EA036403B1

EA036403B1 - Белок с активностью целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (cxe) и его применение

Info

Publication number: EA036403B1
Application number: EA201690634A
Authority: EA
Inventors: Франк Мелеватер; Илсе Ван Ден Бранде; Стефен К. Фрай; Кайл И. Молер; Ленка Франкова; Том Дж. Симмонс; Клэр Холланд; Эндрю Хадсон
Original assignee: Басф Се; Дзе Юниверсити Корт Оф Дзе Юниверсити Оф Эдинбург
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2020-11-06
Also published as: AU2014327258B2; US20200277578A1; AU2014327258A1; EA201690634A1; US20190002849A1; CN105612251A; US10647965B2; MX2016003405A; EP3049517B1; CA2925033A1; UA116400C2; US20160230150A1; EP3049517A1; BR112016005859A2; ZA201601880B; PL3049517T3; US10093907B2; CN105612251B; WO2015044209A1

Abstract

Изобретение относится к белку, имеющему активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (CXE); к нуклеиновой кислоте, кодирующей заявленный белок; к химерному гену, содержащему промотор, заявленную нуклеиновую кислоту и область терминации транскрипции и полиаденилирования; к клетке-хозяину и трансгенному растению, содержащим заявленный химерный ген. Также изобретение относится к способу получения заявленного белка в заявленной клетке-хозяине; к способу получения заявленного трансгенного растения посредством встраивания заявленного химерного гена; к способу изменения свойств волокна в растении; к способам получения целлюлозного материала, пищевого, кормового или промышленного продукта.

Description

Настоящее изобретение относится к белкам гетеро-трансгликозилазам (HTG), имеющим активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (СХЕ) в дополнение к активности бета-глюкан со смешанными связями:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (МХЕ). Белок может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8 или ее функционального фрагмента, или белок может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8, или к аминокислотам 22-280 в SEQ ID NO: 2, к аминокислотам 26-283 в SEQ ID NO: 6 или к аминокислотам 29-287 в SEQ ID NO: 8. Кроме того, изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, в соответствии с изобретением, химерному гену, содержащему, в том числе, заявленную нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину, содержащей указанный химерный ген, и трансгенному растению, содержащему указанный химерный ген. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения трансгенного растения и способу изменения по меньшей мере одного свойства волокна в растении, продуцирующем волокна, или укрепления растения, как описано в формуле изобретения.

В настоящем описании процитирован ряд документов, включая патентные заявки и руководства производителей. Описание этих документов, хотя его и не считают важным для патентоспособности настоящего изобретения, включено, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме. Более конкретно, все упоминаемые документы включены в качестве ссылок в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и отдельно указан как включенный в качестве ссылки.

Структурная целостность наземных растений в значительной степени опосредована клеточными стенками, окружающими растительные клетки и ответственными за прочность и гибкость растений. Помимо этой функции, стенки растительных клеток также важны для межклеточных связей и межклеточной коммуникации. Пористость клеточных стенок делает возможным обмен воды и питательных веществ.

Первичные клеточные стенки сосудистых растений состоят из целлюлозных микрофибрилл, заключенных в химически сложный матрикс, состоящий из полисахаридов, таких как в основном ксилоглюканы и пектиновые полисахариды в двудольных и многих однодольных растениях или глюкуроноарабиноксиланы и (1,3;1,4)-бета-О-глюканы, в основном у трав и зерновых злаков. Хотя к настоящему времени выяснены типы и распространенность полисахаридов в стенках растительных клеток, лишь немногое известно о молекулярных взаимодействиях между полисахаридами в клеточной стенке. Длительное время ответственными за удержание различных полисахаридов на месте считали обширные межмолекулярные водородные связи, а не ковалентные взаимодействия (Bacic et al., 1988; Somerville et al., 2004).

Предпосылки изобретения

Обнаружено, что ксилоглюканы являются важным фактором в морфогенезе клеточной стенки (обзор в Baumann et al., 2007) и способны образовывать водородные связи с целлюлозой, см. The Plant Journal, 1993, p. 1-30.

