése

Annak bizonyítására, hogy a VIP-1 nyitott leolvasási keret (ORF) szükséges az inszekticid aktivitáshoz, a génben egy transzlációs keretmutációt hajtottunk végre. A Bgl II restrikciós enzim felismer egy egyedi, a VIP-1 kódolószakaszban az 1758 bp-nál lévő helyet. A pCIB6201-et Bgl II-vei emésztettük, majd az egyfonalas végeket DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) és dNTPS-sel egészítettük ki. A plazmidot újból ligáltuk, majd E.coli-ba transzformáltuk. Az így kapott plazmid, a pCIB6203 a VIP-1 kódolószakaszban egy négy nukleotidból álló inszertumot tartalmaz. A pCIB6203 nem nyújt inszekticid aktivitást, és ez megerősíti azt, hogy a VIP-1 a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben mutatott aktivitásnak alapvetően fontos komponense.

A VIP-l-et kódoló szakasz további meghatározásához VIP-1 és VIP-2 (kiegészítő fehérje) régió szubklónokat hoztunk létre, és vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képesek komplementálni a pCIB6203-ban a mutáció hatását. A pCIB6023 tartalmazza a 3,7 kb-os XbalEcoRV fragmentet pBluescript SK(+)-ban (Stratagene). A Westem-blot analízis azt mutatja, hogy a pCIB6023 ugyanolyan méretű és mennyiségű VIP-1 fehérjét termel, mint a PL2 és a pCIB6022. A pCIB6023 tartalmazza a teljes gént, amely a 80 kD-os fehérjét kódolja. A pCIB6023-at az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illionis 61604, USA) NRRL B-21223 számon deponáltuk.

A pCIB6023 bizonyos mértékű aktivitást mutat a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben, ez azonban kisebb, mint a PCIB6022 aktivitása. Egy pCIB6203 plazmidot (VIP-2 és mutációval megváltoztatott VIP-1) tartalmazó sejtekből és pCIB6023-at (csak VIP-1) tartalmazó sejtekből álló keverék nagy aktivitást mutat a nyugati gabonagyökér-féreggel szemben. Tehát a pCIB6023 bizonyára termel egy funkcionális VIP-1 génterméket, a PCIB6203 pedig egy funkcionális VIP-2 génterméket. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nyugati gabonagyökér-féreggel szembeni maximális aktivitás eléréséhez a VIP-1 mellett további, a VIP-2 régióból származó géntermék(ek) szükséges(ek), amint az 1. ábrán látható.

A pCIB 6022 jellemzése az 1. ábrán látható. Az ábrán a téglalapokkal jelölt szakaszok a VIP-1 kiterjedését jelentik. A világos árnyékolás a Bacillusban talált 80 kD-os fehéijét kódoló szakaszokat, a sötét árnyékolás pedig VIP-1 DNS-szekvenciaelemzésével előre meghatározott N-terminális aminosavakat jelenti. A nagy „X” jelzi a VIP-l-ben végrehajtott keretmutáció helyét. A nyilak a β-galaktozid promoterrel átírt szerkezeteket jelentik. Restrikciós helyek: C=Cla I; X=Xba I; S=Sca I; RI=Eco Rí; B=Bgl II és RV=Eco RV.

12. példa

AB 78 ellenanyag-termelés

Az ellenanyag-termelést 2 Lewis-patkányban iniciáltuk (indítottuk be), hogy meghagyjuk a lehetőséget mind a hibridóma sejtvonalak termelése felé való elmozdulásra, mind pedig arra, hogy elegendő szérum termelődjék a cDNS klóntár korlátozott szkríneléséhez. Egy további tényező volt, hogy az antigén nagyon korlátozott mennyiségben állt rendelkezésünkre, és csak úgy tudtuk előállítani, hogy PAGE gélelektroforézissel tisztítottuk, majd elektromos úton nitrocellulóz hártyára vittük át (elektrotranszfer).

Minthogy az antigénből igen kis mennyiség volt a nitrocellulózon, a nitrocellulózt dimetil-szulfoxidban (DMSO) emulgeáltuk, és az állatok hátsó talpába injektáltuk, hogy megtudjuk: képződnek-e B-limfociták a talpak felett található térdhajlati nyirokcsomókban. Az elsőként vett vérben Westem-analízissel azt tapasztaltuk, hogy erősen reagáló szérum képződik. Néhány további injekció beadásával és vérvétellel az összes szükséges szkríneléséhez elegendő szérumot kaptunk.

Ezután az egyik patkánynál beindítottuk a hibridómatermelést. A térdhajlati nyirokcsomót kimetszettük, mállasztottuk (macerálás), és az így kapott sejteket P3x63Ag8.653 egér myelomasejtekkel fuzionáltattuk. Az ezt követő sejtszkrínelést az alábbaikaban leírtak szerint végeztük. A mikrotiter lemezről négy - a legerősebb emulziós antigén reakciót adó - lyuk tartalmát választottunk ki, ezekből végeztük a korlátozott hígításos klónozást. További 10 lyukat választottunk ki elszaporításra és fagyasztásos tárolásra.

Eljárás az AB 78-nak nitrocellulózon DMSO-ban végzett emulgeálására és ELISA eljárással végzett szkrínelésére

Miután a PAGE-vel futtatott AB78 mintákat elektrotranszferrel átvittük nitrocellulózra, a reverzibilis Ponceau-színezékkel tesszük láthatóvá az összes átvitt fehérjét. A már azonosított AB78 toxinnak - amelynek már meghatároztuk az N-terminális szekvenciáját - megfelelő sávot azonosítjuk, és kivágjuk a nitrocellulózból.

HU 220 714 Bl

Hogy minél kevesebb nitrocellulózt kelljen emulgeálni, mindegyik sáv mérete körülbelül 1 mmx5 mm. Az így kapott csíkokat egy-egy 250 pml DMSO-t tartalmazó mikrocentrifugacsőbe tesszük, és műanyag pisztillus (Kontes, Vineland, NJ) alkalmazásával maceráljuk. Az emulgeálás elősegítésére a DMSO-os keveréket 2-3 percig 37-45 °C-os hőmérsékleten melegítjük. A melegítés után esetleg további macerálás is szükséges lehet, de a nitrocellulóz teljes mennyiségét emulzióba kell vinni. Az AB78 emulgeálása után a mintát jégre tesszük. Az emulgeált antigénnel bevont mikrotiterlemez elkészítéséhez a mintát boráttal pufferoit nátrium-klorid-oldattal hígítjuk a következő arányokban: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100 és 0. A bevonathoz használt antigént frissen, közvetlenül felhasználás előtt kell elkészíteni.

Az ELISA eljárás az alábbi lépésekből áll:

1. Bevonat készítése az AB78-at DMSO-ban, boráttal pufferoit nátrium-klorid-oldattal (BBS) hígítva tartalmazó oldattal.

2. A lemez lemosása háromszor IX ELISA mosópufferrel.

3. Blokkolás [1% BSA (N,O-bisz(trimetil-szilil)acetamid) és 0,05% Tween 20 PBS-ben] 30 percig szobahőmérsékleten.

4. A lemez lemosása háromszor IX ELISA mosópufferrel.

5. Patkányszérum hozzáadása. Inkubálás 1,5 órán át 37 °C-on.

6. A lemez lemosása háromszor IX ELISA mosópufferrel.

7. Kecskéből származó, patkánnyal szembeni ellenanyag hozzáadása 2 pg/ml koncentrációban, ELISA hígítóban. Inkubálás 1 órán át 37 °C-on.

8. A lemez lemosása háromszor IX ELISA mosópufferrel.

9. Nyűiből származó, kecskével szembeni alkalikus foszfatáz hozzáadása 2 pg/ml koncentrációban, ELISA hígítóban. Inkubálás 1 órán át 37 °C-on.

10. A lemez lemosása háromszor IX ELISA mosópufferrel.

11. Szubsztrát hozzáadása. Inkubálás 30 percig szobahőmérsékleten.

12. Leállítás 3M nátrium-hidroxid-oldattal 30 perc elteltével.

13. példa

Nem aktív Bt-törzsek inszkticid hatásának aktiválása AB78 VIP klánokkal

Ha egy Bt GC91 tözstenyészet felülúszójához pCIB6203-at adunk, az Diabrotica virgifera virgiferával szemben 100%-os mortalitást eredményez. Önmagában sem a pCIB6203, sem pedig a GC91 nem aktív a Diabrotica virgifera virgiferával szemben. Az eredmények a következők:

Vizsgált anyag	A Diabrotica átlagos mortalitása, %
PCIB6203	0
GC91	16

Vizsgált anyag	A Diabrotica átlagos mortalitása, %
PCIB6203+GC91	100
kontroll	0

14. példa

A B. cereus AB81 izolálása és biológiai aktivitása Gabonakamrák pormintáiból egy másik, AB81-nek elnevezett B. cereus-törzset is izoláltunk a szokásos módszerekkel. Az AB81 törzsből egy szubkultúrát tenyésztettünk ki, és előkészítettük biológiai vizsgálatokhoz a 2. példában leírt módon. A biológiai aktivitást a 3. példa szerinti módon mértük. Az alábbi eredményeket kaptuk:

Vizsgált rovarfajok	Mortalitás, %
Ostrinia nubilalais	0
Agrotis ipsilon	0
Diabrotica virgifera virgifera	55

15. példa

A B. thuringiensis AB6 izolálása és biológiai aktivitása Gabonakamrák pormintáiból a szakmában ismert módszerekkel egy AB6-nak elnevezett B. thuringiensis-törzset izoláltunk. Az AB6-ból egy szubkultúrát tenyésztettünk ki, és előkészítettük biológiai vizsgálatokhoz a 2. példában leírt módon. A minta felét 15 percig autoklávban kezeltük, hogy megvizsgáljuk 13-exotoxin jelenlétére.

A biológiai aktivitást a 3. példa szerinti módon mértük. Az alábbi eredményeket kaptuk:

Vizsgált rovarfajok	Mortalitás, %
Ostrinia nubilalais	0
Agrotis ipsilon	100
Agrotis ipsilon (autoklávban kezelt minta)	0
Diabrotica virgifera virgifera	0

Az AB6 törzset az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illionis 61604, USA) NRRL B-21060 számon deponáltuk. 16. példa

A B. thuringiensis AB88 izolálása és biológiai jellemzése

Gabonakamrák pormintáiból egy AB88-nak elnevezett Bt-törzset izoláltunk a szokásos módszerekkel. Az AB88-ból egy szubkultúrát tenyésztettünk ki, és előkészítettük biológiai vizsgálatokhoz a 2. példában leírt módon. A minta felét 15 percig autoklávban kezeltük, hogy megvizsgáljuk 15-exotoxin jelenlétére.

A biológiai aktivitást egy sor rovarral szemben a 3. példa szerinti módon mértük. Az alábbi eredményeket kaptuk:

HU 220 714 Β1

Vizsgált rovarfajok	Rend	Mortalitás% a tenyészet felülúszójában
nem autoklávozott	autoklávozott
Agrotis ipsilon	Lepidoptera	100	5
Ostrinia nubilalais	Lepidoptera	100	0
Spodoptera frugiperda	Lepidoptera	100	4
Helicoverpa zea	Lepidoptera	100	12
Heliothis virescens	Lepidoptera	100	12
Lepinotarsa decemlineata	Coleoptera	0	0
Diabrotica virgifera virgifera	Coleoptera	0	5

Az AB88 törzsből δ-endotoxin-kristályokat nyer- 15 tünk ki és tisztítottunk a szokásos módszerekkel. A tiszta kristályok az Agrotis ipsilonnal szemben a biológiai vizsgálatban nem mutattak aktivitást.

17. példa 20

VIP-ek kinyerése AB88 törzsből és tisztításuk

Folyékony baktériumkultúrát tenyésztettünk Tbközegben egy éjszakán át 30 °C-on. Utána a közeget ammónium-szulfáttal 70%-ig telítve a fehérjéket kicsaptuk és lecentrifugáltuk. Az üledéket az eredeti térfogat- 25 nak megfelelő 20 mM pH=7,5-ös íriszben szuszpendáltuk, majd ugyanezen pufferrel szemben dializáltuk. Az AB88 dializátum zavarosabb volt, mint az AB78-ból kapott ugyanilyen anyag. Az AB88 fehérjéit a tisztítás után több különböző módszerrel választottuk el, ezek 30 közé tartozik az izoelektromos fókuszálás (IEF) (Rotofor, BioRad, Hercules, CA), kicsapás pH=4,5-ön, ioncserés kromatográfia, méretkizárásos kromatográfia és az ultraszűrés.

A kukoricamollyal szemben aktív fehéije a diali- 35 zátumból pH=4,5-ön kiválasztott csapadékban maradt. Mikor a dializátumon 3-10 pH-értékű amfolitokkal (amfoter elektrolitok) IEF-et hajtottunk végre, mindazon frakciókat aktívnak találtuk a kukoricamollyal szemben, amelyeknek pH-ja 7 vagy nagyobb volt. Ezeknek a frak- 40 cióknak az SDS-PAGE vizsgálata körülbelül 60 és körülbelül 80 kD molekulatömegű fehérjék sávjait mutatta. A 60 kD-os és a 80 kD-os sávot anioncserélő HPLCvel, Poros-Q oszlopon (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) választottuk el. Az N-terminális szekvenciát 45 két frakcióból kaptuk meg, amelyekben a fehéijék molekulatömege enyhén eltérő, de mindkettő körülbelül 60 kD méretű volt. Az így kapott szekvenciák hasonlóak voltak egymáshoz és bizonyos δ-endotoxinokhoz.

Az anioncserés kromatográfia 23. (kisebb) frakciója: 50 xEPFVSAxxxQxxx (szekvenciaazonosító: 10) az anioncserés kromatográfia 28. (nagyobb) frakciója:

xEYENVEPFVSAx (szekvenciaazonosító: 11)

Mikor a pH=4,5-ön kiválasztott (aktív) csapadékon egy anioncserélő Poros-Q oszlop alkalmazásával továb- 55 bi elválasztást hajtottunk végre, csak azokat a frakciókat találtuk aktívnak, amelyek egy széles, 60 kD körüli sávot tartalmaztak.

