RO117111B1 - Proteina pesticida si secventa de nucleotide, care o codifica - Google Patents

Abstract

Inventia de fata se refera la o proteina pesticida si secventa de nucleotide, care o codifica, si prezinta utilizare pentru combaterea daunatorilor. Astfel, proteina conform inventiei este proteina pesticida, izolata in timpul fazei de crestere vegetativa a tulpinilor de Bacillus cereus si Bacillus thuringiensis sau a fragmentelor analoge si active ale acestora si care este capabila sa distruga daunatori selectati dintre insecte, fungi, bacterii, nematode, protozoare patogene, paraziti ai animalelor si altele asemenea, in special insecte din clasele: Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera sau Trichoptera, proteina are secventa de aminoacizi redata in SEQ.ID.NO:7, cu greutate moleculara de 60...100 kDa, purificata substantial si este izolata, in perioada de dinaintea inceperii sporularii, din tulpina Bacillus cereus AB78 cu numarul de acces NRRL B-21058, sau este izolata, inaintea producerii proteinei insecticide cristalina, din tulpinile de Bacillus thuringiensis AB6 avand numarul de acces NRRL B-21060, Bacillus thuringiensis AB88 AB289, AB294 si AB359 avand numerele deacces, NRRL B-21225, NRRL B-21227, NRRL B-21229, NRRL B-21226, precum si tulpinile Bacillus thuringiensis AB59 si AB256 cu numerele de acces NRRL B-21228 si respectiv B-21230, toate tulpinile fiind depuse la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, US.

Description

Invenția de față se referă la o proteină pesticidă și secvență de nucleotide care o codifică, folosită pentru combaterea dăunătorilor, insecte sau plante.

Insectele dăunătoare sunt un factor major care determină pierderea unor cantități însemnate de recolte agricole pe plan mondial. Pesticide chimice cu spectru larg au fost folosite din plin pentru a combate sau eradica dăunătorii agriculturii. Există totuși un interes substanțial pentru dezvoltarea unor pesticide noi alternative, eficace.

Pesticidele de natură microbiană au jucat un rol important ca alternativă la combaterea chimică a dăunătorilor. Cel mai des întrebuințat produs de natură microbiană se bazează pe bacteria Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis este un spor gram-pozitiv care produce o proteină insecticidă cristalină (cunoscută sub denumirea ICP)

Sunt cunoscute numeroase tipuri de Bacillus thuringiensis care produc mai mult de 25 tipuri de proteină insecticidă cristalină înrudite, dar diferite. Proteinele insecticide cristaline formate de Bacillus thuringiensis sunt toxice pentru larvele anumitor insecte din clasele Lepidoptera, Diptera și Coleoptera. în general, când proteina insecticidă cristalină este ingerată de o insectă, cristalul este dizolvat și transformat în proporție de 50% într-o substanță toxică de către sistemul digestiv al insectei. Cu toate acestea, nici una din proteinele insecticide cristaline cunoscute a fi active împotriva larvelor coleoptere n-au demonstrat efecte semnificative asupra speciei Diabrotica, în special, Diabrotica virgifera virgifer, viermele vestic de rădăcină al porumbului (WCRW) sau Diabrotica longicornus barberi, viermele nordic de rădăcină al porumbului.

Bacillus thuringiensis este rudă apropiată cu Bacillus cereus (Bc). 0 caracteristică majoră ce îi diferențiază este lipsa unui cristal parasporic în Bacillus cereus.

Bacillus cereus este o bacterie larg răspândită care se găsește de obicei în sol și a fost izolată dintr-o varietate de alimente și medicamente. Organismul a fost implicat în degradarea alimentelor.

Cu toate că Bacillus thuringiensis a fost foarte folositor în combaterea insectelor dăunătoare, se simte nevoia lărgirii numărului de agenți biologici potențiali pentru combaterea dăunătorilor în agricultură.

Datorită faptului că s-a recunoscut că proteinele cu efecte pesticide pot fi izolate din faza de creștere vegetativă a BacilIusiAui, alte tulpini pot fi izolate prin tehnici standardizate și testată acțiunea lor împotriva anumitor plante și insecte dăunătoare. în general, tulpinile de Bacillus pot fi izolate din orice eșantion al mediului înconjurător, inclusiv sol, plante, insecte, praf de siloz și altele, prin metode cunoscute în tehnică. A se vedea, de exemplu, Travers et al. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:1263-1266; Saleh et al.(1969) Can J. Microbiol. 15:1101-1104; DeLucca et al.(1981) Can J. Microbiol. 27:865-870; și Norris et al.(1981) „The geera Bacillus and Sporolactobacillus, în Starr et al.(eds.), The Prokariotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, Voi. II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. După izolare, tulpinile pot fi testate pentru acțiunea pesticidă în timpul creșterii lor vegetative. în acest mod, pot fi identificate noi proteine și tulpini de Bacillus cu efecte pesticide.

Procedee pentru izolarea proteinelor sunt cunoscute în stadiul tehnicii. în general, proteinele pot fi purificate prin cromatografie convențională, care include filtrarea gelului, schimbul de ioni, și cromatografie de imunoafinitate, prin cromatografie în fază

RO 117111 Bl lichidă de înaltă performanță, cum ar fi cromatografia în fază lichidă de înaltă performanță cu fază inversată, cromatografie lichidă de înaltă performanță cu schimb de ioni, filtrare cromatografică de înaltă performanță prin fază staționară de mărime cunoscută, cromatofocalizare de înaltă performanță și cromatografie prin interacțiune 50 hidrofobă, etc, separare prin electroforeză, cum ar fi, gelelectroforeza unidimensională, gel- electroforeză bidimensională, etc. Astfel de procedee de separare sunt cunoscute în tehnică. A se vedea de exemplu Current Protocols în Molecular Biology, voi. 1 and 2, Ausbel et al. (eds), John Wiley & Sons, NY (1988). în plus, anticorpii împotriva proteinelor pot fi obținuți pe preparate deosebit de pure ale acestora. A se 55 vedea, de exemplu, Radka et al.(1983) J. Immunol. 128:2804; și Radka et al.(1984) Immunogenetics 19:63.

Orice combinație de procedee poate fi utilizată la purificarea proteinelor cu proprietăți pesticide. După cum se indică în procedeu, acțiunea pesticidă este determinată după fiecare etapă de purificare. 60

Astfel de etape de purificare vor avea ca rezultat o cantitate de proteine înalt purificate. Prin „ înalt purificată “ sau „substanțial de pură se înțelege proteina care nu conține absolut nici un compus asociat în mod normal cu proteina respectivă în starea sa naturală. Calitatea preparatelor „substațial de pure ale proteinelor pot fi apreciate prin absența altor spoturi ale secvențelor de proteine detectabile care 65 urmează SDS-PAGE, determinate vizual sau prin scanare densimetrică. Pe de altă parte, lipsa altor secvențe amino-terminale sau reziduuri N-terminale într-un preparat purificat pot indica gradul de puritate. Puritatea poate fi verificată prin recromatografia preparatelor „pure care arată absența altor vârfuri prin schimbul de ioni, faza inversată sau electroforeză capilară. Termenii „substanțial de pur sau „înalt purificat 70 nu exclud amestecurile artificiale sau sintetice ale proteinelor cu alți compuși. De asemenea, termenii nu exclud prezența impurităților minore care nu interferează cu acțiunea biologică a proteinei și care pot fi prezente, de exemplu, datorită purificării incomplete.

Unele proteine sunt secvențe cu o singură polipeptidă, pe când multe proteine 75 conțin mai mult de o secvență de polipeptide. Odată proteina purificată izolată, proteina sau polipeptidele din care este alcătuită pot fi caracterizate și ordonate prin metode standardizate cuoscute în stadiul tehnicii De exemplu, proteina purificată, sau polipeptidele din care este alcătuită, poate fi fragmentată cu bromură cianogenă sau cu proteaze, cum ar fi, papaina, chimotripsina, tripsina, C-lisil endopeptidaza, etc. 80 (Oike et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:9751-9758; Liu et al.(1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215). Peptidele rezultate sunt separate, de preferință prin HPLC, sau prin dizolvarea gelurilor și electroabsorbția pe membranele PVDF, și supuse ordonării secvențiale a aminoacizilor. Pentru a îndeplini această sarcină, peptidele sunt, de preferință, analizate de ordonatori automați de secvențe. Este 85 cunoscut faptul că, secvențele N-terminal, C-terminal sau secvențele de aminoacizi interne pot fi determinate.

Se cunoaște faptul că proteinele pot varia în greutate moleculară, pot varia în numărul de peptide componente, în acțiunea lor împotriva dăunătorilor și în alte caracteristici. Oricum, prin procedeele ce vor fi arătate în continuare, proteinele active 90 împotriva unei varietăți de dăunători pot fi izolate și caracterizate.

RO 117111 Bl

Odată ce, proteina purificată a fost izolată și caracterizata, se știe că ea poate fi modificată în diferite moduri, inclusiv substituiri, ștergeri și inserții de aminoacizi. Procedeele pentru astfel de manipulări sunt cunoscute în stadiul tehnicii. De exemplu, variantele secvențelor de aminoacizi ale proteinelor pesticide pot fi preparate prin mutații ale ADN-ului. Astfel de variante obținute vor avea efectul pesticid dorit. Evident, mutațiile care se vor face în ADN, codificând varianta, nu trebuie să plaseze secvența în afara cadrului de citire și, de preferință, nu va crea regiuni complementare care ar putea produce structuri secundare de mARN (EP Patent Application Publication nr.75.444).

Se cunoaște că se pot produce componente polipeptidice sau fragmente de proteine care stopează efectul pesticid. Aceste fragmente includ secvențe scurtate, precum și secvențe N-terminal, C-terminal, secvențe interne de aminoacizi ale proteinelor și aminoacizi sau secvențe de aminoacizi șterse din interiorul proteinelor.

Majoritatea secvențelor șterse, inserărilor și substituțiilor în secvențele de proteine nu produc de regulă schimbări radicale în caracteristicile proteinei pesticide. Oricum, când este greu de prezis efectul exact al substituirii, ștergerii sau inserării, înaintea efectuării operației, o persoană specialistă în domeniu va aprecia ca efectul să fie evaluat prin încercări de triere de rutină.

Se cunosc metode alternative bune pentru obținerea secvențelor de nucleotide și aminoacizi ale proteinelor de față. De exemplu, pentru a obține secvența de nucleotide care codifică proteina pesticidă, clonele cosmidei, care exprimă o proteină pesticidă activă, pot fi izolate din informația genetică a genomului. Din clone mari de cosmide active, subclone mai mici pot fi create și testate în ceea ce privește efectul. în acest mod, clonele care exprimă o proteină pesticidă activă pot fi ordonate, astfel, încât să determine secvența de nucleotide al genei. Apoi, o secvență de aminoacizi poate fi dedusă pentru a forma proteina. Pentru procedee generale de donare moleculară, a se vedea, de exemplu, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, voi. 1-3, Sambrook et al. (eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989], și referințele citate aici.

Genele pesticide pot fi optimizate pentru a avea un efect sporit în plante. A se vedea, de exemplu, U.S. Application Serial nr. 07/951715; EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; și Murray et al (1989) Nucleic Acids Research 17:477-498. în acest mod, genele pot fi sintetizate folosind codoni agreați de plante.

Astfel codonul preferat pentru o anumită gazdă este singurul codon care codifică de cele mai multe ori aminoacidul din gazda respectivă. Codonul preferat al porumbului, de exemplu, pentru un anumit aminoacid poate să fie derivat dintr-o secvență cunoscută de gene al porumbului. Modul de utilizare al codonului porumbului pentru 28 gene din porumb se găsește în lucrarea Murray et al. (1989), Nucleic Acids Research 17:477-498. Genele sintetice pot fi, de asemenea, create pe baza distribuției de codoni pe care o anumită gazdă îi folosește pentru un anume aminoacid.

în acest mod, secvențele de nucleotide pot fi optimizate, în ce privește efectul, în orice plantă. Se cunoaște că, oricare parte sau întreaga secvență a unei gene poate fi optimizată sau sintetizată. Aceasta înseamnă că pot fi, de asemenea, folosite secvențe sintetice sau optimizate parțial.

RO 117111 Bl în mod asemănător, secvențele de nucleotide pot fi optimizate în orice microorganism. Pentru utilizarea codonului preferat al Bacillusului, a se vedea de exemplu,

US Patent nr. 5024837 și Johansen et al(1988) Gene 65:293-304.

Metodologii pentru construirea casetelor de exprimare în plante precum și 140 introducerea ADN-ului străin în plante sunt descrise în stadiul tehnicii. Astfel de casete de exprimare pot include promotori, terminatori, intensificatori, secvențe conducătoare și alte secvențe regulatoare care operează legate de secvența codificator al proteinei pesticide.

în general, pentru introducerea ADN-ului străin în plante, au fost utilizați ca 145 vectori plasmide Ti, la fel ca și utilizarea directă de ADN, a lipozomilor, a electroporației, micro-injecției și utilizarea microproiectilelor. Astfel de metode au fost publicate în revistele de specialitate. A se vedea, de exemplu, Guerche et al (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30-36; Klein et al (1987) Nature 327:70-73; Howell et al (1980) Science 208:1265; Horsch et al 150 (1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al (1989) Plant physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988); și Methods În Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinsky, eds) Academic Press, Inc. (1989). A se vedea, de asemenea, US Patent Application Serial nr. 08/008374. A se vedea, de asemenea, EPA 0193259 și EPA 0451878A1. 155

Se înțelege că metoda de transformare va depinde de celula plantei care urmează a fi transformată.

Se cunoaște că, componentele casetei de exprimare pot fi modificate pentru creșterea efectului exprimării. De exemplu, pot fi folosite secvențele scurtate, substituiri ale nucleotidelor sau alte modificări. A se vedea, de exemplu, Perlak et al (1991) 160

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; Murray et al (1989) Nucleic Acids Research 17:477-498; și WO 91/16432.

Ansamblul poate, de asemenea, cuprinde orice alți regulatori necesari cum ar fi, terminatori, (Guerineau etal (1991), Mol. Gen. Genet., 226:141-144; Proudfoot, (1991), Ce//, 64:671-674; Sanfacon etal (1991), GenesDev5:141 -149; Mogen et 165 al (1990), PlantCell, 2:1261-1272; Munroe etal (1990) Gene, 91:151-158; Ballas et al (1989), Nucleic Acids Res., 17:7891-7903; Joshi et al (1987) Nucleic Acid Res., 15:9627-9639; secvențe translaționale ale plantelor (Joshi, C.P.,(1987), Nucleic Acids Research, 15:6643-6653), introni (Luehrsen ad Walbot, (1991), Mol.

Gen. Genet., 225:81-93) și altele asemenea, care operează legate de secvența de 170 nucleotide. Poate fi avantajos să se includă 12,5 cm secvențe conductoare (secvențe de amorsare) în ansamblul casetei de exprimare. Asemenea secvențe conductoare pot acționa în sensul sporirii translației.

Conductorii translaționali sunt cunoscuți în tehnica de specialitate și cuprind:

- conductori Picornavirus, de exemplu, conductor EMCV [Encephalomyocarditis 175 5 inch regiune necodificatoare) (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T.R., și Moss, B. (1989) PNAS USA 86:6126-6130);

- conductori Potyvirus, de exemplu, TEV [Tobacco Etch Virus - virusul gravat al tutunului) (Alliso et al (1986); MDMV (virusul mozaic pitic al tutunului); Virology, 154:9-20, și 180

- proteina de legare a lanțurilor grele (BiP) a imunoglobulinei umane, (Macejak, D.G., și Sarnow.P., (1991), Nature, 353:90-94;

RO 117111 Bl

- conductorul netranslatat din învelișul proteinei mARN al virusului mozaic alfaalfa (AMV RNA 4], (Jobling, SA., și Gehrke, L., (1987), Nature, 325:622-625;

- conductorul virus de mozaic al tutunului (TMV), (Gallie, D.R., et al (1989), Molecular Biology of RNA, paginile 237-256; și

- conducător virus pestriț clorotic al porumbului (MCMV) (Lommel, S.A., et al, (1991), Virology, 81:382-385. A se vedea, de asemenea, Della-Ciopa et al (1987), Plant Physiology, 84:965-968.

Un terminator plantă poate fi utilizat în caseta de exprimare. A se vedea Rosenberg et al (1987), Gene 56:125; Guerineau et al (1991) Mol. Gen. Genet. 226:141-144; Proudfoot, (1991), Cell 64:671-674; Sanfacon et al (1991), Genes Oev5:141-149; Mogen etal (1990), PlantCell, 2:1261-1272; Munroe etal (1990), Gene 91:151-158; Ballas et al (1989), Nucleic Acids Res., 17:7891-7903; Joshi etal (1987), Nucleic Acid Rea., 15:9627-9639.