Трансгликозилазы полисахаридов, также называемые трансглюканазами полисахаридов, катализируют реорганизацию молекул полисахаридов посредством расщепления гликозидных связей в полисахаридных цепях и переноса их расщепленных частей на гидроксильные группы на невосстанавливающих остатках молекул других полисахаридов или олигосахаридов (обзор в Frankova and Fry, 2013; включенный, таким образом, в качестве ссылки). Примерами трансгликозилаз являются трансглюкозилазы (также называемые трансглюканазами), трансксиланазы и трансманнаназы. Из них ксилоглюканэндотрансглюкозилазы (ХЕТ; также называемые ксилоглюкан-эндотрансглюканазами, или ХТН, или ксилоглюкан-ксилоглюкозилтрансферазами) меняют структуру ксилоглюкана в первичных и вторичных клеточных стенках наземных растений, включая Equisetum и печеночные мхи (Fry et al., 1992; Fry et al. 2008). В отличие от большинства других тестируемых наземных растений у Equisetum дополнительно обнаруживали отдельную эндотрансглюкозилазу (или эндотрансглюканазу), названную бета-глюкан со смешанными связями:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазой (МХЕ) (или бета-глюкан со смешанными связями:ксилогюкан-эндотрансглюканазой). Последний фермент использует (1,3;1,4)-бета-глюкан со смешанными связями (MLG) в качестве донорного субстрата и ковалентно связывает его с ксилоглюканом или его фрагментом (Fry et al., 2008). К настоящему времени ферменты, катализирующие гетеротрансгликозилирование, т.е. использующие качественно иные донорные и акцепторные субстраты, либо обнаружены, но не охарактеризованы подробно (Ait Mohand and Farkas, 2006), либо обнаружены как имеющие минорную активность гетеро-трансгликозилирования (Hrmova et al., см. ниже).

Показано, что ксилоглюканы ковалентно связаны с пектиновыми полисахаридами (Thompson and Fry 2000). Доказательство ковалентного соединения между ксилоглюканом и кислыми пектинами в клетках розы, культивируемых в суспензии, представлено в Abdel-Massih et al. (2003) и Cumming et al. (2005). Кроме того, Hrmova et al. показали, что ХЕТ из ячменя связывает MLG, гидроксиэтилцеллюлозу и целлюлозу, набухшую под действием серной кислоты, (т.е. сульфат целлюлоза) с ксилоглюканом (Hrmova et al. 2007). В своей способности связывать MLG с ксилоглюканом этот фермент ячменя проявляет активность МХЕ, составляющую, однако, лишь приблизительно до 0,2% его активности ХЕТ.

Описание настоящего изобретения

К настоящему времени не описана активность трансглюкозилазы, ковалентно связывающей нерастворимую целлюлозу с ксилоглюканом. Такая активность может иметь важное применение в функцио

- 1 036403 нализации целлюлозных материалов, таких как текстильные изделия, бумага или древесная масса.

Таким образом, в первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку, имеющему активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (СХЕ), указанный белок содержит (а) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8; или (b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности по отношению к последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8; или (с) аминокислотную последовательность имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности по отношению к последовательности аминокислот 22-280 SEQ ID NO: 2, последовательности аминокислот 26-283 SEQ ID NO: 6 или последовательности аминокислот 29-287 SEQ ID NO: 8.

Если не указано иначе, варианты осуществления и примеры, описываемые ниже в случае конкретных аспектов, представленных в настоящем описании, также применимы к соответствующим вариантам осуществления других аспектов, представленных в настоящем описании.

Как применяют в настоящем описании, с помощью термина белок описывают группу молекул, состоящих из более чем 30 аминокислот, в то время как посредством термина пептид описывают молекулы, состоящие из до 30 аминокислот. Белки и пептиды могут дополнительно образовывать димеры, тримеры и высшие олигомеры, т.е. состоящие из нескольких молекул полипептидов. Молекулы белков или пептидов, образующие димеры, тримеры и т.д., могут являться идентичными или неидентичными. Таким образом, соответствующие структуры более высокого порядка называют гомо- или гетеродимерами, гомо- или гетеротримерами и т.д. Термины белок и пептид также относятся к природно модифицированным белкам или пептидам, где модификация осуществляется, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п. Такие модификации хорошо известны в этой области.

Активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (СХЕ) означает активность белка по изобретению, касающуюся катализа переноса звеньев глюкана (или целлоолигосахаридов) с целлюлозы, как донорной молекулы, на ксилоглюкан (или его олигосахариды), как акцепторной молекулы. Более конкретно, белок по изобретению расщепляет β- (1^4)-глюкозную связь в целлюлозной цепи, а затем вновь образует гликозидную связь с невосстанавливающим остатком ксилоглюканового полимера или олигомера, акцепторного субстрата.

Как применяют в настоящем описании, термин содержащий следует истолковывать как определяющий наличие указанных признаков, целых чисел, этапов или компонентов, как это указано, но не исключающий наличия или добавления одного или нескольких признаков, целых чисел, этапов или компонентов или их групп. Таким образом, например, нуклеиновая кислота или белок, содержащие последовательность нуклеотидов или аминокислот, могут содержать больше нуклеотидов или аминокислот, чем фактически процитировано, т.е. могут быть включены в более крупную нуклеиновую кислоту или белок или соединены с другим фрагментом нуклеиновой кислоты или белка. Химерный ген, содержащий область ДНК, функционально или структурно определенную, таким образом, может содержать дополнительные области ДНК и т.д. Однако в контексте настоящего описания термин содержащий также включает термин состоящий из.

Термин функциональный фрагмент аминокислотных последовательностей любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8 означает белок или пептид, содержащий фрагмент указанных выше аминокислотных последовательностей, все равно осуществляющий желаемую функцию, т.е. имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы. Анализ для определения того, имеет ли функциональный фрагмент активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, описывают в прилагаемых примерах. Примером функционального фрагмента аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 является фрагмент, содержащий аминокислоты 22-280 SEQ ID NO: 2; примером функционального фрагмента аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 является фрагмент, содержащий аминокислоты 26283 SEQ ID NO: 6, и примером функционального фрагмента аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 является фрагмент, содержащий аминокислоты 29-287 SEQ ID NO: 8.

В одном из аспектов белок по настоящему изобретению, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95 или по меньшей мере 98% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2, или аминокислотам 22-280 SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 6, или аминокислотам 26-283 SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 8, или аминокислотам 29-287 SEQ ID NO: 8. Такие аминокислотные последовательности также включают полученные искусственно аминокислотные последовательности, такие как полученные, например, с помощью мутагенеза нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или аминокислоты 22-280 SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 6, или аминокислоты 26-283 SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 8, или аминокислоты 29-287 SEQ ID NO: 8. Как правило, аминокислотные последовательности, представленные в настоящем описании, могут иметь по меньшей мере по меньшей мере 70%, например 72, 74, 75, 76, 78%, по меньшей мере 80%, например от 81 до 84%, по меньшей мере 85%, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, до 98 и 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или аминокислотам 22-280 SEQ ID NO: 2, или SEQ

- 2 036403

ID NO: 6, или аминокислотам 26-283 SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 8, или аминокислотам 29-287 SEQ ID NO: 8.

Как применяют в настоящем описании, термин процент идентичности последовательности относится к процентной доле идентичных аминокислот между двумя сегментами в окне оптимально выровненных аминокислотных последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известны специалистам в этой области и их можно осуществлять с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Smith и Waterman (Waterman, M.S., Chapman & Hall. London, 1995), алгоритм гомологичного выравнивания Needleman и Wunsch (1970), способ поиска сходства Pearson и Lipman (1988) и предпочтительно с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступные в виде части GCG (зарегистрированная торговая марка), Wisconsin Package (зарегистрированная торговая марка Accelrys Inc., San Diego, Calif.). Доля идентичности для выровненных сегментов тестируемой последовательности и референсной последовательности является количеством идентичных компонентов, являющихся общими для двух выравниваемых последовательностей, разделенным на общее количество компонентов в сегменте референсной последовательности, т.е. целой референсной последовательности или определенной меньшей референсной последовательности. Процент идентичности последовательности представляет собой долю идентичности, умноженную на 100. Можно осуществлять сравнение одной или нескольких аминокислотных последовательностей или последовательностей ДНК с полноразмерной аминокислотной последовательностью или последовательностью ДНК, или ее частью, или более длинной аминокислотной последовательностью или последовательностью ДНК. Идентичность последовательности вычисляют с учетом более короткой нуклеотидной или аминокислотной последовательности.