Mikor az AB88 dializátum pH-ját 4,5-re állítottuk, a nagy fübagollyal szemben aktív fehéije is maradt a 60 csapadékban. A 3-10 pH-értékű amfolitokkal végzett preparatív IEF során a kukoricamollyal szemben aktív IEF-frakciók a nagy fübagollyal szemben nem mutattak aktivitást; ez utóbbi aktivitás egy pH=4,5 és 5,0 közötti frakcióban volt a legnagyobb. Ezen frakció főkomponenseinek molekulatömege körülbelül 35 kD, illetve körülbelül 80 kD.

A pH=4,5-ön kiválasztott csapadékot anioncserélő HPLC-vel úgy választottuk el, hogy kapjunk olyan frakciókat, amelyek csak a 35 kD-os anyagot tartalmazzák és olyanokat, amelyek mind a 35 kD-os, mind pedig a 80 kD-os sávot tartalmazzák.

18. példa

Az AB88 VIP jellemzése

A különböző lepkékkel szemben aktív vegetatív fehérjéket tartalmazó frakciókat állítottunk elő a 17. példa szerinti módon. Az aktív frakciók elemzése azt mutatja, hogy a különböző lepkefajokkal szembeni aktivitást különböző VIP-ek eredményezik.

Az Agrotis ipsilonnal szembeni aktivitást egy 80 kD-os vagy egy 35 kD-os fehéije okozza különkülön vagy együttesen. Ezek a fehérjék egyetlen, Btből származó δ-endotoxinhoz sem hasonlók, ezt bizonyítja, hogy az ismert Bt δ-endotoxinnal nem mutatnak szekvenciaanalógiát, és nem fordulnak elő az AB88 δendotoxin-kristályban. A fontosabb δ-endotoxin fehérjék N-terminális szekvenciáit összehasonlítottuk a 80 kD-os és a 35 kD-os VIP N-terminális szekvenciákkal, és semmiféle analógiát nem találtunk közöttük. Az eredmények összefoglalva a következők:

Agrotis VIP N-terminális szekvenciák	A fontosabb δ-endotoxin fehérjék N-terminális szekvenciái
	130 kD MDNNPNINE (szekvenciaazonosító: 14)
80 kD MNKNNTKLPTRALP (szekvenciaazonosító: 12)	80 kD MDNNPNINE (szekvenciaazonosító: 15)
35 kD ALSENTGKDGGYIVP (szekvenciaazonosító: 13)	60 kD MNVLNSGRTTI (szekvenciaazonosító: 16)

HU 220 714 Bl

Az Ostrinia nubilalais-szal szembeni aktivitást egy 60 kD-os VIP, a Spodoptera fruglperdával szembeni aktivitást pedig egy ismeretlen méretű VIP eredményezi.

A Bacillus thuringiensis AB88 törzset az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illionis 61604, USA) NRRL B-21225 számon deponáltuk.

19. példa

Egyéb Bacillus fajok izolálása és biológiai aktivitása

Más olyan Bacillus fajokat is izoláltunk, amelyek vegetatív fejlődési időszakukban inszkticid hatású fehérjéket termelnek. Ezeket a törzseket környezeti mintákból, a szokásos módszerekkel izoláltuk. Az izolátumokat a 2. példában leírt módon készítettük elő a biológiai vizsgálatokhoz, a vizsgálatokat pedig a 3. példa szerinti módon végeztük. Az alábbi táblázatban felsoroljuk azokat az izolátumokat, amelyek a vegetatív fejlődési szakaszban a biológiai vizsgálatok szerint az Agrotis ipsilonnal szemben aktív fehéijéket termeltek.

Bacillusizolátum	δ-Endotoxinkristály jelenléte	Mortalitás, %
AB6	+	100
AB53	-	80
AB88	+	100
AB 195	-	60
AB211	-	70
AB217	-	83
AB272	-	80
AB279	-	70
AB289	+	100
AB292	+	80
AB274	-	100
AB300	-	80
AB359	-	100

Az AB289, az AB294 és az AB359 izolátumot az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, II 61604, USA) NRRL B-21227, NRRL B-21229, illetve NRRL B21226 számon deponáltuk.

Az alábbi táblázaton azokat a Bacillus-izolátumokat soroljuk fel, amelyek vegetatív fejlődési szakaszukban a Diabrotica virgifera virgiferával szemben aktív fehéijéket termeltek.

Bacillusizolátum	δ-Endotoxinkristály jelenléte	Mortalitás, %
AB52	-	50
AB59	-	71
AB68	+	60
AB78	-	100

Bacillusizolátum	δ-Endotoxinkristály jelenléte	Mortalitás, %
AB122	-	57
AB218	-	64
AB256	-	64

Az AB59, és az AB256 izolátumot az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illionis 61604, USA) NRRL B-21228, illetve NRRL B-21230 számon deponáltuk.

Az Agricultural Research Service, Patent Culture Collectionnél (NRRL, Northen Régiónál Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illionis 61604, USA) az alább felsoroltakat deponáltuk:

l.E. coliPL2	NRRL B-21221
2. E. coli pCIB 6022	NRRL B-21222
3. E. coli pCIB 6023	NRRL B-21223
4. Bacillus thuringiensis	HD73-78VIP NRRL B-21224
5. Bacillus thuringiensis AB88	NRRL B-21225
6. Bacillus thuringiensis AB359	NRRL B-21226
7. Bacillus thuringiensis AB289	NRRL B-21227
8. Bacillus sp. AB59	NRRL B-21228
9. Bacillus sp. AB294	NRRL B-21229
10. Bacillus sp. AB256	NRRL B-21230
11. E. coli P5-4	NRRL B-21059
12. E. coli P3-12	NRRL B-21061
13. Bacillus cereus AB78	NRRL B-21058
14. Bacillus thuringiensis	NRRL B-21060

Bár a fentiekben a találmányt elég részletesen és példákkal illusztrálva ismertettük, nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások, illetve módosítások az igénypontokban kijelölt oltalmi körön belül végrehajthatók.

A következő oldalakon a találmány szerinti megoldáshoz tartozó szekvencialistákat ismertetjük, melyhez a következő magyarázatot fűzzük: Az 1-es azonosító számú szekvencia a Bacillus cereus-törzsből izolált 6106 bázispár hosszúságú nukleinsav. A 2. és 3. szekvenciák a VIP-1 és VIP-2 fehéijéket íiják le, amelyeket az 1. számú nukleinsavszekvencia bizonyos szakaszai kódolnak. Ezeken belül: a VIP-l-nek egy 100 kD-os szakasza az 5. számon szereplő aminosavszekvencia, ezt kódolja a 4-es azonosító számú, 2655 bázispár hosszúságú szekvencia, amely az 1-es nukleinsavszekvencia 1-2652 közötti szakaszát képezi. A VIP-l-nek egy még szűkebb változata a 7-es azonosító számú 80 kD-os szekvencia, ezt kódolja a 6-os azonosító számú nukleinsavszekvencia, amely az 1-es számú szekvencia 1-2001 bázispárig teijedő szakasza.

A 17-18. azonosító számú szekvenciák olyan génszekvenciákat írnak le, amelyek a 6. és 7. szekvenciaazonosítóval definiált, kukoricára optimalizált 100 kDos, illetve 80 kD-os VIP-1 fehérjét kódolják.

HU 220 714 Bl

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő:

(A) Név: CIBA-GEIGY AG (B) Utca: Klybeckstrasse 141 (C) Város: BÁZEL (E) Ország: SVÁJC (F) Postai kód (ZIP): CH-4002 (G) Telefon: (061)696 11 11 (H) Telefax: (061)696 79 76 (A) Név: Gregory W. Warren (B) Utca: 324 Bond Laké Drive (C) Város: CARY (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27513 (A) Név: Michael G. Köziéi (B) Utca: 509 Carolyn Court (C) Város: CARY (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27511 (A) Név: Martha A. Mullins (B) Utca: 104 Countrybrook Lane (C) Város: Y oungsville (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27596 (A) Név: Gordon J. Nye (B) Utca: 1001 Bray Court (C) Város: APEX (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27502 (A) Név: Brian Carr (B) Utca: 110 D Lady’s Slipper Ct.

(C) Város: RALEIGH (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27606 (A) Név: Nalini Manaj Desai (B) Utca: 107 Silverwood Lane (C) Város: Cary (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27511 (A) Név: N. Kristy Kostichka (B) Utca: 5017 Wineberry Dr.

(C) Város: DURHAM (D) Állam: NC (E) Ország: USA (F) Postai kód (ZIP): 27713

HU 220 714 Bl (ii) A találmány címe: Új peszticid proteinek és törzsek (iii) Szekvenciák száma:

(iv) Kompjuterrel olvasható forma:

(A) média típusa: floppy disk (B) kompjuter: IBM PC kompatibilis (C) operációs rendszer (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, változat #1,25 (EPO) (vi) Korábbi bejelentések adatai:

(A) bejelentési szám: US 08/037,057 (B) bejelentési nap: 25-MAR-1993 (2) Információ az 1. azonosítási számú szekvenciáról:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hossz: 6106bázispár (B) típus: nukleinsav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus cereus (B) törzs: AB78 (C) egyedi izolátum: NRRL B-21058 (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcsszó: CDS (B) elhelyezkedés: 1082... 1810 (D) más információk: /termék=„VIP-1=’’/címke=ORF-1 (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcsszó: CDS (B) elhelyezkedés: 1925.. .2470 (D) más információk: /termék=„VIP-2”/címke=ORF-2 (xi) Szekvencialeírás: 1. azonosító számú szekvencia:

ATCGATACAA	TGTTGTTTTA	CTTAGACCGG	TAGTCTCTGT	AATTTGTTTA	ATGCTATATT	60
CTTTACTTTG	ATACATTTTA	ATAGCCATTT	CAACCTTATC	AGTATGTTTT	TGTGGTCTTC	120
CTCCTTTTTT	TCCACGAGCT	CTAGCTGCGT	TTAATCCTGT	TTTGGTACGT	TCGCTAATAA	180
TATCTCTTTC	TAATTCTGCA	ATACTTGCCA	TCATTCGAAA	GAAGAATTTC	CCCATAGCAT	240
TAGAGGTATC	AATGTTGTCA	TGAATAGAAA	TAAAATCTAC	ACCTAGCTCT	TTGAATTTTT	300
CACTTAACTC	AATTAGGTGT	TTTGTAGAGC	GAGAAATTCG	ATCAAGTTTG	TAAACAACTA	360
TCTTATCGCC	TTTACGTAAT	ACTTTTAGCA	ACTCTTCGAG	TTGAGGGCGC	TCTTTTTTTA	420
TTCCTGTTAT	TTTCTCCTGA	TATAGCCTTT	CTACACCATA	TTGTTGCAAA	GCATCTATTT	480
GCATATCGAG	ATTTTGTTCT	TCTGTGCTGA	CACGAGCATA	ACCAAAAATC	AAATTGGTTT	540
CACTTCCTAT	CTAAATATAT	CTATTAAAAT	AGCACCAAAA	ACCTTATTAA	ATTAAAATAA	600
GGAACTTTGT	TTTTGGATAT	GGATTTTGGT	ACTCAATATG	GATGAGTTTT	TAACGCTTTT	660
GTTAAAAAAC	AAACAAGTGC	CATAAACGGT	CGTTTTTGGG	ATGACATAAT	AAATAATCTG	720
TTTGATTAAC	CTAACCTTGT	ATCCTTACAG	CCCAGTTTTA	TTTGTACTTC	AACTGACTGA	780
ATATGAAAAC	AACATGAAGG	TTTCATAAAA	TTTATATATT	TTCCATAACG	GATGCTCTAT	840
CTTTAGGTTA	TAGTTAAATT	ATAAGAAAAA	AACAAACGGA	GGGAGTGAAA	AAAAGCATCT	900

HU 220 714 Bl

TCTCTATAAT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAAT AAATATGAAT 960