Pentru exprimarea specifică a țesutului, secvențele de nucleotide pot fi legate de promotori tisulari specifici. A se vedea, de exemplu, US Application Serial nr. 07/951715.

Se cunoaște că genele care codifică proteinele pesticide pot fi folosite la transformarea organismelor sensibile la insecte. Astfel de organisme includ Baculovirușii, fungi, protozoare, bacterii și nematode.

Sunt posibile mai multe moduri de introducere a genei care exprimă proteina pesticidă în microorganismul gazdă, în condiții ce permit menținere și exprimarea stabilă a genei. De exemplu, pot fi construite casete de exprimare care includ ansamblurile de ADN de interes, legate operațional de semnalele regulatoare transcripționale și translaționale pentru exprimarea configurațiilor ADN și un lanț ADN omolog cu un lanț al organismului gazdă, prin care va avea loc integrarea, și/sau un sistem identic care este funcțional în gazdă, prin care va avea loc integrarea sau menținerea stabilă.

Semnalele regulatoare transcripționale și translaționale includ, dar nu se limitează la promotori, poziții de plecare a inițierii transcripționale, operatori, activatori, amplificatori, alte elemente regulatoare, poziții ribozomale de legătură, codon de inițiere, semnale de încheiere și altele asemănătoare. A se vedea, de exemplu, US Patent 5039523; US Patent 4853331; EPO 0480762 A2; Sambrook et al. supra; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis et al (eds) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982); Advanced Bacterial Genetica, Davis et al (eds) Cold Spring Harbor, NY(198O); și referințele citate în lucrarea de față.

Celule gazdă potrivite, celule care conțin pesticide tratate în sensul prelungirii acțiunii toxinei în celulă, atunci când celula tratată este aplicată în mediul dăunătorilor țintă, pot include,fie procariote, fie eucariote, în mod normal fiind limitate la acele celule care nu produc substanțe toxice pentru organisme superioare, cum ar fi, mamiferele. Oricum, organismele care produc substanțe toxice pentru organisme superioare ar putea fi folosite acolo unde toxina este instabilă sau nivelul de aplicare suficient de scăzut, astfel, încât să evite orice posibilitate de intoxicare a unei mamifere. Ca gazde, de interes special vor fi procariotele și eucariotele inferioare, cum ar fi, fungi.

Exemple de procariote, atât gram-negative, cât și gram-pozitive, includ Enterobacteriaceae, cum ar fi, Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella și Proteus: Bacillaceae: Rhizobiceae, cum ar fi, Rhizobium: Spirillaceae, cum ar fi, photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum;

RO 117111 Bl

Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, cum ar fi, Pseudomonas și Acetobacter; Azotobacteraceae și Nitrobacteraceae. Printre eucariote se află fungi ca, Phycomycetes și Ascomycetes, care includ drojdie, cum ar fi, Saccharomyces și Schizosaccharomyces; și drojdie Basidiomycetes, cum ar fi, Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces și altele asemănătoare.

Caracteristicile de interes special în selectarea celulei-gazdă în scopuri de producere, includ: ușurința introducerii genei proteinei în gazdă, disponibilitatea sistemelor de exprimare, eficiența exprimării, stabilitatea proteinei în gazdă și prezența capacităților genetice auxiliare. Caracteristicile de interes pentru utilizarea drept capsulă pesticidă includ: calitățile protective ale celulei pentru pesticid, cum ar fi, pereții groși ai celulei, pigmentarea și formarea sau împachetarea corpilor de includere; afinitate la frunze; lipsa toxicității pentru mamifere; atractivitate specifică pentru a fi ingerat de dăunători; ușurință de distrugere și fixare fără a aduce prejudicii toxinei. Alte caracteristici includ ușurința de obținere a unor preparate care să conțină pesticidul și de mânuire a lor, economicitatea și stabilitatea la depozitare a preparatelor, etc.

Organismele-gazdă de interes special includ drojdia, cum ar fi,Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. și Sporobolomyces sp.; organismele filoplane cum ar fi, Pseudomonas sp., Erwinia sp. și Flavobacterium sp.; sau alte organisme ca Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp. și altele asemănătoare. Organismele specifice includ Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis și altele.

Metodele generale pentru utilizarea microorganismelor în controlul cu ajutorul substanțelor pesticide sau în proiectarea altor organisme ca agenți pesticizi sunt cunoscute în tehnica de specialitate. A se vedea, de exemplu, US Patent 5039523 și EP 0480762 A2.

Alternativ, pesticidele sunt produse prin introducerea unei gene heterologe într-o celulă-gazdă. Exprimarea genei heterologe rezultă, direct sau indirect, în producerea și menținerea intracelulară a pesticidului. Aceste celule sunt apoi tratate în condiții care prelungesc acțiunea toxinei produsă în celulă atunci când celula este aplicată mediului dăunătorilor-țintă. Produsul rezultant reține toxicitatea toxinei (o încapsulează natural).

Aceste pesticide încapsulate natural pot fi apoi, condiționate sub formă de compoziții în diferite preparate, în conformitate cu tehnicile convenționale pentru aplicarea în mediul ce găzduiește un dăunător-țintă, de exemplu sol, apă și frunzișul plantelor. A se vedea, de exemplu, EPA 0192319.

Invenția de față se referă la o proteină pesticidă izolată în timpul fazei de creștere vegetative a unei tulpini de Bacillus spp. sau a fragmentelor analoge și active ale acesteia și care este capabilă să distrugă dăunători selectați dintre insecte, fungi, bacterii, nematode, protozoare patogene, paraziți ai animalelor și altele asemenea, în special, insecte din clasele Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptere, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera, sau Trichoptera, această proteină, conform invenției, are secvența de aminoacizi redată în SEQ.ID.N0:7, cu greutate moleculară de 60-100 kDa, purificată substanțial și este izolată în perioada de dinaintea începerii sporulării din Bacillus cereus și anume de tulpina Bacillus cereus AB78 depusa sub numărul de acces NRRL B-21058 la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern

230

235

240

245

250

255

260

265

270

RO 117111 Bl

Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA sau este izolata înaintea producerii proteinei insecticide cristalină din tulpinele de Bacillus thuringiensis AB6 având numărul de acces NRRL B-21060, Bacillus thuringiensis AB88 AB289, AB294 și AB359 având numărele de acces, NRRL B-21225, NRRL B-21227, NRRL B-21229, NRRL B-21226, precum și tulpinile Bacillus thuringiensis AB59 și AB256 cu numerele de acces NRRL B-21228 și respectiv B-2123O, toate tulpinile fiind depuse la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA.

Conform invenției, secvența ADN care codifică proteina pesticidă substanțial pură conținută în tulpina de Bacillus cereus AB78 și în tulpinile de Bacillus thuringiensis AB6, AB88, AB289, AB294, AB359, AB59 și AB256, este în principal secvența clonei P5-4 al E. coli cu numărul de acces NRRL B-21O59 sau secvența clonei P3-12 al E. coli cu numărul de acces NRRL B-21061, ambele fiind depuse la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) Secvența de nucleotide este conținută în clona pCIB6O22 a E coli cu numărul de acces NRRL B-21222 depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA.Secvența de nucleotide este prezentată ca VIP-1 în SEQ ID N0:4.

Avantajele invenției de fața sunt următoarele:

- proteina insecticidă cristalină activă împotriva larvelor coleoptere, obținută conform invenției, a demonstrat efecte semnificative asupra speciei Diabrotîca, în special, Diabrotîca virgifera virgifer. viermele vestic de rădăcină al porumbului (WCRW) sau Diabrotîca longicornus barberi, viermele nordic de rădăcină al porumbului;

- proteina sau alte componente polipeptide descrise în prezenta invenție pot fi folosite simple sau în combinații, iar anumite proteine ale invenției de față sporesc efectul proteinelor pesticide;

- o secvență de nucleotide, izolată, conform invenției, poate fi sintetizată și folosită ca eșantion în scopul izolării genei ce codifică proteina pesticidă;

-tulpina nouă, conform invenției, Bacillus cereus AB78, a arătat un spectru de acțiune insecticidă semnificativ diferit în comparație cu delta-endotoxinele active pe coleoptere cunoscute pe bază de Bacillus thuringiensis:

- proteina, conform invenției, are o acțiune mult mai selectivă împotriva gândacilor decât tulpinile cunoscute de Bacillus thuringiensis active pe coleoptere, în special, împotriva Diabrotîca spp;

- un amestec de celule care conține pCIB6203 (VIP-1 mutat și VIP-2) și celule care conțin pCIB6O23 (numai VIP-1) prezintă o acțiune apreciabil crescută împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului.

Invenția de față cuprinde proteina pesticidă, ca de altfel și componentele și fragmentele ale acesteia pentru combaterea plantelor și insectelor dăunătoare.

în mod particular, sunt dezvăluite noi proteine pesticide produse în timpul creșterii vegetative a tulpinilor de Bacillus și care pot fi izolate în această stare în perioada de dinaintea începerii sporulării. în inveția de față sunt prezentate tulpinile de Bacillus, proteinele și genele care codifică proteinele. Genele care codifică asemenea proteine pot fi izolate, donate și transformate în diferite vehicule de aprovizionare pentru utilizarea în programele de luptă contra dăunătorilor.

RO 117111 Bl

Deși, este cunoscut faptul că proteinele pesticide sunt produse în timpul creșterii vegetative a tulpinilor de Bacillus, în această invenție prin creștere vegetativă se definește numai acea perioadă de timp dinaintea începerii sporulării. în cazul Bacillus thuringiensis, această creștere vegetativă se definește ca fiind cea înaintea producerii proteinei insecticide cristalină.

în această invenție, dăunătorii pot fi insecte, fungi, bacterii, nematode, protozoare patogene, gălbeze de ficat parazite și altele asemenea, dar nu se limitează numai la acestea. Insectele dăunătoare includ insectele selectate din clasele Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptere, Mallophaga, Homoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, Hemiptera, Orthoptera, etc.

Tabelele 1-10 oferă lista de dăunători, asociați plantelor de recoltă de importanță majoră; lista mai cuprinde dăunători de importanță umană și veterinară. Acest gen de dăunători sunt incluși în cuprinsul invenției de față.

325

330

335

Tabelul 1 Lepidoptera (fluturi și molii)

Porumb

Ostrinia nubilalis, (sfredelul european al porumbului)

Agrotis ipsilon, (viermele negru tăietor) Helicoverpa zea, (viermele de spic al porumbului) Sodoptera frugiperda, (larvele de toamnă a moliilor în stol) Diatraea grandiosella, (sfredelul sud-vestic al porumbului) Elasmopalpus lignosellus, (sfredelul pitic al tulpinii porumbului) Diatraea saccharalis, (sfredelul trestiei de zahăr)

Sorg

Chilo partellus, (sfredelul sorgului)

Spodoptera frugiperda, (larvele de toamnă a moliilor în stol)

Helicoverpa zea, (viermele de spic al porumbului)

Elasmopalpus lignosellus, (sfredelul pitic al tulpinii porumbului)

Feltia subterranea, (viermele tăietor care sfărâmă)

Grâu

Pseudaletia unipunctata, (larvele moliilor în stol)

Spodoptera frugiperda, (larvele de toamnă a moliilor în stol)

Elasmopalpus lignosellus, (sfredelul pitic al tulpinii porumbului)

Agrotis orthogonia, (viermele vestic tăietor galben)

Floarea soarelui

Suleima helianthana, (molia caliciului de floarea soarelui)

Homoeosoma electellum, (molia de floarea soarelui)

Bumbac

Heliothis virescens, (viermele seminței de bumbac) Helicoverpa zea, (viermele seminței de bumbac) Spodoptera exigua, (vierme cazon de rădăcină) Pectinophora gossypiella, (vierme roz)

340

345

350

355

360

365

RO 117111 Bl

Orez

Diatraea saccharais, (sfredelul trestiei de zahăr)

Spodoptera frugiperda, (vierme cazon de toamnă)

Helicoverpa zea, (viermele spicului de porumb)

Fasole soia

Pseudoplusia includens, (vierme încolăcitor pentru fasolea soia)

Anticarsia gemmatalis, (omida fasolei furajere)

Plathypena scabra, (vierme verde de trifoi)

Ostrinia nubilalis, (sfredelul european de porumb)

Agrotis ipsilon, (omida neagră tăietoare)

Spodoptera exigua, (larvele de rădăcină a moliilor stol)

Heliothis virescens, (larva moliei seminței de bumbac care face cocon)

Helicoverpa zea, (larva moliei seminței de bumbac care face cocon)

Orz

Ostrinia nubilalis, (sfredelul european al porumbului)

Agrotis ipsilon, (omida neagră tăietoare)

Tabelul 2

Coleoptere (gândaci)

Porumb

Diabrotica virgifera virgifera, (viermele rădăcinii porumbului vestic)

Diabrotica longicoris barberi, (viermele rădăcinii porumbului sudic)

Diabrotica undecimpunctata howardi, (viermele rădăcinii porumbului sudic) Melanotus spp., (viermele subțire cu corpul dur )

Cyclocephala borealis, (gândacul neaparent nordic - larva albă)

Cyclocephala immacuata, (gândacul neaparent sudic - larva albă)

Popilia japonica, (gândacul japonez)

Chaetocnema pulicaria, (gândacul purice de porumb)

Sphenophorus maidis, (gândacul de porumb)

Sorg

Phyllophaga crinita, (larvă albă de gândac)

Eleodes, Conoderus, și Aeous spp, (vierme subțire)

Oulema melanopus, (gândacul frunzei de cereale)

Chaetocema pulicaria, (puricele de porumb)

Sphenophorus maidis, (gândacul de porumb)

Grâu

Oulema melanopus, (gândacul frunzei de cereale)

Hypera punctata, (gândacul frunzei de trifoi)

Diabrotica udecimpunctata howardi, (viermele de rădăcină al porumbului sudic) Floarea soarelui

Zygograma exclamationis, (gândacul florii soarelui)

Bothyrus gibbosus, (gândacul morcovului)

Bumbac

Anthonomus grandis (gândacul gri care distruge învelișul imatur al semințelor de bumbac)

RO 117111 Bl

415

Orez

Colaspis brunnea (gândacul colaspis al strugurelui)

Lissorhoptrus oryzophilus (gândacul de apă al orezului)

Sitophilus oryzae (gândacul orezului)

Fasole-soia

Epilachna varivestis (gândacul mexican al fasolei)

Tabelul 3

Homoptera (musculițe, insecte minuscule)

Porumb

Rhopalosiphum maidis (insecta minusculă a frunzei de porumb care suge sucul plantei] Anuraphis maidiradicis (insecta minusculă a rădăcinii de porumb)

Sorg

Rhopalosiphum maidis (insecta minusculă a frunzei de porumb)

Sipha flava (insecta minusculă galbenă a trestiei de zahăr)

Grâu

Insecta minusculă rusească a grâului

Schizaphis graminum (gândacul verde)

Macrosiphum avenae (insecta minusculă englezească a grâului)

Bumbac

Aphis gossypii (insecta minusculă a bumbacului]

Pseudatomoscelis seriatus (puricele frunzei bumbacului)

Trialeurodes abutilonea (musculița cu aripi dungate)

Orez

Nephotettix nigropictus (puricele frunzei orezului)

Fasolea soia

Myzus persicae (insecta minusculă verde a piersicii)

Empoasca fabae (puricele frunzei cartofului)

Orz

Schizaphis graminum (gândacul verde)

Răpită

Brevicoryne brassicae (insecta minusculă a căpățânii de varză)

420

425

430

435

440

Tabelul 4

445

Hemiptera (gândaci)

Porumb

Blissus leucopterus leucopterus (gândacul negru sugâdu-i sucul)

Sorg

Blissus leucopterus leucopterus (gândacul negru sugâdu-i sucul]

Bumbac

Lyngus lineolaris (gândacul care pătează plantele) Orez

Blissus leucopterus leucopterus (gândacul negru sugâdu-i sucul) cu cu cu aripi aripi aripi albe albe albe care care care atacă atacă atacă planta planta planta

450

455

RO 117111 Bl

Acrosternum hilare (gândacul verde urât mirositor cu corpul de forma unui scut]

Fasole-soia

Acrosternum hilare (gândacul verde urât mirositor cu corpul de forma unui scut)

Orz

Blissus leucopterus leucopterus (gândacul negru cu aripi albe care atacă planta sugâdu-i sucul)

Acrosternum hilare (gândacul verde urât mirositor cu corpul de forma unui scut) Euschistus servus (gândacul maroniu urât mirositor)

Tabelul 5

Orthoptera (lăcuste, greieri și gândaci de bucătărie)

Porumb

Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)

Melanoplus sanguinipes (lăcusta migratoare)

Grâu

Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)

