CN1119877A

CN1119877A - 新杀虫蛋白和菌株

Info

Publication number: CN1119877A
Application number: CN94191570A
Authority: CN
Inventors: G·W·沃伦; M·G·科泽尔; M·A·穆林斯; G·J·奈; N·德塞; B·卡尔; N·K·科斯特彻卡
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 1996-04-03
Also published as: RO117111B1; BG63313B1; CA2157297A1; UA52579C2; SG49845A1; SK117695A3; ES2235162T3; DE69434283T2; BR9406484A; DE69434283D1; AU684068B2; BG100000A; SK283509B6; ATE290083T1; EP1471145A2; HUT73337A; EP0690916B1; CZ290301B6; NZ263445A; CZ247695A3

Abstract

本发明是关于杀虫菌株和蛋白，提供能在营养生长时期产生杀虫蛋白和辅助蛋白的芽孢杆菌菌株。还提供了纯化的蛋白、编码该蛋白的核苷酸序列，及应用该菌株、蛋白和基因防治虫害的方法。

Description

新杀虫蛋白和菌株

本发明是1993个3月25日提交的序号为08/037，057的U.S.申请的部分继续申请，将其并入此作为参考。

本发明是关于防治植物或非植物虫害的方法和组合物。

虫害是造成世界经济上重要的农作物产量损失的一个主要因素。广谱化学杀虫剂已广泛用于防治或根除农业上重要的害虫。但仍非常需要发展其它有效的杀虫剂。

除化学虫害防治之外，微生物杀虫剂已经起了重要的作用。最广泛使用的微生物产品是以细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)为基础的。Bt是革兰氏阳性，形成芽孢的芽孢杆菌，其在芽孢形成过程中产生杀虫的晶体蛋白(ICP)。

已知大量的各种Bt可产生25种以上不同但相关的ICP。由Bt产生的ICP对某些昆虫的幼虫是有毒的，如磷翅目，双翅目和鞘翅目。通常，当ICP被敏感昆虫摄食后，昆虫肠道蛋白酶将晶体溶解并转变成毒性片段。抗鞘翅目幼虫活性的CIP已证实都对叶甲属特别是玉米根叶甲或长角叶角没有明显的作用。

Bt与蜡状芽孢杆菌(Bc)密切相关。一个主要的区别特征是Bt中缺少伴孢晶体。Bt是一种分布广泛的细菌，它一般可在土壤中发现，并已从食品和药品中分离到。该微生物与食品的腐败有关。

虽然Bt在虫害的防治中非常有用，但还需要扩大有效的生物防治剂的数目。

本发明是关于防治植物和非植物虫害的组合物和方法。特别是公开了从芽孢杆菌的营养生长阶段中分离得到的新的杀虫蛋白。提供芽孢杆菌菌株，蛋白和编码蛋白基因。

本方法和组合物可用于各种系统中防治植物和非植物虫害。

提供了用于防治植物害虫的组合物和方法，特别是提供了在芽孢杆菌菌株营养生长时所产生的新杀虫蛋白。该蛋白作为杀虫剂非常有效。

本发明确认杀虫蛋白产生于芽孢杆菌营养生长中。针对本发明，营养生长被定义为芽孢形成开始前的那段时间。对于Bt，营养生长在ICP产生前进行。编码这些蛋白的基因可被分离、克隆并转入各种运送载体，以用于害虫防治项目。

针对本发明，害虫包括但不限于昆虫，真菌，细菌，线虫，螨，蜱，原生动物病原体，动物寄生肝吸虫及类似的。昆虫类害虫包括从鞘翅目，双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等类中选择的。

表1—10给出了与主要农作物植物相关的害虫及人和兽医上重要的害虫的目录。这些害虫包括在本发明的范围内。

表1

鳞翅目(蝴蝶和蛾)玉米

玉米螟

小地老虎

谷实夜蛾

草地夜蛾

西南玉米杆草螟

南美玉米苗斑螟

小蔗杆草螟蜀黍

玉米茎螟

草地夜蛾

谷实夜蛾

南美玉米苗斑螟

粒肤地虎小麦

粘虫

草地夜蛾

南美玉米苗斑螟

西方灰地老虎

南美玉米苗斑螟向日葵

Sulcima helianthana，Sunfloler bud moth

向日葵同斑螟棉花

Heliothis virescens，cotton boll worm

棉铃虫

甜菜夜蛾

棉红铃虫稻

小蔗杆草螟

草地夜蛾

谷实夜蛾大豆

大豆尺夜蛾

梨豆夜蛾

苜蓿绿夜蛾

玉米螟

小地老虎

甜菜夜蛾

烟芽夜蛾

棉铃虫大麦

玉米螟

小地老虎

表2

鞘翅目(甲虫)玉米

玉米根叶甲

长角叶甲

黄瓜十一星叶甲食根亚种

叩头虫

北方圆头犀金龟

南方圆头犀金龟

日本弧丽蛂

玉米铜色跳甲

玉米隐喙象蜀黍

Phy llophaga crinita，Whitegrub

Eleodes；Conoderus，及Aeolus Spp.Wire worms

黑角负泥虫

玉米铜色跳角

玉米隐喙象小麦

黑色负泥虫

三叶草叶象

黄瓜十一星叶甲食根亚种向日葵

向日葵叶甲

胡萝卜利犀金龟棉花

墨西哥棉蛉象稻

葡萄肖叶甲

稻根象

米象大麦：

墨西哥大豆瓢虫

表3

同翅目(白蝶，蚜虫等)玉米

玉米蚜

玉米根蚜蜀黍

玉米蚜

美甘蔗伪毛蚜小麦

俄罗斯白蚜

麦二叉蚜

麦长管蚜棉花

棉蚜

棉序盲蝽

苘麻粉虱稻

二条黑尾叶蝉大豆

桃蚜

蚕豆微叶蝉大麦

麦二叉蚜油籽油菜

甘蓝蚜

表4

半翅目(臭虫)玉米

美洲谷长蝽蜀黍

美洲谷长蝽棉花

美国牧草盲蝽稻

美洲谷长蝽

拟缘蝽大豆

拟缘蝽大麦

美洲谷长蝽

拟缘蝽

烟草蝽

表5

直翅目(蝗虫、蟋蟀、蟑螂)玉米

赤胫黑蝗

血黑蝗小麦

赤胫黑蝗

异黑蝗

血黑蝗棉花

赤胫黑蝗

异黑蝗大豆

赤胫黑蝗

异黑蝗建筑/室内

美洲大蠊

德国蠊

东方蠊

表6

双翅目(蝇和蚊子)玉米

玉米种绳

玉米斑潜蝇蜀黍

高梁瘿蚊小麦

小麦瘿蚊

麦红吸浆虫

美洲杆蝇

麦瘦种蝇向日葵

向日葵籽瘿蚊大豆

玉米种蝇大麦

玉米种蝇

小麦瘿蚊攻击人和动物的害虫和疾病携带者

埃及伊蚊

白纹伊蚊

巴氏白蛉

家蝇

黑蚄

旋丽蝇

表7

缨翅目(蓟马)玉米

玉米黄禾蓟马小麦

烟褐花蓟马棉花

烟蓟马

烟褐花蓟马大豆

大豆蓟马(Sericothrips variabilis)

烟蓟马

表8

膜翅目(叶蜂、蚁、黄蜂等)玉米

窃蚁小麦

麦茎蜂

表9

其它种类及代表性种革翅目(球螋)

欧洲球螋等翅目(白蚁)

欧美散白蚁食毛目(羽蚤)

鸡头羽虱

牛羽虱虱目(血虱)

人虱蚤(蚤目)

猫栉首蚤

表10

螨(螨和蜱)玉米

棉叶螨蜀黍

红叶螨

棉叶螨小麦

麦瘿螨棉花

红叶螨

棉叶螨大豆

草莓叶螨

棉叶螨大麦

潜岩螨重要的人和动物螨

变异草蜱

波斯锐缘蜱

法嗜皮螨特嗜皮螨

既然已经确认可从芽孢杆菌的营养生长期中分离杀虫蛋白，那其它菌株就能用标准技术来分离并检测其抗特定植物和非植物害虫的活性。一般，芽孢杆菌菌株可通过本领域已知的方法从任何环境采样中分离到，包括土壤，植物、昆虫、谷仓尘土和其它样本等。例如，见Travers等(1978)Appl.Environ.Microbial.53：1263-1266；Saleh等(1969)Can J.Microbiol.15：1101-1104；Delucca等(1981)Can J.Microbiol.27：865-870；和Norris等(1981)“Thegenera Bacillus and Sparolactobacillus”在Starr等(eds)编的The Prokaryotes：A Handbook on Habitats，I solation，and Identification of Bacteria，Vol.II，Springer—Verlog BerlinHeidelberg.分离后，可检测菌株在营养生长时的杀虫活性。用这一方法可以确定新的杀虫蛋白和菌株。

本发明中发现有用的这种芽孢杆菌属微生物包括蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，及那些列于表11的芽孢杆菌菌种。

表11

芽孢杆菌种类表形态学组1 非指定菌株巨大芽孢杆菌亚型A蜡状芽孢杆菌^* 蜜蜂芽孢杆菌蜜蜂芽孢杆菌丝状菌落芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌蕈状变种溶硫胺素芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌^* 嗜碱芽孢杆菌地衣形芽孢杆菌亚型B枯草芽孢杆菌^* 丛毛芽孢杆菌短小芽孢杆菌蚀几丁芽孢杆菌强固芽孢杆菌^* 缓慢芽孢杆菌凝结芽孢杆菌亚型C形态学组2 栗褐芽孢杆菌多粘芽孢杆菌解硫胺素芽孢杆菌软化芽孢杆菌延长芽孢杆菌环状芽孢杆菌弗氏杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌亚型D蜂房芽孢杆菌^* 泛酸芽孢杆菌侧孢芽孢杆菌^* 植表芽孢杆菌短芽孢杆菌亚型E₁尘埃芽孢杆菌噬胺芽孢杆菌日本甲虫芽孢杆菌^* 圆孢芽孢杆菌缓死芽孢杆菌^* 异常芽孢杆菌幼虫芽孢杆菌^* 嗜冷芽孢杆菌形态学组3 亚型E2球形芽孢杆菌冷解糖芽孢杆菌巴氏芽孢杆菌马阔里芳孢杆菌

*＝以前在昆虫中发现的那些芽孢杆菌菌株

分组根据Parry，J.M.等(1983)Color Atlas of BacillusSpecies，Wolfe Medical Publications，London进行。

根据本发明，可从芽孢杆菌中分离到营养生长时产生的杀虫蛋白。在一实施方案中，可分离到营养生长时产生的杀虫蛋白，以后称作VIP(营养杀虫蛋白)。蛋白分离方法是本领域中已知的。一般，蛋白可通过常规的色谱法纯化，包括凝胶过滤，离子交换，和免疫亲和层析；还可通过高效液相色谱，如反相高效液相层析、离子交换高效液相层析、大小排阻高效液相层析，高效聚焦层析和疏水反应层析等，还可通过电泳分离，如单向电泳，双向电泳等。这些方法在本领域中是已知的。例如见Current Protocols in MolecularBiology Vols.1和2 Ausubel等(eds.)，John Wiloy和Sons，NY(1988)。另外可制备抗基本纯化的蛋白制品的抗体，例如见Radka等(1983)J.Immunol.128：2804；和Radka等(1984)Im-munogenetics 19：63。任何组合方法都可用于纯化有杀虫特性的蛋白。当方案确定后，每一步纯化步骤后检测杀虫活性。

这些纯化步骤可产生基本纯化的蛋白组份。“基本纯化的”或“基本纯的”是指蛋白基本不含任何在其天然状态下通常与之相结合的化合物。“基本纯的”蛋白制品可通过目测SDS—PAGE胶上没有其它可测到的蛋白条带或通过光密度测定扫描得以确定。另外，纯化蛋白制品中没有其它氨末端序列或N—末端残基地能表明纯度的水平。通过离子交换、反相或毛细管电泳对“纯的”制品再层析时没有其它峰，也能证实其纯度。术语“基本纯的”或“基本纯化的”并不意味着排除人工的或合成的蛋白与其它化合物的混合物。该术语也不意味着不包括存在少量的但不影响蛋白生物活性的杂质存在的情况，例如，由于纯化不完全而存在。

一些蛋白为单一多肽链，而许多蛋白包括不只一条多肽链。一旦分离到纯化的蛋白，该蛋白或组成它的多肽可通过本领域中已知的常规方法进行定性和测序。例如，该蛋白或组成它的多肽可通过溴化氰或蛋白酶如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、赖氨酰—C内肽酶等进行裂解(Oike等(1982)J.Biol.Chem.257：9751-9758；Liu等(1983)Int.J.Pept.Protein Res.21：209-215)。形成的肽被分离，优选经HPLC，或通过凝胶分辨并电吸印到PVDF膜上，进行氨基酸测序。为了完成这一目的，优选自动测序仪分析肽。从而可以测定N—末端，C—末端或内部氨基酸序列。根据纯化蛋的氨基酸序列，可以合成核酸序列，其可作为探针用于分离编码杀虫蛋白的基因。