Только белки, имеющие активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, находятся в объеме настоящего изобретения. Белки, имеющие активность целлюлоза:ксилоглюканэндотрансглюкозилазы, представленную в настоящем описании, включают аминокислотные последовательности, представленные в настоящем описании, и последовательности с указанной степенью идентичности последовательности, а также с делециями последовательности, одним или многочисленными изменениями последовательности или добавлением функциональных элементов при условии, что активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, по существу, сохраняется. Способы получения таких производных хорошо известны в этой области (см., например, J.F. Sambrook, D.W. Russell, and N. Irwin, 2000). Например, специалист в этой области может разграничивать функциональные элементы в белке, представленном в настоящем описании, и удалять любые несущественные элементы.

Функциональные элементы можно модифицировать или комбинировать для повышения применимости или экспрессии последовательностей по изобретению для любого конкретного применения. Специалисты в этой области знакомы со стандартными методическими материалами, в которых описывают конкретные условия и способы конструирования, манипуляции и выделения макромолекул (например, молекул ДНК, плазмид, белков и т.д.), а также получения рекомбинантных организмов и скрининга и выделения молекул ДНК и белков.

Авторы настоящего изобретения впервые показали, что существуют гетеро-трансгликозилазы, способные напрямую соединять целлюлозу с ксилоглюканом.

Как указано выше, Baumann et al. описывают ферментативную активность NXG1 из Tropaeolum majus, которая может использовать целлоолигосахариды в качестве акцепторов. В том числе, они получали продукты целлобиозы, целлотриозы и целлотетраозы. Это частично противоречит результатам, полученным Ait Mohand et al. (2006), которые смогли получить такие продукты при нанесении флуоресцентных красителей в способе детекции, но не при использовании радиоактивно меченых зондов. Авторы сделали вывод о том, что детектируемая активность может являться искусственной активностью, приписываемой наличию флуоресцентного красителя в целлоолигосахаридах, используемых в качестве акцепторов. Hrmova et al. (2007) показали, что очищенная ХЕТ из сеянцев ячменя катализирует образование ковалентных связей in vitro между конкретными растворимыми субстратами (такими как гидроксиэтилцеллюлоза и сульфат целлюлозы) и ксилоглюканом. Авторы указывают, что показано, что такая активность имеет любое значение in muro. Для такой демонстрации необходимо выделение короткого фрагмента из 10 или менее гликозильных остатков, которые, как можно четко показать, происходят из двух разных типов полисахаридов, таких как целлюлоза и ксилоглюкан.

К настоящему времени не показана ферментативная активность, связывающая целлюлозу с ксилоглюканом, в противоположность растворимому целлюлозному материалу, такому как гидроксиэтилцеллюлоза или целлюлоза, набухшая под действием серной кислоты. Как показано в прилагаемых примерах, авторы настоящего изобретения обнаруживали в Equisetum нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент с такой активностью. С помощью нового способа, позволяющего напрямую измерять новую активность с использованием целлюлозы в качестве донора, они неожиданно смогли показать, что новый фермент способен переносить нерастворимую донорную целлюлозу на растворимый ксилоглюкан, в то время как в предшествующих исследованиях смогли лишь идентифицировать ферментативную активность в отношении растворимых производных целлюлозы. Сравнивая полученные результаты с результатами, полученными для других комбинаций доноров и акцепторов, авторы настоящего изобретения дополнительно

- 3 036403 показали, что новая активность является одной из преобладающих активностей белка по изобретению.

Термин преобладающая активность означает активность белка, представленного в настоящем описании как целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилаза, представляющую собой по меньшей мере 5% от наиболее высокой активности в отношении других доноров/акцепторов. В одном из примеров активность составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере столько же (по меньшей мере 100%), по меньшей мере 200, по меньшей мере 500 или по меньшей мере 1000% от наиболее высокой активности в отношении других доноров/акцепторов. Белок по изобретению может иметь несколько преобладающих активностей, например две или три, предпочтительно отличающихся в 10 или менее раз. Белок по изобретению также может иметь одну или несколько активностей, касающихся растворимых производных целлюлозы, таких как водорастворимый ацетат целлюлозы, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, сульфат целлюлозы.