Melanoplus differentialis (lăcustă)

Melanoplus sanguinipes (lăcusta migratoare)

Bumbac

Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii]

Melanoplus differentialis (lăcustă)

Fasole-soia

Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)

Melanoplus differentialis (lăcustă) în gospodărie

Periplaneta americana (gândac de bucătărie american)

Blattella germanica (gândac de bucătărie german)

Blatta orientalis (gândac de bucătărie oriental)

Tabelul 6

Diptera (musculițe și țânțari)

Porumb

Hylemya platura (viermele fără picioare-asemănător larvei- care atacă sămînța de porumb)

Agromyza parvicornis (viermele pătat al frunzelor de porumb)

Sorg

Contarinia sorghicola (musculița sorgului)

Grâu

Mayetiola destructor (musculița hessiană)

Sitodiplosis mosellana (musculița grâului)

Meromyza americana (viermele tulpinii grâului)

Hylemya coarctata (musculița rădăcinii grâului]

Floarea soarelui

Neolasioptera murtfeldtiana (musculița seminței de floarea soarelui)

Fasole-soia

Hylemya platura (viermele seminței de porumb)

RO 117111 Bl

Orz

Hylemya platura (viermele seminței de porumb) 505

Mayetiola destructor (musculița hessiană)

Insecte care atacă oamenii și animalele și sunt purtători de microbi Aedes aegypti (țânțarul febrei galbene)

Aedes albopictus (țânțarul diurn de pădure)

Phlebotomus papatasii (musculița de nisip)

Musca domestica (musculița de casă)

Tabanus atratus (musculița neagră a cailor)

Cochliomyia hominivorax (musculița care pătrunde în piele)

Thysanoptera (insecte)

Porumb

Anaphothrips obscurus (insecta de iarbă)

Grâu

Frankliniella fusca (insecta de tutun)

Bumbac

Thrips tabaci (insecta de ceapă)

Frankliniella fusca (insecta tutunului)

Fasole-soia

Sericothrips variabilis (insectade soia și de fasole)

Thrips tabaci (insecta de ceapă)

510

515

Tabelul 7

520

525

Tabelul 8

Hymenoptera (musculițe tăietoare, furnici, viespi, etc.) 530

Porumb

Solenopsis milesta (furnica hoață) Grâu

Cephus cinctus (musculița tăietoare a tulpinii grâului)

535

Tabelul 9

Alte ordine și specii reprezentative

Dermaptera (urechelnițe)

Forficula auricularia (urechelnița european)

Isoptera (termite) 540

Reticulitermes flavipes (termita estică subterană)

Mallophaga (păduchi mușcători)

Cuclotogaster heterographa (păduchele de cap al găinilor)

Bovicola bovis (păduchele vitelor)

Anoplura (păduchi ventuză) 545

Pediculus humanus (păduchele de cap și de corp)

Siphonaptera (purici)

Ctenocephalides felis (puricele pisicii)

RO 117111 Bl

Tabelul 10

Acarieni (păianjeni minusculi și căpușe]

Porumb

Tetranychus urticae (păianjenul minuscul dublu-pătat] Sorg

Tetranychus cinnabarinus (păianjenul minuscul roșu-carmin)

Tetranychus urticae (păianjenul minuscul dublu-pătat) Grâu

Aceria tulipae (viermele spiralat al grâului)

Bumbac

Tetranychus cinnabarius (păianjenul minuscul roșu-carmin)

Tetranychus urticae (păianjenul minuscul dublu-pătat) Fasole-soia

Tetranychus turkestani (păianjenul minuscul al căpșunilor) Tetraychus urticae (păianjenul minuscul dublu-pătat) Orz

Petrobia latens (acarian maroniu al grâului)

Acarieni importanți de animale și de oameni

Demacentor variabilis (căpușa americană al câinelui) Argas persicus (căpușa păsărilor de curte) Dermatophagoides farinae (acarianul american de praf de casă) Dermatophagoides pteronyssimus (acarianul european de praf de casă)

Nici una din proteinele insecticide cristaline active împotriva larvelor coleoptere cunoscute n-au demonstrat efecte semnificative asupra speciei Diabrotica, în special, Diabrotica virgifera virgifer, viermele vestic de rădăcină al porumbului (WCRW) sau Diabrotica longicornus barberi, viermele nordic de rădăcină al porumbului.Invenția de față se referă la astfel de proteine pesticide.

în această invenție, creșterea vegetativă este definită ca acea perioadă de timp dinaintea începerii sporulării. în cazul Bacilius thuringiensis, această creștere vegetativă are loc înaintea producerii proteinei insecticide cristalină.

Invenția de față cuprinde, de asemenea, secvențe de nucleotide din microorganisme, altele decât Bacilius, unde secvențele de denucleotide sunt izolabile prin hibridare cu secvențe de nucleotide ale tulpinilor de Bacilius, conform invenției. Astfel de secvențe nucleotide pot fi testate în acțiunea pesticidă.

Invenția cuprinde,de asemenea, secvențele de nucleotide care codifică proteinele pesticide.

Mai mult, invenția cuprinde proteine obținute din organisme altele decât Bacilius unde proteina interacționează cu anticorpii ce luptă împotriva proteinelor din invenție. De asemenea, astfel de proteine izolate pot fi testate în ceea ce privește efectul pesticid prin procedeele dezvăluite în prezenta invenție.

dată izolate secvențele de nucleotide care codifică proteinele pesticide ale invenției, acestea pot fi manipulate și folosite să pună în valoare proteina într-o diversitate de gazde incluzând alte organisme, microorganisme și plante.

RO 117111 Bl

Din secvența de aminoacizi al proteinei purificate, o secvență de nucleotide poate fi sintetizată și folosită ca probă în scopul ajutării izolării genei ce codifică 595 proteina pesticidă.

Genele pesticide ale invenției pot fi optimizate prin metode cunoscute pentru a avea un efect sporit în plante.

Genele care codifică asemenea proteine pot fi izolate, donate și transformate în diferite vehicule de aprovizionare pentru utilizarea în programele de luptă contra 600 dăunătorilor.

Astfel, microorganismele Bacillus care își găsesc întrebuințarea, conform prezentei invenții, includ Bacillus cereus și Bacillus Thuringiensis, ca și celelalte specii de Bacillus, listate în tabelul 11:

605 Tabelul 11

Lista speciilor de Bacillus

Grupul morfologic 1	Tulpini neatribuite
B. megaterium	Subgrupa A
B. cereus *	B. apiarus *	610
B. cereus var. mycoides	B. filicolonicus
B. thuringiensis *	B. thiaminolyticus
B. licheniformis	B. alcalophilus
B. subtilis *	Subgrupa B
B. pumnilus	B. cirroflagellosus	615
B. firmus *	B. chitinosporus
B. coagulans Grupul morfologic 2	B. lentus
B. polymyxa	Subgrupa C
B. macerans	B. badius	620
B. circulans	B. aneurinolyticus
B. stearothermophilus	B. macroides
B. alvei *	B. freundenreichii
B. laterosporus *	Subgrupa D
B. brevis	B. pantothenticus	625
B. pulvifaciens	B. epiphytus
B. popilliae *	Subgrupa E1
B. lentimorbus *	B. aminovorans
B. larvae *	B. globisporus
Grupul morfologic 3	B. insolitus	630
B. sphaericus *	B. psychrophilus
B. pasteurii	Subgrupa E2 B. psychrosaccharolyticus
* Acele tulpini de Bacillus care au fost anterior descoperite în insecte.

Gruparea a fost alcătuită conform Parry, J.M. et al. (1983) Color Atlas of 635 Bacillus species, Wolfe Medical Publications, London.

Proteina pesticidă, conform invenției, produsă în timpul creșterii vegetative, poate fi izolată din tulpinile Bacillus la momentele indicate de această invenție. într-unul din cazuri, pot fi izolate proteinele insecticide produse în timpul creșterii vegetative, denumite VIP (proteine vegetative insecticide). 640

RO 117111 Bl

Proteinele sau alte componente polipeptide descrise în prezenta invenție pot fi folosite simple sau în combinații. Adică, mai multe proteine pot fi folosite pentru combaterea diferitelor insecte dăunătoare. în plus, anumite proteine ale invenției de față sporesc efectul proteinelor pesticide. Aceste proteine sunt denumite “proteine auxiliare. în timp ce mecanismul de acțiune nu este absolut sigur, când proteinele auxiliare și proteinele pesticide care ne interesează sunt împreună, proprietățile insecticide ale proteinelor pesticide sunt sporite de câteva ori.

Proteinele pesticide ale invenției de față pot varia în greutate moleculară, având drept componente polipeptide cu o greutate moleculară de cel puțin 30 kDa sau mai mare, de preferință, aproximativ 50 kDa sau mai mare.

Tulpinile de Bacillus,conform invenției, pot fi folosite la protejarea de dăunători a recoltelor agricole și a produselor acestora. Alternativ, o genă care codifică pesticidul poate fi introdusă cu ajutorul unui vector potrivit într-o gazdă microbiană, și această gazdă poate fi aplicată mediului sau plantelor sau animalelor. Gazdele microorganisme pot fi selectate dintre acelea care ocupă „fitosfera [phylloplane, phillosphere, rhizosphere, și/sau rhizoplana) uneia sau mai multor recolte de interes. Aceste microorganisme sunt selectate, astfel, încât să fie capabile să concureze cu succes într-un anumit mediu înconjurător, cu tipuri de microorganisme sălbatice, să asigure menținerea și exprimarea stabilă a genei care exprimă pesticidul polipeptidic și, este de dorit, să asigure protecția îmbunătățită a pesticidului contra degradării și inactivării lui datorate mediului înconjurător.

Astfel de microorganisme includ bacterii, alge, fungi. De un interes special sunt microorganisme cum ar fi, bacteriile Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc și Alcaligenes: fungi, în particular drojdia, de exemplu, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotoruia și Aureobasidium. De interes special sunt specii de bacterii ale fitosferei, cum ar fi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcesces, Acetobacter xilinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli și Azotobacter vinlandii; și specii de drojdie din fitosferă, cum ar fi, Rhodotoruia rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis,

S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae și Aureobasidium polluans. De interes special sunt microorganismele pigmentate.

Tulpinile de Bacillus, conform invenției, sau microorganismele care au fost modificate genetic, astfel, încât să conțină gena și proteina pesticidă, pot fi utilizate în scopul protejării recoltelor și a produselor agricole contra dăunătorilor. într-unul din aspectele invenției, totalitatea celulelor unui organism producător de toxine pesticide se tratează cu reactivi care prelungesc acțiunea toxinei produsă în celulă, atunci când celula este aplicată în mediul dăunatorilor-țintă.

Ingredientele active ale invenției de față sunt aplicate, în mod normal, sub formă de compoziții și pot fi aplicate pe suprafața cu recoltă sau pe planta de tratat, simultan sau succesiv cu alți compuși. Acești compuși pot fi, atât fertilizatori sau donori micronutritivi, cât și alte compoziții care influențează creșterea plantei. Ei pot fi, de asemenea, erbicide selective, insecticide, fungicide, bactericide, nematocide,

RO 117111 Bl

690 moluscocide sau amestecuri de mai multe asemenea compoziții, dacă se dorește, împreună cu alți purtători acceptabili pentru agricultură, surfactanți sau adjuvanți de accelerare utilizați de obicei în tehnica compozițiilor. Purtătorii și adjuvanții potriviți pot fi solizi sau lichizi și corespund substanțelor utilizate de regulă în tehnologia compozițiilor, de exemplu, substanțe minerale naturale sau regenerate, solvenți, dispersând, agenți de umectare, lianți sau fertilizatori.

Metodele preferate de aplicare a unui ingredient activ sau a unei compoziții agrochimice, conform invenției, care conține cel puțin una din proteinele pesticide produse de tulpinile bacteriene, conform invenției, sunt: aplicarea pe frunze, acoperirea semințelor și aplicarea pe sol. Numărul de aplicări și frecvența acestora depind de intensitatea infestării cu dăunătorul corespunzător.

într-o variantă a invenției, a fost izolat un microorganism Bacillus cereus capabil să distrugă Diabrotica virgifera virgifera și Diabrotica longicornis barberi.

Noua tulpină este tulpina Bacillus cereus AB78 ea a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA și are numărul de acces RRL B-21058.

O proteină a fost purificată substanțial dintr-o tulpină de Bacillus cereus. Purificarea proteinei a fost verificată prin acțiune SDS-PAGE și biologică. Proteina are o greutate moleculară, de aproximativ 60...100 kDa, în mod particular 70...90 kDa, în mod și mai particular, aproximativ 80 kDa.

Secvența amino-terminală relevă următorul lanț de aminoacizi: NH2-Lys-Arg-GluIle-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-lle-Pro-(SEQ ID N0:8), unde Asx reprezintă, fie Asp, fie Asn. întregul lanț de aminoacizi este dat în SEQ ID NO: 7.

Un eșantion de oligonucleotidă a fost generată pentru porțiunea de genă care codifică aminoacizii 3-9 ai terminației NH2-. Eșantionul a fost sintetizat pe baza utilizării codonului genei delta-endotoxină din Bacillusului thuringiensis (Bt). Secvența de nucleotide al eșantionului de oligonucleotide utilizată pentru hibridizări sudice a fost următoarea:

5’ΌΑΑ AK GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID NO: 9) unde N reprezintă orice bază.

în plus, eșantionul de ADN pentru gena Bacillus cereus AB78 VIP-1 descrisă în prezenta invenție, permite sortarea oricărei tulpini de Bacillus sau a altor organisme în scopul determinării dacă gena VIP-1 (sau o gena înrudită) este prezentă în mod natural sau dacă un organism anume transformat include gena VIP-I.

Se dau, mai jos, exemple de realizare a invenției, fără ca acestea să limiteze invenția, precum se dau, de asemenea, construcția secvențelor de aminoacizi aflate în legătură cu invenția, secvențe care toate fac parte integrantă din invenția de față și înfățișează părți ale proteinelor pesticide sau a secvențelor de nucleotide care codifică aceste proteine.

Exemplul 1. Izolarea și caracterizarea tulpinii Bacillus cereus AB78

Tulpina Bacillus cereus AB78 a fost izolată de pe o placă de laborator contaminată, în mediu T3 (pe litru: 3 g tripton, 2 g triptoză, 1,5 g extract de drojdie, 0,05 M fosfat de sodiu (pH= 6,8], 0,005 g MnCI₂; mediu Travers, R.S. 1983). AB78 a prezentat o acțiune semnificativă împotriva viermelui de rădăcină al porumbului vestic. A fost, de asemenea, demonstrată acțiunea antibiotică împotriva Bacillus spp. gram-pozitiv (tabelul 12).

695

700

705

710

715

720

725

730

RO 117111 Bl

Tabelul 12

Acțiunea antibiotică a supernatantului de cultură al tulpinii AB78

Bacteria testată	Zona de inhibiție (cm)
AB78	Streptomicină
E.coli	0,0	3,0
B.megaterium	1,1	2,2
B.mycoides	1,3	2,1
B. cereus CB	1,0	2,0
B. cereus 11950	1,3	2,1
B. cereus 14579	1,0	2,4
B. cereus AB78	0,0	2,2
Bt var. isrealensis	1.1	2,2
Bt. var tenebrionis	0.9	2,3

Caracteristicile morfologice ale tulpinii Bacillus cereus AB78 sunt următoarele: Bastonașe vegetative cu lungimea,de 3,1 - 5,0 mm și lățimea, de 0,2 - 2,0 mm. Celule cu capete rotunjite, singure în lanțuri scurte. Un singur endospor subterminal, cilindrico-oval, format în fiecare celulă. Nici o formațiune de cristal parasporal. Colonii opace, erodate, lobate și plate. Fără producere de pigmenți. Celule motile. Flagella prezentă.

Caracteristicile de creștere sunt următoarele:

Facultativ aerobă, cu temperatura optimă de creștere, de 21 - 3O°C. Crește la 15, 20, 25, 30 și 37°C. Nu crește, la temperaturi peste 4O°C. Crește în NaCI 5-7 %.

Tabelul 13 indică profilul biochimic al tulpinii Bacillus cereus AB78.