蛋白可有分子量、肽组成、抗特定昆虫的活性及其它特征方面的不同。但通过本文提出的方法，可分离和鉴定抗各种昆虫的活性蛋白。

一旦纯化的蛋白被分离和鉴定，可通过各种方法改变它，包括氨基酸取代、缺失和插入。这些操作方法一般为本领域所知。例如，杀虫蛋白的氨基酸序列改变可通过DNA突变得到。这些突变将产生需要的杀虫活性。显然，在编码这些变型的DNA上进行的突变不能在读码框架之外的序列上，而且最好不能产生可形成mRNA二级结构的互补区。见，EP专利申请公开No.75,444。

因此，本发明包括杀虫蛋白及其组份和片段。那就是可产生保持杀虫活性的蛋白片段或多肽组份。这些片段包括蛋白截短的序列及N—末端、C—末端和内部缺失的氨基酸序列。

大多数蛋白序列的缺失、插入和取代不会对杀虫蛋白的特性形成根本的改变。但在做之前，难以预期这些取代、缺失或插入的准确影响，本领域的技术人员将通过常规筛选分析衡量影响。

这里所述的蛋白或其它多肽组份可单独或组合使用。那就是几种蛋白可用于防治不同的害虫。而且，本发明的一些蛋白可以增强杀虫蛋白的活性，这里这些蛋白被称为“辅助蛋白”。虽然这一作用机制不完全确实，当辅助蛋白和杀虫蛋白在一起时，杀虫蛋白的杀虫能力增强了许多倍。

本发明的杀虫蛋白可有不同分子量，其含有一至少30KDa或更大的多肽组份，优选约50KDa或更大。

本发明的辅助蛋白可有不同分子量，其分子量至少约15KDa或更大，优选约20KDa或更大。该辅助蛋白自身可有多肽组份。

杀虫蛋白和辅助蛋白可能是一多体杀虫蛋白的组份。这一包括辅助蛋白作为其一个或更多的多肽组份的杀虫蛋白可有不同分子量，其分子量至少从50KDa到至少200KDa，优选约100KDa至150KDa。

辅助蛋白可与本发明的杀虫蛋白联合使用以增强活性。为了确定辅助蛋白是否影响活性，杀虫蛋白可单独或与辅助病毒联合表达，并在用于提高杀虫活性的饲养分析中比较不同的活性。

通过检测菌株单独或与辅助蛋白联合的活性以筛选有潜在杀虫活性的菌株是有益的。在一些例子中，辅助蛋白与菌株的天然蛋白联合产生杀虫活性，而没有辅助蛋白时，则没有活性。

如上所述，辅助蛋白可通过本领域中已知的方法进行改造。因此根据本发明的目的，“营养生长蛋白”(VIP)这一词语包括那些营养生长时产生的，单独或联合用以杀虫的那些蛋白。这包括杀虫蛋白，辅助蛋白和那些仅存在辅助蛋白时才有活性的蛋白及这些蛋白的多肽组份。

存在得到本蛋白的核酸和氨基酸序列的替代方法，例如，为了得到编码杀虫蛋白的核苷酸序列，可从基因文库中分离到表达杀虫蛋白的粘性克隆。从较大的活性粘性克隆中制备亚克隆并检测其活性。这样，表达活性杀虫蛋白的克隆可被测序以确实基因的核苷酸序列。然后可推导蛋白的氨基酸序列。作为一般分子方法，见例如，Molecular cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Vols.1-3，Sanbrook等(eds.)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY(1989)，及本文中引用的参考文献。

本发明也包括来自芽孢杆菌之外的生物体的核苷酸序列，该核苷酸序列可通过与本发明的芽孢杆菌核苷酸序列杂交而分离得到。可检测这些核苷酸序列的杀虫活性，本发明还包括这些核苷酸序列编码的蛋白。而且，本发明还包括来自芽孢杆菌之外的生物体的蛋白，其中该蛋白与由本发明的蛋白产生的抗体发生交叉反应。然后所分离的蛋白可通过这里所公开的方法，分析其杀虫活性。

一旦编码本发明的杀虫蛋白的核苷酸序列被分离，可通过基因工程，在各种宿主除其它生物外，包括微生物和植物中表达蛋白。

本发明的杀虫基因可被优化用于植物中的增强表达。见，例如U.S.专利No.07/951，715；EPA 0359472；EPA 0385962；WO91/16432；Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328；和Murray等(1989)Nucleic Acids Research 17：477-498。这样，使用值物优选的密码子合成基因，对于特定宿主的优选密码子是指编码宿主氨基酸最常用的单一密码子。例如，对于一特定氨基酸，玉米优选密码子可从玉米的已知基因序列中得到。来自玉米植物的28个基因中玉米贯用编码子可从Murray等(1989)，Nucleic Acids Research 17：477-498中找到，其内容在本文作为参考。可根据某一特定宿主用于某一特定氨基酸的密码子的分布进行基因合成。

如此，该核苷酸序列可被优化作于在任何植物中表达。全部基因或其任何部分都可被优化或合成。那么合成的或部分优化的序列也可应用。

相似的情况，该核苷酸序列可被优化用于在任何微生物中表达。对于芽孢杆菌优选的密子习惯见例如U.S专利号No.5，024，837和Johansen等(1988)Gene 65：293-304。

构建植物表达盒的方法学和外源DNA导入植物在本领域中已有描述。这些表达盒包括启动子、终止子、增强子、先导序列、内含子和其它与杀虫蛋白编码序列可操作性地连接的调节序列。

一般为了将外源DNA导入植物，可使用Ti质粒载体转运外源DNA，及DNA直接摄取、脂质体，电穿孔法，微注射法和应用微粒。这些方法在本领域中已发表。例如见，Guerche等(1987)Plant Science 52：111-116；Neuhause等(1987)Theor.Appl.Genet.75：30-36；Klein等(1987)Nature 327：70-73；How-ell等(1980)Science 208：1265；Horsch等(1985)Science 227：1229-1231；DeBlock等(1989)Plant Physiology 91：694-701；Methods fon Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach，eds.)Academic Press Inc.(1988)；和Methods in plant MolecularBioloy(Schuler和Zielinski，eds.)Academic Press，Inc.(1989).还见，US专利申请N0.08/008,374，这里引入作为参考。还可见，EPA0193259和EPA0451878A1。可以理解，转化的方法将取决于要转化的植物细胞。

而且表达盒的元件可进行改造以提高表达。例如可应用截短序列、核苷酸取代或其它改造。例如见，Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328；Murray等(1989)Nu-cleic Acids Research 17：477-498；和Wo91/16432。

该结构还可包括其它任何需要的调节子，如终止子(Guer-ineau等，(1991)，Mol.Gen.Genet，226：141-144；Proudfoot，(1991)Cell，64：671-674；Sanfacon等，(1991)，Genes Dev.5：141-149；Mogen等，(1990)，Plant Cell，2：1261-1272；Munroe等，(1990)，Gene，91：151-158；Ballas等，(1989)Nucleic Acids Res.，17：7891-7903；Joshi等，(1987)，Nucleic Acids Res15：9627-9639)；植物翻译保守序列(Joshi，C.P.(1987)，Nucleic Acids Research，15：6643-6653)，内含子(Lue hrsen和Walbot，(1991)，Mol.Gen.Genet，225：81-93)和类似的有效地与核苷酸序列相连的调节子。在表达盒结构中含有5’先导序列是有利的。这些先导序列能增强翻译，翻译先导序列在本领域中是已知的，其包括：

微小RNA病毒先导序列，例如，EMCV先导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elory-stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.(1989)FNAS USA 86：6126-6130)；

马铃薯Y病毒先导序列，例如，TEV先导序列(烟草蚀刻病毒)(Allison等，(1986)；MDMV先导序列(玉米矮小花叶病毒)；Virology，154：9-20)，和

人免疫球蛋白体重链结合蛋白(Bip)，(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.，(1991)Nature 353：90-94；

苜蓿花叶病毒包膜蛋白mRNA非翻译先导序列(AMV RNA4)，(Jobliny，S.A.和Gehrke，L.，(1987)，Nature，325：622-625；

烟草花叶病毒先导序列(TMV)，(Gallie，D.R.等(1989)，Molecular Biology of RNA，237-256页；和

玉米萎斑病毒先导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等(1991)，Virology，81：382-385.还见，Della-Cioppa等(1987)，Plant Physiology，84：965-968。

植物终止子可应用于表达盒。见，Rosernberg等，(1987)，Gene，56：125；Guerineau等，(1991)，Mol.Gen.Genet.，226：141-144；Proudfoot，(1991)，Cell，64：671-674；Sanfa-con等，(1991)，Genes Dev，5：141-149；Mogen等，(1990)，Plant Cell，2：1261-1272；Munroe等(1990)，Gene，91：151-158；Ballas等，(1989)，Nucleic Acids Res.，17：7891-7903；Joshi等，(1987)，Nucleic Acids Res.，15：9627-9636。

对于组织特异性表达，本发明的核苷酸序列可有效地连接到组织特异性启动子上。见，例如US专利申请号07/951,715，其并入本文作为参考。

编码杀虫蛋白的基因可用于转化昆虫病原生物，这些生物包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。

本发明的芽孢杆菌菌株可用于保护农作物和农产品免受害虫。另外，编码杀虫剂的基因可通过适当的载体导入微生物宿主中，该宿主可应用于环境或植物或动物。可以选择已知占据一种或更多重要作物的“植物圈”(Phyllo-plane，phyllosphere，rhizosphere，和/或rhizoplana)的微生物。选择这些微生物可以能够与特定环境中的野生微生物竞争，保证稳定持续表达多肽杀虫剂基因，而且改进很需要的使杀虫剂免受环境降解和失活的保护。

这些微生物包括细菌，藻类和真菌。特别重要的是微生物，如细菌，例如假单胞菌属，欧文氏杆菌属，沙雷氏菌属，克雷白氏杆菌属，黄单胞菌属，链霉菌属，根瘤菌属，红假单胞菌属，Methylius，土壤杆菌属，醋杆菌属，乳芽孢杆菌属，节杆菌属，固氮杆菌属，明串珠菌属和，产碱杆菌属；真菌，尤其是酵母，例如：酵母属，隐球酵母属，克鲁维氏酵母属，掷胞酵母属，红酵母属和短柄霉属。特别有意义的是植物圈中的细菌种类，如：丁香假单胞菌、荧光假单胞菌，粘质沙雷氏菌，木质醋杆菌，土壤杆菌、球形红假单孢菌、田野黄单孢菌，苜蓿根瘤菌，真养产碱杆菌，Clavibacter xvli和棕色固氮杆菌，和植物圈酵母种类，如：深红酵母，胶粘红酵母，海滨红酵母，橙黄红酵母，浅白色隐球酵母，流散隐形酵母，罗仑氏隐球酵母。罗茜酵酵母，普地酵母，啤酒酵母，红色掷孢酵母，香气掷孢酵母，佛地克鲁维氏酵母和出芽短柄霉。尤其值得注意的产色微生物。

在维持稳定并表达基因的条件下，有很多方法可将表达杀虫蛋白的基因导入微生物宿主中。例如，可构建一表达盒，其包括与用于DNA结构表达的转录与翻译调节信号有效连结的目的DNA结构，并且DNA序列与宿主生物的序列同源，从而发生整合，和/或宿主中有功能性复制系统，以产生整合或维持稳定。

转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、激活物、增强子，其它调控元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。见，例如，US专利5,039,523；US专利4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook等同上；MolecularCloning，a Laboratory Manual，Maniatis等Cedsl Cold Spring Har-bor Laboratory，Cold Spring Harbor NY(1982)；Ad vanced Bacte-vial Genetics，Davis等(eds.) Cold Spring Harbor Laboratory ColdSpring Harbor NY(1980)；和本文所引用的参考文献。

合适的宿主细胞包括真核或原核细胞。这些含杀虫剂的细胞通过处理，当该处理过的细胞施于靶害虫的环境中时，可以延长细胞中毒素的活性。这些宿主细胞一般限于那些不产生对高级生物如哺乳动物有毒物质的细胞。但产生对高级生物有毒物质的生物也能使用，当毒素不稳定或使用浓度非常低可避免对哺乳物宿主任何可能的毒性时。特别重要的宿主是原核生物和低等真核生物，如真菌。这种原核生物包括革兰氏阳性和革兰氏阴性，包括肠杆菌科，如：埃希氏杆菌属，欧文氏杆菌属、志贺氏菌属，沙门氏菌属和变形菌属；芽孢杆菌科；根瘤科，如根瘤菌属；螺菌科，如发光杆菌属，发酵单孢菌属，沙雷氏菌属。，气单孢菌属，孤菌属，脱硫弧菌属，螺菌属；乳芽孢杆菌族；假单胞菌科；如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮杆菌科和硝化植菌科。真核生物中是真菌，如须霉菌Ascomycetes，其中包括酵母，如：酵母属和裂殖糖酵母属；和担子菌纲酵母，如：红酵母属，短柄霉属，掷孢酵母属等。