В этой области известны способы измерения и сравнения активности фермента в отношении различных комбинаций растворимых доноров/акцепторов, и их также можно найти в прилагаемых примерах. В прилагаемых примерах описывают способ определения активности фермента в отношении (нерастворимой) целлюлозы в качестве донорной молекулы. Природа растворимых или нерастворимых донорных молекул не позволяет определять ферментативную активность строго в одинаковых условиях, т.к., например, целлюлоза в качестве нерастворимой донорной молекулы гораздо менее доступна для фермента, чем растворимые донорные молекулы. Однако в целях по настоящему изобретению сравнение различных активностей можно осуществлять в условиях, описываемых в прилагаемых примерах для растворимых и нерастворимых донорных молекул.

В одном из примеров белок по изобретению дополнительно имеет активность МХЕ.

Также описывают выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, представленный в настоящем описании.

Нуклеиновые кислоты могут являться ДНК или РНК, одно- или двухцепочечными. Нуклеиновые кислоты можно химически синтезировать или получать с помощью биологической экспрессии in vitro или даже in vivo.

Нуклеиновые кислоты можно химически синтезировать с использованием соответствующим образом защищенных фосфорамидатов рибонуклеозидов и общепринятого синтезатора ДНК/РНК.

Поставщиками реагентов для синтеза РНК являются Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical (часть Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA) и Cruachem (Glasgow, UK).

Применительно к химерному гену по настоящему изобретению, ДНК включает кДНК и геномную ДНК.

Как применяют в настоящей заявке, термин выделенная нуклеиновая кислота или выделенная последовательность нуклеиновой кислоты относится к нуклеиновой кислоте, как определено выше, не являющейся природной (такой как искусственная или синтетическая нуклеиновая кислота с иной нуклеотидной последовательностью, чем природная нуклеиновая кислота, или нуклеиновая кислота, более короткая, чем природная нуклеиновая кислота) или более не находящейся в природном окружении, в котором она исходно находилась, например нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность, связанную с гетерологичным регуляторным элементом (такая как бактериальная кодирующая последовательность, функционально связанная с промотором, экспрессирующимся в растениях) в химерном гене, или нуклеиновая кислота, перенесенная в другую клетку-хозяина, такую как трансгенная растительная клетка.

Белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (СХЕ), представленный в настоящем описании, может являться белком HTG.

Как применяют в настоящем описании, белок HTG, также называемый ферментом HTG, гетеро-транс-в-глюканазой или гетеро-транс-в-глюкозилазой, является гетеро-трансгликозилазой, или гетеро-трансгликаназой, основной активностью которой является активность гетеро-трансгликозилазы. Указанная основная активность может составлять по меньшей мере 50, по меньшей мере 60 или по меньшей мере 70% общей активности. HTG может иметь активность МХЕ и СХЕ.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюканэндотрансглюкозилазы (СХЕ), или указанный белок HTG, можно встраивать в растения для получения модифицированных целлюлозных микрофибрилл в живом растении, например сельскохозяйственной культуре.

Полагают, что экспрессия нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в растении приведет к активности полученного фермента, ковалентно связывающего некоторые из молекул целлюлозы в растении с его эндогенным ксилоглюканом, таким образом укрепляя клеточную стенку, например, в продуктах из растительных волокон. Укрепление стенки также может быть применимым в любой сельскохозяйственной культуре, например, для минимизации полегания (сельскохозяйственных) растений, таких как зерновые злаки или масличные культуры, или для повышения прочности лесных или сельскохозяйственных культур.

- 4 036403

Альтернативно, растение, экспрессирующее нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании, можно подкармливать ксилоглюканом или генетически изменять для эндогенного синтеза ксилоглюкана, где указанный ксилоглюкан в случае подкормки, необязательно, содержит связанную с ним дополнительную органическую или неорганическую молекулу (как дополнительно описывают ниже). Потенциальное применение включает целлюлозную бумагу, целлюлозные текстильные изделия, например хлопковые или льняные, целлюлозную упаковку, например картон, целлюлозные строительные материалы, например пиломатериалы и древесностружечные плиты, производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлозу или ацетат целлюлозы, загустители, например ксантановую камедь или ее производные, целлюлозные перевязочные материалы, например хлопковую вату, марлю, целлофан, диализные трубки, целлюлозные сорбенты для хроматографических колонок; присоединяемые органические или неорганические вещества можно выбирать так, чтобы сделать возможной аффинную хроматографию.