Tabelul 13

Caracteristici biochimice ale tulpinii B. cereus AB78

Acid din L-arabinoză	-	Albastru de metilen reoxidat	+
Gaz din L-arabinoză	-	Azotat redus	+
Acid din D-xyloză	-	Azotat redus la N02	+
Gaz din D-xyloză	-	VP	+
Acid din D-glucoză	+	H202 descompus	+
Gaz din D-glucoză	-	Indol	-
Acid din lactoză	-	Tirozină descompusă	+
Gaz din lactoză	-	Oihidroxiacetoa	-
Acid din zaharoză	-	Acid lactic turnesol	-

RO 117111 Bl

Tabelul 13 (continuare)

Gaz din zaharoză	-	Lapte coagulat turnesol	-
Acid din D-mannitol	-	Lapte alcalin turnesol	-
Gaz din D-mannitol	-	Lapte peptonizat turnesol	-
Utilizarea propionatului	+	Lapte redus turnesol	-
Utilizarea cifratului	+	Hidrolizat de caseină	+
Hidroliză hipurată	W	Hidrolizat de amidon	+
Albastru metilen redus	+	Gelatină lichefiată cu producere de lecitinază	W

\N - reacție slabă 780

Exemplul 2. Culturi bacteriene subcultură a tulpinii Bacillus cereus AB78 a fost utilizată la inocularea următorului mediu, cunoscut ca „supă TB:

Triptonă......

Extract de drojdie Glicerol ......

KH2P04 .....

K2HP04 .....

pH=7,4 g/l 785 g/l ml/l

2,1 g/l

14,7 g/l

790

Fosfatul de potasiu a fost adăugat, după răcire, „supei autoclavate. Recipientele au fost ținute în incubator, la 3O°C, pe un vibrator rotativ, la 250 rot/min, timp, de 24... 36 h.

Procedura de mai sus poate fi adaptată pentru fermenți mari, prin proceduri bine cunoscute în tehnică. 795 în timpul creșterii vegetative, de regulă 24...36 h după începerea culturii, bacteriile AB78 au fost centrifugate din supernatantul culturii. Supernatantul culturii, care conține proteina activă, a fost folosit în probe biologice.

Exemplul 3. Probe biologice cu insecte

Tulpina de Bacillus cereus AB78 a fost testată împotriva a numeroase insecte 800 descrise mai jos.

Viermele nordic, vestic și sudic de rădăcină al porumbului, Diabrotica virgifera virgifera, D. longicornis barberi și, respectiv, D. undecempunctata howardi: Diluțiile s-au făcut din supernatant de cultură al tulpinii AB78, crescută 24...36 h, prin amestecare cu mediul de cultură artificial lichid (Marrone et al (1985) J. of Economic 805 Entomology 78:290-293] și lăsarea acetuia să se solidifice. Mediul de cultură solidificat a fost tăiat și așezat în farfurii. Larvele nou născute au fost plasate pe compoziție și ținute, la 3O°C. După 6...8 zile s-a înregistrat moartea larvelor.

Proba biologică donată E. coli: E.coli a fost crescut peste noapte în L-Amp 100, la 37°C. Zece ml de cultură au fost supusă ultrasunetelor de 3 ori, câte 20 s, 810 de fiecare dată. 500 ml de cultură tratată cu u.s. au fost adăugați mediului de cultură lichid pentru viermele vestic de rădăcină al porumbului.

RO 117111 Bl

Gândacul de Colorado al cartofului, Leptinotarsa decemlineata: diluțiile în Triton X-1OO (pentru a da o concentrație finală, de 0,1% TX-1OO) au fost făcute din supernatantul de cultură al tulpinii AB78, crescută 24...36 h. 5 cm² de porțiuni de frunză de cartof au fost înmuiate în aceste diluții, uscate în aer și plasate pe hârtie de filtru umectată, în farfurii de plastic. Larvele nou născute au fost așezate pe porțiunile de frunze și menținute, la 3O°C. Moartea larvelor a fost înregistrată, după 3...5 zile.

Viermele galben de masă, Tenebrio molitor. diluțiile s-au făcut din supernatant de cultură al tulpinii AB78 crescută 24...36 h, prin amestecare cu mediul de cultură lichid (Bioserv #F924O) și repaos pentru solidificare. Mediul de cultură solidificat a fost tăiat și plasat în farfurii de plastic. Larvele nou născute au fost așezate pe mediul de cultură și menținute, la 3O°C. Mortalitatea larvelor s-a înregistrat, după 6... 8 zile.

Sfredelul european al porumbului, viermele negru tăietor, viermele de mugure al tutunului, viermele cu coarne al tutunului și viermele sfeclei; Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Manduca sexta și respectiv Spodoptera exigua: diluții, în TX-1OO (pentru a da o concentrație finală de 0,1% TX-1OO], făcute din supernatant de cultură al tulpinii AB78 crescută 24...36 h. 100 ml suprernatant s-a pipetat pe o suprafață, de 18 cm² de mediu de cultură solidificat (Bioserv #F924O] și s-a lăsat să se usuce în aer. Larvele în primele stadii de dezvoltare au fost apoi plasate pe suprafața mediului de cultură și menținute, la 30°C. Mortalitatea larvelor s-a înregistrat, după 3...6 zile.

Țânțarul nordic de casă, Culex pipiens: diluțiile s-au făcut din supernatant de cultură al tulpinii B78 crescută 24...36 h. 100 ml s-au pipetat în 10 ml apă, într-o ceașcă de plastic de 30 ml. Trei larve au fost adăugate apei și menținute, la temperatura camerei. Mortalitatea larvelor s-a înregistrat, după 24...48 h Spectrul activității tulpinii AB78 este dat în tabelul 14.

Tabelul 14

Acțiunea supernatantului de cultură al tulpinii AB78 Împotriva diferitelor specii de insecte

Specii de insecte	Ordinul	Acțiunea
Vierme vestic de rădăcină al porumbului (Diabrotica virgifera virgifera]	Col	+++
Vierme nordic de rădăcină al porumbului (Diabrotica longicornis barberi]	Col	+++
Vierme sudic de rădăcină al porumbului (Diabrotica undecimpunctata howardi)	Col	-
Gândac de Colorado al cartofului [Leptinotarsa decemlineata)	Col	-

RO 117111 Bl

Tabelul 14 (continuare]

860

Specii de insecte	Ordinul	Acțiunea
Vierme galben de masă [Tenebrio molitor)	Col
Sfredelul de porumb european (Ostrinia nubilalis]	Lep	-
Viermele de mugure al tutunului (Heliothis virescens)	Lep
Viermele cu coarne al tutunului (Manduca sexta)	Lep
Viermele sfeclei [Spodoptera exigua]	Lep	-
Vierme negru tăietor (Agrotis ipsilon)	Lep	-
Țânțarul nordic de casă (Culex pipiens)	-	-

865

870

Tulpina nouă izolată, conform invenției, Bacillus cereusAB78, a arătat un spectru de acțiune insecticidă semnificativ diferit în comparație cu delta-endotoxinele active pe coleoptere cunoscute pe bază de Bacillus thuringiensis.

în particular, tulpina AB7B, conform invenției, a arătat o acțiune mult mai selectivă împotriva gândacilor, decât tulpinile cunoscute de Bacillus thuringiensis active pe coleoptere, prin aceea că a fost mult mai activ împotriva Diabrotica spp. Cel mai activ a fost împotriva D. virgifera virgifera și D. longicornis barberi, dar nu împotriva D. undecimpunctata howardi.

Un număr de tulpini de Bacillus au fost testate biologic în ceea ce privește acțiunea lor în timpul creșterii vegetative (tabelul 15) împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului. Rezultatele demonstrează că tulpina AB78, conform invenției, este unică în ceea ce privește acțiunea împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului, care nu este un fenomen general.

Tabelul 15

875

880

885

890

Acțiunea supernatanților de cultură din diferite tulpini de Bacillus spp Împotriva viermelui vestic de rădăcină

Tulpina de Bacillus	Procentul de mortalitate
B.cereus Ab 78 (Bat. 1)	1CO
B.cererus AB 78 (Bat. 2)	1OO
B.cererus (Carolina Bio.)	12
B.cereus ATCC 11950	12
B.cereus ATCC 14579	8

895

RO 117111 Bl

Tabelul 15 (continuare]

B.mycoides [Carolina Bio.)	30
B.popillia	28
B.thuringiensis HD 135	41
B.thuringiensis HD 191	9
B.thuringiensis GC 91	4
B.thuringiensis isrealensis	24
Controlul cu ajutorul apei	4

Acțiunea specifică a tulpinii AB78, conform invenției, împotriva viermelui vestic de rădăcină este prezentată în tabelul 16.

Tabelul 16

Acțiunea supernatantului de cultură a tulpinii AB78 împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului

Concentrația supernatantului de cultură (pl/ml)	Procentul de mortalitate
100	100
25	87
10	80
5	40
2,5	20
1	6
0	0

Pentru viermele vestic de rădăcină al porumbului, LC 50 s-a calculat a fi 6,2 pl de supernatant de cultură pentru un mililitru de compoziție.

Exemplul 4. Izolarea și purificarea proteinei active pentru viermele de rădăcină al porumbului din tulpina AB78

Mediul de cultură fără celule și resturi de celule a fost tratat la o saturație de 70% prin adăugarea 472 g/l de sulfat de amoniu solid. Dizolvarea s-a făcut, la temperatura camerei, urmată de răcire într-o baie cu gheață și centrifugare, la 1OOOO x g, timp, de 30 min pentru ca proteinele precipitate să apară sub formă aglomerată.

Supernatantul a fost înlăturat și precipitatul a fost dizolvat în 1/10 din volumul inițial cu 20 mM soluție tampon TRIS-HCI, la pH=7,5.

Sărurile înglobate în precipitat au fost îndepărtate din soluție, fie prin dializă în 20 mM soluție TRIS-HCI,pH=7,5, fie prin trecerea printr-o coloană de purificare.

Soluția de proteină astfel obținută a fost titrată, la pH=3,5, cu 20 mM citrat de sodiu pH=2,5. în urma unei incubații,de 30 min, la temperatura camerei, soluția a fost centrifugată la 3000 x g, timp, de 10 min. Supernatantul conținea în acest stadiu cea mai mare cantitate de proteină activă.

RO 117111 Bl în urma neutralizării soluției la pH=7,O, supernatantul a fost trecut peste un schimbător anionic Mono-Q, echilibrat în coloană cu 20 mM TRIS, pH=7,5, la un 940 debit, de 300 ml/min. Coloana a fost eluată cu un gradient liniar și în trepte, utilizând

400 mM NaCI, în 20 mM TRIS, pH=7,5.

Probele biologice ale porțiunilor din eluat și analiza SDS-PAGE au fost folosite ca să confirme porțiunile active. Analiza SDS-PAGE a identificat proteina activă biologic ca având greutatea moleculară în valoare de 80 kDa. 945

Exemplul 5. Analiza secvenței proteinei active a viermelui de rădăcină al porumbului

Proteina, de 80 kDa izolată prin SDS-PAGE a fost transferată la membrana de electroforeză PVDF și a fost supusă la secvențierea amino-terminală, îndeplinită de ciclurile Edman repetate pe ordonatorul lichid-pulsant ABI 470. Transferul s-a efectuat 950 în 10 mM tampon CAPS, cu 10% metanol, pH=11,0 după cum urmează:

Incubația gelului ce a urmat electroforezei s-a făcut în tamponul de transfer, timp de 5 min.

Membrana ProBlott PVDF a fost umectată sumar cu 100% MeOH, apoi echilibrată în tamponul de transfer. 955

Multistratul a fost aranjat între bureți spumoși și pătrate de hârtie-filtru cu configurația unui Catod-Gel-Membrană-Anod.

Transferul s-a efectuat la un voltaj constant de 70 V, timp, de o oră.

După transfer, membrana a fost clătită cu apă și colorată, timp, de 2 min cu 0,25% Coomassie Blue R-250 în 50% MeOH. înlăturarea colorantului s-a făcut prin 960 clătiri succesive cu 50% MeOH, 40 % apă, 10% acid acetic.

După curățare, membrana a fost uscată în aer înaintea extragerii benzilor pentru analiza secvenței. S-au utilizat Blott Cartridge și cicluri corespunzătoare pentru a obține maximum de eficiență și productivitate. Analiza datelor s-a realizat cu ajutorul programului software 610 Sequence Analysis pentru identificarea și cuantificarea 965 derivaților aminoacizi PTH pentru fiecare ciclu secvențial.

Secvența N-terminală s-a determinat a fi: NH2-Lys-Arg-Glu-lle-Asp-Glu-Asp-ThrAsp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-lle-Pro- (SEQ ID NO: 8], unde Asx reprezintă Asp sau Asn.

Exemplul 6. Construcția eșantionului din ADN 970

A fost generat un eșantion de oligonucleotidă pentru regiunea genei care codifică aminoacizii 3-9 ai secvenței N-terminale (exemplul 5). Eșantionul a fost sintetizat pe baza utilizării cu rol de codon a genei delta-endotoxină a Bacillus-ului thuringiensis (Bt). Secvența de nucleotide 5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3’ (SEQ ID NO: 9) a fost folosit ca eșantion în hibridări sudice. Oligonucleotidă a fost sintetizată folosind 975 echipament și proceduri standard.

Exemplul 7. Determinarea punctului izoelectric al proteinei active a viermelui de rădăcină al porumbului

Proteina purificată din exemplul 5 a procedeului de purificare a fost analizată pe un gel focalizat izoelectric 3-9 pl, utilizând sistemul de electroforeză Phastgel 980 (Pharmacia). Procedurile de operare standard au fost urmate de separare și colorare cu argint, pl-ul s-a aproximat, la 4,9.

Exemplul 8. Datele PCR despre tulpina AB78

Analiza PCR (A se vedea, de exemplu, US Patent Application Serial nr. 08/008006; Carozzi et al (1991) Appl. Environ. Microbio 1. 57(11): 3057-3061, 985

RO 117111 Bl incluse aici prin referință] s-a folosit pentru a verifica dacă tulpina Bacillus cereus

AB78 nu conținea nici un fel de gene ale proteinei cristaline insecticide a tulpinei

Bacillus thuringiensis sau Bacillus. sphaericus (tabelul 17).

Tabelul 17

Primerii genei proteinei cristaline insecticide Bacillus testate de PCR împotriva ADN-ului AB78

Primeri testați	Produs rezultat
2 seturi specifice pentru CrylllA	Negativ
CrylllB	Negativ
2 seturi specifice pentru CrylA	Negativ
CrylA(a)	Negativ
CrylA(b) specific	Negativ
CrylB	Negativ
CrylC specific	Negativ
CrylE specific	Negativ
2 seturi specifice pentru B.sphaericus	Negativ
2 seturi pentru CrylV	Negativ
Control cu Bacillus (PI-PLC)	Pozitiv

Exemplul 9. Clonarea cosmidei întregului ADN din tulpina B. cereus AB78

Gena VIP-1 a fost donată din întregul ADN preparat din tulpina AB78, după cum urmează:

Izolarea ADN-ului tulpinii AB78 a fost făcută după cum urmează:

1. Cultivarea peste noapte a bacteriilor, în 10 ml soluție L (Se utilizează tub steril centrifugal, de 50 ml).

2. Se adaugă 25 ml soluție-L proaspătă și ampicilina (30 mg/ml).

3. Creșterea celulelor, cu agitare, 2...6 h, la tempeatura, de 3O°C.

4. Rotirea celulelor într-o eprubetă, cu 50 ml polipropilenă, într-o centrifugă clinică tip IEC, la 3/4 din turație.

5. Resuspendarea celulei aglomerate, în 10 ml TES

6. Se adaugă 30 mg lyzozym și se incubează 2 h, la temperatura, de 37 °C.

7. Se adaugă 200 ml 20% SDS și 400 ml Proteinază K (20 mg/ml). Se incubează, la temperatura, de 37°C.

8. Se adaugă 200 ml Proteinază K proaspătă. Se incubează o oră, la temperatura, de 55°C. Se adaugă 5 ml TES (TES = 50mM, pH=8,O, 100 mM EDTA, 15 mM NaCI), astfel, încât în final să fie un volum, de 15 ml.

9. Se extrage în două rânduri cu fenol (10 ml fenol, rotiți la temperatura camerei, la 3/4 din turație, într-o centrifugă clinică tip IEC). Se transferă supernatantul într-un tub curat prevăzut cu o pipetă cu diametru mare.

10. Se extrage deodată 1:1 voi. fenol:cloroform/isoamyl alcool (raport 24:1).

RO 117111 Bl

1030

11. Se precipită ADN-ul cu un volum egal de isopropanol rece; se centrifughează pentru aglomerarea sub formă de placă a ADN-ului.

12. Se resuspendă aglomeratul în 5 ml TE.

13. Se precipită ADN-ul, cu 0,5 ml 3M NaOAc, pH=5,2 și 11 ml 95% etanol. Se depozitează, la temperatura, de -20°C, timp, de 2 h.

14. Se „agață ADN-ul din tub cu un cadru de plastic, se transferă într-un tub microfug, se centrifughează, se pipetează etanolul în exces, se usucă în vid.

15. Se resuspendă, în 0,5 ml TE. Se incubează 90 min, la temperatura, de 65°C pentru a ajuta ADN-ul să treacă în soluție.