针对生产目的，在选择宿主细胞时，特别重要的特征包括蛋白基因导入宿主的难易、可用的表达系统，表达的效率，宿主中蛋白的稳定性及是否存在辅助遗传能力。应用杀虫微囊体的重要特征包括对杀虫剂的保护性能、例如厚细胞壁，色素和细胞内包装或包涵体的形成；对叶的亲和性；缺少哺乳动物毒性；对摄取昆虫的攻击性；杀虫的难易和稳定而不破坏毒性，及类似的。其它考虑因素包括配制和操作的难易。经济性，贮存稳定性和类似的。

特别重要的宿主生物包括酵母，如红酵母属菌种，短柄霉属菌种，掷孢菌属菌种，叶面生物例如：假单胞菌属菌种，欧文氏杆菌属菌种，和黄杆菌属菌种；或其它的生物如埃希氏杆菌属种，乳芽孢杆菌属种，芽孢杆菌属菌种，等等。特异的生物包括铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，啤酒酵母，苏云金芽孢杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等等。

将本发明的菌种应用于虫害防治或基因操作其它生物作为杀虫剂的一般方法在本领域中是已知的。见，例如US专利No.5,039,523和EP 0480762A2。

本发明的芽孢杆菌菌株和遗传改造的含有杀虫基因和蛋白的微生物可用于保护农作物和农产品免受虫害。本发明的一方面，产生毒素(杀虫剂)的生物的完整未裂解细胞在施用到靶害虫的环境时，用延长胞内所产生的毒素活性的试剂处理。

另外，通过将异源基因导入细胞宿主产生杀虫剂。异源基因的表达直接或间接地影响胞内生产和杀虫剂的稳定。接着这些细胞在施于靶害早的环境时通过处理以延长胞内所产生的毒素的活性。生成的产物保持毒素的毒性。接着针对所应用的靶害虫宿生的的环境，如土壤、水和植物叶面，根据传统技术配制这些天然被囊的杀虫剂。见，例如EPA 0192319，和本文所引用的参考文献。

本发明的活性组份一般以组合物形式使用，并可同时或相继与其它化合物用于要处理的农用或植物，这些化合物可以是肥料或微量元素供体或其它影响植物生长的制剂。它们也可是选择性除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂的多种混合物，如果需要，可联合其它在制剂领域中惯用的农业适用的载体、表面活性剂或施用增效佐剂。适当的载体和佐剂可以是固体或液体，其与制剂技术中常用的物质相对应，如天然或再生无机物，溶剂、分散剂、润湿剂、胶粘剂、粘合剂或肥料。

应用本发明的一种活性组份或一种含有至少一种由本发明的细菌菌株所产生的杀虫蛋白的农业化学组合物的优选方法是叶面施用、种子覆裹和土壤施用。施用的量和施用的频率取决于相应害虫的侵害密度。

在本发明的一实施方案中，已分离到能杀死玉米根叶甲和长角叶甲的蜡状芽孢杆菌。该新的蜡状芽孢杆菌菌株AB78已保藏在Agricultural Research Seruice，Patent Culture Collection(NRRL)，Northen Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，IL61604，USA，并给予保藏号NO.NRRL B—21058。

蛋白已从该蜡状芽孢杆菌菌株中基本纯化出来。蛋白的纯度已由SDS—PAGE和生物活性证实。该蛋白分子量大约60～100KDa，特别是大约70～90KDa，尤其特别是大约是80KDa。

已揭示其氨基末端序列，N—末端氨基酸序列为：NH₂—Lys-Arg-Glu-ILe-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-ILe-Pro-(SEQ ID NO：8)这里Asx代表Asp或Asn。全部氨基酸序列在SEQ ID NO：7中给出。

合成了针对编码NH₂—末端氨基酸3—9的基因区的寡核苷酸探针。该探针根据苏云金芽孢杆菌(Bt)δ—内毒素基因的密码子惯例而合成。用于Southern杂交的该寡核苷酸探针的核苷酸序列如下：

5’—GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT—3’(SEQ ID NO：9)，这里N代表任何碱基。

而且，这里所述的针对Bc AB78 VIP—I基因的DNA探针可用于筛选任何芽孢杆菌菌株或其它生物，以确定VIP—1基因(或相关基因)是否为天然存在，或特定转化生物是否含有VIP—1基因。

现已一般性地描述了本发明，通过参考下面详细实施例可更好地理解本发明，提供这些实施例是为了说明目的，并不应认为限制本发明，除非这样声明。

实施例1.AB78的分离和鉴定：

蜡状芽孢杆菌株AB78是在实验室中T3培养基上(每升：3g胰蛋白胨，2g胰蛋白胨，1.5g酵母浸膏，0.05M磷酸钠(PH6.8)，和0.005gMnCl₂；Travers，R.S.1983)作为一平板污染物被分离的。AB78具有抗玉米根叶甲显著活性。还显示抗革兰氏阳性芽孢杆菌属菌种的抗生活性(表12)。

表12AB78培养物上清液的抗生活性

链霉素测试细菌 AB78 抑菌圈(cm)大肠杆菌 0.0 3.0锰杆菌 1.1 2.2蕈状芽孢杆菌 1.3 2.1蜡状芽孢杆菌CB 1.0 2.0蜡状芽孢杆菌11950 1.3 2.1蜡状芽孢杆菌14579 1.0 2.4蜡状芽孢杆菌AB78 0.0 2.2

Bt var.isrealensis 1.1 2.2

Bt var.tenebrionis 0.9 2.3

AB78的形态学特征如下：

营养体直棒状，长3.1—5.0mm，宽0.5—2.0mm。细胞具有圆形末端，单一短链。每个细胞中能形成单个近末端的，卵圆柱形的内生孢子。没有伴孢晶体形成。菌落呈不透明、锯齿形、裂片形和扁平形。没有色素产生细胞能动，有鞭毛存在。

AB78的生长特征如下：

兼性厌氧菌，最适生长温度为21—30℃，可以生长在15，20，25，30和37℃，超过40℃不生长。在5～7％NaCl中生长。

表13提供了AB78的生化特征

表13

蜡状芽孢杆菌AB78的生化特征L—阿拉伯糖产酸 - 美蓝再氧化 +L—阿拉伯糖产气 - 硝酸盐还原 +D—木糖产酸 - NO₃还原为NO₂+D—木糖产气 - VP +D—葡萄糖产酸 - H₂O₂分解 +D—葡萄糖产气 - 吲哚 -乳糖产酸 - 酪氨酸分解 +乳糖产气 - 二羟丙酮 -蔗糖产酸 - 石蕊牛奶酸化 -蔗糖产气 - 石蕊牛奶凝固 -D—甘露糖醇产酸 - 石蕊牛奶碱化 -D—甘露糖醇产气 - 石蕊牛奶胨化 -丙酸盐利用- + 石蕊牛奶还原 -柠檬酸盐利用 + 酪蛋白水解 +马尿酸盐水解 w 淀粉水解 +美蓝还原 + 明胶液化 +

软磷酯产生 w

w＝弱反应实施例2：细菌培养

Bc菌种AB78的传代培养通常是接种于以下的培养基中，即TB肉汤：

胰蛋白胨 12g/l

酵母浸膏 24g/l

甘油 4ml/l

KH₂PO₄ 2.1g/l

K₂HPO₄ 14.7g％

PH7.4

磷酸钾是在灭菌的肉汤冷却后加入。培养瓶在30℃250rpm旋转摇床上24小时—36小时。

上述的操作可以按照本领域中已知的工艺操作简单地按比例放大到大的发酵罐。

营养生长期中，通常指开始培养后24—36小时，AB78细菌从培养上清液中离心出来。含有活性蛋白的培养物上清液用于生物检定。实施例3，昆虫生物检定：蜡状芽孢杆菌菌株AB78用于抗各种昆虫的试验如下所述。

玉米根叶甲、长角叶角、黄瓜十一星叶甲食根亚种：由生长24—36小时的AB78培养上清液制得稀释液，与融化的人造食物混合(Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293)并固化。固化的食物被切开放于盘中。新生的幼虫放在食物上，30℃保温。记录六天后的死亡率。

E.coli克隆生物检定：E.coli在L-Amp 100中，37℃培养过夜。10ml培养物超声处理三次，每次20秒。500ml超声处理的培养物加入到融化的玉米根叶甲食物中。

马铃薯叶甲：生长24—36小时的AB78的培养上清液在Tri-ton x-100中制成稀释液(TX—100的最终浓度为0.1％)5cm²的马铃薯叶片浸入到这些稀释液中，风干，放在塑料盘中的湿润的滤纸上。新生的幼虫放在这些叶片上，30℃保温。3—5天后记录死亡率。

黄粉虫：制备生长24—36小时的AB78培养上清液的稀释液，与融化的人工食物(Bioserv#F9240)混合并固化。固化的食物被切开放于塑料盘中，新生的幼虫放在食物上，保温30℃，6—8天后记录死亡率。玉米螟、小地老虎、烟芽叶蛾、Mandnca Sexta和甜菜叶蛾：

生长24—36小时的AB培养上清液在TX—100中制成稀释液(TX—100)的最终浓度为0.1％)。用吸管吸取100毫升于固化人工食物的18cm²的表面上，风干。新生的幼虫放在食物的表面，保温30℃、3—6天后记录死亡率。尖音库蚊：

生长24—36小时的AB78培养上清液制成稀释液。吸取100ml稀释液加入到10ml水中，放于30ml的塑料杯内。三龄虫放置于水中保持在室温下。24—48小时后记录死亡率。表14中列出了Ab78的杀昆虫活性谱。

表14AB78培养上清液抗各种昆虫种类的活性检测昆虫种类种类活性玉米根叶甲鞘翅目 +++长角叶甲鞘翅目 +++黄瓜十一星叶甲鞘翅目 -食根亚种马铃薯叶甲鞘翅目 -黄粉虫鞘翅目 -玉米螟鳞翅目 -烟芽叶娥鳞翅目 -谷实夜娥鳞翅目 -草地夜蛾鳞翅目 -小地老虎鳞翅目 -尖音库蚊双翅目 -

与已知的Bt中的鞘翅目活性δ—内毒素相比，新近发现的蜡状芽胞杆菌AB78的杀虫活性谱具有显著的差异。特别是，AB78对甲虫比鞘翅目活性的Bt菌株有更强的选择活性，尤其对叶甲属种类具有特异的活性。具体地讲，它抗玉米根叶甲和长角叶甲活性最高，但不抗黄瓜十一星叶甲食根亚种。

对一些蜡状芽孢杆菌菌株在营养生长时抗玉米根叶甲的活性已做了生物检定(表15)。结果证明AB78抗玉米根叶甲活性是独特的，这不是普遍现象。

表15

各种芽孢杆菌菌种培养上清液抗玉米根叶甲活性

芽孢杆菌 WCRW百分致死率蜡状芽孢杆菌AB78(Bat.1) 100蜡状芽孢杆菌AB78(Bat.2) 100蜡状芽孢杆菌(Carolina Bio.) 12蜡状芽孢杆菌ATCC 11950 12蜡状芽孢杆菌ATCC 14579 8蕈状芽孢杆菌(Carolina Bio.) 30日本甲虫芽孢杆菌 28苏云金芽孢杆菌HD135 41苏云金芽孢杆菌HD191 9苏云金芽孢杆菌GC91 4苏云金芽孢杆菌isrealensis 24水对照 4表16中列出了AB78抗玉米根叶甲的特异活性。

表16AB78培养上清液抗玉米根叶甲活性培养上清液浓度 WCRW致死百分率(μl/ml)

100 100

25 87

10 80

5 40

2.5 20

1 6

0 0计算得出LC50为每ml玉米根叶甲食物中6.2μl培养上清液。实施例4，AB78玉米根叶甲(Corn Rootworm)活性蛋白的分离纯化。

加入固体硫酸铵对去细胞及碎片的培养液进行70％饱合(472g/l)。将溶液冰浴冷至室温并10000xg离心30分钟，沉淀出沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀溶于1/10初始体积的PH7.5的20mM Tris—HCl中。

溶解的沉淀或通过在PH7.5 20mM Tris-HCl中透析脱盐，或通过脱盐柱脱盐。

脱盐的材料用PH2.5 20mM柠檬酸钠滴定到PH3.5。溶液保持室温30分钟后，3000xg离心10分钟。这一时期的上清液中含有最大量的活性蛋白。

中和上清至PH7.0，施于Mono-Q阴离子交换柱上，此柱已用PH7.5 20mM Tris-HCl平衡，流速为300mL/min。柱子用含PH7.5 20mMTris-HCl中的400mM NaCl进行逐步线性梯度洗脱。

柱流份的生物检定和SDS—PAGE电泳被用来确定活性流份。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定了生物活性蛋白为分子量在80KDa的范围内的蛋白。实施例5玉米根叶甲(Corn Rootworm)活性蛋白的序列分析。

将SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的80KDa蛋白转移到PVDF膜上，再通过在ABI470脉冲—液体测序仪上重复Edman循环来进行氨基末端的序列分析。