В другом примере растение, экспрессирующее нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании, можно собирать в условиях поддержания активностей фермента HTG, например, в растительных волокнах, таким образом, что ксилоглюкан или ксилоглюкановый олигосахарид, необязательно, содержащий связанное с ним органическое или неорганическое вещество, можно встраивать в целлюлозу после сбора без дальнейшего добавления фермента. Потенциальное применение указано выше.

Альтернативно, белок HTG можно экспрессировать гетерологично, например, в микроорганизме, и после выделения наносить на немодифицированные растительные волокна или (полученную из растений) целлюлозу после сбора в присутствии ксилоглюкана или ксилоглюканового олигосахарида, необязательно, содержащего связанную с ним органическую или неорганическую молекулу, с которым будет ковалентно связываться целлюлоза.

В целом, добавляя белок по изобретению к нерастворимому целлюлозному материалу, т.е. материалу, содержащему целлюлозу, авторы настоящего изобретения способны повышать количество опосредованных ксилоглюканом связей между целлюлозными волокнами. Таким образом, они создали экологически безопасный ферментативный способ улучшения прочности и/или других свойств различных целлюлозных материалов в качестве альтернативы химическим способам, известным к настоящему времени. Альтернативно, белок по изобретению делает возможным ковалентное присоединение новых функциональных групп к целлюлозе посредством ковалентного присоединения модифицированных ксилоглюканов.

В одном из примеров выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или комплементарным им последовательностям, или нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидам 64-840 SEQ ID NO: 1 или комплементарной им последовательности, или нуклеотидам 76-849 SEQ ID NO: 5 или комплементарной им последовательности, или нуклеотидам 85-861 SEQ ID NO: 7 или комплементарной им последовательности, или последовательность нуклеиновой кислоты, гибридизующуюся в условиях высокой строгости с последовательностью SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или комплементарными им последовательностями. Указанная выделенная нуклеиновая кислота также может содержать или состоять из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или нуклеотидов 64840 SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 5, или нуклеотидов 76-849 SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или нуклеотидов 85-861 SEQ ID NO: 7, или комплементарных им последовательностей. Кроме того, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может являться выделенной нуклеиновой кислотой, имеющей по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидам 64-840 SEQ ID NO: 1 или комплементарной им последовательности при условии отсутствия нуклеотидов 1-63, или нуклеотидам 76-849 SEQ ID NO: 5 или комплементарной им последовательности при условии отсутствия нуклеотидов 1-75, или нуклеотидам 85-861 SEQ ID NO: 7 или комплементарной им последовательности при условии отсутствия нуклеотидов 1-84. Кроме того, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может являться выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 6 и 8, в которой частоту использования кодонов адаптируют для экспрессии в бактериях, экспрессии в дрожжах или экспрессии в растениях.

Можно оптимизировать частоту использования кодонов, например, как описывают в Moreira, 2004.

В другом варианте химерный ген обеспечен содержанием следующих функционально связанных элементов: (а) промотор, экспрессирующийся в растениях; (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую белок в соответствии с изобретением; и (с) область терминации транскрипции и полиаденилирования.

Химерный ген является искусственным геном, сконструированным посредством функционального связывания фрагментов неродственных генов или других последовательностей нуклеиновой кислоты. Другими словами, термин химерный ген означает ген, в норме не обнаруживаемый в видах растений или относящийся к любому гену, в котором промотор или одна или несколько других регуляторных областей гена в природе не связаны со всей транскрибируемой нуклеиновой кислотой или ее частью, т.е. являются гетерологичными в отношении транскрибируемой нуклеиновой кислоты. Более конкретно,

- 5 036403 химерный ген является искусственным, т.е. неприродным, геном, получаемым посредством функционального связывания промотора, экспрессирующегося в растениях, и нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем описании, такой как нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или нуклеотидов 64-840 SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 5, или нуклеотидов 76-849 SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или нуклеотидов 85-861 SEQ ID NO: 7, где указанный экспрессирующийся в растениях промотор не является от природы функционально связанным с указанной нуклеиновой кислотой.