ATCTATCTAT AATTGTTTGC TTCTACAATA ACTTATCTAA CTTTCATATA CAACAACAAA 1020

ACAGACTAAA TCCAGATTGT ATATTCATTT TCAGTTGTTC CTTTATAAAA TAATTTCATA 1080

A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA 1126

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu

1

5

10

15

CAA

GTA

GTT

ACT

AAA

ACT

GTA

TTG

CTT

AGT

ACA

GTT

TTC

TCT

ATA

TCT

1174

Gin

Va 1

Val

Thr

Ly s 20

Thr

Va 1

Leu

Ser 25

Thr

Val

Phe

Ser

Ile 30

Ser

TTA

AAT

GAA

GTG

ATA

AAA

GCT

GAA

CAA

TTA

AAT

ATA

AAT

TCT

1222

Leu

Asn

Asn 35

Glu

Val

Ile

Ly s

Al a 40

Glu

Gin

Leu

Asn

Ile 45

Asn

Ser

CAA

AGT

AAA

TAT

ACT

AAC

TTG

CAA

AAT

CTA

AAA

ATC

ACT

GAC

AAG

GTA

1270

Gin

Ser

Ly s 50

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin 55

Asn

Le u

Ly s

Ile

Thr 60

As p

Lys

Va 1

GAG

GAT

TTT

AAA

GAA

GAT

AAG

GAA

AAA

GCG

AAA

GAA

TGG

GGG

AAA

GAA

1318

Glu

As p 65

Phe

Lys

Glu

Asp

Ly s 70

G1 u

Ly s

Al a

Ly s

Glu 75

Trp

Gly

Lys

Glu

AAA

GAA

AAA

GAG

TGG

AAA

CTA

ACT

GCT

ACT

GAA

AAA

GGA

AAA

ATG

AAT

1366

Lys 80

Glu

Lys

Glu

Trp

Ly s 85

Leu

Thr

Al a

Thr

Glu 90

Ly s

Gly

Ly s

Me t

Asn 95

AAT

TTT

TTA

GAT

AAT

AAA

AAT

GAT

ATA

NAG

ACA

AAT

TAT

AAA

GAA

ATT

1414

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn 100

Lys

Asn

Asp

Ile

Xaa 105

Thr

Asn

Tyr

Ly s

Glu 110

Ile

ACT

TTT

TCT

ATG

GCA

GGC

TCA

TTT

GAA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAT

TTA

AAA

1462

Thr

Phe

Ser

Me t 115

Al a

Gly

Ser

Phe

Glu 120

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp 125

Leu

Lys

GAA

ATT

GAT

AAG

ATG

TTT

GAT

AAA

ACC

AAT

CTA

TCA

AAT

TCT

ATT

ATC

1510

Glu

Ile

Asp 130

Lys

Me t

Phe

Asp

Ly s 135

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn 140

Ser

Ile

ACC

TAT

AAA

AAT

GTG

GAA

CCG

ACA

ATT

GGA

TTT

AAT

AAA

TCT

TTA

1558

Thr

Tyr 145

Lys

Asn

Va 1

Glu

Pro 150

Thr

Ile

G1 y

Phe 155

Asn

Ly s

Ser

Leu

ACA

GAA

GGT

AAT

ACG

ATT

AAT

TCT

GAT

GCA

ATG

GCA

CAG

TTT

AAA

GAA

1606

Thr 160

Glu

Gly

Asn

Thr

Ile 165

Asn

Ser

Asp

Al a

Me t 170

Al a

Gin

Phe

Lys

Glu 175

CAA

TTT

TTA

GAT

AGG

GAT

ATT

AAG

TTT

GAT

AGT

TAT

CTA

GAT

ACG

CAT

1654

Gin

Phe

Leu

Asp

Arg 180

Asp

Ile

Ly s

Phe

Asp 185

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr 190

Hi s

TTA

ACT

GCT

CAA

GTT

TCC

AGT

AAA

GAA

AGA

GTT

ATT

TTG

AAG

GTT

1702

Leu

Thr

Al a

Gin 195

Gin

Val

Ser

Lys 200

Glu

Arg

Val

Ile

Leu 205

Lys

Va 1

HU 220 714 Bl

ACG GTT CCG AGT

GGG Gly

AAA Lys

GGT Gly

TCT ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC

1750

Thr

Val

Pro 210

Ser

Ser 215

Thr

Pro

Thr

Lys 220

Al a

Gly

Val

ATT

TTA

AAT

AGT

GAA

TAC

AAA

ATG

CTC

ATT

GAT

AAT

GGG

TAT

ATG

1798

Ile

Leu

Asn

Ser

Glu

Tyr

Ly s

Me t

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Me t

225

230

235

GTC

CAT

GTA

GAT

TAAGGTATCA AAAGTGGTGA AAAAAGGGGG TGGAGTGCCT

1850

Val

Hi s

Val

Asp

240

TACAAATTGA AGGGACTTTA AAAAAGAGTC TTGACTTTAA AAATGATATA AATGCTGAAG 1910

CGCATAGCTG GGGT ATG AAG AAT TAT GAA GAG TGG GCT AAA GAT TTA ACC 1960

Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr

5 10

GAT Asp

TCG CAA

AGG GAA

GCT TTA GAT GGG

TAT Tyr

GCT Al a

AGG Arg

CAA GAT

TAT Tyr

AAA Lys

2008

Ser

Gin 15

Arg

Glu

Ala

Leu

As p 20

Gly

Gin 25

As p

GAA

ATC

AAT

TAT

TTA

AGA

AAT

CAA

GGC

GGA

AGT

GGA

AAT

GAA

AAA

2056

Glu

Ile 30

Asn

Tyr

Leu

Arg 35

Asn

Gin

Gly

Ser 40

Gly

Asn

Glu

Lys

CTA

GAT

GCT

CAA

ATA

AAA

AAT

ATT

TCT

GAT

GCT

TTA

GGG

AAG

AAA

CCA

2104

Leu 45

As p

Al a

Gin

Ile

Ly s 50

Asn

Ile

Ser

Asp

Al a 55

Leu

Gly

Ly s

Pro 60

ATA

CCG

GAA

AAT

ATT

ACT

GTG

TAT

AGA

TGG

TGT

GGC

ATG

CCG

GAA

TTT

2152

Ile

Pr o

Glu

Asn

Ile 65

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp 70

Cys

Gly

Me t

Pro

Glu 75

Phe

GGT

TAT

CAA

ATT

AGT

GAT

CCG

TTA

CCT

TCT

TTA

AAA

GAT

TTT

GAA

2200

Gly

Tyr

Gin

Ile 80

Ser

As p

Pro

Leu

Pro 85

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe 90

Glu

CAA

TTT

TTA

AAT

ACA

ATC

AAA

GAA

GAC

AAA

GGA

TAT

ATG

AGT

ACA

AGC

2248

Gin

Phe

Leu 95

Asn

Thr

Ile

Lys

Glu 100

Asp

Lys

Gly

Tyr

Me t 105

Ser

Thr

Ser

TTA

TCG

AGT

GAA

CGT

CTT

GCA

GCT

TTT

GGA

TCT

AGA

AAA

ATT

ATA

TTA

2296

Leu

Ser 110

Ser

Glu

Arg

Leu

Al a 115

Al a

Phe

Gly

Ser

Arg 120

Ly s

Ile

Leu

CGA

TTA

CAA

GTT

CCG

AAA

GGA

AGT

ACG

GGT

GCG

TAT

TTA

AGT

GCC

ATT

2344

Arg 125

Leu

Gin

Val

Pro

Ly s 130

Gly

Ser

Thr

Gly

Al a 135

Tyr

Leu

Ser

Al a

Ile 140

GGT

GGA

TTT

GCA

AGT

GAA

AAA

GAG

ATC

CTA

CTT

GAT

AAA

GAT

AGT

AAA

2392

Gly

G1 y

Phe

Al a

Ser 145

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu 150

Leu

Asp

Lys

As p

Ser 155

Lys

TAT

CAT

ATT

GAT

AAA

GTA

ACA

GAG

GTA

ATT

AAA

GGT

GTT

AAG

CGA

2440

Tyr

Hi s

Ile

Asp 160

Lys

Val

Thr

Glu

Val 165

Ile

Lys

Gly

Val 170

Lys

Arg

HU 220 714 Bl

TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT TAAGGAGATG AAAAATATGA 2490

Tyr Val Val Asp Alá Thr Leu Leu Thr Asn

175 180

AGAAAAAGTT	AGCAAGTGTT	GTAACGTGTA	CGTTATTAGC	TCCTATGTTT	TTGAATGGAA	2550
ATGTGAATGC	TGTTTACGCA	GACAGCAAAA	CAAATCAAAT	TTCTACAACA	CAGAAAAATC	2610
AACAGAAAGA	GATGGACCGA	AAAGGATTAC	TTGGGTATTA	TTTCAAAGGA	AAAGATTTTA	2670
GTAATCTTAC	TATGTTTGCA	CCGACACGTG	ATAGTACTCT	TATTTATGAT	CAACAAACAG	2730
CAAATAAACT	ATTAGATAAA	AAACAACAAG	AATATCAGTC	TATTCGTTGG	ATTGGTTTGA	2790
TTCAGAGTAA	AGAAACGGGA	GATTTCACAT	TTAACTTATC	TGAGGATGAA	CAGGCAATTA	2850
TAGAAATCAA	TGGGAAAATT	ATTTCTAATA	AAGGGAAAGA	AAAGCAAGTT	GTCCATTTAG	2910
AAAAAGGAAA	ATTAGTTCCA	ATCAAAATAG	AGTATCAATC	AGATACAAAA	TTTAATATTG	2970
ACAGTAAAAC	ATTTAAAGAA	CTTAAATTAT	TTAAAATAGA	TAGTCAAAAC	CAACCCCAGC	3030
AAGTCCAGCA	AGATGAACTG	AGAAATCCTG	AATTTAACAA	GAAAGAATCA	CAGGAATTCT	3090
TAGCGAAACC	ATCGAAAATA	AATCTTTTCA	CTCAAMAAAT	GAAAAGGGAA	ATTGATGAAG	3150
ACACGGATAC	GGATGGGGAC	TCTATTCCTG	ACCTTTGGGA	AGAAAATGGG	TATACGATTC	3210
AMAATAGAAT	CGCTGTAAAG	TGGGACGATT	CTCTAGCAAG	TAAAGGGTAT	ACGAAATTTG	3270
TTTCAAATCC	ACTAGAAAGT	CACACAGTTG	GTGATCCTTA	TACAGATTAT	GAAAAGGCAG	3330
CAAGAGATCT	AGATTTGTCA	AATGCAAAGG	AAACGTTTAA	CCCATTGGTA	GCTGCTTTTC	3390
CAAGTGTGAA	TGTTAGTATG	GAAAAGGTGA	TATTATCACC	AAATGAAAAT	TTATCCAATA	3450
GTGTAGAGTC	TCATTCATCC	ACGAATTGGT	CTTATACAAA	TACAGAAGGT	GCTTCTGTTG	3510
AAGCGGGGAT	TGGACCAAAA	GGTATTTCGT	TCGGAGTTAG	CGTAAACTAT	CAACACTCTG	3570
AAACAGTTGC	ACAAGAATGG	GGAACATCTA	CAGGAAATAC	TTCGCAATTC	AATACGGCTT	3630
CAGCGGGATA	TTTAAATGCA	AATGTTCGAT	ATAACAATGT	AGGAACTGGT	GCCATCTACG	3690
ATGTAAAACC	TACAACAAGT	TTTGTATTAA	ATAACGATAC	TATCGCAACT	ATTACGGCGA	3750
AATCTAATTC	TACAGCCTTA	AATATATCTC	CTGGAGAAAG	TTACCCGAAA	AAAGGACAAA	3810
ATGGAATCGC	AATAACATCA	ATGGATGATT	TTAATTCCCA	TCCGATTACA	TTAAATAAAA	3870
AACAAGTAGA	TAATCTGCTA	AATAATAAAC	CTATGATGTT	GGAAACAAAC	CAAACAGATG	3930
GTGTTTATAA	GATAAAAGAT	ACACATGGAA	ATATAGTAAC	TGGCGGAGAA	TGGAATGGTG	3990
TCATACAACA	AATCAAGGCT	AAAACAGCGT	CTATTATTGT	GGATGATGGG	GAACGTGTAG	4050
CAGAAAAACG	TGTAGCGGCA	AAAGATTATG	AAAATCCAGA	AGATAAAACA	CCGTCTTTAA	4110
CTTTAAAAGA	TGCCCTGAAG	CTTTCATATC	CAGATGAAAT	AAAAGAAATA	GAGGGATTAT	4170

HU 220 714 BI

TATATTATAA	AAACAAACCG	ATATACGAAT	CGAGCGTTAT	GACTTACTTA	GATGAAAATA	4230
CAGCAAAAGA	AGTGACCAAA	CAATTAAATG	ATACCACTGG	GAAATTTAAA	GATGTAAGTC	4290
ATTTATATGA	TGTAAAACTG	ACTCCAAAAA	TGAATGTTAC	AATCAAATTG	TCTATACTTT	4350
ATGATAATGC	TGAGTCTAAT	GATAACTCAA	TTGGTAAATG	GACAAACACA	AATATTGTTT	4410
CAGGTGGAAA	TAACGGAAAA	AAACAATATT	CTTCTAATAA	TCCGGATGCT	AATTTGACAT	4470
TAAATACAGA	TGCTCAAGAA	AAATTAAATA	AAAATCGTGA	CTATTATATA	AGTTTATATA	4530
TGAAGTCAGA	AAAAAACACA	CAATGTGAGA	TTACTATAGA	TGGGGAGATT	TATCCGATCA	4590
CTACAAAAAC	AGTGAATGTG	AATAAAGACA	ATTACAAAAG	ATTAGATATT	ATAGCTCATA	4650
ATATAAAAAG	TAATCCAATT	TCTTCACTTC	ATATTAAAAC	GAATGATGAA	ATAACTTTAT	4710
TTTGGGATGA	TATTTCTATA	ACAGATGTAG	CATCAATAAA	ACCGGAAAAT	TTAACAGATT	4770
CAGAAATTAA	ACAGATTTAT	AGTAGGTATG	GTATTAAGTT	AGAAGATGGA	ATCCTTATTG	4830
ATAAAAAAGG	TGGGATTCAT	TATGGTGAAT	TTATTAATGA	AGCTAGTTTT	AATATTGAAC	4890
CATTGCCAAA	TTATGTGACC	AAATATGAAG	TTACTTATAG	TAGTGAGTTA	GGACCAAACG	4950
TGAGTGACAC	ACTTGAAAGT	GATAAAATTT	ACAAGGATGG	GACAATTAAA	TTTGATTTTA	5010
CCAAATATAG	TAAAAATGAA	CAAGGATTAT	TTTATGACAG	TGGATTAAAT	TGGGACTTTA	5070
AAATTAATGC	TATTACTTAT	GATGGTAAAG	AGATGAATGT	TTTTCATAGA	TATAATAAAT	5130
AGTTATTATA	TCTATGAAGC	TGGTGCTAAA	GATAGTGTAA	AAGTTAATAT	ACTGTAGGAT	5190
TGTAATAAAA	GTAATGGAAT	TGATATCGTA	CTTTGGAGTG	GGGGATACTT	TGTAAATAGT	5250
TCTATCAGAA	ACATTAGACT	AAGAAAAGTT	ACTACCCCCA	CTTGAAAATG	AAGATTCAAC	5310
TGATTACAAA	CAACCTGTTA	AATATTATAA	GGTTTTAACA	AAATATTAAA	CTCTTTATGT	5370
TAATACTGTA	ATATAAAGAG	TTTAATTGTA	TTCAAATGAA	GCTTTCCCAC	AAAATTAGAC	5430
TGATTATCTA	ATGAAATAAT	CAGTCTAATT	TTGTAGAACA	GGTCTGGTAT	TATTGTACGT	5490
GGTCACTAAA	AGATATCTAA	TATTATTGGG	CAAGGCGTTC	CATGATTGAA	TCCTCGAATG	5550
TCTTGCCCTT	TTCATTTATT	TAAGAAGGAT	TGTGGAGAAA	TTATGGTTTA	GATAATGAAG	5610
AAAGACTTCA	CTTCTAATTT	TTGATGTTAA	ATAAATCAAA	ATTTGGCGAT	TCACATTGTT	5670
TAATCCACTG	ATAAAACATA	CTGGAGTGTT	CTTAAAAAAT	CAGCTTTTTT	CTTTATAAAA	5730
TTTTGCTTAG	CGTACGAAAT	TCGTGTTTTG	TTGGTGGGAC	CCCATGCCCA	TCAACTTAAG	5790
AGTAAATTAG	TAATGAACTT	TCGTTCATCT	GGATTAAAAT	AACCTCAAAT	TAGGACATGT	5850
TTTTAAAAAT	AAGCAGACCA	AATAAGCCTA	GAATAGGTAT	CATTTTTAAA	AATTATGCTG	5910
CTTTCTTTTG	TTTTCCAAAT	CCATTATACT	CATAAGCAAC	ACCCATAATG	TCAAAGACTG	5970