转移在含10％甲醇的10mM CAPS缓冲液(PH11.0)中进行，操作如下：

电泳后，在转移缓冲液中温育凝胶5分钟。

ProBlott PVDF膜用100％MeOH迅速湿润，然后在转移缓冲液中平衡。

在泡沫海绵和方形滤间三明治形式的阳极—胶膜—阴极。

70V恒定电压下转移1小时。

转移后，用水冲洗膜，在50％MeOH中用0.25％考马斯亮蓝R—250染色两分钟。

用50％MeOH40％水10％乙酸冲洗几次脱色。

膜脱色后，风干，将区带切割下来以做序列分析。使用BlottCartildfe和适当循以达到最大效率和产量。使用610型序列分析软件进行数据分析，对来自每个连续循环的PTH—氨基酸衍生物进行定性和定量。

N—末端的序列被确定为：

NH₂-Lys-Arg-Glu-ILe-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-ILe-Pro-(SEQ ID NO：8)这里Asx代表Asp或Asn。实施例6，DNA探针的构建

制备了针对编码N—末端序列(实施例5)氨基酸3—9的基因区的寡核苷酸探针。该探针根据苏云金芽孢杆菌(Bt)δ—内毒素基因的密码子贯例合成。该核苷酸序列在Southern杂交中用作探针。

5’—GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT—3’(SEQ IDNO：9)使用标准流程和设备合成该寡核苷酸。实施例7，玉米根叶甲(Corn Rootworm)活性蛋白等电点的确定

纯化过程步骤5的纯化蛋白使用Phastqel电泳系统(Pharmacia)在3—9PI等电聚焦凝胶上进行分析。对于分离和银染色步骤均按照此单元操作的标准操作步骤。等电点约为4.9。实施例8，对AB78的PCR分析

应用PCR分析(见，例如US专利申请NO.08/008,006；和Carozzi等(1991)Appl.Environ.Microbiol.57(11)：3057-3061)证实蜡状芽孢杆菌菌株AB78不含任何苏云金芽孢杆菌或球形芽孢杆菌的杀虫晶状蛋白基因(表17)。

表17通过RCR对AB78 DNA进行芽孢杆菌杀虫晶状蛋白基因引物测试

测试引物产物2套对CryIII A特异 -

CryIIIB -2套对CryIA特异 -

Cry IA(a) -

Cry IA(b)特异 -

CryIB -

CryIC特异 -

CryIE特异 -2套对球形芽孢杆菌特异 -2套对CryIV特异 -芽孢杆菌对照(PI—PIC) +实施例9，蜡状芽孢杆菌菌株AB78全DNA的粘粒克隆

VIP—I基因从菌株AB78制备的全DNA中克隆如下：AB78 DNA提取如下：1.细菌在10ml LB中生长过夜(用50ml灭菌离心管)。2.加入25ml新鲜LB和氨苄青霉素(30mg/ml)。3.细胞30℃振荡生长2—6小时。4.用聚丙烯橘黄盖管在IEC台式医用离心机上以3/4速度离心细胞。5.用10ml TES重悬细胞沉淀。6.加30mg溶菌酶并37℃温育2小时。7.加200ml 20％SDS和400ml蛋白酶K(20mg/ml)37℃温育。8.加200ml新鲜蛋白酶K，55℃温育1小时，加5ml TES(TES＝50mM Tris PH8.0，100EDTA，15mM NaCl)使终体积为15ml。9.苯酚抽提两次(10ml苯酚，室温下IEC台式医用离心机中以3/4速度离心)。将上清液(上层)用广口移液管移入一干净离心管中。10.用1∶1体积的苯酚∶氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次。11.用等体积冷的异丙醇沉淀DNA；离心沉淀DNA。12.用5ml TE重悬沉淀13.用0.5ml 3M NaOAc PH5.2和11ml 95％乙醇沉淀DNA，

20℃放置2小时。14.用塑料环从管中“钓起”DNA，转移至微量离心管中，离心，

移去多余的乙醇真空干燥。15.用0.5ml TE重悬，65℃温育90分钟帮助DNA重新溶解。16.用标准方法确定浓度

AB78的粘粒克隆

除非另外说明，所有方法根据Stratugene Protocol，Supercosl

Instruction Manual，Cat No.251301进行。

一般步骤如下：A.Sau 3A不完全消化AB78 DNAB.载体DNA的制备C.DNA的连接和包装D.滴定粘粒文库

1.将50ml HB101过夜培养物置于含0.2％麦芽糖的5ml TB中

开始HB101细胞的培养。37℃培养3.5小时。

2.离心分出细胞并重悬于0.5ml 10mM MgSO₄中。

3.一起加入：

100ml细胞

100ml稀释的包装混合物

100ml 10mM MgSO₄

30mlTB

4.不振荡室温下吸收30分钟

5.加1mlTB，温和混匀，37℃温育30分钟。

6.加200ml到L—amp平板上，37℃培养过夜。

如实施例3所述至少可筛选出400个有抗玉米根叶甲活性的粘粒克隆。5个活性克隆和5个无活性克隆的DNA用于Southern杂交，结果证明用上述寡核苷酸探针进行的杂交与玉米根叶甲活性相关(表18)。

粘粒克隆P3—12和P5—4已保藏在Agricultural Research Ser-vice Patent Culture Collecton(NRRL)并分别给予保藏号B—21061和B—21059。

表18AB78粘粒克隆抗玉米根叶甲的活性克隆平均致死百分比(N＝4)与探针杂交的克隆P1—73 47P1—83 64P2—2 69P3—12 85P5—4 97不与探针杂交的克隆P1—2 5P3—8 4P3—9 12P3—18 0P4—6 9实施例10 6kb抗玉米根叶甲活性区的鉴定

P3—12的DNA用限制酶Sau 3A作不完全酶切，连到大肠杆菌载体pUC19上，并转化大肠杆菌。通过部分P3—12 DNA的PCR扩增来合成针对80KDa蛋白的DNA探针。利用80KDa蛋白的部分氨基酸序列合成与部分VIP—1杂交的寡核苷酸MK113和MK17。通过与PCK探针的菌落杂交确实质粒亚克隆，并测试其抗玉米根叶甲的活性。一个克隆PL2可与PCK片段杂交，并且通过上述的分析方法发现对玉米根叶甲有活性。

-6Kb的PL2 Cla I酶切片段被克隆到大肠杆菌—芽孢杆菌穿梭载体PHT 3101(Lereclus，D.等，1989，FEMS Microbiologyletters 60：211-218)的SmaI位点上，产生pCIB6201。这一结构在芽孢杆菌和大肠杆菌菌株(任一方向)都带来抗玉米根叶甲的活性。pCIB6022为含有同样6KbClaI片段的pBluescripSK⁽⁺⁾(Stratagene)，可产生同样的VIP—1蛋白(通过Western印迹)，并也有抗玉米根叶甲的活性。

pCIP 6022的核苷酸序列是通过Sanger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467(1977)的双脱氧终止法，使用PRI SM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit和PRISM Sequenase^Terminator Double-Stranded DNA SequencingKit，并在AB1 373自动测序仪上进行分析而确是的。该序列见SEQ ID No.：1。pCIP 6022保藏在Agricultural Research Service，Patent Culture Collection，(NRRL)，Northern Regional ReaearchCenter，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA，并给予保藏号NRRL B—21222。实施例11，VIP—1 DNA区的功能性裂解

为了证实VIP—1开放读码框架对于杀虫活性是必需的，在基因上产生了一翻译移码突变。限制酶Bg1 II可识别位于VIP—1编码区内1758bp一个单一位点。pCIB 6201用Bg1 II酶切，并用DNA聚合酶(Klenow片段)和dNTPs补平单链末端。该质粒被重新连接并转入大肠杆菌。产生的质粒pCIB6203在VIP—1编码区含有一四个核苷酸的插入。pCIB6203没有杀虫活性，证明VIP—1是抗玉米根叶甲活性的必要组份。

为了进一步限定VIP—1编码必需区，构建了VIP—1和VIP—2(辅助蛋白)区的亚克隆，并测试其与pCIB6203中的突变的互补能力。pCIB6023含有pBluescript SK^(t)(Stratagene)的3.7Kb×baI-EcoRv片段。Western印迹法分析表明pCIB 6023产生的VIP—1蛋白与克隆PL₂和PClB6022的大小与数量都相同。pCIB6023含有80KDa蛋白的全基因。pCIB6023被保藏在Agricul-tural Research Service，Pateat Culture Collection，(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North University StreetPeoria，Illinois 61604，USA，并给予保藏No.NRRL B-21223.

pCIB6023表现出一些抗玉米根叶甲活性，但是，活性水平低于pCIB6022。含有pCIB6023(突变的VIP—1和VIP—2)的细胞含与含pCIB6203(仅VIP—1)的细胞混和物表现出抗玉米根叶甲高活性。因此，pCIB6023必产生功能性VIP—1基因产物，并且pCIB6203必产生功能性VIP—2基因产物。这些结果表明需要额外的VIP—2区的基因产物与VIP—1一起产生最大的抗玉米根叶甲活性。见表19。表19pCIB6022的特征

盒状区代表VIP—1的范围，浅阴影部分代表编码在芽孢杆菌中发现的80KDa肽的区域，暗的阴影部分代表VIP—1 DNA序列所预示的N—末端氨基酸。大“X”代表引入VIP—1中的移码突变发生的位置，箭头代表由B—半乳糖苷酶转录的结构。限制酶酶切位点：C—ClaI；X-XbaI；S-ScaI；RI-EcoRI；B-BglII；RV-EcoRV。实施例12。AB78抗体的制备

先在两只Lewis大鼠中产生抗体，以保证转移制备杂交瘤细胞系的可能性和产生足够的cDNA文序有限筛选的血清。另一因素是可得到的抗体的量非常有限，并且只能制得通过PAGE纯化并接着转到硝酸纤维素上的纯度。

由于硝酸纤维素上的抗原有限，硝酸纤维素在DMSO中乳化并注射到动物的后们脚垫中，诱导上游的腘淋巴结产生B—细胞。通过western分析在第一次产物取血中产生强反应血清。几次连续注射并取血，产生足以完成所有筛选需要的血清。

接着开始其中一只大鼠进行杂交瘤制备。切下腘淋巴结、浸软，形成的细胞与小鼠骨髓淋巴瘤P3×63Ag 8.653融合。接着按如下所述进行细胞筛选。选出前四个产生最高乳化抗原反应的孔转到一有限稀释的克隆中。选择另外的10个孔进行扩大和冷冻保存。应用于ELSA筛选的在DMSO中乳化硝酸纤维素上的AB78的方法：

在PAGE上电泳的AB78样品转移到硝酸纤维素上之后，使用丽春红可逆染色以观察所有转移的蛋白。已进行了鉴定和N—末端测序的AB78毒素的对应条带确定后，从硝酸纤维素上切下来。每条带大小大约为1mm×5mm以减小要乳化的硝酸纤维素的量。每条带置于装有250μl DMSO的微量离心管中并用塑料乳钵槌Ckontes，Vineland，TVI使其浸软。为了乳化，DMSO混合物在37℃～45℃加热2—3分钟。加热后可进一步浸软；但是，所有硝酸纤维素都应被乳化。一旦AB78被乳化，将样品置于冰上。在制备用乳化抗原包被的微量滴定板时，样品必须用硼酸盐缓冲液盐水作如下稀释：1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶30，1∶50，1∶00和0。包被抗原必须是使用前新制备的。ELISA方法：1.以BSS中的AB78/DMSO包被，4℃温育过夜。2. 1×ELISA冲洗缓冲液，洗反三次。3.室温封闭(1％BSA和0.05％Tween的PBS)30分种。4. 1×ELISA冲洗缓冲液洗板三次5.加鼠血清，37℃温育1.5小时。6. 1×ELISA冲洗缓冲液洗板三次。7.加入含浓度为2μg/ml的羊抗鼠抗体的ELISA稀释液，37℃温育1小时。8. 1×ELISA冲洗缓冲液洗板三次。9.加含浓度为2μg/ml兔抗羊碱性磷酸酶的EIISA稀释粹，37℃温育1小时。10. 1×ELISA冲洗缓冲液洗板三次。11.加底物。室温温育30分钟。12. 30分钟后用3N NaOH终止。实施例13，无活性Bt菌株用AB78 VIP克隆激活杀虫活性。

一起加入pCIB6203和Bt菌株GC91培养上清可产生对玉米根叶甲100％的致死率。pCIB6203和GC91自身对玉米根叶甲都没有活性，数据如下所示：测试材料玉米根叶甲致死率pCIB6203 0GC91 16pCIB6203+GC91 100对照 0实施例14，蜡状芽孢杆菌AB81的分离和生物活性。

第二株蜡状芽孢杆菌菌株定名为AB81，它是通过标准方法从谷仓灰尘采样中分离到的。AB81进行传代培养并按实施例2所述作生物分析。生物学活性如实施例3所述进行评估。结果如下：测试昆虫种类致死百分率玉米螟 0小地老虎 0玉米根叶甲 55实施例15苏云金芽孢杆菌AB6的分离和生物活性

一苏云金芽孢杆菌定名为AB6，它通过本领域已知的标准方法从谷仓灰尘采样中分离到的。AB6进行传代培养并按实施例2所述进行生物分析。一半样品经高温灭菌15分钟检测B—外毒素是否存在。

生物活性按实施例3所示评估，结果如下：测试昆虫种类百分致死率玉米螟 0小地老虎 100小地老虎(灭菌样品) 0玉米根叶甲 0

菌株AB6已被保藏在Agricultuve Research Service，PatentCulture Collection，(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North Univetsity Street，Peoria，Illinois 61604，USA并给予保藏号No.NRRL B—21060。实施例16苏云金芽孢杆菌AB88的分离和生物学特征