16. Se determină concentrația utilizând proceduri standard.

Clonarea cosmidei tulpinii AB78

Toate procedurile (numai în cazul în care nu se indică altfel) s-au realizat în conformitate cu Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, Cat. nr. 251301.

în general, etapele au fost după cum urmează:

A. Digestie parțială de restricție Sau 3A a ADN-ului tulpinii AB78.

B. Prepararea vectorului ADN

C. Legarea și învelirea ADN-ului

D. Titrarea informației genetice a cosmidei

1. Se prepară o cultură de celule HB prin plasarea unei culturi crescute peste noapte, în 5 ml de TB, cu 0,2% maltoză. Se incubează 3,5 h, la temperatura, de 37 °C.

2. Se centrifughează celulele și se resuspendează, în 0,5 ml 10 mM MgSO₄.

3. Se amestecă:

100 ml celule

100 ml amestec de învelire diluat

100 ml 10 mM MgSO₄ ml TB

4. Se adsoarbe, la temperatura camerei, timp, de 30 min, fără agitare.

5. Se adaugă 1 ml TB și se amestecă ușor. Se incubează 30 min, la temperatura, de 37 °C.

6. Se întind 200 ml pe plăcile L-amp. Se incubează peste noapte, la temperatura de 37 °C.

Cel puțin 400 clone ale cosmidei au fost selectate pentru acțiune împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului descris în exemplul 3. ADN-ul din 5 clone active și 5 clone inactive a fost folosit în hibridări sudice. Rezultatele au demonstrat că hibridarea utilizând eșantionul de oligonucleotidă descris mai sus este corelată cu acțiunea viermelui vestic de rădăcină al porumbului (tabelul 18).

Clonele cosmidei P3-12 și P5-4 au fost depuse la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) și li s-au dat numerele de acces B-21061 și, respectiv, B-21059.

1035

1040

1045

1050

1055

1060

1065

RO 117111 Bl

Tabelul 18

Acțiunea clonelor cosmidei tulpinii AB78 împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului

Clona	Media procentuală a mortalității (N=4)
Clone care hibridează cu eșantionul
P1-73	47
P1-83	64
P2-2	69
P3-12	85
P5-4	97
Clone care nu hibridează cu eșantionul
P1-2	5
P3-8	4
P3-9	12
P3-18	0
P4-6	9

Exemplul 10. Identificarea unei regiuni active de 6 kb împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului

ADN-ul din P3-12 a fost digerat parțial cu enzima de restricție sau 3A, și legat în vectorul pUCI9 al E. coli și transformat în £ coli. Un eșantion ADN specific pentru proteina, de 80 kDa a fost sintetizată prin amplificarea PCR a unei porțiuni de ADN P3-12. Oligonucleotidele MK113 și MK117, care hibridează la porțiuni din VIP-1, au fost sintetizate prin utilizarea secvenței parțiale de aminoacid al proteinei de 80 kDa. Subclonele plasmidelor au fost identificate prin hibridarea în colonie a eșantionului PCR și testate în ceea ce privește acțiunea lor împotriva viermelui vestic de rădăcină. Unul din aceste clone, PL2, hibridează la fragmentul PCR și este activ împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului, conform probei biologice descrise anterior.

Un fragment restrictiv 6kb Cla I din PL2 a fost donat în Sma I al vectorului oscilant pHT31O1 al E. coli-Bacillus (Lereclus, D. et al, 1989, FEMS Microbiology Letters 60:211-218) pentru a obține pCIB6201. Această configurație conferă acțiune anti-vierme vestic de rădăcină al porumbului la ambele tulpini de Bacillus și £ coli, în orice orientare.

pCIB6O22 conține același fragment 6 kb Cla I în pBluescript SK(+) (Stratagene), produce proteina VIP-1 echivalentă și este, de asemenea, activă împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului.

Secvența de nucleotide al pCIP6O22 a fost determinată prin metoda terminației dideoxi a lui Stanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977), utilizând PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits și PRISM Sequenase Terminator Double-StrandedADN Sequencing Kit și analizat pe ordonatorul automat ABI 373. Secvența este dată în SEQ ID NO:I care cuprinde SEQ ID NO:4 codificând proteina VIP-1, de 1OOkDa definită în secvența SEQ ID N0:5.

RO 117111 Bl pCIB6O22 a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture

Collection, (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University 1110

Street, Peoria, lllinois 61604, USA, și i s-a dat numărul de acces NRRL B-21222.

Exemplul 11. Disecția funcțională a regiunii VIP-1 din ADN

Pentru a confirma necesitatea cadrului deschis de citire (ORF) al VIP-1 pentru acțiunea insecticidă, a fost creată în genă o mutație. Enzima restrictivă Bgl II recunoaște un singur locus localizat 1758 bp în regiunea codificatoare a VIP-1. pCIB6201 1115 a fost digerat cu Bgl II și capetele cu un singur fir umplute cu ADN polimerază (fragment Klenow) și dNTPS.PIasmida a fost relegată și transformată în E. coli. Plasmida rezultantă, pCIB6203,conține o inserție cu 4 nucleotide în regiunea codificatoare a VIP-1.

pCIB6203 nu conferă acțiune insecticidă, confirmând că VIP-1 este un 1120 component esențial al acțiunii viermelui vestic de rădăcină al porumbului.

Pentru a defini mai departe regiunea necesară codificării VIP-1, subclonele regiunilor VIP-1 și VIP-2 (proteina auxiliară) au fost construite și testate pentru capacitatea lor de a întregi mutația în pCIB6203.

pCIB6023 conține fragmentul 3,7 kb Xba l-EcoRV în pBluescript SK(+) 1125 (Stratagene). Analiza petei vestice indică faptul că pCIB6023 produce proteina VIP-1 în cantitate și de mărime egală ca și clonele PL2 și pCIB6022.

pCIB6023 conține gena întreagă pentru proteina 80 kd.

pCIB6023 a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University 1130 Street, Peoria, lllinois 61604, USA, și i s-a dat numărul de acces NRRL B-21223.

pCIB6O23 prezintă oarecare acțiune. Oricum nivelul acțiunii este mai scăzut decât cel al pCIB6022. Un amestec de celule care conține pCIB6203 (VIP-1 mutat și VIP-2) și celule care conțin pCIB6023 (numai VIP-1) prezintă o acțiune crescută împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului. Astfel, pCIB6023 trebuie să pro- 1135 ducă produs genetic funcțional VIP-1 și pCIB6203 trebuie să producă produs genetic funcțional VIP-2. Aceste rezultate sugerează o cerere suplimentară de produs genetic din regiunea VIP-2, în combinație cu VIP-1, pentru a conferi o acțiune maximă împotriva viermelui vestic de rădăcină al porumbului. (Vezi tabelul 19).

Tabelul 191140

Caracterizarea lui pCIB 6022 c x s m b vn»irv c

1

JOOlp

1-----------------------------------------------------------------------------1

L

J

Configurații testate	Acțiunea contra WCRW
pCIB6022	+++	1145

pCIB6023	+
PCIB6203		1150

pCIB6203 pCIB6023 +++

RO 117111 Bl

Regiunile încadrate reprezintă cantitatea de VIP-1. Porțiunile deschise la culoare indică regiunile care codifică peptida de 80 kDa observată în Bacillus. Porțiunile închise la culoare reprezintă aminoacizii N-terminali stabiliți la secvența ADN al VIP-1.

Săgețile reprezintă configurații transcrise de promotorul beta-galactosidază.

Locurile de restricție: C-Cla; X-Xba I; S-Sca I; Rl-Eco Rl; B-Bgl II; RV-Eco RV.

Exemplul 12. Producția de anticorpi a tulpinii AB78

Producția de anticorpi a fost inițiată în doi șobolani rasa Lewis pentru a le permite ambilor să producă linii celulare hibridoma și să producă, de asemenea, suficient ser pentru selectarea limitată a informației din cADN. Alt factor a fost cantitatea foarte limitată de antigen disponibilă și faptul că acesta putea fi purificat numai prin PAGE și apoi, prin electrotransfer pe nitroceluloză.

Datorită disponibilității limitate a antigenului pe nitroceluloză, aceasta din urmă a fost emulsificată în DMSO și injectată în labele din spate ale animalelor pentru a favoriza producerea de celule-B în ganglionii limfatici popliteali aflați chiar deasupra. Un ser cu reacție puternică a fost produs prin analiza vestică în prima producție obținută prin sângerare. Mai multe injecții și sângerări consecutive au produs suficient ser pentru a realiza selecția necesară.

Atunci, producția de hibridoma a fost inițiată cu unul dintre șobolani. Ganglionul limfatic popliteal a fost extras, macerat și celulele rezultante au fost amestecate cu mielom mouis P3x63Ag8,653. Selectarea în continuare a celulelor s-a făcut în modul descris mai jos. Au fost selectate pentru a fi agitate patru surse inițiale care dădeau cea mai puternică reacție antigenă emulsificată la donarea cu diluție limitată. Zece surse adiționale au fost alese pentru exprimare și păstrare la rece.

Procedura de emulsionare a tulpinii AB78 pe nitroceluloză în DMSO pentru selectare tip ELISA:

După electrotransferul eșantioanelor tulpinilor AB78 și transferarea lor prin PAGE în nitroceluloză, tulpina reversibilă Ponceanus este utilizată la vizualizarea tuturor proteinelor transferate.

Banda corespuzătoare toxinei tulpinii AB78, identificată anterior și ordonată Nterminal, este identificată și extrasă din nitroceluloză. Fiecare bandă are o mărime de 1 mm x 5 mm în scopul minimalizării cantității de nitroceluloză emulsionată. O singură bandă este plasată într-un tub centrifugal cu 250 pl de DMSO și macerată cu ajutorul unui pistil de plastic (Kontes, Vineland, NJ]. Pentru a ajuta emulsionarea, amestecul DMSO este încălzit, timp, de 2...3 min, la temperatura, de 37... 45°C. 0 macerare ulterioară ar putea fi necesară după încălzire; oricum, toată nitroceluloza ar trebui să fie emulsionată. O data emulsionat, eșantionul AB78 este plasat pe gheață. în pregătirea microtitrării se acoperă placa cu antigen emulsionat, iar eșantionul trebuie diluat în soluție-tampon salină borată după cum urmează: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:5O, 1:100 și O. Antigenul de învelire trebuie pregătit imediat înaintea utilizării.

Protocolul ELISA;

1. Acoperire cu AB78/DMS0 în BBS. Incubare peste noapte, la temperatura, de 4°C.

2. Spălarea plăcii 3X cu tampon de spălare 1X ELISA.

3. Menținere, timp, de 30 min, la temperatura camerei (1% BSA & 0,05% Tween 20 în BPS).

4. Spălarea plăcii 3X cu tampon de spălare 1X ELISA.

RO 117111 Bl

1205

5. Se adaugă ser de șobolan. Se incubează, la temperatura, de 37°C.

6. Spălarea plăcii 3X cu tampon de spălare 1X ELISA.

7. Se adaugă anti-șobolan preparat pe capră cu o concentrație de 2 pg/ml, în diluent ELISA. Se incubează o oră, la temperatura, de 37°C.

8. Spălarea plăcii 3X cu tampon de spălare 1X ELISA.

9. Se adaugă fosfatază alcalină anti-capră preparata pe iepure cu concentrația 2 pg/ml în diluent ELISA.

10. Spălarea 3X cu tampon de spălare 1X ELISA.

11. Se adaugă substrat. Se incubează 30 min, la temperatura camerei.

12. După 30 min se oprește incubarea cu adaos NaOH soluție 3N.

Exemplul 13. Activarea acțiunii insecticide a tulpinilor Bacillus thuringiensis inactive cu ajutorul clonelor AB78 VIP

Adăugând pCIB6203 la supematant de cultură dintr-o tulpină Bacillus thuringiensis GC91, are loc o mortalitate 100% a Diabrotica virgifera virgifera. Luate separat, nici pCIB6203, nici GC91 nu sunt active împotriva Diabrotica virgifera virgifera. Datele sunt prezentate mai jos:

1210

1215

Materialul testat	Mortalitatea în procente a Diabrotica
PCIB62O3	0
GC91	16
PCIB62O3+GC91	100
Control	0

1220

Exemplul 14. Izolarea și acțiunea biologică a tulpinii B. cereus AB81

Un a doua tulpină Bacillus cereus, numită ΑΒΘ1, a fost izolată din eșantioane de praf de siloz prin metodologii standard. O subcultură a tulpinii AB81 a fost crescută și preparată pentru a fi proba biologică, așa cum este descris în exemplul 2. Acțiunea biologică a fost evaluată, așa cum s-a descris în exemplul 3. Rezultatele sunt după cum urmează:

1225

1230

Specii de insecte testate	Procentul de mortalitate
Ostrinia nubilalis	0
Agrotis ipsilon	0
Diabrotica virgifera virgifera	55

1235

Exemplul 15. Izolarea și acțiunea biologică a tulpinii B. thuringiensis AB6

O tulpină Bacillus thuringiensis, denumită AB6, a fost izolată din eșantioane de praf de siloz prin metode standard cunoscute în tehnică. O subcultură a tulpinii AB6 a fost crescută și preparată pentru a fi testată biologic după cum este descris, în exemplul 2. Jumătate din eșantion a fost autoclavat 15 min, în scopul testării prezenței beta-exotoxinei.

1240

RO 117111 Bl

Acțiunea biologică a fost evaluată după cum este descris, în exemplul 3.

Rezultatele sunt următoarele:

Specii de insecte testate	Procentul de mortalitate
Ostrinia nubilalis	O
Agrotis ipsilon	1OO
Agrotis ipsilon [eșantion autoclavat]	0
Diabrotica virgifera virgifera	0

Tulpina AB6 a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA, și are numărul de acces NRRL B-21O6O.

Exemplul 16. Izolarea și acțiunea biologică a tulpinii B. thurigiensis AB88 tulpină Bacillus thuringiensis, denumită AB88, a fost izolată din eșantioane de praf de siloz prin metode standard. 0 subcultură de tulpină AB88 a fost crescută și preparată pentru a fi testată biologic, așa cum este descris, în exemplul 2. Jumătate din eșantion a fost autoclavat 15 min, pentru a testa prezența beta-toxinei. Acțiunea biologică a fost evaluată împotriva unui număr de specii de insecte descrise, în exemplul 3. Rezultatele sunt după cum urmează:

Specii de insecte testate	Clasa	Mortalitatea procentuală a supernatantului de cultură
Neautoclavat	Autoclavat
Agrotis ipsilon	Lepidoptere	100	5
Ostrinia nubilalis	Lepidoptere	100	0
Spodoptera frugiperda	Lepidoptere	100	4
Helicoverpa zea	Lepidoptere	100	12
Heliothis virescens	Lepidoptere	100	12
Leptinotarsa decemlineata	Coleoptere	0	0
Diabrotica virgifera virgifera	Coleoptera	0	5

Cristalele de delta-endotoxină au fost purificate din tulpina AB88 prin metode standard. Nu a fost observată nici o acțiune din partea cristalelor pure împotriva

Agrotis ipsilon, atunci când au fost testate biologic.

RO 117111 Bl

1285

Exemplul 17. Purificarea VIP din tulpina AB88

Cultura de lichid bacterian a fost crescută o noapte, la temperatura, de 3O°C în mediu TB. Celulele au fost eliminate și supernatantul a fost păstrat. Proteinele au fost precipitate cu sulfat de amoniu (saturație 70%), centrifugate și sedimentul astfel obținut s-a păstrat. Sedimentul a fost resuspendat în volumul inițial, de 20 mM Tris, pH=7,5 și dializat pe același tampon. Dializatul tulpinii AB88 este mai tulbure decât alt material comparabil obținut din tulpina AB78. Proteinele tulpinii AB88 au fost separate după clarificare prin mai multe metode diferite, care includ focalizarea izoelectrică (Rotofor, BioRad, Hercules, CA), precipitare la pH=4,5, cromatografie cu schimb de ioni, cromatografie prin faza staționară de mărime și ultrafiltrare.

Proteina activă împotriva sfredelului european al porumbului a rămas în sedimentul obținut prin precipitarea dializatului, la pH=4,5. Când IEF pregătitor a fost făcut pe dializat, utilizând amfoliți pH=3...1O, acțiunea insecticidă a ECB a fost găsită în toate fracțiunile cu pH, de valoarea 7 sau mai mare.

SDS-PAGE al acestor fracțiuni a prezentat benzi de proteine de masă moleculară aproximativ egală, cu 60 kDa și aproximativ 80 kDa. Benzile de 60 kDa și 80 kDa au fost separate prin schimb de ioni HPLC pe o coloană Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). Secvența N-terminală a fost obținută din două fracțiuni ce conțin proteine de masă moleculară ușor diferite, dar amândouă având dimensiunea, de aproximativ 60 kDa. Secvențele obținute se aseamănă, atât între ele, cât și cu unele delta-endotoxine.