HU 220 714 Β1

TTTTTGTCTC

TCTAGAGCGG

TTCGAGCTTG

ATATCGATAA

CCGCCACCGC

TCGTGG

GCTTGATATC

GGTGGAGCTC

GAATTCCTGC

CAGCTTTTGT

AGCCCGGGGG

TCCCTTTAGT

ATCCACTAGT

GAGGGTTAAG

6030

6090

6106 (2) Információ a 2. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 243 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 2. azonosító számú szekvencia:

Me t 1

Lys

Arg

Me t

Glu 5

Gly

Ly s

Leu

Phe

Me t 10

Val

Ser

Ly s

Lys

Leu 15

Gin

Val

Va 1

Thr

Lys 20

Thr

Va 1

Le u

Ser 25

Thr

Va 1

Phe

Ser

Ile 30

Ser

Leu

Asn

Asn 35

Glu

Val

Ile

Lys

Al a 40

Glu

Gin

Leu

Asn

Ile 45

Asn

Ser

GI n

Ser

Ly s 50

Tyr

Thr

As n

Leu

Gin 55

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr 60

As p

Ly s

Val

Glu

Asp 65

Phe

Lys

Glu

As p

Ly s 70

Glu

Ly s

Al a

Lys

Glu 75

Trp

Gly

Ly s

Glu

Ly s 80

Glu

Ly s

Glu

Trp

Ly s 85

Leu

Thr

Al a

Thr

Glu 90

Ly s

Gly

Lys

Me t

Asn 95

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn 100

Ly s

Asn

As p

Ile

Xaa 105

Thr

Asn

Tyr

Ly s

Glu 110

Ile

Thr

Phe

Ser

Me t 115

Al a

Gly

Ser

Phe

Glu 120

Asp

Glu

Ile

Lys

As p 125

Leu

Lys

Glu

Ile

As p 130

Lys

Me t

Phe

As p

Ly s 135

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn 140

Ser

Ile

Thr

Tyr 145

Ly s

Asn

Val

GI u

Pro 150

Thr

Ile

GI y

Phe 155

Asn

Ly s

Ser

Leu

Thr 160

Glu

Gly

Asn

Thr

Ile 165

Asn

Ser

Asp

Al a

Me t 170

Al a

Gin

Phe

Ly s

Glu 175

Gin

Phe

Leu

Asp

Arg 180

Asp

Ile

Ly s

Phe

Asp 185

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr 190

Hi s

Leu

Thr

Al a

Gin 195

Gin

Val

Ser

Ly s 200

Glu

Arg

Val

Ile

Leu 205

Lys

Val

Thr

Val

Pro 210

Ser

Gly

Lys

GI y

Ser 215

Thr

Pro

Thr

Lys 220

Al a

Gly

Val

Ile

Leu 225

Asn

Ser

Glu

Tyr 230

Lys

Me t

Leu

Ile

As p 235

Asn

Gly

Tyr

Me t

Val 240

His Val Asp

HU 220 714 Bl

2) Szekvenciainformáció a 3. azonosító számú szekvenciához:

i) Szekvenciakarakterisztika:

(A) hosszúság: 182 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris ii) Molekulatípus: protein xi) Szekvencialeírás: 3. azonosító számú szekvencia:

Me t

Ly s

Asn

Tyr

Glu

Trp

Alá

Lys

As p

Leu

Thr

As p

Ser

Gin

Arg

1

5

10

15

Glu

Al a

Leu

Asp

Gly

Tyr

Alá

Arg

Gin

As p

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

20

25

30

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu

Asp

Al a

Gin

35

40

45

Ile

Ly s

Asn

Ile

Ser

Asp

Al a

Leu

Gly

Ly s

Pro

Ile

Pro

G1 u

Asn

50

55

60

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

Me t

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

65

70

75

80

Ser

As p

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Ly s

Asp

Phe

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

85

90

95

Thr

Ile

Lys

Glu

As p

Ly s

Gly

Tyr

Me t

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Glu

100

105

110

Arg

Leu

Al a

Alá

Phe

Gly

Ser

Arg

Ly s

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

115

120

125

Pro

Ly s

Gly

Ser

Thr

Gly

Al a

Tyr

Leu

Ser

Al a

Ile

Gly

Phe

Al a

130

135

140

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

As p

Lys

Asp

Ser

Ly s

Tyr

Hi s

I le

Asp

145

150

155

160

Lys

Va 1

Thr

Glu

Va 1

Ile

Ly s

Gly

Val

Ly s

Arg

Tyr

Va 1

As p

165

170

175

Al a

Thr

Leu

Thr

Asn

180

(2) Információ a 4. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 2655 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nincs (iii) Antiszensz: nincs (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Bacillus cereus (B) Törzs: AB78 (C) Egyedi izolátum: NRRL B-21058 (ix) Jellemző:

(A) név/kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1... 2652

HU 220 714 Β1 (C) Azonosítási módszer: kísérleti (D) Más információ: /termék=„100 kD-os VIP-1 protein” /bizonyíték=kísérleti (xi) Szekvencialeírás: 4. azonosító számú szekvencia:

ATG AAA

AAT ATG

AAG Lys 5

AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA AGG TGT

ACG Thr 15

TTA Leu

48

Me t 1

Ly s

Asn

Me t

Lys

Leu

Al a

Ser 10

Val

Thr

Cy s

TTA

GCT

CCT

ATG

TTT

TTG

AAT

GGA

AAT

GTG

AAT

GCT

GTT

TAG

GCA

GAC

96

Leu

Alá

Pro

Me t 20

Phe

Leu

Asn

Gly

Asn 25

Va 1

Asn

Al a

Val

Tyr 30

Al a

Asp

AGC

AAA

ACA

AAT

CAA

ATT

TCT

AGA

CAG

AAA

AAT

CAA

CAG

AAA

GAG

144

Ser

Ly s

Thr 35

Asn

Gin

Ile

Ser

Thr 40

Thr

Gin

Ly s

Asn

Gin 45

Gin

Ly s

Glu

ATG

GAC

CGA

AAA

GGA

TTA

CTT

GGG

TAT

TTC

AAA

GGA

AAA

GAT

TTT

192

Me t

As p 50

Arg

Ly s

G1 y

Leu

Leu 55

Gly

Tyr

Phe

Ly s 60

Gly

Ly s

Asp

Phe

AGT

AAT

CTT

ACT

ATG

TTT

GCA

CCG

ACA

CGT

GAT

AGT

ACT

CTT

ATT

TAT

240

Ser 65

Asn

Leu

Thr

Me t

Phe 70

Al a

Pro

Thr

Arg

As p 75

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr 80

GAT

CAA

ACA

GCA

AAT

AAA

CTA

TTA

GAT

AAA

CAA

GAA

TAT

288

Asp

Gin

Thr

Al a 85

Asn

Ly s

Leu

As p 90

Ly s

Lys

Gin

Glu 95

Tyr

CAG

TCT

ATT

CGT

TGG

ATT

GGT

TTG

ATT

CAG

AGT

AAA

GAA

ACG

GGA

GAT

336

Gin

Ser

Ile

Arg 100

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile 105

Gin

Ser

Ly s

Glu

Thr 110

Gly

As p

TTC

ACA

TTT

AAC

TTA

TCT

GAG

GAT

GAA

CAG

GCA

ATT

ATA

GAA

ATC

AAT

384

Phe

Thr

Phe 115

Asn

Leu

Ser

Glu

Asp 120

Glu

Gin

Al a

Ile

Ile 125

G1 u

Ile

Asn

GGG

AAA

ATT

TCT

AAT

AAA

GGG

AAA

GAA

AAG

CAA

GTT

GTC

CAT

TTA

432

Gly

Ly s 130

Ile

Ser

Asn

Ly s 135

Gly

Ly s

Glu

Ly s

Gin 140

Val

Va 1

His

Leu

GAA

AAA

GGA

AAA

TTA

GTT

CCA

ATC

AAA

ATA

GAG

TAT

CAA

TCA

GAT

ACA

480

Glu 145

Ly s

Gly

Lys

Leu

Val 150

Pro

Ile

Lys

Ile

Glu 155

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr 160

AAA

TTT

AAT

ATT

GAC

AGT

AAA

ACA

TTT

AAA

GAA

CTT

AAA

TTA

TTT

AAA

528

Lys

Phe

Asn

Ile

Asp 165

Ser

Lys

Thr

Phe

Ly s 170

Glu

Le u

Ly s

Le u

Phe 175

Ly s

ATA

GAT

AGT

CAA

AAC

CAA

CCC

CAG

CAA

GTC

CAG

CAA

GAT

GAA

CTG

AGA

576

Ile

As p

Ser

Gin 180

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin 185

Val

Gin

As p

Glu 190

Leu

Arg

AAT

CCT

GAA

TTT

AAC

AAG

AAA

GAA

TCA

CAG

GAA

TTC

TTA

GCG

AAA

CCA

624

Asn

Pro

Glu 195

Phe

As n

Lys

Glu 200

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu 205

Al a

Lys

Pro

TCG

AAA

ATA

AAT

CTT

TTC

ACT

CAA

MAA

ATG

AAA

AGG

GAA

ATT

GAT

GAA

672

Ser

Ly s 210

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr 215

Gin

Xaa

Me t

Ly s

Arg 220

Glu

Ile

As p

Glu

HU 220 714 Β1

GAC ACG GAT

ACG GAT

GGG GAC TCT ATT CCT GAC CTT

TGG GAA GAA AAT

720

Asp 225

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly 230

Asp

Ser

Ile

Pro

Asp 235

Leu

Trp

Gl u

Glu

Asn 240

GGG

TAT

ACG

ATT

CAM

AAT

AGA

ATC

GCT

GTA

AAG

TGG

GAC

GAT

TCT

CTA

768

Gly

Tyr

Thr

Ile

Xaa 245

Asn

Arg

Ile

Al a

Val 250

Ly s

Trp

As p

Asp

Ser 255

Leu

GCA

AGT

AAA

GGG

TAT

ACG

AAA

TTT

GTT

TCA

AAT

CCA

CTA

GAA

AGT

CAC

816

Alá

Ser

Lys

Gly 260

Tyr

Thr

Ly s

Phe

Val 265

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu 270

Ser

Hi s

ACA

GTT

GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT

TAT

GAA

AAG

GCA

AGA

GAT

CTA

864

Thr

Val

Gly 275

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp 280

Tyr

Glu

Ly s

Al a

Al a 285

Arg

Asp

Leu

GAT

TTG

TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG

TTT

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

TTT

912

As p

Leu 290

Ser

Asn

Al a

Ly s

Glu 295

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu 300

Va 1

Al a

Phe

CCA

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

960

Pro 305

Ser

Val

Asn

Val

Ser 310

Me t

Glu

Ly s

Va 1

Ile 315

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu 320

AAT

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

1008

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser 325

Val

Glu

Ser

Hi s

Ser 330

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser 335

Tyr

ACA

AAT

ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT

GAA

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

1056

Thr

Asn

Thr

Glu 340

Gly

Al a

Ser

Va 1

Glu 345

Al a

Gly

Ile

Gly

Pro 350

Lys

Gly

ATT

TCG

TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC

TAT

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA

GTT

GCA

1104

Ile

Ser

Phe 355

Gly

Val

Ser

Val

Asn 360

Tyr

Gin

Hi s

Ser

Glu 365

Thr

Val

Al a

CAA

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

1152

Gin

Glu 370

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr 375

Gl y

Asn

Thr

Ser

Gin 380

Phe

As n

Thr

Al a

TCA

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

1200

Ser 385

Al a

Gly

Tyr

Leu

Asn 390

Al a

As n

Val

Arg

Tyr 395

Asn

Va 1

Gly

Thr 400

GGT

GCC

ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

1248

Gly

Al a

Ile

Tyr

Asp 405

Val

Lys

Pro

Thr

Thr 410

Ser

Phe

Val

Leu

Asn 415

Asn

GAT

ACT

ATC

GCA

ACT

ATT

ACG

GCG

AAA

TCT

AAT

TCT

ACA

GCC

TTA

AAT

1296

Asp

Thr

Ile

Al a 420

Thr

Ile

Thr

Al a

Ly s 425

Ser

As n

Ser

Thr

Al a 430

Leu

Asn

ATA

TCT

CCT

GGA

GAA

AGT

TAC

CCG

AAA

GGA

CAA

AAT

GGA

ATC

GCA

1344

Ile

Ser

Pro 435

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro 440

Lys

Gly

Gin

Asn 445

Gly

Ile

Al a

ATA

ACA

TCA

ATG

GAT

TTT

AAT

TCC

CAT

CCG

ATT

ACA

TTA

AAT

AAA

1392

Ile

Thr 450

Ser

Me t

As p

Phe 455

As n

Ser

Hi s

Pro

Ile 460

Thr

Le u

Asn

Ly s

HU 220 714 Bl

AAA Lys 465

CAA Gin

GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT

AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA

1440

Val

Asp

Asn

Leu 470

Leu

Asn

Lys

Pro 475

Me t

Leu

Glu

Thr 480

AAC

CAA

ACA

GAT

GGT

GTT

TAT

AAG

ATA

AAA

GAT

ACA

CAT

GGA

AAT

ATA

1488

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly 485

Val

Tyr

Ly s

Ile

Ly s 490

As p

Thr

Hi s

Gly

Asn 495

Ile

GTA

ACT

GGC

GGA

GAA

TGG

AAT

GGT

GTC

ATA

CAA

ATC

AAG

GCT

AAA

1536

Val

Thr

Gly

Gly 500

Glu

Trp

Asn

Gly

Val 505

Ile

Gin

Ile

Ly s 510

Al a

Lys

ACA

GCG

TCT

ATT

GTG

GAT

GGG

GAA

CGT

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

1584

Thr

Al a

Ser 515

Ile

Val

Asp

As p 520

Gly

Glu

Arg

Val

Al a 525

Glu

Ly s

Arg

GTA

GCG

GCA

AAA

GAT

TAT

GAA

AAT

CCA

GAA

GAT

AAA

ACA

CCG

TCT

TTA

1632

Val

Al a 530

Al a

Lys

Asp

Tyr

Glu 535

Asn

Pro

Glu

As p

Ly s 540

Thr

Pro

Ser

Leu

ACT

TTA

AAA

GAT

GCC

CTG

AAG

CTT

TCA

TAT

CCA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

1680

Thr 545

Leu

Ly s

Asp

Al a

Leu 550

Ly s

Leu

Ser

Tyr

Pro 555

Asp

Glu

Ile

Ly s

Glu 560

ATA

GAG

GGA

TTA

TAT

AAA

AAC

AAA

CCG

ATA

TAC

GAA

TCG

AGC

1728

Ile

Glu

Gly

Leu

Leu 565

Tyr

Ly s

Asn

Ly s 570

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser 575

Ser

GTT

ATG

ACT

TAC

TTA

GAT

GAA

AAT

ACA

GCA

AAA

GAA

GTG

ACC

AAA

CAA

1776

Val

Me t

Thr

Tyr 580

Leu

Asp

Glu

As n

Thr 585

Alá

Ly s

Glu

Val

Thr 590

Ly s

Gin

TTA

AAT

GAT

ACC

ACT

GGG

AAA

TTT

AAA

GAT

GTA

AGT

CAT

TTA

TAT

GAT

1824

Leu

Asn

Asp 595

Thr

Gly

Ly s

Phe 600

Lys

Asp

Va 1

Ser

Hi s 605

Leu

Tyr

Asp

GTA

AAA

CTG

ACT

CCA

AAA

ATG

AAT

GTT

ACA

ATC

AAA

TTG

TCT

ATA

CTT

1872

Val

Ly s 610

Leu

Thr

Pro

Lys

Me t 615

Asn

Va 1

Thr

Ile

Lys 620

Leu

Ser

Ile

Leu

TAT

GAT

AAT

GCT

GAG

TCT

AAT

GAT

AAC

TCA

ATT

GGT

AAA

TGG

ACA

AAC

1920

Tyr 625

As p

Asn

Al a

Glu

Ser 630

Asn

As p

Asn

Ser

Ile 635

Gly

Ly s

Trp

Thr

Asn 640

ACA

AAT

ATT

GTT

TCA

GGT

GGA

AAT

AAC

GGA

AAA

CAA

TAT

TCT

1968

Thr

Asn

Ile

Val

Ser 645

Gly

Asn

Gly 650

Ly s

Lys

Gin

Tyr

Ser 655

Ser

AAT

CCG

GAT

GCT

AAT

TTG

ACA

TTA

AAT

ACA

GAT

GCT

CAA

GAA

AAA

2016

Asn

Pro

Asp 660

Al a

Asn

Leu

Thr

Leu 665

Asn

Thr

As p

Al a

Gin 670

Glu

Lys

TTA

AAT

AAA

AAT

CGT

GAC

TAT

ATA

AGT

TTA

TAT

ATG

AAG

TCA

GAA

2064

Leu

Asn

Lys 675

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr 680

Ile

Ser

Leu

Tyr

Me t 685

Ly s

Ser

Glu

AAA

AAC

ACA

CAA

TGT

GAG

ATT

ACT

ATA

GAT

GGG

GAG

ATT

TAT

CCG

ATC

2112

Ly s

Asn 690

Thr

Gin

Cy s

Glu

Ile 695

Thr

Ile

As p

Gly

Glu 700

Ile

Tyr

Pro

Ile

HU 220 714 Bl

ACT ACA

AAA Lys

ACA GTG AAT

GTG AAT

AAA Lys

GAC AAT Asp Asn 715

TAC Tyr

AAA Ly s

AGA Arg

TTA Leu

GAT Asp 720

2160

Thr 705

Thr

Val

Asn 710

Val

Asn

ATT

ATA

GCT

CAT

AAT

ATA

AAA

AGT

AAT

CCA

ATT

TCT

TCA

CTT

CAT

ATT

2208

Ile

Al a

Hi s

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

Pro

Ile

Ser

Leu

Hi s

Ile

725

730

735

AAA

ACG

AAT

GAT

GAA

ATA

ACT

TTA

TTT

TGG

GAT

ATT

TCT

ATA

ACA

2256

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe

Trp

As p

Ile

Ser

Ile

Thr

740

745

750

GAT

GTA

GCA

TCA

ATA

AAA

CCG

GAA

AAT

TTA

ACA

GAT

TCA

GAA

ATT

AAA

2304

Asp

Va 1

Al a

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Ly s

755

760

765

CAG

ATT

TAT

AGT

AGG

TAT

GGT

ATT

AAG

TTA

GAA

GAT

GGA

ATC

CTT

ATT

2352

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

I 1 e

Lys

Leu

Glu

As p

Gly

Ile

Leu

Ile

770

775

780

GAT

AAA

GGT

GGG

ATT

CAT

TAT

GGT

GAA

TTT

ATT

AAT

GAA

GCT

AGT

2400

Asp

Ly s

Gly

Ile

Hi s

Tyr

Gly

Glu

Ph e

Ile

Asn

Glu

Alá

Ser

785

790

795

800

TTT

AAT

ATT

GAA

CCA

TTG

CCA

AAT

TAT

GTG

ACC

AAA

TAT

GAA

GTT

ACT

2448

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

Val

Thr

Ly s

Tyr

Glu

Val

Thr

805

810

815

TAT

AGT

GAG

TTA

GGA

CCA

AAC

GTG

AGT

GAC

ACA

CTT

GAA

AGT

GAT

2496

Tyr

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

820

825

830

AAA

ATT

TAG

AAG

GAT

GGG

ACA

ATT

AAA

TTT

GAT

TTT

ACC

AAA

TAT

AGT

2544

Lys

Ile

Tyr

Ly s

Asp

Gly

Thr

Ile

Ly s

Phe

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr

Ser

835

840

845

AAA

AAT

GAA

CAA

GGA

TTA

TTT

TAT

GAC

AGT

GGA

TTA

AAT

TGG

GAC

TTT

2592

Ly s

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

As p

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

850

855

860

AAA

ATT

AAT

GCT

ATT

ACT

TAT

GAT

GGT

AAA

GAG

ATG

AAT

GTT

TTT

CAT

2640

Lys

Ile

Asn

Al a

Ile

Thr

Tyr

As p

Gly

Lys

Glu

Me t

Asn

Va 1

Phe

Hi s

865

870

875

880

AGA

TAT

AAT

AAA

TAG

2655

Arg

Tyr

Asn

Lys

(2) Információ az 5. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hossz: 884 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 5. azonosító számú szekvencia:

Me t 1

Ly s

Asn

Me t

Ly s 5

Lys

Leu

Al a

Ser 10

Va 1

Val

Thr

Cy s

Thr 15

Leu

Al a

Pro

Me t

Phe

Leu

Asn

Gly

Asn

Va 1

As n

Al a

Va 1

Tyr

Al a

20

25

30

HU 220 714 Bl

Ser

Ly s

Thr 35

Asn

Gin

Ile

Ser

Thr 40

Thr

Gin

Ly s

As n

Gin 45

Gin

Lys

Glu

Me t

As p 50

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu 55

Gly

Tyr

Phe

Lys 60

Gly

Lys

Asp

Phe

Ser 65

Asn

Leu

Thr

Me t

Phe 70

Al a

Pro

Thr

Arg

As p 75

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr 80

Asp

Gin

Thr

Al a 85

Asn

Lys

Leu

As p 90

Ly s

Gin

Gl n

Glu 95

Tyr

Gin

Ser

Ile

Arg 100

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile 105

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr 110

Gly

Asp

Phe

Thr

Phe 115

Asn

Leu

Ser

Glu

As p 120

Glu

Gin

Al a

Ile

Ile 125

Glu

Ile

Asn

Gly

Lys 130

Ile

Ser

Asn

Ly s 135

Gly

Lys

Glu

Ly s

Gin 140

Val

Va 1

Hi s

Leu

Glu 145

Ly s

Gly

Lys

Leu

Val 150

Pro

Ile

Ly s

Ile

Glu 155

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr 160

Lys

Phe

Asn

Ile

As p 165

Ser

Ly s

Thr

Phe

Lys 170

Glu

Leu

Ly s

Leu

Phe 175

Lys

Ile

Asp

Ser

Gin 180

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin 185

Val

Gin

Asp

Glu 190

Leu

Arg

Asn

Pro

Glu 195

Phe

Asn

Lys

Glu 200

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu 205

Al a

Ly s

Pro

Ser

Lys 210

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr 215

Gin

Xaa

Me t

Lys

Arg 220

Glu

Ile

Asp

Glu

Asp 225

Thr

Asp

Thr

As p

Gly 230

Asp

Ser

Ile

Pro

Asp 235

Leu

Trp

Glu

Asn 240

Gly

Tyr

Thr

Ile

Xa a 245

Asn

Arg

Ile

Al a

Val 250

Ly s

Trp

As p

Ser 255

Leu

Al a

Ser

Lys

Gly 260

Tyr

Thr

Lys

Phe

Va 1 265

Ser

As n

Pro

Leu

Glu 270

Ser

Hi s

Thr

Va 1

Gly 275

Asp

Pro

Tyr

Thr

As p 280

Tyr

Glu

Ly s

Al a

Al a 285

Arg

As p

Leu

Asp

Leu 290

Ser

Asn

Al a

Lys

Glu 295

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu 300

Val

Alá

Al a

Phe

Pro 305

Ser

Val

Asn

Va 1

Ser 310

Me t

Glu

Lys

Val

Ile 315

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu 320

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser 325

Val

Glu

Ser

Hi s

Ser 330

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser 335

Tyr

Thr

Asn

Thr

Glu 340

Gly

Al a

Ser

Val

Glu 345

Al a

Gly

Ile

Gly

Pro 350

Ly s

Gly

HU 220 714 Bl

Ile

Ser

Phe 355

Gly

Val

Ser

Val

Asn 360

Tyr

Gin

Hi s

Ser

Glu 365

Thr

Val

Al a

Gin

Glu 370

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr 375

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin 380

Phe

Asn

Thr

Alá

Ser 385

Al a

Gly

Tyr

Leu

Asn 390

Al a

Asn

Val

Arg

Tyr 395

Asn

Val

Gly

Thr 400

Gly

Al a

Ile

Tyr

As p 405

Va 1

Ly s

Pro

Thr

Thr 410

Ser

Phe

Val

Leu

Asn 415

Asn

Asp

Thr

Ile

Al a 420

Thr

Ile

Thr

Al a

Ly s 425

Ser

As n

Ser

Thr

Al a 430

Leu

Asn

Ile

Ser

Pro 435

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro 440

Ly s

Lys

Gly

Gin

Asn 445

Gly

Ile

Al a

Ile

Thr 450

Ser

Me t

Asp

Phe 455

Asn

Ser

Hi s

Pro

Ile 460

Thr

Leu

Asn

Ly s

Lys 465

Gin

Val

As p

Asn

Leu 470

Leu

As n

Asn

Ly s

Pro 475

Me t

Leu

Glu

Thr 480

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly 485

Val

Tyr

Ly s

Ile

Lys 490

As p

Thr

Hi s

Gly

Asn 495

Ile

Val

Thr

Gly

Gly 500

Glu

Trp

Asn

Gly

Va 1 505

Ile

Gin

Ile

Ly s 510

Al a

Lys

Thr

Al a

Ser 515

Ile

Val

As p

Asp 520

Gly

Glu

Arg

Val

Al a 525

Glu

Lys

Arg

Val

Al a 530

Al a

Lys

Asp

Tyr

Glu 535

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys 540

Thr

Pro

Ser

Leu

Thr 545

Leu

Lys

Asp

Al a

Leu 550

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro 555

Asp

Glu

Ile

Ly s

Glu 560

Ile

Glu

Gly

Leu

Leu 565

Tyr

Lys

Asn

Lys 570

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser 575

Ser

Val

Me t

Thr

Tyr 580

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr 585

Alá

Lys

Glu

Val

Thr 590

Ly s

Gin

Leu

Asn

Asp 595

Thr

Gly

Lys

Phe 600

Lys

Asp

Val

Ser

Hi s 605

Leu

Tyr

As p

Va 1

Ly s 610

Leu

Thr

Pro

Lys

Me t 615

Asn

Val

Thr

Ile

Lys 620

Leu

Ser

Ile

Leu

Tyr 625

As p

Asn

Al a

Glu

Ser 630

Asn

Asp

Asn

Ser

Ile 635

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn 640

Thr

Asn

Ile

Val

Ser 645

Gly

Asn

Gly 650

Lys

Gin

Tyr

Ser 655

Ser

Asn

Pro

As p 660

Al a

Asn

Leu

Thr

Leu 665

Asn

Thr

Asp

Al a

Gin 670

Glu

Lys

HU 220 714 Bl

Leu

Asn

Lys 675

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr 680

Ile

Ser

Leu

Tyr

Me t 685

Ly s

Ser

Glu

Lys

Asn 690

Thr

Gin

Cys

Glu

Ile 695

Thr

Ile

Asp

Gly

Glu 700

Ile

Tyr

Pro

Ile

Thr 705

Thr

Lys

Thr

Val

Asn 710

Val

Asn

Lys

Asp

Asn 715

Tyr

Ly s

Arg

Leu

Asp 720

Ile

Al a

Hi s

Asn 725

Ile

Lys

Ser

Asn

Pro 730

Ile

Ser

Leu

His 735

Ile

Lys

Thr

Asn

Asp 740

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe 745

Trp

As p

Ile

Ser 750

Ile

Thr

Asp

Val

Al a 755

Se r

Ile

Ly s

Pro

Glu 760

Asn

Leu

Thr

Asp

Ser 765

Glu

Ile

Ly s

Gin

Ile 770

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly 775

Ile

Lys

Leu

Glu

Asp 780

Gly

Ile

Leu

Ile

Asp 785

Lys

Ly s

Gly

Ile 790

Hi s

Tyr

Gly

Glu

Phe 795

1 le

Asn

Glu

Ala

Ser 800

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro 805

Leu

Pro

Asn

Tyr

Val 810

Thr

Ly s

Tyr

Glu

Val 815

Thr

Tyr

Ser

Glu 820

Leu

Gly

Pro

Asn

Val 825

Ser

As p

Thr

Leu

Glu 830

Ser

Asp

Lys

Ile

Tyr 835

Ly s

As p

Gly

Thr

Ile 840

Lys

Phe

As p

Phe

Thr 845

Ly s

Tyr

Ser

Lys

Asn 850

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe 855

Tyr

Asp

Ser

Gly

Leu 860

Asn

Trp

Asp

Phe

Lys 865

Ile

Asn

Al a

Ile

Thr 870

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu 875

Me t

Asn

Val

Phe

Hi s 880

Arg Tyr Asn Lys (2) Információ a 6. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 2004 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nincs (iii) Antiszensz: nincs (vi) Eredeti forrás:

(A) név/kulcs: CDS (B) elhelyezkedés: 1.. .2001 (C) azonosítási módszer: kísérleti (D) más információ: /termék=„80 kD VIP-1 protein”/bizonyíték=kísérleti

HU 220 714 Β1 (xi) Szekvencialeírás a 6. azonosító számú szekvenciához:

ATG

AAA

AGG

GAA

ATT

GAT

GAA

GAC

ACG

GAT

ACG

GAT

GGG

GAC

TCT

ATT

48

Me t 1

Lys

Arg

Glu

lle 5

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp 10

Thr

Asp

Gly

As p

Ser 15

lle

CCT

GAC

CTT

TGG

GAA

AAT

GGG

TAT

ACG

ATT

CAM

AAT

AGA

ATC

GCT

96

Pro

Asp

Leu

Trp 20

Glu

Asn

Gly

Tyr 25

Thr

lle

Xaa

Asn

Arg 30

lle

Al a

GTA

AAG

TGG

GAC

GAT

TCT

CTA

GCA

AGT

AAA

GGG

TAT

ACG

AAA

TTT

GTT

144

Val

Lys

Trp 35

Asp

As p

Ser

Leu

Al a 40

Ser

Ly s

Gly

Tyr

Thr 45

Ly s

Phe

Val

TCA

AAT

CCA

CTA

GAA

AGT

CAC

ACA

GTT

GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT

TAT

192

Ser

Asn 50

Pro

Leu

Glu

Ser

Hi s 55

Thr

Va 1

Gly

As p

Pro 60

Tyr

Thr

As p

Tyr

GAA

AAG

GCA

AGA

GAT

CTA

GAT

TTG

TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG

TTT

240

Glu 65

Ly s

Al a

Alá

Arg

As p 70

Leu

As p

Leu

Ser

Asn 75

Al a

Ly s

Glu

Thr

Phe 80

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

TTT

CCA

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

288

Asn

Pro

Leu

Val

Al a 85

Al a

Phe

Pro

Ser

Val 90

Asn

Val

Ser

Me t

Glu 95

Lys

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

AAT

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

336

Val

lle

Leu

Ser 100

Pro

Asn

Glu

As n

Leu 105

Ser

Asn

Ser

Val

Glu 110

Ser

Hi s

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

ACA

AAT

ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT

GAA

384

Ser

Thr 115

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr 120

Asn

Thr

Glu

Gly

Al a 125

Ser

Val

Glu

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

ATT

TCG

TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC

TAT

432

Al a

Gly 130

lle

Gly

Pro

Ly s

Gly 135

lle

Ser

Phe

Gly

Val 140

Ser

Val

Asn

Tyr

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA

GTT

GCA

CAA

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

480

Gin 145

Hi s

Ser

Glu

Thr

Val 150

Al a

Gin

Glu

Trp

Gly 155

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn 160

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

TCA

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

528

Thr

Ser

Gin

Phe

As n 165

Thr

Al a

Ser

Al a

Gly 170

Tyr

Leu

Asn

Al a

Asn 175

Val

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

GGT

GCC

ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

576

Arg

Tyr

Asn

Asn 180

Val

Gly

Thr

Gly

Alá 185

lle

Tyr

Asp

Val

Ly s 190

Pro

Thr

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

GAT

ACT

ATC

GCA

ACT

ATT

ACG

GCG

AAA

624

Thr

Ser

Phe 195

Val

Leu

Asn

Asp 200

Thr

lle

Alá

Thr

lle 205

Thr

Al a

Lys

TCT

AAT

TCT

ACA

GCC

TTA

AAT

ATA

TCT

CCT

GGA

GAA

AGT

TAC

CCG

AAA

672

Ser

Asn 210

Ser

Thr

Al a

Leu

Asn 215

lle

Ser

Pro

Gly

Glu 220

Ser

Tyr

Pro

Lys

AAA

GGA

CAA

AAT

GGA

ATC

GCA

ATA

ACA

TCA

ATG

GAT

TTT

AAT

TCC

720

Ly s 225

Gly

Gin

Asn

Gly

lle 230

Alá

lle

Thr

Ser

Me t 235

Asp

As p

Phe

Asn

Ser 240

HU 220 714 Bl

CAT Hi s

CCG Pro

ATT I le

ACA Thr

TTA Leu 245

AAT Asn

AAA Lys

CAA Gin

GTA Val 250

GAT AAT CTG CTA AAT AAT

768

As p

Asn

Leu

Asn 255

Asn

AAA

CCT

ATG

TTG

GAA

ACA

AAC

CAA

ACA

GAT

GGT

GTT

TAT

AAG

ATA

816

Lys

Pro

Me t

Me t 260

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin 265

Thr

As p

Gly

Val

Tyr 270

Lys

I le

AAA

GAT

ACA

CAT

GGA

AAT

ATA

GTA

ACT

GGC

GGA

GAA

TGG

AAT

GGT

GTC

864

Ly s

As p

Thr 275

Hi s

Gly

Asn

I le

Va 1 280

Thr

Gly

Glu

Trp 285

Asn

Gly

Val

ATA

CAA

ATC

AAG

GCT

AAA

ACA

GCG

TCT

ATT

GTG

GAT

GGG

912

I le

Gin 290

Gin

I le

Lys

Al a

Lys 295

Thr

Al a

Ser

I le

I le 300

Val

As p

Gly

GAA

CGT

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

GTA

GCG

GCA

AAA

GAT

TAT

GAA

AAT

CCA

960

Glu 305

Arg

Va 1

Al a

Glu

Ly s 310

Arg

Va 1

Al a

Ly s 315

As p

Tyr

Glu

Asn

Pro 320

GAA

GAT

AAA

ACA

CCG

TCT

TTA

ACT

TTA

AAA

GAT

GCC

CTG

AAG

CTT

TCA

1008

Glu

As p

Lys

Thr

Pro 325

Ser

Leu

Thr

Leu

Ly s 330

Asp

Al a

Leu

Ly s

Leu 335

Ser

TAT

CCA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

ATA

GAG

GGA

TTA

TAT

AAA

AAC

1056

Tyr

Pro

Asp

Glu 340

I le

Lys

Glu

I le

Glu 345

Gly

Leu

Tyr

Tyr 350

Ly s

Asn

AAA

CCG

ATA

TAC

GAA

TCG

AGC

GTT

ATG

ACT

TAC

TTA

GAT

GAA

AAT

ACA

1104

Lys

Pro

I le 355

Tyr

Glu

Ser

Val 360

Me t

Thr

Tyr

Leu

As p 365

Glu

Asn

Thr

GCA

AAA

GAA

GTG

ACC

AAA

CAA

TTA

AAT

GAT

ACC

ACT

GGG

AAA

TTT

AAA

1152

Al a

Ly s 370

Glu

Val

Thr

Lys

Gin 375

Leu

Asn

As p

Thr

Thr 380

Gly

Ly s

Phe

Ly s

GAT

GTA

AGT

CAT

TTA

TAT

GAT

GTA

AAA

CTG

ACT

CCA

AAA

ATG

AAT

GTT

1200

Asp 385

Val

Ser

Hi s

Leu

Tyr 390

Asp

Va 1

Ly s

Leu

Thr 395

Pro

Lys

Me t

Asn

Val 400

ACA

ATC

AAA

TTG

TCT

ATA

CTT

TAT

GAT

AAT

GCT

GAG

TCT

AAT

GAT

AAC

1248

Thr

I le

Ly s

Leu

Ser 405

I le

Leu

Tyr

As p

Asn 410

Al a

Glu

Ser

Asn

Asp 415

Asn

TCA

ATT

GGT

AAA

TGG

ACA

AAC

ACA

AAT

ATT

GTT

TCA

GGT

GGA

AAT

AAC

1296

Ser

I le

Gly

Lys 420

Trp

Thr

Asn

Thr

Asn 425

I le

Va 1

Ser

Gly

Gly 430

Asn

GGA

AAA

CAA

TAT

TCT

AAT

CCG

GAT

GCT

AAT

TTG

ACA

TTA

1344

Gly

Ly s

Lys 435

Gin

Tyr

Ser

Asn 440

Asn

Pro

As p

Al a

Asn 445

Leu

Thr

Leu

AAT

ACA

GAT

GCT

CAA

GAA

AAA

TTA

AAT

AAA

AAT

CGT

GAC

TAT

ATA

1392

Asn

Thr 450

As p

Al a

Gin

Glu

Ly s 455

Leu

Asn

Ly s

As n

Arg 460

As p

Tyr

I le

AGT

TTA

TAT

ATG

AAG

TCA

GAA

AAA

AAC

ACA

CAA

TGT

GAG

ATT

ACT

ATA

1440

Ser 465

Leu

Tyr

Me t

Ly s

Ser 470

Glu

Ly s

Asn

Thr

Gin 475

Cys

Glu

I le

Thr

I le 480

HU 220 714 Β1

GAT Asp

GGG GAG

ATT Ile

TAT CCG

ATC ACT ACA AAA ACA GTG AAT GTG

AAT Asn 495

AAA Lys

1488

Gly

Glu

Tyr 485

Pro

Ile

Thr

Lys 490

Thr

Val

Asn

Val

GAC

AAT

TAC

AAA

AGA

TTA

GAT

ATT

ATA

GCT

CAT

AAT

ATA

AAA

AGT

AAT

1536

Asp

Asn

Tyr

Ly s

Arg

Leu

As p

Ile

Al a

Hi s

Asn

Ile

Ly s

Ser

Asn

500

505

510

CCA

ATT

TCT

TCA

CTT

CAT

ATT

AAA

ACG

AAT

GAT

GAA

ATA

ACT

TTA

TTT

1584

Pro

Ile

Ser

Leu

Hi s

Ile

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe

515

520

525

TGG

GAT

ATT

TCT

ATA

ACA

GAT

GTA

GCA

TCA

ATA

AAA

CCG

GAA

AAT

1632

Trp

As p

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr

As p

Val

Alá

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

530

535

540

TTA

ACA

GAT

TCA

GAA

ATT

AAA

CAG

ATT

TAT

AGT

AGG

TAT

GGT

ATT

AAG

1680

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Ly s

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

TTA

GAA

GAT

GGA

ATC

CTT

ATT

GAT

AAA

GGT

GGG

ATT

CAT

TAT

GGT

1728

Leu

Glu

As p

Gly

Ile

Leu

Ile

As p

Ly s

Lys

Gly

Ile

Hi s

Tyr

Gly

565

570

575

GAA

TTT

ATT

AAT

GAA

GCT

AGT

TTT

AAT

ATT

GAA

CCA

TTG

CCA

AAT

TAT

1776

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Al a

Ser

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

580

585

590

GTG

ACC

AAA

TAT

GAA

GTT

ACT

TAT

AGT

GAG

TTA

GGA

CCA

AAC

GTG

1824

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

595

600

605

AGT

GAC

ACA

CTT

GAA

AGT

GAT

AAA

ATT

TAC

AAG

GAT

GGG

ACA

ATT

AAA

1872

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

610

615

620

TTT

GAT

TTT

ACC

AAA

TAT

AGT

AAA

AAT

GAA

CAA

GGA

TTA

TTT

TAT

GAC

1920

Phe

As p

Phe

Thr

Ly s

Tyr

Ser

Ly s

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

As p

625

630

635

640

AGT

GGA

TTA

AAT

TGG

GAC

TTT

AAA

ATT

AAT

GCT

ATT

ACT

TAT

GAT

GGT

1968

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

Ly s

Ile

Asn

Al a

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

645

650

655

AAA

GAG

ATG

AAT

GTT

TTT

CAT

AGA

TAT

AAT

AAA

TAG

2004

Lys

Glu

Me t

Asn

Val

Phe

Hi s

Arg

Tyr

Asn

Ly s

660

665

(2) Információ a 7. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 667 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás a 7. azonosító számú szekvenciához:

Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile 15 10 15

HU 220 714 Bl

Pro

Asp

Leu

Trp 20

Glu

Asn

Gly

Tyr 25

Thr

Ile

Xaa

Asn

Arg 30

Ile

Al a

Val

Ly s

Trp 35

As p

Asp

Ser

Leu

Alá 40

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr 45

Ly s

Phe

Val

Ser

Asn 50

Pro

Leu

Glu

Ser

Hi s 55

Thr

Val

Gly

As p

Pro 60

Tyr

Thr

As p

Tyr

Glu 65

Ly s

Al a

Arg

Asp 70

Leu

As p

Leu

Ser

Asn 75

Al a

Lys

Glu

Thr

Phe 80

Asn

Pro

Leu

Val

Al a 85

Al a

Phe

Pro

Ser

Val 90

As n

Val

Ser

Me t

Glu 95

Ly s

Val

Ile

Leu

Ser 100

Pro

Asn

Glu

As n

Leu 105

Ser

As n

Ser

Va 1

Glu 110

Ser

Hi s

Ser

Thr 115

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr 120

Asn

Thr

Glu

Gly

Al a 125

Ser

Val

Glu

Al a

Gly 130

Ile

Gly

Pro

Ly s

Gly 135

I 1 e

Ser

Phe

Gly

Val 140

Ser

Va 1

Asn

Tyr

Gin 145

Hi s

Ser

Glu

Thr

Va 1 150

Al a

Gin

Glu

Trp

Gly 155

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn 160

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn 165

Thr

Al a

Ser

Al a

Gly 170

Tyr

Leu

Asn

Al a

Asn 175

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn 180

Val

Gly

Thr

Gly

Al a 185

Ile

Tyr

As p

Val

Ly s 190

Pro

Thr

Ser

Phe 195

Val

Leu

Asn

As p 200

Thr

Ile

Al a

Thr

Ile 205

Thr

Alá

Ly s

Ser

As n 210

Ser

Thr

Al a

Leu

Asn 215

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu 220

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys 225

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile 230

Al a

Ile

Thr

Ser

Me t 235

Asp

As p

Phe

Asn

Ser 240

Hi s

Pro

Ile

Thr

Leu 245

Asn

Lys

Ly s

Gin

Val 250

As p

Asn

Leu

Asn 255

Asn

Lys

Pro

Me t

Me t 260

Leu

Glu

Thr

As n

Gin 265

Thr

As p

Gly

Val

Tyr 270

Lys

Ile

Lys

Asp

Thr 275

Hi s

Gly

Asn

Ile

Val 280

Thr

Gly

Glu

Trp 285

Asn

Gly

Val

Ile

Gin 290

Gin

Ile

Lys

Al a

Lys 295

Thr

Al a

Ser

Ile

Ile 300

Val

As p

Asp

Gly

Glu 305

Arg

Val

Al a

Glu

Lys 310

Arg

Val

Al a

Lys 315

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro 320

Glu

As p

Lys

Thr

Pro 325

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys 330

Asp

Al a

Leu

Ly s

Leu 335

Ser

HU 220 714 Bl

Tyr

Pro

Asp

Glu 340

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu 345

Gly

Leu

Tyr

Tyr 350

Ly s

Asn

Lys

Pro

Ile 355

Tyr

Glu

Ser

Val 360

Me t

Thr

Tyr

Leu

Asp 365

Glu

Asn

Thr

Al a

Ly s 370

G1 u

Val

Thr

Lys

Gin 375

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr 380

Gly

Ly s

Phe

Lys

Asp 385

Val

Ser

Hi s

Leu

Tyr 390

Asp

Va 1

Ly s

Leu

Thr 395

Pro

Lys

Me t

Asn

Val 400

Thr

Ile

Lys

Leu

Ser 405

Ile

Leu

Tyr

Asp

Asn 410

Al a

Glu

Ser

Asn

As p 415

Asn

Ser

Ile

Gly

Ly s 420

Trp

Thr

Asn

Thr

Asn 425

Ile

Val

Ser

Gly

Gly 430

Asn

Gly

Ly s

Lys 435

Gin

Tyr

Ser

Asn 440

Asn

Pro

Asp

Al a

Asn 445

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr 450

As p

Al a

Gin

Glu

Ly s 455

Leu

As n

Ly s

Asn

Arg 460

Asp

Tyr

Ile

Ser 465

Leu

Tyr

Me t

Ly s

Ser 470

Glu

Ly s

Asn

Thr

Gin 475

Cy s

Glu

Ile

Thr

Ile 480

As p

Gly

Glu

Ile

Tyr 485

Pro

Ile

Thr

Lys 490

Thr

Val

Asn

Va 1

Asn 495

Lys

Asp

Asn

Tyr

Lys 500

Arg

Leu

Asp

Ile

Ile 505

Alá

Hi s

Asn

Ile

Ly s 510

Ser

Asn

Pro

Ile

Ser 515

Ser

Leu

Hi s

Ile

Lys 520

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile 525

Thr

Leu

Phe

Trp

As p 530

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr 535

As p

Val

Al a

Ser

Ile 540

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu 545

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile 550

Lys

Gin

Ile

Tyr

Ser 555

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys 560

Leu

G1 u

Asp

Gly

Ile 565

Leu

Ile

Asp

Ly s

Ly s 570

Gly

Ile

Hi s

Tyr 575

Gly

Glu

Phe

Ile

Asn 580

Glu

Al a

Ser

Phe

Asn 585

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro 590

Asn

Tyr

Val

Thr

Lys 595

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr 600

Ser

Glu

Leu

Gly 605

Pro

Asn

Val

Ser

Asp 610

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp 615

Ly s

Ile

Tyr

Ly s

Asp 620

Gly

Thr

Ile

Ly s

Phe 625

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr 630

Ser

Lys

Asn

Glu

G1 n 635

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp 640

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp 645

Asp

Phe

Ly s

Ile

Asn 650

Alá

Ile

Thr

Tyr

As p 655

Gly

HU 220 714 Bl

Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys 660 665 (2) Információ a 8. azonosító számú szekvenciához:

(i) szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 16 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmentum típusa: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1...16 (D) más információ: /megjegyzés=„az AB78 törzsből tisztított protein N-terminális szekvenciája” (xi) Szekvencialeírás a 8. azonosító számú szekvenciára:

Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly Asp Ser Ile Pro 15 10 15 (2) Információ a 9. azonosító számú szekvenciáról:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 21 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nincs (iii) Antiszensz: nincs (ix) Jellemzők:

(A) név/kulcs: vegyes vonások (B) elhelyezkedés: 1...21 (D)más információ: /megjegyzés=„Oligonukleotid próba a 8. azonosító számú szekvencia 3-9 aminosavai alapján, a Bacillus thüringiensis kodon alkalmazásával” (xi) Szekvencialeírás: 9. azonosító számú szekvencia:

GAAATTGATC AAGATACNGA T (2) Információ a 10. azonosító számú szekvenciáról:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 14 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus thüringiensis (B) törzs: AB88 (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1...14 (D)más információ: /megjegyzés=„a 23 anioncserés frakcióként (kisebb) ismert peptid N-terminális aminosavszekvenciája/

HU 220 714 Bl (xi) Szekvencialeírás a 10. azonosító számú szekvenciához:

Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa 1 5 10 (2) Információ all. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 13 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus thüringiensis (B) törzs: AB88 (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1...13 (D) más információ: /megjegyzés=„a 23 anioncserés frakcióként (kisebb) ismert peptid N-terminális aminosavszekvenciája (xi) Szekvencialeírás all. azonosító számú szekvenciához:

Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa

5 10 (2) Információ a 12. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 14 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti fonás:

(A) szervezet: Bacillus thüringiensis (B) törzs: AB88 (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1...14 (D) más információ: /megjegyzés: „N-terminális szekvenciája a 80 kD-os, Agrotis ipsilonnal szemben aktív VIP-nek”/ (xi) Szekvencialeírás a 12. azonosító számú szekvenciához:

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro

5 10 (2) Információ a 13. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 15 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus thüringiensis (B) törzs: AB88

HU 220 714 Bl (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1...15 (D) más információ: /megjegyzés: „N-terminális aminosavszekvenciája a 35 kD-os, Agrotis ipsilonnal szemben aktív VIP-nek”/ (xi) Szekvencialeírás a 13. azonosító számú szekvenciához:

Alá Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr Ile Val Pro 15 10 15 (2) Információ a 14. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 9 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus thuringiensis (ix) Jellemző:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1.. .9 (D) más információ: /megjegyzés: „N-terminális szekvenciája a 130 kD-os delta-endotoxinnak”/ (xi) Szekvencialeírás a 14. azonosító számú szekvenciára:

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu 1 5 (2) Információ a 15. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 9 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (ix) Jellegzetességek:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1... 9 (D) más információ: /megjegyzés: „N-terminális aminosavszekvenciája a 80 kD-os delta-endotoxinnak/ (xi) Szekvencialeírás a 15. azonosító számú szekvenciához:

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu

5 (2) Információ a 16. azonosításiszámú szekvenciáról:

(A) hosszúság: 11 aminosav (B) típus: aminosav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmenstípus: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) szervezet: Bacillus thuringiensis

HU 220 714 Bl (ix) Jellemző:

(A) név/kulcs: peptid (B) elhelyezkedés: 1... 11 (D) más információ: /megjegyzés: „a 60 kD-os delta-endotoxin N-terminális szekvenciája”/ (xi) Szekvencialeírás a 16. azonosító számú szekvenciára:

Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile

5 10 (2) Információ a 17. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 2655 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nincs (iii) Antiszensz: nincs (xi) Szekvencialeírás a 17. azonosító számú szekvenciára:

ATGAAGAACA	TGAAGAAGAA	GCTGGCCAGC	GTGGTGACCT	GCACCCTGCT	GGCCCCCATG	60
TTCCTGAACG	GCAACGTGAA	CGCCGTGTAC	GCCGACAGCA	AGACCAACCA	GATCAGCACC	120
ACCCAGAAGA	ACCAGCAGAA	GGAGATGGAC	CGCAAGGGCC	TGCTGGGCTA	CTACTTCAAG	130
GGCAAGGACT	TCAGCAACCT	GACCATGTTC	GCCCCCACGC	GTGACAGCAC	CCTGATCTAC	240
GACCAGCAGA	CCGCCAACAA	GCTGCTGGAC	AAGAAGCAGC	AGGAGTACCA	GAGCATCCGC	300
TGGATCGGCC	TGATCCAGAG	CAAGGAGACC	GGCGACTTCA	CCTTCAACCT	GAGCGAGGAC	360
GAGCAGGCCA	TCATCGAGAT	CAACGGCAAG	ATCATCAGCA	ACAAGGGCAA	GGAGAAGCAG	420
GTGGTGCACC	TGGAGAAGGG	CAAGCTGGTG	CCCATCAAGA	TCGAGTACCA	GAGCGACACC	480
AAGTTCAACA	TCGACAGCAA	GACCTTCAAG	GAGCTGAAGC	TTTTCAAGAT	CGACAGCCAG	540
AACCAGCCCC	AGCAGGTGCA	GCAGGACGAG	CTGCGCAACC	CCGAGTTCAA	CAAGAAGGAG	600
AGCCAGGAGT	TCCTGGCCAA	GCCCAGCAAG	ATCAACCTGT	TCACCCAGCA	GATGAAGCGC	660
GAGATCGACG	AGGACACCGA	CACCGACGGC	GACAGCATCC	CCGACCTGTG	GGAGGAGAAC	720
GGCTACACCA	TCCAGAACCG	CATCGCCGTG	AAGTGGGACG	ACAGCCTGGC	TAGCAAGGGC	780
TACACCAAGT	TCGTGAGCAA	CCCCCTGGAG	AGCCACACCG	TGGGCGACCC	CTACACCGAC	840
TACGAGAAGG	CCGCCCGCGA	CCTGGACCTG	AGCAACGCCA	AGGAGACCTT	CAACCCCCTG	900
GTGGCCGCCT	TCCCCAGCGT	GAACGTGAGC	ATGGAGAAGG	TGATCCTGAG	CCCCAACGAG	960
AACCTGAGCA	ACAGCGTGGA	GAGCCACTCG	AGCACCAACT	GGAGCTACAC	CAACACCGAG	1020
GGCGCCAGCG	TGGAGGCCGG	CATCGGTCCC	AAGGGCATCA	GCTTCGGCGT	GAGCGTGAAC	1080
TACCAGCACA	GCGAGACCGT	GGCCCAGGAG	TGGGGCACCA	GCACCGGCAA	CACCAGCCAG	1140
TTCAACACCG	CCAGCGCCGG	CTACCTGAAC	GCCAACGTGC	GCTACAACAA	CGTGGGCACC	1200
GGCGCCATCT	ACGACGTGAA	GCCCACCACC	AGCTTCGTGC	TGAACAACGA	CACCATCGCC	1260

HU 220 714 Bl

ACCATCACCG CCAAGTCGAA TTCCACCGCC

AAGAAGGGCC AGAACGGCAT CGCCATCACC

ACCCTGAACA AGAAGCAGGT GGACAACCTG

AACCAGACCG ACGGCGTCTA CAAGATCAAG

GAGTGGAACG GCGTGATCCA GCAGATCAAG

GGCGAGCGCG TGGCCGAGAA GCGCGTGGCC

ACCCCCAGCC TGACCCTGAA GGACGCCCTG

ATCGAGGGCC TGCTGTACTA CAAGAACAAG

CTAGACGAGA ACACCGCCAA GGAGGTGACC

AAGGACGTGA GCCACCTGTA CGACGTGAAG

CTGAGCATCC TGTACGACAA CGCCGAGAGC

ACCAACATCG TGAGCGGCGG CAACAACGGC

GCCAACCTGA CCCTGAACAC CGACGCCCAG

ATCAGCCTGT ACATGAAGAG CGAGAAGAAC

ATATACCCCA TCACCACCAA GACCGTGAAC

ATCATCGCCC ACAACATCAA GAGCAACCCC

GAGATCACCC TGTTCTGGGA CGACATATCG

AACCTGACCG ACAGCGAGAT CAAGCAGATA

GGCATCCTGA TCGACAAGAA GGGCGGCATC

TTCAACATCG AGCCCCTGCA GAACTACGTG

CTGGGCCCCA ACGTGAGCGA CACCCTGGAG

AAGTTCGACT TCACCAAGTA CAGCAAGAAC

AACTGGGACT TCAAGATCAA CGCCATCACC

CGCTACAACA AGTAG (2) Információ a 18. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) hosszúság: 2010 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) lánctípus: egyfonalas (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nincs (iii) Antiszensz: nincs

CTGAACATCA	GCCCCGGCGA	GAGCTACCCC	1320
AGCATGGACG	ACTTCAACAG	CCACCCCATC	1380
CTGAACAACA	AGCCCATGAT	GCTGGAGACC	1440
GACACCCACG	GCAACATCGT	GACCGGCGGC	1500
GCCAAGACCG	CCAGCATCAT	CGTCGACGAC	1560
GCCAAGGACT	ACGAGAACCC	CGAGGACAAG	1620
AAGCTGAGCT	ACCCCGACGA	GATCAAGGAG	1680
CCCATCTACG	AGAGCAGCGT	GATGACCTAT	1740
AAGCAGCTGA	ACGACACCAC	CGGCAAGTTC	1800
CTGACCCCCA	AGATGAACGT	GACCATCAAG	1860
AACGACAACA	GCATCGGCAA	GTGGACCAAC	1920
AAGAAGCAGT	ACAGCAGCAA	CAACCCCGAC	1980
GAGAAGCTGA	ACAAGAACCG	CGACTACTAC	2040
ACCCAGTGCG	AGATCACCAT	CGACGGCGAG	2100
GTGAACAAGG	ACAACTACAA	GCGCCTGGAC	2160
ATCAGCAGCC	TGCACATCAA	GACCAACGAC	2220
ATTACCGACG	TCGCCAGCAT	CAAGCCCGAG	2280
TACAGTCGCT	ACGGCATCAA	GCTGGAGGAC	2340
CACTACGGCG	AGTTCATCAA	CGAGGCCAGC	2400
ACCAAGTACG	AGGTGACCTA	CAGCAGCGAG	2460
AGCGACAAGA	TTTACAAGGA	CGGCACCATC	2520
GAGCAGGGCC	TGTTCTACGA	CAGCGGCCTG	2580
TACGACGGCA	AGGAGATGAA	CGTGTTCCAC	2640 2655