一Bt菌株定名为AB88，它通过标准方法从谷仓灰尘采样中分离到。AB88进行传代培养并按实施例2所述进行生物分析。一半样品经高温灭菌所进行测试β—外毒素是否存在。抗各种昆虫的生物学活性按实施例3所述进行评估。结果如下：

培养上清的致死百分率测试昆虫品种类未灭菌灭菌小地老虎鳞翅目 100 5玉米螟鳞翅目 100 0翅夜蛾属草地夜蛾鳞翅目 100 4谷实夜蛾鳞翅目 100 12烟芽夜蛾鳞翅目 100 12马铃薯叶甲属马铃薯叶甲鞘翅目 0 0Diabrotica virgifera玉米根叶甲鞘翅目 0 5

通过标准方法从菌株AB88中纯化δ—内毒素晶体。做抗小地老虎生物分析时，纯化的晶体无活性。

实施例17菌株AB88的VIP的纯化

TB培养中进行细菌液体培养，37℃过夜。离心除去细胞并保留上清液。用硫酸铵(70％饱合)沉淀蛋白，离心并留下沉淀。用原体积的20mM Tris PH7.5重新悬浮沉淀，以同样的缓冲液进行透析。AB88的透析液比AB78相应物要混浊。澄清后，AB88蛋白通过多种不同方法进行分离，包括等电聚焦电泳(Rotofor，BioRad，Hercules，CA)、PH4.5沉淀、离子交换层析，孔经排阻层析和超滤。

通过PH4.5沉淀透析液，玉米螟活性蛋白存在于沉淀中。当使用PH3—10的两性电解液对透析液进行制备性等电聚焦电泳时，在PH7或更大的所有组份中发现ECB杀虫活性。这些级份的SDS—PAGE胶显示出MW～60KDa和MW～80KDa的蛋白条带。在Poros-Q柱上(Per Septive Biosystems，Cambrige，MA)进行离子交换IIPLC可将60KDa和80KDa条带分开。从含有MW稍有区别，但二者大小都约为60KDa的蛋白流份中得到N—末端序列。得到的序列彼此相似并与δ—内毒素有些相类似。离子交换流份23(较小)：xEPFVSA xxxQxxx(SEQ ID NO：10)离子交换流份28(较大)：xEYENVEPFVSAx(SEQ ID NO：11)

当PH4.5(活性)沉淀在Poros-Q柱上通过离子交换进行进一步分离时，仅在～60KDa的主带流份中发现活性。

当AB88透析液降至PH4.5时，小地老虎活性蛋白也保留在沉淀中。应用PH3—10的两性电解液进行制备性等电聚焦电泳，并未在ECB活性IEF组份中发现活性；相反，在PH4.5—5.0组份中活性最高。其主成份的分子量为～35和～80KDa。

PH4.5沉淀通过离子交换HPLC分离，产生只含35KDa物质的流份及含有35KDa与80KDa带的流份。实施例18，AB88 VIP的定性

如实施例17所述，制得含各种鳞翅目活性营养蛋白的级份。活性级份分析证实不同的VIP对应不同的鳞翅目种类活性。

小地老滤活性与80KDa和或35KDa蛋白有关，或者单独产生，或者复合产生。这些蛋白与任何来自Bt的δ—内毒素无关，因为它们与已知δ—内毒素序列缺少序列同源性。而且，在AB88δ—内毒素晶体中没发现这些蛋白。主要的δ—内毒素蛋白的N—末端序列与80KDa和35KDa VIP的N—末端序列相比较，发现没有序列同源性。结果总结如下：小地老虎VIP N—末端序列主要δ—内毒素蛋白 N—末端序列

130 kDa

MDNNPNINE(SEQ ID NO：14)

80kDa 80kDa

MNKNNTKLPTRALP(SEQ ID NO：12) MDNNPNINE(SEQ ID NO：15)

60kDa

35kDa MNVLNSGRTTI(SEQ ID NO：16)

ALSENTGKDGGYIVP(SEQ ID NO：13)

玉米螟活性与60KDa VIP有关而草地夜蛾活性与一未知大小的VIP有关。

苏云金芽孢杆菌菌株AB88已保藏在Agricultural ResearchService，Patent Culture Collection(NRRL)，Northern Regional Re-search Center，1815 North Uiniversity Street，Peoria，Illionis，61604，USA并给予保藏号No.NRRL B—21225。实施例19，其它芽孢杆菌菌株的分离和生物学活性

已分离到其它在营养生长时产生有杀虫活性蛋白的芽孢杆菌菌种。这些菌株通过标准方法从环境采样中分离到。分离株分别如实施例2和3所述的分析行生物分析。在生物分析中营养生长时产生有抗小地老虎活性的杀虫蛋白的分离株列于下表。芽孢杆菌分离株 δ—内毒素晶体存在致死百分率AB6 + 100AB5 - 80AB88 + 100AB195 - 60AB211 - 70AB217 - 83AB272 - 80AB279 - 70AB289 + 100AB292 + 80AB294 - 100AB300 - 80AB359 - 100

分离株AB289，AB294和AB359已保藏于Agricultural Re-search Service，Patent Culture Collection(NRRL)，Northern Re-gional Research Center，1815 North University Street，Peoria，IL61604，USA并分别给予保藏号NRRL B—21227，NRRL B—21229和NRRL B—21226。

在营养生长时产生抗玉米根叶甲活性的杀虫蛋白的芽孢杆菌分离株列入下表。芽孢杆菌分离株 δ—内毒素晶体存在致死百分率AB52 - 50AB59 - 71AB68 + 60AB78 - 100AB122 - 57AB218 - 64AB256 - 64

分离株AB59和AB256已保藏于Agricultural Research Service，Patent Culture Collection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，IL61604，USA并分别给予保藏号NRRL B—21228和NRRL B—21230。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请说明本发明相关的领域中熟练技术人员的技术水平。所有这些出版物和专利申请并入本文作为参考，如同每个出版物或专利申请逐一具体描述在本文中作为参考。

已在Agricultural Research Service，Patent Culture collection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North Univer-sity Street，Peoria，Illinois 61604，U.S.A进行了下列保藏：1.大肠杆菌PL2 保藏号NRRL B—212212.大肠杆菌pCIB6022 保藏号NRRL B—212223.大肠杆菌pCIB6023 保藏号NRRL B—212234.苏云金芽孢杆菌

HD 73—78VIP 保藏号NRRL B—212245.苏云金芽孢杆菌AB88 保藏号NRRL B—212256.苏云金芽孢杆菌AB359 保藏号NRRL 3—212267.苏云金芽孢杆菌AB289 保藏号NRRL B—212278.芽孢杆菌AB59 保藏号NRRL B—212289.芽孢杆菌AB294 保藏号NRRL B—2122910.芽孢杆菌AB256 保藏号NRRL B—2123011.大肠杆菌P5—4 保藏号NRRL B—2105912.大肠杆菌P3—12 保藏号NRRL B—2106l13.蜡状芽孢杆菌AB78 保藏号NRRL B—2105814.苏云金芽孢杆菌AB6 保藏号NRRL B—21060

虽然通过说明和为清楚理解起见的实施例相当详细地说明了本发明，但是很明显在所附权利要求范围内可进行某些改变和修饰。

序列表(1)一般信息

(i)申请人

(A)姓名：CIBA—GEIGY AG

(B)街道：Klybeckstrasse 141

(C)城市：Basle

(E)国籍：瑞士

(F)邮政编码(ZIP)：CH—4002

(G)电话：(061)696 11 11

(H)传真：(061)696 79 76

(A)姓名Gregory W.Warren

(B)街道：324 Bond Lake Drive

(C)城市：Cary

(D)州：NC

(E)国籍：USA

(F)邮政编码(ZIP)：27513

(A)姓名：Michael G.Koziel

(B)街道：509 Carolyn Court

(C)城市：Cary

(D)州：NC

(E)国籍：USA

(F)邮政编码(ZIP)27511

(A)姓名：Martha A.Mullins

(B)街道：104 Countrybrook Lane

(C)城市：Youngsv-lle

(D)州：NC

(E)国籍：USA

(F)邮政编码(ZIP)：27596

(A)姓名：Cordon J.Nye

(B)街道：1001 Bray Court

(C)城市：Apex

(D)州：NC

(E)国籍：USA

(F)邮政编码(ZIP)：27502

(A)姓名：Brian Carr

(B)街道：110 D Lady’s Slipper Ct

(C)城市：Raloigh

(D)州：N.C.

(E)国籍：U.S.A.

(F)邮政编码(ZIP)27606

(A)姓名：Nalini Manai Desai

(B)街道：107 Silverwood Lane

(C)城市：Cary

(D)州：N.C.

(E)国籍：U.S.A.

(F)邮政编码(ZIP)：27511

(A)姓名：N.Kristy Kostichka

(B)街道：5017 Wineberry Dr.

(C)城市：Durham

(D)州：NC

(E)国籍：USA

(F)邮政编码(ZIP)：27713

(ii)发明题目：新杀虫蛋白和菌株

(iii)序列数目：18

(iv)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统:PC—DOS/MS—DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version#1.25(EPO)

(vi)(ii)先有申请资料：

(A)申请号：US 08/037,057

(B)申请日：25-MAR-1993(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

(A)长度：6106碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线状

(ii)分子类型：DNA(基团组的)

(vi)最初的来源

(A)生物：蜡状芽孢杆菌

(B)菌株：AB78

(C)个体分离物：NRRL B—21058

(ix)特征

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1082…1810

(D)其它信息 /product＝“VIP-2”

/Tabel＝ORF-1

(ix)特征

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1925…2470 2470

(D)其它信息 /product＝“VIP-2”

/label＝ORF-2

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATCGATACAA TGTTGTTTTA CTTAGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT 60CTTTACTTTG ATACATTTTA ATAGCCATTT CAACCTTATC AGTATGTTTT TGTGGTCTTC 120CTCCTTTTTT TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TTAATCCTGT TTTGGTACGT TCGCTAATAA 180TATCTCTTTC TAATTCTGCA ATACTTGCCA TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT 240TAGAGGTATC AATGTTGTCA TGAATAGAAA TAAAATCTAC ACCTAGCTCT TTGAATTTTT 300CACTTAACTC AATTAGGTGT TTTGTAGAGC GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA 360TCTTATCGCC TTTACGTAAT ACTTTTAGCA ACTCTTCGAG TTGAGGGCGC TCTTTTTTTA 420TTCCTGTTAT TTTCTCCTGA TATAGCCTTT CTACACCATA TTGTTGCAAA GCATCTATTT 480GCATATCGAG ATTTTGTTCT TCTGTGCTGA CACGAGCATA ACCAAAAATC AAATTGGTTT 540CACTTCCTAT CTAAATATAT CTATTAAAAT AGCACCAAAA ACCTTATTAA ATTAAAATAA 600GGAACTTTGT TTTTGGATAT GGATTTTGGT ACTCAATATG GATGAGTTTT TAACGCTTTT 660GTTAAAAAAC AAACAAGTGC CATAAACGGT CGTTTTTGGG ATGACATAAT AAATAATCTG 720TTTGATTAAC CTAACCTTGT ATCCTTACAG CCCAGTTTTA TTTGTACTTC AACTGACTGA 780ATATGAAAAC AACATGAAGG TTTCATAAAA TTTATATATT TTCCATAACG GATGCTCTAT 840CTTTAGGTTA TAGTTAAATT ATAAGAAAAA AACAAACGGA GGGAGTGAAA AAAAGCATCT 900TCTCTATAAT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAAT AAATATGAAT 960ATCTATCTAT AATTGTTTGC TTCTACAATA ACTTATCTAA CTTTCATATA CAACAACAAA 1020ACAGACTAAA TCCAGATTGT ATATTCATTT TCAGTTGTTC CTTTATAAAA TAATTTCATA 1080A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA 1126Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu

1 5 10 15CAA GTA GTT ACT AAA ACT GTA TTG CTT AGT ACA GTT TTC TCT ATA TCT 1174Gln Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser Ile Ser

20 25 30TTA TTA AAT AAT GAA GTG ATA AAA GCT GAA CAA TTA AAT ATA AAT TCT 1222Leu Leu Asn Asn Glu Val Ile Lys Ala Glu Gln Leu Asn Ile Asn Ser

35 40 45CAA AGT AAA TAT ACT AAC TTG CAA AAT CTA AAA ATC ACT GAC AAG GTA 1270Gln Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val

50 55 60GAG GAT TTT AAA GAA GAT AAG GAA AAA GCG AAA GAA TGG GGG AAA GAA 1318Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu

65 70 75AAA GAA AAA GAG TGG AAA CTA ACT GCT ACT GAA AAA GGA AAA ATG AAT 1366Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn80 85 90 95AAT TTT TTA GAT AAT AAA AAT GAT ATA NAG ACA AAT TAT AAA GAA ATT 1414Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Xaa Thr Asn Tyr Lys Glu Ile

100 105 110ACT TTT TCT ATG GCA GGC TCA TTT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA AAA 1462Thr Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys

115 120 125GAA ATT GAT AAG ATG TTT GAT AAA ACC AAT CTA TCA AAT TCT ATT ATC 1510Glu Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile

130 135 140ACC TAT AAA AAT GTG GAA CCG ACA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA 1558Thr Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu

145 150 155ACA GAA GGT AAT ACG ATT AAT TCT GAT GCA ATG GCA CAG TTT AAA GAA 1606Thr Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gln Phe Lys Glu160 165 170 175CAA TTT TTA GAT AGG GAT ATT AAG TTT GAT AGT TAT CTA GAT ACG CAT 1654Gln Phe Leu Asp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His

180 185 190TTA ACT GCT CAA CAA GTT TCC AGT AAA GAA AGA GTT ATT TTG AAG GTT 1702Leu Thr Ala Gln Gln Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val

195 200 205ACG GTT CCG AGT GGG AAA GGT TCT ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC 1750Thr Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val

210 215 220ATT TTA AAT AAT AGT GAA TAC AAA ATG CTC ATT GAT AAT GGG TAT ATG 1798Ile Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met

225 230 235GTC CAT GTA GAT TAAGGTATCA AAAGTGGTGA AAAAAGGGGG TGGAGTGCCT 1850Val His Val Asp240TACAAATTGA AGGGACTTTA AAAAAGAGTC TTGACTTTAA AAATGATATA AATGCTGAAG 1910CGCATAGCTG GGGT ATG AAG AAT TAT GAA GAG TGG GCT AAA GAT TTA ACC 1960

Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr

1 5 10GAT TCG CAA AGG GAA GCT TTA GAT GGG TAT GCT AGG CAA GAT TAT AAA 2008Asp Ser Gln Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Tyr Lys

15 20 25GAA ATC AAT AAT TAT TTA AGA AAT CAA GGC GGA AGT GGA AAT GAA AAA 2056Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gln Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys

30 35 40CTA GAT GCT CAA ATA AAA AAT ATT TCT GAT GCT TTA GGG AAG AAA CCA 2104Leu Asp Ala Gln Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro45 50 55 60ATA CCG GAA AAT ATT ACT GTG TAT AGA TGG TGT GGC ATG CCG GAA TTT 2152Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe

65 70 75GGT TAT CAA ATT AGT GAT CCG TTA CCT TCT TTA AAA GAT TTT GAA GAA 2200Gly Tyr Gln Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu

80 85 90CAA TTT TTA AAT ACA ATC AAA GAA GAC AAA GGA TAT ATG AGT ACA AGC 2248Gln Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser

95 100 105TTA TCG AGT GAA CGT CTT GCA GCT TTT GGA TCT AGA AAA ATT ATA TTA 2296Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile Ile Leu

110 115 120CGA TTA CAA GTT CCG AAA GGA AGT ACG GGT GCG TAT TTA AGT GCC ATT 2344Arg Leu Gln Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Ile125 130 135 140GGT GGA TTT GCA AGT GAA AAA GAG ATC CTA CTT GAT AAA GAT AGT AAA 2392Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys

145 150 155TAT CAT ATT GAT AAA GTA ACA GAG GTA ATT ATT AAA GGT GTT AAG CGA 2440Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys Gly Val Lys Arg

160 165 170TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT TAAGGAGATG AAAAATATGA 2490Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn

175 180AGAAAAAGTT AGCAAGTGTT GTAACGTGTA CGTTATTAGC TCCTATGTTT TTGAATGGAA 2550ATGTGAATGC TGTTTACGCA GACAGCAAAA CAAATCAAAT TTCTACAACA CAGAAAAATC 2610AACAGAAAGA GATGGACCGA AAAGGATTAC TTGGGTATTA TTTCAAAGGA AAAGATTTTA 2670GTAATCTTAC TATGTTTGCA CCGACACGTG ATAGTACTCT TATTTATGAT CAACAAACAG 2730CAAATAAACT ATTAGATAAA AAACAACAAG AATATCAGTC TATTCGTTGG ATTGGTTTGA 2790TTCAGAGTAA AGAAACGGGA GATTTCACAT TTAACTTATC TGAGGATGAA CAGGCAATTA 2850TAGAAATCAA TGGGAAAATT ATTTCTAATA AAGGGAAAGA AAAGCAAGTT GTCCATTTAG 2910AAAAAGGAAA ATTAGTTCCA ATCAAAATAG AGTATCAATC AGATACAAAA TTTAATATTG 2970ACAGTAAAAC ATTTAAAGAA CTTAAATTAT TTAAAATAGA TAGTCAAAAC CAACCCCAGC 3030AAGTCCAGCA AGATGAACTG AGAAATCCTG AATTTAACAA GAAAGAATCA CAGGAATTCT 3090TAGCGAAACC ATCGAAAATA AATCTTTTCA CTCAAMAAAT GAAAAGGGAA ATTGATGAAG 3150ACACGGATAC GGATGGGGAC TCTATTCCTG ACCTTTGGGA AGAAAATGGG TATACGATTC 3210AMAATAGAAT CGCTGTAAAG TGGGACGATT CTCTAGCAAG TAAAGGGTAT ACGAAATTTG 3270TTTCAAATCC ACTAGAAAGT CACACAGTTG GTGATCCTTA TACAGATTAT GAAAAGGCAG 3330CAAGAGATCT AGATTTGTCA AATGCAAAGG AAACGTTTAA CCCATTGGTA GCTGCTTTTC 3390CAAGTGTGAA TGTTAGTATG GAAAAGGTGA TATTATCACC AAATGAAAAT TTATCCAATA 3450GTGTAGAGTC TCATTCATCC ACGAATTGGT CTTATACAAA TACAGAAGGT GCTTCTGTTG 3510AAGCGGGGAT TGGACCAAAA GGTATTTCGT TCGGAGTTAG CGTAAACTAT CAACACTCTG 3570AAACAGTTGC ACAAGAATGG GGAACATCTA CAGGAAATAC TTCGCAATTC AATACGGCTT 3630CAGCGGGATA TTTAAATGCA AATGTTCGAT ATAACAATGT AGGAACTGGT GCCATCTACG 3690ATGTAAAACC TACAACAAGT TTTGTATTAA ATAACGATAC TATCGCAACT ATTACGGCGA 3750AATCTAATTC TACAGCCTTA AATATATCTC CTGGAGAAAG TTACCCGAAA AAAGGACAAA 3810ATGGAATCGC AATAACATCA ATGGATGATT TTAATTCCCA TCCGATTACA TTAAATAAAA 3870AACAAGTAGA TAATCTGCTA AATAATAAAC CTATGATGTT GGAAACAAAC CAAACAGATG 3930GTGTTTATAA GATAAAAGAT ACACATGGAA ATATAGTAAC TGGCGGAGAA TGGAATGGTG 3990TCATACAACA AATCAAGGCT AAAACAGCGT CTATTATTGT GGATGATGGG GAACGTGTAG 4050CAGAAAAACG TGTAGCGGCA AAAGATTATG AAAATCCAGA AGATAAAACA CCGTCTTTAA 4110CTTTAAAAGA TGCCCTGAAG CTTTCATATC CAGATGAAAT AAAAGAAATA GAGGGATTAT 4170TATATTATAA AAACAAACCG ATATACGAAT CGAGCGTTAT GACTTACTTA GATGAAAATA 4230CAGCAAAAGA AGTGACCAAA CAATTAAATG ATACCACTGG GAAATTTAAA GATGTAAGTC 4290ATTTATATGA TGTAAAACTG ACTCCAAAAA TGAATGTTAC AATCAAATTG TCTATACTTT 4350ATGATAATGC TGAGTCTAAT GATAACTCAA TTGGTAAATG GACAAACACA AATATTGTTT 4410CAGGTGGAAA TAACGGAAAA AAACAATATT CTTCTAATAA TCCGGATGCT AATTTGACAT 4470TAAATACAGA TGCTCAAGAA AAATTAAATA AAAATCGTGA CTATTATATA AGTTTATATA 4530TGAAGTCAGA AAAAAACACA CAATGTGAGA TTACTATAGA TGGGGAGATT TATCCGATCA 4590CTACAAAAAC AGTGAATGTG AATAAAGACA ATTACAAAAG ATTAGATATT ATAGCTCATA 4650ATATAAAAAG TAATCCAATT TCTTCACTTC ATATTAAAAC GAATGATGAA ATAACTTTAT 4710TTTGGGATGA TATTTCTATA ACAGATGTAG CATCAATAAA ACCGGAAAAT TTAACAGATT 4770CAGAAATTAA ACAGATTTAT AGTAGGTATG GTATTAAGTT AGAAGATGGA ATCCTTATTG 4830ATAAAAAAGG TGGGATTCAT TATGGTGAAT TTATTAATGA AGCTAGTTTT AATATTGAAC 4890CATTGCCAAA TTATGTGACC AAATATGAAG TTACTTATAG TAGTGAGTTA GGACCAAACG 4950TGAGTGACAC ACTTGAAAGT GATAAAATTT ACAAGGATGG GACAATTAAA TTTGATTTTA 5010CCAAATATAG TAAAAATGAA CAAGGATTAT TTTATGACAG TGGATTAAAT TGGGACTTTA 5070AAATTAATGC TATTACTTAT GATGGTAAAG AGATGAATGT TTTTCATAGA TATAATAAAT 5130AGTTATTATA TCTATGAAGC TGGTGCTAAA GATAGTGTAA AAGTTAATAT ACTGTAGGAT 5190TGTAATAAAA GTAATGGAAT TGATATCGTA CTTTGGAGTG GGGGATACTT TGTAAATAGT 5250TCTATCAGAA ACATTAGACT AAGAAAAGTT ACTACCCCCA CTTGAAAATG AAGATTCAAC 5310TGATTACAAA CAACCTGTTA AATATTATAA GGTTTTAACA AAATATTAAA CTCTTTATGT 5370TAATACTGTA ATATAAAGAG TTTAATTGTA TTCAAATGAA GCTTTCCCAC AAAATTAGAC 5430TGATTATCTA ATGAAATAAT CAGTCTAATT TTGTAGAACA GGTCTGGTAT TATTGTACGT 5490GGTCACTAAA AGATATCTAA TATTATTGGG CAAGGCGTTC CATGATTGAA TCCTCGAATG 5550TCTTGCCCTT TTCATTTATT TAAGAAGGAT TGTGGAGAAA TTATGGTTTA GATAATGAAG 5610AAAGACTTCA CTTCTAATTT TTGATGTTAA ATAAATCAAA ATTTGGCGAT TCACATTGTT 5670TAATCCACTG ATAAAACATA CTGGAGTGTT CTTAAAAAAT CAGCTTTTTT CTTTATAAAA 5730TTTTGCTTAG CGTACGAAAT TCGTGTTTTG TTGGTGGGAC CCCATGCCCA TCAACTTAAG 5790AGTAAATTAG TAATGAACTT TCGTTCATCT GGATTAAAAT AACCTCAAAT TAGGACATGT 5850TTTTAAAAAT AAGCAGACCA AATAAGCCTA GAATAGGTAT CATTTTTAAA AATTATGCTG 5910CTTTCTTTTG TTTTCCAAAT CCATTATACT CATAAGCAAC ACCCATAATG TCAAAGACTG 5970TTTTTGTCTC ATATCGATAA GCTTGATATC GAATTCCTGC AGCCCGGGGG ATCCACTAGT 6030TCTAGAGCGG CCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT GAGGGTTAAG 6090TTCGAGCTTG TCGTGG 6106(2)SEQ ID NO 2的资料：

(i)序列特征

(A)长度：243个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：蛋白

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu Gln1 5 10 15Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser Ile Ser Leu

20 25 30Leu Asn Asn Glu Val Ile Lys Ala Glu Gln Leu Asn Ile Asn Ser Gln

35 40 45Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu

50 55 60Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys65 70 75 80Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn

85 90 95Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Xaa Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr

100 105 110Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu

115 120 125Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr

130 135 140Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr145 150 155 160Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gln Phe Lys Glu Gln

165 170 175Phe Leu Asp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu

180 185 190Thr Ala Gln Gln Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val Thr

195 200 205Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val Ile

210 215 220Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met Val225 230 235 240His Val Asp(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征

(A)长度：182个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述 SEQ ID NO：3：Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gln Arg1 5 10 15Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn

20 25 30Tyr Leu Arg Asn Gln Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gln

35 40 45Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn

50 55 60Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gln Ile65 70 75 80Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gln Phe Leu Asn

85 90 95Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu

100 105 110Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gln Val

115 120 125Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala

130 135 140Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Asp145 150 155 160Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp

165 170 175Ala Thr Leu Leu Thr Asn

180(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征

(A)长度：2655碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：DNA(基团组的)

(iii)假设：无

(iii)反义：无

(vi)最初来源

(A)生物：蜡状芽孢杆菌

(B)菌株：AB78

(C)个体分离物NRRL B—21058

(ix)特征

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1…2652

(C)鉴定方法：实验的

(D)其它信息 /product＝“100 kDa protein VIP-1”

/evidence＝EXPERIMENTAL

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA 48Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu1 5 10 15TTA GCT CCT ATG TTT TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC 96Leu Ala Pro Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp

20 25 30AGC AAA ACA AAT CAA ATT TCT ACA ACA CAG AAA AAT CAA CAG AAA GAG 144Ser Lys Thr Asn Gln Ile Ser Thr Thr Gln Lys Asn Gln Gln Lys Glu

35 40 45ATG GAC CGA AAA GGA TTA CTT GGG TAT TAT TTC AAA GGA AAA GAT TTT 192Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe

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85 90 95CAG TCT ATT CGT TGG ATT GGT TTG ATT CAG AGT AAA GAA ACG GGA GAT 336Gln Ser Ile Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gln Ser Lys Glu Thr Gly Asp

100 105 110TTC ACA TTT AAC TTA TCT GAG GAT GAA CAG GCA ATT ATA GAA ATC AAT 384Phe Thr Phe Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gln Ala Ile Ile Glu Ile Asn

115 120 125GGG AAA ATT ATT TCT AAT AAA GGG AAA GAA AAG CAA GTT GTC CAT TTA 432Gly Lys Ile Ile Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gln Val Val His Leu

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180 185 190AAT CCT GAA TTT AAC AAG AAA GAA TCA CAG GAA TTC TTA GCG AAA CCA 624Asn Pro Glu Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gln Glu Phe Leu Ala Lys Pro

195 200 205TCG AAA ATA AAT CTT TTC ACT CAA MAA ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA 672Ser Lys Ile Asn Leu Phe Thr Gln Xaa Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu

210 215 220GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT 720Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn225 230 235 240GGG TAT ACG ATT CAM AAT AGA ATC GCT GTA AAG TGG GAC GAT TCT CTA 768Gly Tyr Thr Ile Xaa Asn Arg Ile Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu

245 250 255GCA AGT AAA GGG TAT ACG AAA TTT GTT TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC 816Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His

260 265 270ACA GTT GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT GAA AAG GCA GCA AGA GAT CTA 864Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu

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290 295 300CCA AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA 960Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu305 310 315 320AAT TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT 1008Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr

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340 345 350ATT TCG TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT CAA CAC TCT GAA ACA GTT GCA 1104Ile Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gln His Ser Glu Thr Val Ala

355 360 365CAA GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT ACT TCG CAA TTC AAT ACG GCT 1152Gln Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gln Phe Asn Thr Ala

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(i)序列特征(A)长度：884个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu1 5 10 15Leu Ala Pro Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp

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835 840 845Lys Asn Glu Gln Gly Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe

850 855 860Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His865 870 875 880Arg Tyr Asn Lys(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征

(A)长度：2004个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(iii)假设：无

(iii)反义：无

(vi)最初来源：

(A)生物：蜡状芽孢杆菌

(B)菌株：AB78

(C)个体分离物：NRRL B—21058

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置1…2001

(C)鉴定方法：实验的

(D)其它信息：/product＝“80 kDa蛋白 VIP-1”

/evidence＝ EXPERIMENTAL

(xi)序列描述 SEQ ID NO：6：ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT 48Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile1 5 10 15CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT GGG TAT ACG ATT CAM AAT AGA ATC GCT 96Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr Ile Xaa Asn Arg Ile Ala

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100 105 110TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT ACA AAT ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA 384Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu

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450 455 460AGT TTA TAT ATG AAG TCA GAA AAA AAC ACA CAA TGT GAG ATT ACT ATA 1440Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gln Cys Glu Ile Thr Ile465 470 475 480GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC ACT ACA AAA ACA GTG AAT GTG AAT AAA 1488Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys

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515 520 525TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT 1632Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu Asn

530 535 540TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA CAG ATT TAT AGT AGG TAT GGT ATT AAG 1680Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gln Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys545 550 555 560TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT GAT AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT 1728Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly

565 570 575GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT TTT AAT ATT GAA CCA TTG CCA AAT TAT 1776Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr

580 585 590GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG 1824Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val

595 600 605AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT AAA ATT TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA 1872Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys

610 615 620TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT AAA AAT GAA CAA GGA TTA TTT TAT GAC 1920Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gln Gly Leu Phe Tyr Asp625 630 635 640AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT AAA ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT 1968Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly

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660 665(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

(A)长度：667个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述 SEQ ID NO：7：Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile1 5 10 15Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr Ile Xaa Asn Arg Ile Ala

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290 295 300Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro305 310 315 320Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser

325 330 335Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu Ile Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn

340 345 350Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr

355 360 365Ala Lys Glu Val Thr Lys Gln Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys

370 375 380Asp Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val385 390 395 400Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn

405 410 415Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn

420 425 430Gly Lys Lys Gln Tyr Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu

435 440 445Asn Thr Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr Ile

450 455 460Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gln Cys Glu Ile Thr Ile465 470 475 480Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys

485 490 495Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp Ile Ile Ala His Asn Ile Lys Ser Asn

500 505 510Pro Ile Ser Ser Leu His Ile Lys Thr Asn Asp Glu Ile Thr Leu Phe

515 520 525Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu Asn

530 535 540Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gln Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys545 550 555 560Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly

565 570 575Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr

580 585 590Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val

595 600 605Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys

610 615 620Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gln Gly Leu Phe Tyr Asp625 630 635 640Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly

645 650 655Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys

660 665(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—未端

(vi)最初来源

(A)生物：蜡状芽孢杆菌

(B)菌株：AB78

(C)个体分离物：NRRL B—21058

(ix)特征

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：1…16

(D)其它信息：/note＝“菌株AB78中纯化的蛋白的N—末端序列”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly Asp Ser Ile Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(iii)假设：无

(iii)反义：无

(ix)特征：

(A)名称/关键词：misc feature

(B)位置：1…21

(D)其它信息：/note＝利用苏云金芽孢杆菌的编码习惯、基于SEQ

ID NO：8的3到9位氨基酸的寡聚核苷酸探针

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GAAATTGATC AAGATACNGA T(2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—未端

(vi)最初来源：

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(B)菌株：AB88

(ix)特征

(A)名称/关链词：肽

(B)位置：1…14

(D)其它信息：/note＝“阴离子交换流份23(较小的)蛋白的N—末端氨

基酸序列”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa

1 5 10(2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—未端

(vi)最初来源：

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(B)菌株：AB88

(ix)特征

(A)名称/关链词：肽

(B)位置：1…13

(D)其它信息：/note＝“阴离子交换流份23(较大的)蛋白的N—末端氨

基酸序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1l：

Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa

1 5 10(2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—未端

(vi)最初来源：

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(B)菌株：AB88

(ix)特征

(A)名称/关键词

(B)位置：1…14

(D)其它特征：/note＝“抗小地老虎活性80 kDa VIP的N—末端序列

(xi)序列描述： SEQ ID NO：12：

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro

1 5 10(2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—末端

(vi)最初来源

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(B)菌株：AB88

(ix)特征

(A)名称/关键词：

(B)位置：1…15

(D)其它信息：/note＝“抗小地老虎活性的35kDa VIP的N—未端氨

基酸序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr Ile Val Pro

1 5 10 15(2)SEQ ID NO：14的资料

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—末端

(vi)最初来源

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(ix)特征：

(A)名称/关连词

(B)位置：1…9

(D)其它信息/note＝“130kDa δ—内毒素的N—末端序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu

1 5(2)SEQ ID NO：15的资料

(i)序列特征

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—末端

(ix)特征

(A)名称/关键词：

(B)位置1…9

(D)其它信息：/note＝“80kDa的δ—内毒素的N—末端序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu

1 5(2)SEQ ID NO：16的资料

(i)序列特征

(A)长度：11个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：N—末端

(vi)最初来源

(A)生物：苏云金芽孢杆菌

(ix)特征

(A)名称/关键词

(B)位置：1…11

(D)其它信息：/note＝“60kDa的δ—内毒素的N—末端序列”

(xi)序列描述 SEQ ID NO：16：

Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile

1 5 10(2)SEQ ID NO：17的资料

(i)序列特征

(A)长度：2655个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(iii)假设：无

(iii)反义：无

(xi)序列描述： SEQ ID NO：17：ATGAAGAACA TGAAGAAGAA GCTGGCCAGC GTGGTGACCT GCACCCTGCT GGCCCCCATG 60TTCCTGAACG GCAACGTGAA CGCCGTGTAC GCCGACAGCA AGACCAACCA GATCAGCACC 120ACCCAGAAGA ACCAGCAGAA GGAGATGGAC CGCAAGGGCC TGCTGGGCTA CTACTTCAAG 180GGCAAGGACT TCAGCAACCT GACCATGTTC GCCCCCACGC GTGACAGCAC CCTGATCTAC 240GACCAGCAGA CCGCCAACAA GCTGCTGGAC AAGAAGCAGC AGGAGTACCA GAGCATCCGC 300TGGATCGGCC TGATCCAGAG CAAGGAGACC GGCGACTTCA CCTTCAACCT GAGCGAGGAC 360GAGCAGGCCA TCATCGAGAT CAACGGCAAG ATCATCAGCA ACAAGGGCAA GGAGAAGCAG 420GTGGTGCACC TGGAGAAGGG CAAGCTGGTG CCCATCAAGA TCGAGTACCA GAGCGACACC 480AAGTTCAACA TCGACAGCAA GACCTTCAAG GAGCTGAAGC TTTTCAAGAT CGACAGCCAG 540AACCAGCCCC AGCAGGTGCA GCAGGACGAG CTGCGCAACC CCGAGTTCAA CAAGAAGGAG 600AGCCAGGAGT TCCTGGCCAA GCCCAGCAAG ATCAACCTGT TCACCCAGCA GATGAAGCGC 660GAGATCGACG AGGACACCGA CACCGACGGC GACAGCATCC CCGACCTGTG GGAGGAGAAC 720GGCTACACCA TCCAGAACCG CATCGCCGTG AAGTGGGACG ACAGCCTGGC TAGCAAGGGC 780TACACCAAGT TCGTGAGCAA CCCCCTGGAG AGCCACACCG TGGGCGACCC CTACACCGAC 840TACGAGAAGG CCGCCCGCGA CCTGGACCTG AGCAACGCCA AGGAGACCTT CAACCCCCTG 900GTGGCCGCCT TCCCCAGCGT GAACGTGAGC ATGGAGAAGG TGATCCTGAG CCCCAACGAG 960AACCTGAGCA ACAGCGTGGA GAGCCACTCG AGCACCAACT GGAGCTACAC CAACACCGAG 1020GGCGCCAGCG TGGAGGCCGG CATCGGTCCC AAGGGCATCA GCTTCGGCGT GAGCGTGAAC 1080TACCAGCACA GCGAGACCGT GGCCCAGGAG TGGGGCACCA GCACCGGCAA CACCAGCCAG 1140TTCAACACCG CCAGCGCCGG CTACCTGAAC GCCAACGTGC GCTACAACAA CGTGGGCACC 1200GGCGCCATCT ACGACGTGAA GCCCACCACC AGCTTCGTGC TGAACAACGA CACCATCGCC 1260ACCATCACCG CCAAGTCGAA TTCCACCGCC CTGAACATCA GCCCCGGCGA GAGCTACCCC 1320AAGAAGGGCC AGAACGGCAT CGCCATCACC AGCATGGACG ACTTCAACAG CCACCCCATC 1380ACCCTGAACA AGAAGCAGGT GGACAACCTG CTGAACAACA AGCCCATGAT GCTGGAGACC 1440AACCAGACCG ACGGCGTCTA CAAGATCAAG GACACCCACG GCAACATCGT GACCGGCGGC 1500GAGTGGAACG GCGTGATCCA GCAGATCAAG GCCAAGACCG CCAGCATCAT CGTCGACGAC 1560GGCGAGCGCG TGGCCGAGAA GCGCGTGGCC GCCAAGGACT ACGAGAACCC CGAGGACAAG 1620ACCCCCAGCC TGACCCTGAA GGACGCCCTG AAGCTGAGCT ACCCCGACGA GATCAAGGAG 1680ATCGAGGGCC TGCTGTACTA CAAGAACAAG CCCATCTACG AGAGCAGCGT GATGACCTAT 1740CTAGACGAGA ACACCGCCAA GGAGGTGACC AAGCAGCTGA ACGACACCAC CGGCAAGTTC 1800AAGGACGTGA GCCACCTGTA CGACGTGAAG CTGACCCCCA AGATGAACGT GACCATCAAG 1860CTGAGCATCC TGTACGACAA CGCCGAGAGC AACGACAACA GCATCGGCAA GTGGACCAAC 1920ACCAACATCG TGAGCGGCGG CAACAACGGC AAGAAGCAGT ACAGCAGCAA CAACCCCGAC 1980GCCAACCTGA CCCTGAACAC CGACGCCCAG GAGAAGCTGA ACAAGAACCG CGACTACTAC 2040ATCAGCCTGT ACATGAAGAG CGAGAAGAAC ACCCAGTGCG AGATCACCAT CGACGGCGAG 2100ATATACCCCA TCACCACCAA GACCGTGAAC GTGAACAAGG ACAACTACAA GCGCCTGGAC 2160ATCATCGCCC ACAACATCAA GAGCAACCCC ATCAGCAGCC TGCACATCAA GACCAACGAC 2220GAGATCACCC TGTTCTGGGA CGACATATCG ATTACCGACG TCGCCAGCAT CAAGCCCGAG 2280AACCTGACCG ACAGCGAGAT CAAGCAGATA TACAGTCGCT ACGGCATCAA GCTGGAGGAC 2340GGCATCCTGA TCGACAAGAA GGGCGGCATC CACTACGGCG AGTTCATCAA CGAGGCCAGC 2400TTCAACATCG AGCCCCTGCA GAACTACGTG ACCAAGTACG AGGTGACCTA CAGCAGCGAG 2460CTGGGCCCCA ACGTGAGCGA CACCCTGGAG AGCGACAAGA TTTACAAGGA CGGCACCATC 2520AAGTTCGACT TCACCAAGTA CAGCAAGAAC GAGCAGGGCC TGTTCTACGA CAGCGGCCTG 2580AACTGGGACT TCAAGATCAA CGCCATCACC TACGACGGCA AGGAGATGAA CGTGTTCCAC 2640CGCTACAACA AGTAG 2655(2)SEQ ID NO：18的资料(i)序列特征