Fracțiunea de schimb anionică 23 (mai mică): xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID NO: 10)

Fracțiunea de schimb anionică 28 (mai mare): xEYENVEPFVSAx (SEQ ID NO: 11) Când sedimentul (activ), cu pH=4,5 a fost separat mai departe prin schimb de anioni pe o coloană Poros-Q, acțiunea a fost găsită numai în fracțiunile cu o bandă majoră, de aproximativ 60 kDa.

Proteina activă împotriva viermelui negru tăietor a rămas, de asemenea. în sediment, când dializatul tulpinii AB88 a fost coborât, la pH=4,5.

Folosind amfoliți pH=3...10în IEF pregătitor, acțiunea nu a fost descoperită în fracțiunile IEF ECB-active; în schimb, avea o fracțiune mai mare, de pH=4,5... 5,0.

Compușii săi majori au greutăți moleculare, de aproximativ 35 și 80 kDa.

Sedimentul,cu pH=4,5 a fost separat prin schimb de anioni HPLC în fracțiuni care conțin numai materialul, de 35 kDa și fracțiuni care conțin, atât benzi, de 35 kDa, cât și 80 kDa.

Exemplul 18. Caracterizarea VIP al tulpinii AB88

Fracțiuni care conțin feluritele proteine vegetale active împotriva Lepidopterelor au fost generate după cum s-a descris, în exemplul 17. Analiza fracțiunilor active a demonstrat că diferiții VIP sunt răspunzători de acțiunea împotriva diferitelor specii, de Lepidoptere.

Acțiunea Agrotis ipsilon este datorată unei proteine, de 80 kDa sau 35 kDa, care este singură sau în combinație. Aceste proteine nu sunt înrudite cu nici una din delta-endotoxinele Bacillus thuringiensis, după cum s-a evidențiat prin lipsa omologiei de secvență cu secvențele cunoscute de delta-endotoxină. De asemenea, aceste proteine nu se găsesc în cristalul delta-endotoxină AB88. Secvențele N-terminale ale proteinelor delta-endotoxine majore au fost comparate cu secvențele N-terminale ale VIP, de 80 kDa și 35 kDa și nu s-a descoperit nici o omologie de secvență. Sumarul rezultatelor este următorul:

1290

1295

1300

1305

1310

1315

1320

1325

RO 117111 Bl

Secvențe N-terminale VIP Agrotis	Secvența N-terminală al proteinelor majore detal-endotoxine
80 kDa	130 kDa MDNNPNINE (SEQ ID NO: 14) 80 kDa
MNKNNTKLPTRALP (SEQ ID NO: 12]	MDNNPNINE (SEQ ID NO: 15) 60 kDa
35 kDa ALSENTGKDGGYIVP [SEQ ID NO: 13)

Acțiunea Ostriniei nubilalis se datorează unui VIP.de 60 kDa și acțiunea Spodopterei frugiperda se datorează unui VIP de mărime necunoscută.

Tulpina AB88 a Bacillus thuringiensis a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA și are numărul de acces NRRL B-21225.

Exemplul 19. Izolarea și acțiunea biologică a altor specii de Bacillus

Au fost izolate alte specii de Bacillus care produc proteine cu acțiune insecticidă în timpul creșterii vegetative. Aceste tulpini au fost izolate din eșantioane ale mediului înconjurător, prin metode standard. Tulpinile izolate au fost pregătite pentru a fi studiate biologic și apoi, au fost testate după cum s-a descris, în exemplele 2 și, respectiv, 3. Tulpinile izolate care au produs proteine insecticide în timpul creșterii vegetative, cu acțiune împotriva Agrotis ipsilon, sunt date în tabelul de mai jos:

Bacillus izolat	Prezența cristalului de deltaendotoxină	Procentul de mortalitate
AB6	+	100
AB53	-	80
AB88	+	100
AB195	-	60
AB211	-	70
AB217	-	83
AB272	-	80
AB279	-	70
AB289	+	100
AB292	+	80
AB294	-	100
AB300	-	80
AB359	-	100

RO 117111 Bl

Tulpinile izolate AB289, AB294 și AB359 au fost depuse la Agricultural

Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research 1370

Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA, și au numerele de acces NRRL B-21227, NRRL B-21229 și,respectiv, NRRL B-21226.

Tulpinile de Bacillus care produc proteine insecticide în timpul creșterii vegetative, cu acțiune împotriva Diabrotica virgifera virgifera sunt date în tabelul de mai jos. 1375

Bacillus izolat	Prezența cristalului de deltaendotoxină	Procentul de mortalitate
AB52	-	50
AB59	-	71
AB68	+	60
AB78	-	100
AB122	-	57
AB218	-	64
AB256	-	64

1380

1385

Tulpinile izolate AB59 și AB256 au fost depuse la Agricultural Research Service, Patent Culture Collrctio (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA, și au numerele de acces NRRL B-21228 și respectiv B-21230.

Următoarele depozite au fost constituite la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA:

1390

1. E. coli PL 2	nr. acces NRRL B-21221
2. E. coli pCIB 6022	nr. acces NRRL B-21222	1395
3. E. coli pCIB 6023	nr. acces NRRL B-21223
4. Bacillus thuringiensis HD73-78 VIP	nr. acces NRRL B-21224
5. Bacillus thuringiensis AB88	nr. acces NRRL B-21225
6. Bacillus thuringiensis AB359	nr. acces NRRL B-21226
7. Bacillus thuringiensis AB289	nr. acces NRRL B-21227	1400
8. Bacillus sp. AB59	nr. acces NRRL B-21228
9. Bacillus sp. AB294	nr. acces NRRL B-21229
10. Bacillus sp. AB256	nr. acces NRRL B-21230
11. E. coli P 5-4	nr. acces NRRL B-21059
12. E. coli P 3-12	nr. acces NRRL B-21061	1405
13. Bacillus cereus AB78	nr. acces NRRL B-21058
14. Bacillus thuringiensis AB6	nr. acces NRRL B-21060

RO 117111 Bl

Lista de secvențe ale proteinelor pesticide (1) Informații generale:

(1) Titular: CIBA-GEIGY AG, CH-4OO2 Klybeckstrasse 191, Basel, Elveția (A) Inventatori: Gregory W. Warren, SUA; Michael G. Koziel, SUA; Martha A. Mullins, SUA; Gordon J. Nye, SUA; Brian Carr, SUA; Nalini Manaj Desai, SUA și N. Kristy Kostichka, SUA.

(ii) Titlul invenției: Noi proteine și varietăți pesticide (iii) Numărul de secvențe: 18 (vi) Data priorității cererii:

(A) Nr. cererii: US O8/O37O57; (B) Data depunerii: 25 martie 1993 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 1:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 6106 perechi de baze (b) tip: acid nucleic (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: ADN (genomic) (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus cereus (b) varietate: AB78 (c) izolat individual: NRRL B-21058 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: CDS (b) localizare: 1082...1810 (d) alte informații: /product= „VIP-2“ /label= orf-1 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: CDS (b) localizare: 1925...2470 (d) alte informații: /product= „vip-2 /label= orf-2 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 1:

ATCGATACAA TGIIGI11 IA CTTAGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT 60

CTTTACTTTG ATACATTTTA ATAGCCATTT CAACCTTATC AGTATGTTTT

TGTGGTCTTC120

CTCCTTT111 TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TTAATCCTGT TTTGGTACGT

TCGCTAATAA180

TATCTCTTTC TAATTCTGGA ATACTTGCCA TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT 240

TAGAGGTATC AATGTTGTCA TGAATAGAAA TAAAATCTAC ACCTAGCTCT TTGAATTITT 300

CACTTAACTC AATTAGGTGT TTTGTAGAGC GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA

360

RO 117111 Bl

TCTTATCGCCTTTACGTAAT ACTTTTAGCA ACTCTTCGAG TTGAGGGCGC TCTTI ΓΤΙ IA 420

TTCCTGTTAT TTTCTCCTGA TATAGCCTTT CTACACCATA TTGTTGCAAA GCATCTATT480 GCATATCGAG ΑΓΙ ΙIGTICTTCTGTGCTGA CACGAGCATA ACCAAAAATC AAAKGGTTT 540

CACTTCCTAT CTAAATATAT CTATTAAAAT AGCACCAAAA ACCTTATTAA ATTAAAATAA

600

GGAACTTTGT TTTTGGATAT GGATTKGGT ACTCAATATG GATGAGTTTT TAACGCTTTT

660

GTTAAAAAAC AAACAAGTGC CATAAACGGT CGI Π II GGG ATGACATAAT AAATAATCTG 720

TTTGATTAAC CTAACCTTGT ATCCTTACAG CCCAGTTTTA TTTGTACTTC AACTGACTGA

780

ATATGAAAAC AACATGAAGG TTTCATAAAA ΠΤΑΤΑΤΑΚ KCCATAACG GATGCTCTAT 840

CTTTAGGTTA TAGTTAAATT ATAAGAAAAA AACAAACGGA GGGAGTGAAA

AAAAGCATCT 900

TCTCTATAAT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAAT AAATATGAAT 960

ATCTATCTAT AATTGTTTGC KCTACAATA ACTTATCTAA CTTTCATATA CAACAACAAA 1020

ACAGACTAAA TCCAGAKGT ATAKCAKT TCAGKGKC CKTATAAAA TAATTTCATA 1080

A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG KG KT ATG GTG TCA AAA AAA TTA1126

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu 15 1015

CAA GTA GTT ACT AAA ACT GTA TTG CTT AGT ACA GTT TTC TCT ATA TCT 1174

Gin Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser lle Ser

2530

TTA TTA AAT AAT GAA GTG ATA AAA GCT GAA CAA TTA AAT ΑΤΑ AAT TCT 1222

Leu Leu Asn Asn Glu Val lle Lys Ala Glu Gin Leu Asn lle Asn Ser

4045

CAA AGT AAA TAT ACT AAC KG CAA AAT CTA AAA ATC ACT GAC AAG GTA 1270

Gin Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val

5560

GAG GAT TTT AAA GAA GAT AAG GAA AAA GCG AAA GAA TGG GGG AAA GAA 1318

Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu

70 75

AAA GAA AAA GAG TGG AAA CTA ACT GCT ACT GAA AAA GGA AAA ATG AAT 1366

Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn

85 90 95

AAT KT KA GAT AAT AAA AAT GAT ATA NAG ACA AAT TAT AAA GAA AK 1414

Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp lle Xaa Thr Asn Tyr Lys Glu lle

100 105 110

1455

1460

1465

1470

1475

1480

1485

1490

1495

RO 117111 Bl

1462

1510

1558

1606

1654

1702

1750

1798

ACT TTT TCT ATG GCA GGC TCA TTT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA AAA

Thr Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys

115 120125

GAA ATT GAT AAG ATG TTT GAT AAA ACC AAT CTA TCA AAT TCT ATT ATC

Glu Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile

130 135140

ACC TAT AAA AAT GTG GAA CCG ACA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA

Thr Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu

145 150155

ACA GAA GGT AAT ACG ATT AAT TCT GAT GCA ATG GCA CAG TTT AAA GAA

Thr Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu

160 165 170175

CAA TTT TTA GAT AGG GAT ATT AAG TTT GAT AGT TAT CTA GAT ACG CAT

Gin Phe Leu Asp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His

180 185190

TTA ACT GCT CAA CAA GTT TCC AGT AAA GAA AGA GTT ATT TTG AAG GTT

Leu Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val

195 200205

ACG GTT CCG AGT GGG AAA GGT TCT ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC

Thr Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val

210 215220

ATT TTA AAT AAT AGT GAA TAC AAA ATG CTC ATT GAT AAT GGG TAT ATG

Ile Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met

225 230235

GTC CAT GTA GAT TAAGGTATCA AAAGTGGTGA AAAAAGGGGG TGGAGTGCCT

Val His Val Asp

240

TACAAATTGA AGGGACTTTA AAAAAGAGTC TTGACTTTAA AAATGATATA AATGCTGAAG 1910

CGCATAGCTG GGGT ATG AAG AAT TAT GAA GAG TGG GCT AAA GAT TTA ACC 1960

Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr

510

GAT TCG CAA AGG GAA GCT TTA GAT GGG TAT GCT AGG CAA GAT TAT AAA

Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp Tyr Lys

2025

GAA ATC AAT AAT TAT TTA AGA AAT CAA GGC GGA AGT GGA AAT GAA AAA

Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys

3540

CTA GAT GCT CAA ATA AAA AAT ATT TCT GAT GCT TTA GGG AAG AAA CCA

Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro

50 5560

ATA CCG GAA AAT ATT ACT GTG TAT AGA TGG TGT GGC ATG CCG GAA TTT

Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe

7075

1850

2008

2056

2104

2152

RO 117111 Bl

GGT TAT CAA ATT AGT GAT CCG TTA CCT TCT TTA AAA GAT TTT GAA GAA

Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu

85 90

CAA TTT TTA AAT ACA ATC AAA GAA GAC AAA GGA TAT ATG AGT ACA AGC

Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser

100 105

TTA TCG AGT GAA CGT CTT GCA GCT TTT GGA TCT AGA AAA ATT ATA TTA

2200

2248

2296

1545

1550

Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile Ile Leu

110 115120

CGA TTA CAA GTT CCG AAA GGA AGT ACG GGT GCG TAT TTA AGT GCC ATT 2344

Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Ile

125 130 135140

GGT GGA TTT GCA AGT GAA AAA GAG ATC CTACTT GAT AAA GAT AGT AAA 2392

Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys

145 150155

1555

TAT CAT ATT GAT AAA GTA ACA GAG GTA ATT ATT AAA GGT GTT AAG CGA 2440

1560

Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys Gly Val Lys Arg

160 165 170

TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT TAAGGAGATG AAAAATATGA 2490

Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn

175 180

AGAAAAAGTT AGCAAGTGTT GTAACGTGTA CGTTATTAGC TCCTATGTTT TTGAATGGAA

1565

2550

ATGTGAATGC TGTTTACGCA GACAGCAAAA CAAATCAAAT TTCTACAACA

CAGAAAAATC 2610

AACAGAAAGA GATGGACCGA AAAGGATTAC TTGGGTATTA TTTCAAAGGA

AAAGATTTTA 2670

GTAATCTTAC TATGTTTGCA CCGACACGTG ATAGTACTCT TATTTATGAT CAACAAACAG

1570

2730

CAAATAAACT ATTAGATAAA AAACAACAAG AATATCAGTC TATTCGTTGG ATTGGTTTGA

2790

TTCAGAGTAA AGAAACGGGA GATTTCACAT TTAACTTATC TGAGGATGAA CAGGCAATTA 2850

TAGAAATCAA TGGGAAAATT ATTTCTAATA AAGGGAAAGA AAAGCAAGTT GTCCATTTAG

2910

AAAAAGGAAA ATTAGTTCCA ATCAAAATAG AGTATCAATC AGATACAAAA TTTAATATTG

1575

1580

2970

ACAGTAAAAC ATTTAAAGAA CTTAAATTAT TTAAAATAGA TAGTCAAAAC CAACCCCAGC

3030

AAGTCCAGCA AGATGAACTG AGAAATCCTG AATTTAACAA GAAAGAATCA

CAGGAATTCT 3090

TAGCGAAACC ATCGAAAATA AATCTTTTCA CTCAAMAAAT GAAAAGGGAA

ATTGATGAAG 3150

ACACGGATAC GGATGGGGAC TCTATTCCTG ACCTTTGGGA AGAAAATGGG TATACGATTC 3210

AMAATAGAAT CGCTGTAAAG TGGGACGATT CTCTAGCAAG TAAAGGGTAT

1585

1590

ACGAAATTTG 3270

RO 117111 Bl

TTTCAAATCC ACTAGAAAGT CACACAGTTG GTGATCCTTA TACAGATTAT GAAAAGGCAG

3330

CAAGAGATCT AGATTTGTCA AATGCAAAGG AAACGTTTAA CCCATTGGTA GCTGCTTTTC 3390

CAAGTGTGAA TGTTAGTATG GAAAAGGTGA TATTATCACC AAATGAAAAT TTATCCAATA 3450

GTGTAGAGTC TCATTCATCC ACGAATTGGT CTTATACAAA TACAGAAGGT GCTTCTGTTG 3510

AAGCGGGGAT TGGACCAAAA GGTATTTCGT TCGGAGTTAG CGTAAACTAT CAACACTCTG 3570

AAACAGTTGC ACAAGAATGG GGAACATCTA CAGGAAATAC TTCGCAATTC

AATACGGCTT 3630

CAGCGGGATA TTTAAATGCA AATGTTCGAT ATAACAATGT AGGAACTGGT GCCATCTACG 3690

ATGTAAAACC TACAACAAGT TTTGTATTAA ATAACGATAC TATCGCAACT ATTACGGCGA 3750

AATCTAATTC TACAGCCTTA AATATATCTC CTGGAGAAAG TTACCCGAAA AAAGGACAAA 3810

ATGGAATCGC AATAACATCA ATGGATGATT TTAATTCCCA TCCGATTACA TTAAATAAAA 3870

AACAAGTAGA TAATCTGCTA AATAATAAAC CTATGATGTT GGAAACAAAC CAAACAGATG 3930

GTGTTTATAA GATAAAAGAT ACACATGGAA ATATAGTAAC TGGCGGAGAA

TGGAATGGTG 3990

TCATACAACA AATCAAGGCT AAAACAGCGT CTATTATTGT GGATGATGGG GAACGTGTAG 4050

CAGAAAAACG TGTAGCGGCA AAAGATTATG AAAATCCAGA AGATAAAACA

CCGTCTTTAA 4110

CTTTAAAAGA TGCCCTGAAG CTTTCATATC CAGATGAAAT AAAAGAAATA GAGGGATTAT 4170

TATATTATAA AAACAAACCG ATATACGAAT CGAGCGTTAT GACTTACTTA GATGAAAATA 4230

CAGCAAAAGA AGTGACCAAA CAATTAAATG ATACCACTGG GAAATTTAAA

GATGTAAGTC 4290

ATTTATATGA TGTAAAACTG ACTCCAAAAA TGAATGTTAC AATCAAATTG TCTATACTTT 4350

ATGATAATGC TGAGTCTAAT GATAACTCAA TTGGTAAATG GACAAACACA AATATTGTTT 4410

CAGGTGGAAA TAACGGAAAA AAACAATATT CTTCTAATAA TCCGGATGCT AATTTGACAT 4470

TAAATACAGA TGCTCAAGAA AAATTAAATA AAAATCGTGA CTATTATATA AGTTTATATA 9530

TGAAGTCAGA AAAAAACACA CAATGTGAGA TTACTATAGA TGGGGAGATT

TATCCGATCA 4590

CTACAAAAAC AGTGAATGTG AATAAAGACA ATTACAAAAG ATTAGATATT ATAGCTCATA

4650

1640

RO 117111 Bl

ATATAAAAAG TAATCCAATT TCTTCACTTC ATATTAAAAC GAATGATGAA ATAACTTTAT

4710

TTTGGGATGA TATTTCTATA ACAGATGTAG CATCAATAAA ACCGGAAAAT TTAACAGATT 4770

CAGAAATTAA ACAGATTTAT AGTAGGTATG GTATTAAGTT AGAAGATGGA ATCCTTATTG 4830 ataaaaaagg tgggattcat tatggtgaat ttattaatga agctagtttt aatattgaac

4890

CATTGCCAAA TTATGTGACC AAATATGAAG TTACTTATAG TAGTGAGTTA GGACCAAACG 9950

TGAGTGACAC ACTTGAAAGT GATAAAATTT ACAAGGATGG GACAATTAAA TTTGATTTTA 5010

CCAAATATAG TAAAAATGAA CAAGGATTAT TTTATGACAG TGGATTAAAT TGGGACTTTA 5070

AAATTAATGC TATTACTTAT GATGGTAAAG AGATGAATGT TTTTCATAGA TATAATAAAT 5130

AGTTATTATA TCTATGAAGC TGGTGCTAAA GATAGTGTAA AAGTTAATAT ACTGTAGGAT 5190

TGTAATAAAA GTAATGG AAT TGATATCGTA CTTTGGAGTG GGGGATACTT TGTAAATAGT 5250

TCTATCAGAA ACATTAGACT AAGAAAAGTT ACTACCCCCA CTTGAAAATG AAGATTCAAC 5310

TGATTACAAA CAACCTGTTA AATATTATAA GGTTTTAACA AAATATTAAA CTCTTTATGT 5370

TAATACTGTA ATATAAAGAG TTTAATTGTA TTCAAATGAA GCTTTCCCAC AAAATTAGAC 5430

TGATTATCTA ATGAAATAAT CAGTCTAATT TTGTAGAACA GGTCTGGTAT TATTGTACGT 5490

GGTCACTAAA AGATATCTAA TATTATTGGG CAAGGCGTTC CATGATTGAA TCCTCGAATG 5550

TCTTGCCCTT TTCATTTATT TAAGAAGGAT TGTGGAGAAA nATGGTTTA GATAATGAAG 5610

AAAGACTTCA CTTCTAATH TTGATGTTAA ATAAATCAAA ATTTGGCGAT TCACATTGTT

5670

TAATCCACTG ATAAAACATA CTGGAGTGTT CTTAAAAAAT CAGUI11111 CTTTATAAAA 5730

TTTTGCTTAG CGTACGAAAT TCGTGTTTTG TTGGTGGGAC CCCATGCCCA TCAACTTAAG 5790

AGTAAATTAG TAATGAACTT TCGTTCATCT GGATTAAAAT AACCTCAAAT TAGGACATGT 5850

TTTTAAAAAT AAGCAGACCA AATAAGCCTA GAATAGGTAT CATTTTTAAA AATTATGCTG 5910

Cinci 11IG TTTTCCAAAT CCATTATACT CATAAGCAAC ACCCATAATG TCAAAGACTG 5970

TTTTTGTCTC ATATCGATAA GCTTGATATC GAATTCCTGC AGCCCGGGGG ATCCACTAGT

6030

1645

1650

1655

1660

1665

1670

1675

1680

RO 117111 Bl

TCTAGAGCGG CCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT GAGGGTTAAG

6090

TTCGAGCTTG TCGTGG

6106 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 2:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 243 aminoacizi (b) tip: aminoacid (d] topologie: liniară (ii) tipul moleculei: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 2:

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu Gin

1015

Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser lle Ser Leu

2530

Leu Asn Asn Glu Val lle Lys Ala Glu Gin Leu Asn lle Asn Ser Gin

4045

Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val Glu

5560

Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys

70 7580

Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn

9095

Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp lle Xaa Thr Asn Tyr Lys Glu lle Thr

100 105110

Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu lle Lys Asp Leu Lys Glu

115 120125 lle Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser lle lle Thr

130 135140

Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr lle Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr

145 150 155160

Glu Gly Asn Thr lle Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin

165 170175

Phe Leu Asp Arg Asp lle Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu

180 185190

Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val lle Leu Lys Val Thr

195 200205

Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala G1y Va1 lle

210 215220

Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu lle Asp Asn Gly Tyr Met Val

225 230 235240

His Val

RO 117111 Bl (2) Informații pentru SEQ ID NO: 3:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 182 aminoacizi (b) tip: aminoacid (D) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO; 3:

Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin Arg

5 1015

Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp Tyr Lys Glu lle Asn Asn

2530

Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gin

4045 lle Lys Asn lle Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro lle Pro Glu Asn

5560 lle Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin lle

70 7580

Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn

9095

Thr lle Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu 100 105110

Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys lle lle Leu Arg Leu Gin Val

115 120125

Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala lle Gly Gly Phe Ala

130 135140

Ser Glu Lys Glu lle Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His lle Asp 145 150 155160

Lys Val Thr Glu Val lle lle Lys Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp

165 170175

Ala Thr Leu Leu Thr Asn

180 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 4:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 2655 perechi de baze (b) tip: acid nucleic (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: ADN(genomic) (iii) ipotetic: nu

1730

1735

1740

1745

1750

1755

1760

1765 ' (iii) anti-sens: nu

1770

RO 117111 Bl (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus cereus (b) varietate: AB78 (c) izolat individual: NRRL B-21O58 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: CDS (b) localizare: 1...2652 (c) metoda de identificare: experimentală (d) alte informații/product: = „proteina VIP-1, de 10O kDa“ /evidence= experimental (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 4:

ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA 48

Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu

5 1015

TTA GCT CCT ATG TTT TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC 96

Leu Ala Pro Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp

2530

AGC AAA ACA AAT CAA ATT TCT ACA ACA CAG AAA AAT CAA CAG AAA GAG 144

Ser Lys Thr Asn Gin lle Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin Lys Glu

4045

ATG GAC CGA AAA GGA TTA CTT GGG TAT TAT TTC AAA GGA AAA GAT TTT 192

Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe

5560

AGT AAT CTT ACT ATG TTT GCA CCG ACA CGT GAT AGT ACT CH ATT TAT 240

Ser Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu lle Tyr

70 7580

GAT CAA CAA ACA GCA AAT AAA CTA TTA GAT AAA AAA CAA CAA GAA TAT 288

Asp Gin Gin Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr

9095

CAG TCT ATT CGT TGG ATT GGT TTG ATT CAG AGT AAA GAA ACG GGA GAT 336

Gin Ser lle Arg Trp lle Gly Leu lle Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp

100 105110

TTC ACA TTT AAC TTA TCT GAG GAT GAA CAG GCA ATT ATA GAA ATC AAT 384

Phe Thr Phe Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gin Ala lle lle Glu lle Asn

115 120125

GGG AAA ATT ATT TCT AAT AAA GGG AAA GAA AAG CAA GTT GTC CAT TTA 432

Gly Lys lle lle Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val His Leu

130 135140

GAA AAA GGA AAA TTA GTT CCA ATC AAA ATA GAG TAT CAA TCA GAT ACA 480

Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro lle Lys lle Glu Tyr Gin Ser Asp Thr

145 150 155160

AAA TTT AAT ATT GAC AGT AAA ACA TTT AAA GAA CTT AAA TTA TTT AAA 528

Lys Phe Asn lle Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys

165 170175

RO 117111 Bl

ΑΤΑ GAT AGT CAA AAC CAA CCC CAG CAA GTC CAG CAA GAT GAA CTG AGA 576 lle Asp Ser Gin Asn Gin Pro Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu Leu Arg 180 185190

AAT CCT GAA TTT AAC AAG AAA GAA TCA CAG GAA TTC TTA GCG AAA CCA

Asn Pro Glu Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Pro

195 200205

TCG AAA ATA AAT CTT TTC ACT CAA MAA ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA

Ser Lys lle Asn Leu Phe Thr Gin Xaa Met Lys Arg Glu lle Asp Glu

210 215220

GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT

Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn

225 230 235240

GGG TAT ACG ATT CAM AAT AGA ATC GCT GTA AAG TGG GAC GAT TCT CTA Gly Tyr Thr lle Xaa Asn Arg lle Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu

245 250255

GCA AGT AAA GGG TAT ACG AAA TTT GTT TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC

Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His

260 265270

ACA GTT GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT GAA AAG GCA GCA AGA GAT CTA

Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu

275 280285

GAT TTG TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTT AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT

Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe

290 295300

CCA AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA

Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys Val lle Leu Ser Pro Asn Glu

305 310 315320

AAT TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr 325 330335

ACA AAT ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA GCG GGG ATT GGA CCA AAA GGT

Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly lle Gly Pro Lys Gly

340 345350

ATT TCG TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT CAA CAC TCT GAA ACA GTT GCA lle Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ala

355 360365

CAA GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT ACT TCG CAA TTC AAT ACG GCT

Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala

370 375 380

TCA GCG GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT CGA TAT AAC AAT GTA GGA ACT

Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr

385 390 395 400

GGT GCC ATC TAC GAT GTA AAA CCT ACA ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC

Gly Ala lle Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn

405 410 415

1820

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1825

1830

1835

1840

1845

1850

1855

1860

1248

RO 117111 Bl

GAT ACT ATC GCA ACT ATT ACG GCG AAA TCT AAT TCT ACA GCC TTA AAT Asp Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn

420 425430

ATA TCT CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA AAA GGA CAA AAT GGA ATC GCA Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala

435 440445

ATA ACA TCA ATG GAT GAT TTT AAT TCC CAT CCG ATT ACA TTA AAT AAA Ile Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys

450 455460

AAA CAA GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr 465 470 475480

AAC CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAG ATA AAA GAT ACA CAT GGA AAT ATA Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile Lys Asp Thr His Gly Asn Ile

485 430495

GTA ACT GGC GGA GAA TGG AAT GGT GTC ATA CAA CAA ATC AAG GCT AAA Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val ile Gin Gin Ile Lys Ala Lys

500 505510

ACA GCG TCT ATT ATT GTG GAT GAT GGG GAA CGT GTA GCA GAA AAA CGT Thr Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg

515 520525

GTA GCG GCA AAA GAT TAT GAA AAT CCA GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu

530 535540

ACT TTA AAA GAT GCC CTG AAG CTT TCA TAT CCA GAT GAA ATA AAA GAA Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu 545 550 555560

ATA GAG GGA TTA TTA TAT TAT AAA AAC ZXAA CCG ATA TAC GAA TCG AGC Ile Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser

565 570575

GTT ATG ACT TAC TTA GAT GAA AAT ACA GCA AAA GAA GTG ACC AAA CAA

Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin

580 585590

TTA AAT GAT ACC ACT GGG AAA TTT AAA GAT GTA AGT CAT TTA TAT GAT Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val Ser His Leu Tyr Asp

595 600605

GTA AAA CTG ACT CCA AAA ATG AAT GTT ACA ATC AAA TTG TCT ATA CTT Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu

610 615620

TAT GAT AAT GCT GAG TCT AAT GAT AAC TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn 625 630 635640

ACA AAT ATT GTT TCA GGT GGA AAT AAC GGA AAA AAA CAA TAT TCT TCT Thr Asn Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser

645 650655

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1-872

1920

1968

RO 117111 Bl

2016

1910

2064

AAT AAT CCG GAT GCT AAT TTG ACA TTA AAT ACA GAT GCT CAA GAA AAA

Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys

660 665 670

TTA AAT AAA AAT CGT GAC TAT TAT ATA AGT TTA TAT ATG AAG TCA GAA

Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu

675 680685

AAA AAC ACA CAA TGT GAG ATT ACT ATA GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC Lys Asn Thr Gin Cys Glu Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile

690 695700

ACT ACA AAA ACA GTG AAT GTG AAT AAA GAC AAT TAC AAA AGA TTA GAT Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp

705 710 715720

ATT ATA GCT CAT AAT ATA AAA AGT AAT CCA ATT TCT TCA CTT CAT ATT Ile Ile Ala His Asn Ile Lys Ser Asn Pro Ile Ser Ser Leu His Ile

725 730735

AAA ACG AAT GAT GAA ATA ACT TTA ΤΓΤ TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA Lys Thr Asn Asp Glu Ile Thr Leu Phe Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr

740 745750

GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu Asn Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys

755 760765

CAG ATT TAT AGT AGG TAT GGT ATT AAG TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile

770 775780

GAT AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser

785 790 795800

TTT AAT ATT GAA CCA TTG CCA AAT TAT GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr

805 810815

TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp

820 825830

AAA ATT TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser

835 840845

AAA AAT GAA CAA GGA TTA TTT TAT GAC AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe

850 855 860

AAA ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT

Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His

865 870 875 880

AGA TAT AAT AAA TAG

Arg Tyr Asn Lys

2112

2160

2208

2256

2304

2352

2400

2448

2496

2544

2592

2640

1915

1920

1925

1930

1935

1940

1945

1950

2655

RO 117111 Bl (2) Informații pentru SEQ ID NO: 5:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 884 aminoacizi (b) tip: aminoacid (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 5:

Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu 15 1015

Leu Ala Pro Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp 20 2530

Ser Lys Thr Asn Gin lle Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin Lys Glu

4045

Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe 50 5560

Ser Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu lle Tyr 65 70 7580

Asp Gin Gin Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr 85 9095

Gin Ser lle Arg Trp lle Gly Leu lle Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp 100 105110

Phe Thr Phe Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gin Ala lle lle Glu lle Asn 115 120125

Gly Lys lle lle Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val His Leu 130 135140

Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro lle Lys lle Glu Tyr Gin Ser Asp Thr 145 150 155160

Lys Phe Asn lle Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys 165 170175 lle Asp Ser Gin Asn Gin Pro Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu Leu Arg 180 185190

Asn Pro Glu Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Pro 195 200205

Ser Lys lle Asn Leu Phe Thr Gin Xaa Met Lys Arg Glu lle Asp Glu 210 215220

Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn 225 230 235240

Gly Tyr Thr lle Xaa Asn Arg lle Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu 245 250255

A1 a Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His 260 265270

Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu

275 280285

RO 117111 Bl

Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe 290 295300

Pro Ser Val Asn Val SerMet Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu 305 310 315320

Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr 325 330335

Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly Ile Gly Pro Lys Gly

340 345350

Ile Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ala 355 360365

Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala 370 375380

Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr 385 390 395400

Gly Ala Ile Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn

405 410415

Asp Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn 420 425430

Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala 435 440445

Ile Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys 450 455460

Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr 465 970 975480

Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile Lys Asp Thr His Gly Asn Ile

485 490495

Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val Ile Gin Gin Ile Lys Ala Lys