HU 220 714 Bl (xi) Szekvencialeírás a 18. azonosító számú szekvenciára:

GGATCCATGA	AGCGCGAGAT	CGACGAGGAC	ACCGACACCG	ACGGCGACAG	CATCCCCGAC	60
CTGTGGGAGG	AGAACGGCTA	CACCATCCAG	AACCGCATCG	CCGTGAAGTG	GGACGACAGC	120
CTGGCTAGCA	AGGGCTACAC	CAAGTTCGTG	AGCAACCCCC	TGGAGAGCCA	CACCGTGGGC	180
GACCCCTACA	CCGACTACGA	GAAGGCCGCC	CGCGACCTGG	ACCTGAGCAA	CGCCAAGGAG	240
ACCTTCAACC	CCCTGGTGGC	CGCCTTCCCC	AGCGTGAACG	TGAGCATGGA	GAAGGTGATC	300
CTGAGCCCCA	ACGAGAACCT	GAGCAACAGC	GTGGAGAGCC	ACTCGAGCAC	CAACTGGAGC	360
TACACCAACA	CCGAGGGCGC	CAGCGTGGAG	GCCGGCATCG	GTCCCAAGGG	CATCAGCTTC	420
GGCGTGAGCG	TGAACTACCA	GCACAGCGAG	ACCGTGGCCC	AGGAGTGGGG	CACCAGCACC	480
GGCAACACCA	GCCAGTTCAA	CACCGCCAGC	GCCGGCTACC	TGAACGCCAA	CGTGCGCTAC	540
AACAACGTGG	GCACCGGCGC	CATCTACGAC	GTGAAGCCCA	CCACCAGCTT	CGTGCTGAAC	600
AACGACACCA	TCGCCACCAT	CACCGCCAAG	TCGAATTCCA	CCGCCCTGAA	CATCAGCCCC	660
GGCGAGAGCT	ACCCCAAGAA	GGGCCAGAAC	GGCATCGCCA	TCACCAGCAT	GGACGACTTC	720
AACAGCCACC	CCATCACCCT	GAACAAGAAG	CAGGTGGACA	ACCTGCTGAA	CAACAAGCCC	780
ATGATGCTGG	AGACCAACCA	GACCGACGGC	GTCTACAAGA	TCAAGGACAC	CCACGGCAAC	840
ATCGTGACCG	GCGGCGAGTG	GAACGGCGTG	ATCCAGCAGA	TCAAGGCCAA	GACCGCCAGC	900
ATCATCGTCG	ACGACGGCGA	GCGCGTGGCC	GAGAAGCGCG	TGGCCGCCAA	GGACTACGAG	960
AACCCCGAGG	ACAAGACCCC	CAGCCTGACC	CTGAAGGACG	CCCTGAAGCT	GAGCTACCCC	1020
GACGAGATCA	AGGAGATCGA	GGGCCTGCTG	TACTACAAGA	ACAAGCCCAT	CTACGAGAGC	1080
AGCGTGATGA	CCTATCTAGA	CGAGAACACC	GCCAAGGAGG	TGACCAAGCA	GCTGAACGAC	1140
ACCACCGGCA	AGTTCAAGGA	CGTGAGCCAC	CTGTACGACG	TGAAGCTGAC	CCCCAAGATG	1200
AACGTGACCA	TCAAGCTGAG	CATCCTGTAC	GACAACGCCG	AGAGCAACGA	CAACAGCATC	1260
GGCAAGTGGA	CCAACACCAA	CATCGTGAGC	GGCGGCAACA	ACGGCAAGAA	GCAGTACAGC	1320
AGCAACAACC	CCGACGCCAA	CCTGACCCTG	AACACCGACG	CCCAGGAGAA	GCTGAACAAG	1380
AACCGCGACT	ACTACATCAG	CCTGTACATG	AAGAGCGAGA	AGAACACCCA	GTGCGAGATC	1440
ACCATCGACG	GCGAGATATA	CCCCATCACC	ACCAAGACCG	TGAACGTGAA	CAAGGACAAC	1500
TACAAGCGCC	TGGACATCAT	CGCCCACAAC	ATCAAGAGCA	ACCCCATCAG	CAGCCTGCAC	1560
ATCAAGACCA	ACGACGAGAT	CACCCTGTTC	TGGGACGACA	TATCGATTAC	CGACGTCGCC	1620
AGCATCAAGC	CCGAGAACCT	GACCGACAGC	GAGATCAAGC	AGATATACAG	TCGCTACGGC	1680
ATCAAGCTGG	AGGACGGCAT	CCTGATCGAC	AAGAAGGGCG	GCATCCACTA	CGGCGAGTTC	1740
ATCAACGAGG	CCAGCTTCAA	CATCGAGCCC	CTGCAGAACT	ACGTGACCAA	GTACGAGGTG	1800

HU 220 714 Bl

ACCTACAGCA GCGAGCTGGG CCCCAACGTG AGCGACACCC TGGAGAGCGA CAAGATTTAC 1860

AAGGACGGCA CCATCAAGTT CGACTTCACC AAGTACAGCA AGAACGAGCA GGGCCTGTTC 1920

TACGACAGCG GCCTGAACTG GGACTTCAAG ATCAACGCCA TCACCTACGA CGGCAAGGAG 1980

ATGAACGTGT TCCACCGCTA CAACAAGTAG

Claims

1. Egy tisztított Bacillus törzs, amely vegetatív fejlődési szakaszában folyékony tápközegből izolálható peszticid fehérjét termel, ahol a fehérjét egy olyan nukleotidszekvencia kódolja, amely az 1., 4., 6., 9., 17. vagy

18. azonosító számon megadott nukleotidszekvencia egyikével azonos, vagy standard körülmények között azzal hibridizál, vagy ahol ez a fehérje a 2., 3., 5., 7., 8., vagy 10-16. azonosító számon megadott fehérjék ellen termelt antitestekkel keresztreakcióba lép.

2. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely all. táblázatban felsorolt Bacillus fajok egyikébe tartozik.

3. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely rovarok, gombák, baktériumok, fonalférgek, kukacok, atkák, protozoon kórokozók, és állatok parazitái közül választott kártevők elpusztítására alkalmas fehéijét termel.

4. A 3. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Siphonaptera vagy Trichoptera rendbe tartozó rovarok elpusztítására alkalmas fehérjét termel.

5. A 4. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely a bogárfajok (Coleoptera) közül egy Diabrotica faj elpusztítására alkalmas fehérjét termel.

6. Az 5. igénypont szerinti Bacillus törzs, ahol a Diabrotica faj Diabrotica virgifera virgifera vagy Diabrotica longicomis barberi.

7. A 4. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely a lepkefajok (Lepidoptera) közül egy Agrotis faj elpusztítására alkalmas fehérjét termel.

8. A 7. igénypont szerinti Bacillus törzs, ahol az Agrotis faj Agrotis ipsilon.

9. A 2. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely Bacillus cereus.

10. A 9. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely NRRL B-21058 deponálási számú Bacillus cereus.

11. A 2. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely Bacillus thuringiensis.

12. A 11. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely NRRL B-21060 deponálási számú Bacillus thuringiensis.

13. A 2. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely 30 kD vagy nagyobb molekulatömegű fehérjét termel.

14. A 13. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely körülbelül 60 és körülbelül 100 kD közötti molekulatömegű fehérjét termel.

15. A 14. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely körülbelül 80 kD molekulatömegű fehérjét termel.

10

16. A 15. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely a

7. azonosító számon megadott szekvenciájú fehérjét termel.

17. A 14. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely körülbelül 100 kD molekulatömegű fehérjét termel.

15

18. A 17. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az 5. azonosító számon megadott szekvenciájú fehérjét termel.

19. Bacillus fajok vegetatív fejlődési szakaszában izolálható, gyakorlatilag tiszta peszticid fehérje vagy

20 módosított peszticid fehérjék és azok aktív fragmentumai, ahol ez a fehérje folyékony tápközegből izolálható, és ahol a fehérjét egy olyan nukleotidszekvencia kódolja, amely az 1.,4.,6.,9.,17. vagy 18. azonosító számon megadott nukleotidszekvencia egyikével azonos,

25 vagy standard körülmények között azzal hibridizál, vagy ahol ez a fehérje a 2., 3., 5., 7., 8., vagy 10-16. azonosító számon megadott fehérjék ellen termelt antitestekkel keresztreakcióba lép.

20. A 19. igénypont szerinti peszticid fehérje,

30 amelynek peszticid tulajdonságait egy kiegészítő anyag fokozza.

21. A 19. igénypont szerinti peszticid fehéqe, amely all. táblázaton felsorolt Bacillus fajok egyikének vegetatív fejlődési szakaszában izolálható.

35

22. A 21. igénypont szerinti peszticid fehéqe, amely a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Siphonaptera vagy Trichoptera rendbe tartozó rovarok elpusztítására al40 kalmas.

23. A 22. igénypont szerinti peszticid fehérje, amely a bogárfajok közül egy Diabrotica faj elpusztítására alkalmas.

24. A 23. igénypont szerinti peszticid fehéqe, ahol a 45 Diabrotica faj Diabrotica virgifera virgifera vagy Diabrotica longicomis barberi.

25. A 22. igénypont szerinti peszticid fehérje, amely a lepkefajok közül egy Agrotis faj elpusztítására alkalmas.

26. A 25. igénypont szerinti peszticid fehérje, ahol ahol az Agrotis faj Agrotis ipsilon.

27. A 19. igénypont szerinti peszticid fehérje, ahol a Bacillus törzs Bacillus cereus.

28. A 27. igénypont szerinti peszticid fehéqe, ahol a Bacillus törzs NRRL B-21058 deponálási számú Bacillus cereus.

29. A 19. igénypont szerinti peszticid fehéqe, ahol a Bacillus törzs Bacillus thuringiensis.

30. A 29. igénypont szerinti peszticid fehéqe, amely az NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225,

HU 220 714 BI

NRRL B-21226 vagy az NRRL B-21227 deponálási számú Bacillus thuringiensis-törzs vegetatív fejlődési szakaszában izolálható.

31. A 19. igénypont szerinti peszticid fehérje, amelynek molekulatömege 30 kD vagy nagyobb.

32. A 31. igénypont szerinti peszticid fehéije, amelynek molekulatömege körülbelül 60 és körülbelül 100 kD közötti.

33. A 32. igénypont szerinti peszticid fehéije, amelynek molekulatömege körülbelül 80 kD.

34. A 33. igénypont szerinti peszticid fehéije, amelynek szekvenciája a 7. azonosító számon megadott.

35. A 32. igénypont szerinti peszticid fehéije, amelynek szekvenciája az 5. azonosító számon megadott.

36. A 19. igénypont szerinti peszticid fehéije, amely egy, a 10. vagy 11. azonosító számon megadott N-terminális szekvenciát tartalmaz.

37. Egy izolált nukleotidszekvencia, amely a 19. igénypont szerinti fehéijét kódolja.

38. Egy izolált nukleotidszekvencia, amely a 34. igénypont szerinti fehéijét kódolja.

39. Egy izolált nukleotidszekvencia, amely a 35. igénypont szerinti fehéijét kódolja.

40. Egy izolált nukleotidszekvencia, amely a 35. igénypont szerinti fehéijét kódolja.

41. A 37. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely valamilyen növényben végbemenő expresszió szempontjából optimalizált.

42. A 41. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, ahol a növény kukorica, szójabab, gyapot, búza, napraforgó, paradicsom, burgonya vagy olajrepce.

43. A 38. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely egy növényben végbemenő expresszió szempontjából optimalizált.

44. A 43. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, ahol a növény kukorica, szójabab, gyapot, búza, napraforgó, paradicsom, burgonya vagy olajrepce.

45. A 39. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely valamilyen növényben végbemenő expresszió szempontjából optimalizált.

46. A 45. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely a 18. azonosító számon megadott.

47. A 40. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely valamilyen mikroorganizmusban végbemenő expresszió szempontjából optimalizált.

48. A 47. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely a 17. azonosító számon megadott.

49. A 37. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely egy mikroorganizmusban végbemenő expresszió szempontjából optimalizált.

50. A 49. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, ahol a mikroorganizmus Bacillus, Pseudomonas, Saccharomyces, Clavibacter, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xantomonas, Streptomyces, Agrobacterium, vagy a rovarok patogén vírusai, a gombák, a protozoonok vagy a nematódák közé tartozik.

51. Egy, a 37-48. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciával stabilan transzformált növény.

52. A 49. igénypont szerinti növény, amely kukorica.

53. A 37. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely lényegében az E. coli P5-4 klón NRRL B-21059 deponálási számú szekvenciája.

54. A 37. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely lényegében az E. coli P5-4 klón NRRL B-21061 deponálási számú szekvenciája.

55. A 37. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely az NRRL B-21222 deponálási számú E. coli pCIB 6022 klón részét képezi.

56. Az 54. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely az 1. azonosító számú szekvencián belül VIP-1 néven megadott.

57. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21225 deponálási számú AB88 törzs.

58. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21227 deponálási számú AB289 törzs.

59. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21229 deponálási számú AB294 törzs.

60. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21226 deponálási számú AB359 törzs.

61. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21228 deponálási számú AB59 törzs.

62. Az 1. igénypont szerinti Bacillus törzs, amely az NRRL B-21230 deponálási számú AB256 törzs.

63. Eljárás a 19. igénypont szerinti peszticid fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy

a) Bacillus sejteket szaporítunk egy táptalajon

b) a vegetatív növekedés folyamán eltávolítjuk a sejteket

c) a peszticid fehérjét izoláljuk a folyékony tápközegből és tisztítjuk.