(A)长度：2010个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假设：无(iii)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GGATCCATGA AGCGCGAGAT CGACGAGGAC ACCGACACCG ACGGCGACAG CATCCCCGAC 60CTGTGGGAGG AGAACGGCTA CACCATCCAG AACCGCATCG CCGTGAAGTG GGACGACAGC 120CTGGCTAGCA AGGGCTACAC CAAGTTCGTG AGCAACCCCC TGGAGAGCCA CACCGTGGGC 180GACCCCTACA CCGACTACGA GAAGGCCGCC CGCGACCTGG ACCTGAGCAA CGCCAAGGAG 240ACCTTCAACC CCCTGGTGGC CGCCTTCCCC AGCGTGAACG TGAGCATGGA GAAGGTGATC 300CTGAGCCCCA ACGAGAACCT GAGCAACAGC GTGGAGAGCC ACTCGAGCAC CAACTGGAGC 360TACACCAACA CCGAGGGCGC CAGCGTGGAG GCCGGCATCG GTCCCAAGGG CATCAGCTTC 420GGCGTGAGCG TGAACTACCA GCACAGCGAG ACCGTGGCCC AGGAGTGGGG CACCAGCACC 480GGCAACACCA GCCAGTTCAA CACCGCCAGC GCCGGCTACC TGAACGCCAA CGTGCGCTAC 540AACAACGTGG GCACCGGCGC CATCTACGAC GTGAAGCCCA CCACCAGCTT CGTGCTGAAC 600AACGACACCA TCGCCACCAT CACCGCCAAG TCGAATTCCA CCGCCCTGAA CATCAGCCCC 660GGCGAGAGCT ACCCCAAGAA GGGCCAGAAC GGCATCGCCA TCACCAGCAT GGACGACTTC 720AACAGCCACC CCATCACCCT GAACAAGAAG CAGGTGGACA ACCTGCTGAA CAACAAGCCC 780ATGATGCTGG AGACCAACCA GACCGACGGC GTCTACAAGA TCAAGGACAC CCACGGCAAC 840ATCGTGACCG GCGGCGAGTG GAACGGCGTG ATCCAGCAGA TCAAGGCCAA GACCGCCAGC 900ATCATCGTCG ACGACGGCGA GCGCGTGGCC GAGAAGCGCG TGGCCGCCAA GGACTACGAG 960AACCCCGAGG ACAAGACCCC CAGCCTGACC CTGAAGGACG CCCTGAAGCT GAGCTACCCC 1020GACGAGATCA AGGAGATCGA GGGCCTGCTG TACTACAAGA ACAAGCCCAT CTACGAGAGC 1080AGCGTGATGA CCTATCTAGA CGAGAACACC GCCAAGGAGG TGACCAAGCA GCTGAACGAC 1140ACCACCGGCA AGTTCAAGGA CGTGAGCCAC CTGTACGACG TGAAGCTGAC CCCCAAGATG 1200AACGTGACCA TCAAGCTGAG CATCCTGTAC GACAACGCCG AGAGCAACGA CAACAGCATC 1260GGCAAGTGGA CCAACACCAA CATCGTGAGC GGCGGCAACA ACGGCAAGAA GCAGTACAGC 1320AGCAACAACC CCGACGCCAA CCTGACCCTG AACACCGACG CCCAGGAGAA GCTGAACAAG 1380AACCGCGACT ACTACATCAG CCTGTACATG AAGAGCGAGA AGAACACCCA GTGCGAGATC 1440ACCATCGACG GCGAGATATA CCCCATCACC ACCAAGACCG TGAACGTGAA CAAGGACAAC 1500TACAAGCGCC TGGACATCAT CGCCCACAAC ATCAAGAGCA ACCCCATCAG CAGCCTGCAC 1560ATCAAGACCA ACGACGAGAT CACCCTGTTC TGGGACGACA TATCGATTAC CGACGTCGCC 1620AGCATCAAGC CCGAGAACCT GACCGACAGC GAGATCAAGC AGATATACAG TCGCTACGGC 1680ATCAAGCTGG AGGACGGCAT CCTGATCGAC AAGAAGGGCG GCATCCACTA CGGCGAGTTC 1740ATCAACGAGG CCAGCTTCAA CATCGAGCCC CTGCAGAACT ACGTGACCAA GTACGAGGTG 1800ACCTACAGCA GCGAGCTGGG CCCCAACGTG AGCGACACCC TGGAGAGCGA CAAGATTTAC 1860AAGGACGGCA CCATCAAGTT CGACTTCACC AAGTACAGCA AGAACGAGCA GGGCCTGTTC 1920TACGACAGCG GCCTGAACTG GGACTTCAAG ATCAACGCCA TCACCTACGA CGGCAAGGAG 1980ATGAACGTGT TCCACCGCTA CAACAAGTAG 2010

Claims

1.在其营养生长期产生杀虫蛋白的基本纯化的芽孢杆菌属菌株。

2.权利要求1的芽孢杆菌属菌株，其中所述的芽孢杆菌选自表11中的列出的芽孢杆菌属种类。

3.权利要求1的芽孢杆菌属菌株，其中所述的蛋白能够杀死选自昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱、原生动物病原体、动物寄生虫及类似物的害虫。

4.权利要求3的芽孢杆菌菌株，其中所述蛋白能够杀死选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、食毛目、虱目、蚤目或毛翅目的害虫。

5.权利要求4的芽孢杆菌菌株，其中所述鞘翅目种类为叶甲属。

6.权利要求5的芽孢杆菌菌株，其中所述的叶甲是玉米根叶甲或长角叶角。

7.权利要求4的芽孢杆菌菌株，其所述的鳞翅目种类为地老虎属。

8.权利要求7的芽孢杆菌菌株，其中所述的地老虎为小地老虎。

9.权利要求2的芽孢杆菌菌株，其中所述的芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌。

10.权利要求9的芽孢杆菌菌株，其中所述的蜡状芽孢杆菌为保藏号为NRRL B—21058的蜡状芽孢杆菌。

11.权利要求2的芽孢杆菌菌株，其中所述的芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌。

12.权利要求11的芽孢杆菌菌株，其中所述的苏云金芽孢杆菌是保藏号为NRRL—21060的苏云金芽孢杆菌。

13.权利要求2的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质分子量为30KDa或更大。

14.权利要求13的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质分子量为约60到约100KDa。

15.权利要求14的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质分子量约为80KDa。

16.权利要求15的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质具有SEQ、ID NO：7所给出的序列。

17.权利要求14的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质分子量约为100KDa。

18.权利要求17的芽孢杆菌菌株，其中所述的蛋白质具有SEQ、ID、NO：5所给出的序列。

19.一种在芽孢杆菌菌种营养生长期可分离到的基本纯的杀虫蛋白或类似物及其活性片段。

20.权利要求19的杀虫蛋白，其中所述的芽孢杆菌选自表11中所列出的芽孢杆菌种类。

21.权利要求20的杀虫蛋白，其中所述的害虫选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、食毛目、虱目、蚤目或毛翅目。

22.权利要求21的杀虫蛋白，其中所述的鞘翅目种类为叶甲属。

23.权利要求22的杀虫蛋白，其中所述的叶甲属为玉米根叶甲或长角叶角。

24.权利要求21的杀虫蛋白，其中所述的鳞翅目种类为地老虎属。

25.权利要求24的杀虫蛋白，其中所述的地老虎属为小地老虎。

26.权利要求19的杀虫蛋白，其中所述的芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌。

27.权利要求26的杀虫蛋白，其中所述的蜡状芽孢杆菌为保藏号为B—21085的蜡状芽孢杆菌。

28.权利要求19的杀虫蛋白，其中所述的芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌。

29.权利要求28的杀虫蛋白，其中所述的苏云金芽孢杆菌为选自保藏号NRRL B—21060，NRRL B—21224，NRRL B—21225，NRRL B—21226和NRRL B—21227的苏云金芽孢杆菌。

30.权利要求19的杀虫蛋白，其中所述的蛋白分子量为30KDa或更大。

31.权利要求30的杀虫蛋白，其中所述的蛋白分子量为约60KDa至约100KDa。

32.权利要求31的杀虫蛋白，其中所述的蛋白分子量约为80KDa。

33.权利要求32的杀虫蛋白，其中所述的蛋白具有SEQ IDNO：7所给出的序列。

34.权利要求31的杀虫蛋白，其中所述的蛋白具有SEQ IDNO：5所给出的序列。

35.权利要求19的杀虫蛋白，其中所述的蛋白包括SED IDNO：10或11中所给出的N—末端序列。

36.一种基本纯的编码权利要求19的蛋白的核苷酸序列。

37.一种基本纯的编码权利要求33的蛋白的核苷酸序列。

38.一种基本纯的编码权利要求34的蛋白的核苷酸序列。

39.一种基本纯的编码权利要求35的蛋白的核苷酸序列。

40.权利要求36的核苷酸序列，其中所述的序列已被优化用于在植物中表达。

41.权利要求40的核苷酸序列，其中所述的植物选自玉米、大豆、棉花、小麦、向日葵、蕃茄、马铃薯和油籽油菜。

42.权利要求37的核苷酸序列，其中所述的序列已被优化用于在植物中表达。

43.权利要求42的核苷酸序列，其中所述的植物选自玉米、大豆、棉花、小麦、向日葵、蕃茄、马铃薯和油籽油菜。

44.权利要求38的核苷酸序列，其中所述的序列已被优化用于在植物中表达。

45.权利要求44的核苷酸序列，其中所述的序列为SEQ.IDNO：18中所给出的序列。

46.权利要求39的核苷酸序列，其中所述的序列已被优化用于在植物中的表达。

47.权利要求46的核苷酸序列，其中所述的序列为SEQ IDN0：17中所给出的序列。

48.权利要求36的核苷酸序列，其中所述的序列已被优化用于在微生物中的表达。

49.权利要求48的核苷酸序列，其中所述微生物选自芽孢杆菌属、假单胞菌属、酵母属、Clavibacter、欧文氏杆菌属、沙雷氏菌属、克雷白氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、土壤杆菌属、昆虫致病病毒、真菌、原生动物和线虫。

50.已用权利要求36～47中任一核苷酸序列稳定转化的植物。

51.权利要求48的植物，其中所述植物为玉米植物。

52.权利要求36的核苷酸序列，其中所述的序列基本为保藏号为NRRL B—21059的大肠杆菌克隆P5—4的序列。

53.权利要求36的核苷酸序列，其中所述的序列基本为保藏号为NRRL B—21061的大杆菌克隆P3—12的序列。

54.权利要求36的核苷酸序列，其中所述的序列包含在保藏号为NRRL B—21222的大肠杆菌克隆pCIB6022中。

55.权利要求54的核苷酸序列，其中所述的序列为SEQ IDNO：1中所给出的VIP—1。

56.一种增强杀虫蛋白杀虫活性的辅助蛋白。

57.权利要求56的辅助蛋白，其中所述的杀虫蛋白来自芽孢杆菌。

58.权利要求57的辅助蛋白，其中所述的杀虫蛋白来自蜡状芽孢杆菌。

59.权利要求58的辅助蛋白，其中所述的杀虫蛋白来自菌株AB78。

60.权利要求56的辅助蛋白，其中所述的辅助蛋白来自芽孢杆菌。

61.权利要求60的辅助蛋白，其中所述的辅助蛋白来自蜡状芽孢杆菌。

62.权利要求61的辅助蛋白，其中所述的辅助蛋白来自菌株AB78。

63.一种基本纯的编码权利要求56，60，61和62中任一辅助蛋白的核苷酸序列。

64.权利要求63的核苷酸序列，其中所述的序列含在保藏号为NRRL B—21222的大肠杆菌克隆pCIB6022中。

65.权利要求1的芽孢杆菌菌株，其中所述的菌株为保藏号为NRRLN B—21225的AB88。

66.权利要求1的芽孢杆菌菌株，其中所述的菌株为保藏号为NRRL B—21227的AB289。

67.权利要求1的芽孢杆菌菌株，其中所述的菌株为保藏号为NRRL B—21229的AB294。

68.权利要求1的芽孢杆菌，其中所述的菌株为保藏号为NRRL—21226的AB359。

69.权利要求1的芽孢杆菌，其中所述的菌株为保藏号为NR-RL B—21228的AB59。

70.权利要求1的芽孢杆菌，其中所述的菌株为保藏号为NR-RL B—21230的AB256。