500 505510

Thr Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg 515 520525

Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu 530 535540

Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu 545 550 555560

Ile Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser

565 570575

Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin 580 585590

Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val Ser His Leu Tyr Asp 595 600605

Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu 610 615620

Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn 625 630 635640

Thr Asn Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser

645 650655

2000

2005

2010

2015

2020

2025

2030

2035

2040

RO 117111 Bl

Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys

660 665 670

Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu

675 680 685

Lys Asn Thr Gin Cys Glu Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile

690 695700

Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp 705 710 715720

Ile Ile Ala His Asn Ile Lys Ser Asn Pro Ile Ser Ser Leu His Ile

725 730735

Lys Thr Asn Asp Glu Ile Thr Leu Phe Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr 740 745750

Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu Asn Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys

755 760765

Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile

770 775780

Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser

785 790 795800

Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr

805 810815

Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp 820 825830

Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser 835 840845

Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe 850 855860

Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His 865 870 875880

ArgTyrAsn Lys (2) Informații pentru SEQ ID NO: 6:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 2004 perechi de baze (b) tip: acid nucleic (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: ADN(genomic) (iii) ipotetic: nu (iii) anti-sens: nu (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus cereus (b) varietate: AB78 (c) izolat individual: NRRL B-21058

RO 117111 Bl

2090 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: CDS (b) localizare: 1...2001 (c) metoda de identificare: experimentală (d) alte informații: /product= .80 kda protein VIP-1 “ /evidence= experimental

2095 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 6:

ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT Met Lys Arg Glu lle Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle

5 1015

CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT GGG TAT ACG ATT CAM AAT AGA ATC GCT

Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr lle Xaa Asn Arg lle Ala

2530

GTA AAG TGG GAC GAT TCT CTA GCA AGT AAA GGG TAT ACG AAA TTT GTT

Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val

4045

TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC ACA GTT GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT

Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr

5560

GAA AAG GCA GCA AGA GAT CTA GAT TTG TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTT

Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe

70 7580

AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT CCA AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys

9095

GTG ΑΤΑ TTA TCA CCA AAT GAA AAT TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT Val lle Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His

100 105110

TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT ACA AAT ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA

Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu

115 120125

GCG GGG ATT GGA CCA AAA GGT ATT TCG TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT

Ala Gly lle Gly Pro Lys Gly lle Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr

130 135140

CAA GAC TCT GAA ACA GTT GCA CAA GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT

Gin His Ser Glu Thr Val Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn

145 150 155160

ACT TCG CAA TTC AAT ACG GCT TCA GCG GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val

165 170 175

CGA TAT AAC AAT GTA GGA ACT GGT GCC ATC TAC GAT GTA AAA CCT ACA

Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly Ala lle Tyr Asp Val Lys Pro Thr

180 185 190

ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC GAT ACT ATC GCA ACT ATT ACG GCG AAA

Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asp Thr lle Ala Thr lle Thr Ala Lys

195 200 205

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

2100

2105

2110

2115

2120

2125

2130

624

2135

RO 117111 Bl

TCT AAT TCT ACA GCC TTA AAT ATA TCT CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA

Ser Asn Ser Thr A1 a Leu Asn lle Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys

210 215220

AAA GGA CAA AAT GGA ATC GCA ATA ACA TCA ATG GAT GAT TTT AAT TCC

Lys Gly Gin Asn Gly lle Ala lle Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser

225 230 235240

CAT CCG ATT ACA TTA AAT AAA AAA CAA GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT His Pro lle Thr Leu Asn Lys Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn

245 250255

AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA AAC CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAG ATA Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys lle

260 265270

AAA GAT ACA CAT GGA AAT ATA GTA ACT GGC GGA GAA TGG AAT GGT GTC Lys Asp Thr His Gly Asn lle Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val

275 280285

ATA CAA CAA ATC AAG GCT AAA ACA GCG TCT ATT ATT GTG GAT GAT GGG lle Gin Gin lle Lys A1a Lys Thr Ala Serile lle Val Asp Asp Gly

290 295300

GAA CGT GTA GCA GAA AAA CGT GTA GCG GCA AAA GATTAT GAA AAT CCA Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro

305 310 315320

GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA ACT TTA AAA GAT G~C CTG AAG CTT TCA

Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser

325 330335

TAT CCA GAT GAA ATA AAA GAA ATA GAG GGA TTA TTA TAT TAT AAA AAC

Tyr Pro Asp Glu lle Lys Glu lle Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn

340 345350

AAA CCG ATA TAC GAA TCG AGC GTT ATG ACT TAC TTA GAT GAA AAT ACA

Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr

355 360365

GCA AAA GAA GTG ACC AAA CAA TTA AAT GAT ACC ACT GGG AAA TTT AAA

Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys

370 375380

GAT GTA AGT CAT TTA TAT GAT GTA AAA CTG ACT CCA AAA ATG AAT GTT

Asp Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val

385 390 395400

ACA ATC AAA TTG TCT ATA CTT TAT GAT AAT GCT GAG TCT AAT GAT AAC Thr lle Lys Leu Ser lle Leu Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn

405 410415

TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC ACA AAT ATT GTT TCA GGT GGA AAT AAC

Ser lle Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn lle Val Ser Gly Gly Asn Asn

420 425430

GGA AAA AAA CAA TAT TCT TCT AAT AAT CCG GAT GCT AAT TTG ACA TTA

Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu

435 440445

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

RO 117111 Bl

1392

2185

1440

AAT ACA GAT GCT CAA GAA AAA TTA AAT AAA AAT CGT GAC TAT TAT ATA

Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr Ile

450 455 460

AGT TTA TAT ATG AAG TCA GAA AAA AAC ACA CAA TGT GAG ATT ACT ATA

Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gin Cys Glu Ile Thr Ile

465 470 475480

GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC ACT ACA AAA ACA GTG AAT GTG AAT AAA

Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys

485 490495

GAC AAT TAC AAA AGA TTA GAT ATT ATA GCT CAT AAT ATA AAA AGT AAT

Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp Ile Ile Ala His Asn Ile Lys Ser Asn

500 505510

CCA ATT TCT TCA CTT CAT ATT AAA ACG AAT GAT GAA ATA ACT TTA TTT

Pro Ile Ser Ser Leu His Ile Lys Thr Asn Asp Glu Ile Thr Leu Phe

515 520525

TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT

Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu Asn

530 535540

TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA GAG ATT TAT AGT AGG TAT GGT ATT AAG

Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys

545 550 555560

TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT GAT AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT

Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly

565 570575

GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT TTT AAT ATT GAA CCA KG CCA AAT TAT

Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr

580 585590

GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG

Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val

595 600605

AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT AAA ATT TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA

Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys

610 615620

TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT AAA AAT GAA CAA GGA TTA TTT TAT GAC

Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr Asp

625 630 635640

AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT AAA ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT

Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly

645 650655

AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT AGA TAT AAT AAA TAG

Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys

660665

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2190

2195

2200

2205

2210

2215

2220 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 7:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 667 aminoacizi

2004

2225

RO 117111 Bl (b) tip: aminoacid (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 7:

Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile 15 1015

Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr Ile Xaa Asn Arg Ile Ala

2530

Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val 35 4045

Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr 50 5560

Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe 65 70 7580

Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val Asn Va1 Ser Met Glu Lys 85 9095

Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His 100 105110

Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu

115 120125

Ala Gly Ile Gly Pro Lys Gly Ile Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr

130 135140

Gin His Ser Glu Thr Val Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn 145 150 155160

Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val 165 170175

Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly Ala Ile Tyr Asp Val Lys Pro Thr

180 185190

Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asp Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys 195 200205

Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys 210 215220

Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala Ile Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser 225 230 235240

His Pro Ile Thr Leu Asn Lys Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn

245 250255

Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile

260 265270

Lys Asp Thr His Gly Asn Ile Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val

275 280285

Ile Gin Gin Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly

290 295300

Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro 305 310 315320

RO 117111 Bl

Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser 325 330335

Tyr Pro Asp Glu lle Lys Glu lle Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn

340 345350

Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr 355 360365

Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys 370 375380

Asp Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val 385 390 395400

Thr lle Lys Leu Ser lle Leu Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn 405 410415

Ser lle Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn lle Val Ser Gly Gly Asn Asn 420 425430

Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu 435 440445

Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr lle 450 455460

Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gin Cys Glu lle Thr lle 465 470 475480

Asp Gly Glu lle Tyr Pro lle Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys

485 490495

Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp lle lle Ala His Asn lle Lys Ser Asn

500 505510

Pro lle Ser Ser Leu His lle Lys Thr Asn Asp Glu lle Thr Leu Phe 515 520525

Trp Asp Asp lle Ser lle Thr Asp Val Ala Ser lle Lys Pro Glu Asn 530 535540

Leu Thr Asp Ser Glu lle Lys Gin lle Tyr Ser Arg Tyr Gly lle Lys 545 550 555560

Leu Glu Asp Gly lle Leu lle Asp Lys Lys Gly Gly lle His Tyr Gly

565 570575

Glu Phe lle Asn Glu Ala Ser Phe Asn lle Glu Pro Leu Pro Asn Tyr 580 585590

Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val 595 600605

Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys lle Tyr Lys Asp Gly Thr lle Lys 610 615620

Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr Asp 625 630 635640

Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys lle Asn Ala lle Thr Tyr Asp Gly 645 650655

Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys

660665

2275

2280

2285

2290

2295

2300

2305

2310

2315

RO 117111 Bl (2) Informații pentru SEQ ID NO: 8:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 16 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus cereus (b) varietate: AB78 (c) izolat individual: NRRL B-21058 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...16 (d) alte informații: /note= „ secvența N-terminal a proteinei purificate din tulpina AB78“ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 8:

Lys Arg Glu lle Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly Asp Ser lle Pro 15 10 15 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 9:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 21 perechi de baze (b) tip: acid nucleic (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: ADN (genomic) (iii) ipotetic: nu (iii) anti-sens: nu (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: mise feature (b) localizare: 1...21 (d) alte informații: /note= „ eșantion de oligonucleotide bazat pe amino acizii 3 la 9 din SEQ ID NO: 8, folosind codonul tulpinii Bacillus thuringiensis (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 9:

GAAATTGATC AAGATACNGA T 21

RO 117111 Bl

2365 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 10:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 14 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus thuringiensis (b) varietate: AB88 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...14 (d) alte informații: /note= „ secvența de aminoacid N-terminal al proteinei cunoscute ca schimbător de anion al fracției 23 (cea mai mică)“ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 10:

Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa

5 10 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 11:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 13 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus thuringiensis (b) varietate: ΑΒ8Θ (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...13 (d) alte informații: /note= „ secvența de aminoacid N-terminal al proteinei cunoscute ca schimbător de anion al fracției 23 (cea mai mare)“ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 11 :

Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa

5 10

2370

2375

2380

2385

2390

2395

2400

2405

RO 117111 Bl (2) Informații pentru SEQ ID NO: 12:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 14 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus thurigiensis (b) varietate: AB88 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...14 (d) alte informații: /note= „Secvența N-terminal a VIP 80 kDa activă împotriva Agrotis ipsilon (XI) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 12:

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro

10 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 13:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 15 aminoacizi (b) tip: amino acid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(a) organism: Bacillus thuringiensis (b) varietate: AB88 (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...15 (d) alte informații: /note= „ Secvența de aminoacid N-terminal a VIP 35 kDa activă împotriva Agrotis ipsilon (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 13:

Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr Ile Val Pro

10 15

RO 117111 Bl

2455 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 14:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 9 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(A) organism: Bacillus thuringiensis (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...9 (d) alte informații: /note= „Secvența N-terminal a delta-endotoxine de 130kda“

2460

2465 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 14: Met Asp Asn Asn Pro Asn lle Asn Glu

5

2470 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 15:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 9 aminoacizi

2475 (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: peptidă (iii) ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (ix) caracteristici:

2480 (a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1...9 (d) alte informații: /note= endotoxinei de 80 kDa “ „Secvența N-terminal a delta2485 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 15: Met Asp Asn Asn Pro Asn lle Asn Glu

5 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 16:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 11 aminoacizi (b) tip: aminoacid (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară

2490

2495

RO 117111 Bl (ii] tipul moleculei: peptidă (iii] ipotetic: nu (v) fragment tip: N-terminal (vi) sursa originală:

(A)organism: Bacillus thuringiensis (ix) caracteristici:

(a) nume/cheie: peptide (b) localizare: 1 ...11 (d) alte informații:/note= „Secvența N-terminal din deltaendotoxinei de 60 kDa “ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 16:

Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr lle

5 10 (2) Informații pentru SEQ ID NO: 17:

(i) caracteristicile secvenței:

(a) lungime: 2655 perechi de baze (b) tip: acid nucleic (c) înfășurare: simplă (d) topologie: liniară (ii) tipul moleculei: ADN(genomic) (iii) ipotetic: nu (iii) anti-sense: nu (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 17:

ATGAAGAACA TGAAGAAGAA	GCTGGCCAGC	GTGGTGACCT	GCACCCTGCT
GGCCCCCATG 60 TTCCTGAACG GCAACGTGAA	CGCCGTGTAC	GCCGACAGCA	AGACCAACCA
GATCAGCACC 120 ACCCAGAAGA ACCAGCAGAA	GGAGATGGAC	CGCAAGGGCC	TGCTGGGCTA
CTACTTCAAG 180 GGCAAGGACT TCAGCAACCT	GACCATGTTC	GCCCCCACGC	GTGACAGCAC
CCTGATCTAC 240 GACCAGCAGA CCGCCAACAA	GCTGCTGGAC	AAGAAGCAGC	AGGAGTACCA
GAGCATCCGC 300 TGGATCGGCC TGATCCAGAG	CAAGGAGACC	GGCGACTTCA	CCTTCAACCT
GAGCGAGGAC 360 GAGCAGGCCA TCATCGAGAT	CAACGGCAAG	ATCATCAGCA	ACAAGGGCAA
GGAGAAGCAG 420 GTGGTGCACC TGGAGAAGGG	CAAGCTGGTG	CCCATCAAGA	TCGAGTACCA
GAGCGACACC 480 AAGTTCAACA TCGACAGCAA	GACCTTCAAG	GAGCTGAAGC	TTTTCAAGAT
CGACAGCCAG 540 AACCAGCCCC AGCAGGTGCA	GCAGGACGAG	CTGCGCAACC	CCGAGTTCAA
CAAGAAGGAG 600

Claims (10)

1. Proteină pesticidă izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a unei tulpini de Bacillus spp. sau fragmentele analoge și active ale acesteia și care este capabilă să distrugă dăunători selectați dintre insecte, fungi, bacterii, nematode, protozoare patogene, paraziți ai animalelor și altele asemenea, în special, insecte din clasele Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptere, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera, sau Trichoptera., caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi redată în SEQ.ID.N0:7, greutate moleculară, de 60...100 kDa și este izolată și purificată substanțial în perioada de dinaintea începerii sporulării din tulpina Bacillus cereus AB78 cu numărul de acces NRRL B-21058, sau este izolată înaintea producerii proteinei insecticide cristalină din tulpinile de Bacillus thuringiensis AB6 având numărul de acces NRRL B-21O6O, Bacillus thuringiensis AB88 AB289, AB294 și AB359 având numărele de acces, NRRL B-21225, NRRL B-21227, NRRL B-21229 și NRRL B-21226, precum și tulpinile Bacillus thuringiensis AB59 și AB256 cu numerele de acces NRRL B-21228 și, respectiv, B-21230, toate tulpinile fiind depuse la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA.

2. Proteină pesticidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, greutatea moleculară a acesteia este, de 100 kDa.

3. Proteină pesticidă, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, aceasta are secvența de aminoacizi redată în SEQ.ID.N0:5.

4. Proteină pesticidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că insectele din clasa Coleoptera aparțin speciei Diabrotica.

5. Proteină pesticidă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că insectele din specia Diabrotica aparțin genului Diabrotica virgifera virgifera sau Diabrotica longicornis barberi.

6. Proteină pesticidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că insectele din clasa de Lepidoptere aparțin speciei Agrotis.

7. Proteină pesticidă, conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că insectele din specia Agrotis aparțin genului Agrotis ipsilon.

8. Secvență de nucleotide aparținând unui ADN, caracterizată prin aceea că, codifică proteina pesticidă substanțial pură, definită în revendicarea 1, conținută în tulpina de Becillus cereus AB7B și în tulpinile de Bacillus thuringiensis AB6, AB88,

RO 117111 Bl

AB289, AB294, AB359, AB59 și AB256, secvența de aminoacizi fiind,în principal, secvența clonei P5-4 al E. coli cu numărul de acces NRRL B-21O59 sau secvența clonei P3-12 al E.coli cu numărul de acces NRRL B-21O61, ambele fiind depuse la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL).

9. Secvență de nucleotide, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea ca ea este conținută în clona pCIB6O22 a E. Coli cu numărul de acces NRRL B-21222 depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA.

10. Secvența de nucleotide, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că aceasta este prezentată în SEQ ID N0:4.