Термин гетерологичный относится к взаимосвязи между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты или белка, полученными из разных источников. Например, промотор является гетерологичным в отношении функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты, такой как кодирующая последовательность, если такую комбинацию в норме не обнаруживают в природе. Кроме того, конкретная последовательность может являться гетерологичной в отношении клетки или организма, в который ее встраивают (т.е. не встречается в природе в этой конкретной клетке или организме). Например, химерный ген, представленный в настоящем описании, является гетерологичной нуклеиновой кислотой.

Выражение функционально связанный означает, что указанные элементы химерного гена связывают друг с другом таким образом, что их функционирование является скоординированным и делает возможной экспрессию кодирующей последовательности, т.е. они являются функционально связанными. В качестве примера, промотор является функционально связанным с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, если он способен обеспечивать транскрипцию и, в конечном итоге, экспрессию указанной последовательности нуклеиновой кислоты, и две кодирующие белок нуклеотидные последовательности, например последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, являются функционально связанными друг с другом, если они соединены таким образом, что может образовываться слитый белок из первого и второго белка или полипептида.

Промотором может являться любой регуляторный элемент, способный запускать экспрессию гена в желаемой клетке-хозяине или организме, таких как растительные клетки и растения, бактерии или дрожжи. В случае растений можно использовать любую промоторную последовательность гена, в природе экспрессирующегося в растениях, таких как, например, промоторы бактериального, вирусного или растительного происхождения.

Как правило, промоторы могут являться конститутивными или индуцибельными.

Экспрессирующийся в растениях промотор может являться конститутивным промотором, т.е. промотором, способным регулировать высокие уровни экспрессии в большинстве типов клеток (пространственно-независимым образом).

Примеры экспрессирующихся в растениях конститутивных промоторов включают промоторы бактериального происхождения, такие как промоторы октопинсинтазы (OCS) и нопалинсинтазы (NOS) из Agrobacterium, а также промоторы вирусного происхождения, такие как промоторы транскрипта 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Hapster et al., 1988) или генов 19S РНК (Odell et al., 1985; патент США № 5352605; WO84/02913; Benfey et al., 1989), промоторы вируса мозаики прожилок маниоки (CsVMV; WO97/48819, US7053205), промотор цирковируса (AU689311), промотор палочковидного баднавируса сахарного тростника (ScBV) (Samac et al., 2004), промотор вируса мозаики норичника шишковатого (FMV) (Sanger et al., 1990), промотор №№ 4 или 7 вируса мозаики клевера подземного (WO96/06932) и усиленный промотор 35S, как описано в US5164316, US5196525, US5322938, US5359142 и US5424200. Среди промоторов растительного происхождения, следует упомянуть промоторы из растительного промотора малой цепи рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Rubisco) (US 4962028), промотор гена гистона Н4 Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987), промоторы убиквитина (Holtorf et al., 1995) кукурузы, риса и сахарного тростника, промотор актина 1 риса (Act-1, US 5641876), гистоновые промоторы, как описано в ЕР0507 698 А1, и промотор алкогольдегидрогеназы 1 (Adh-1) кукурузы.

Альтернативно, для экспрессии белка, представленного в настоящем описании, можно использовать промоторную последовательность, специфичную для конкретных областей, тканей или органов растений. Примерами таких промоторов, которые можно использовать, являются тканеспецифическии или органоспецифичные промоторы, подобные примордий-специфичным промоторам (An et al., 1996), стебле-специфичным промоторам (Keller et al., 1988), мезофилл-специфичным промоторам (таким как светоиндуцибельные промоторы Rubisco), волокно-специфичным промоторам, таким как волокноспецифичный промотор волокно-специфичного гена β-тубулина (как описано в WO0210377), волокноспецифичного гена актина (как описано в WO0210413), волокно-специфичного гена липидтранспортного белка (как описано в US5792933), промотор протеазы, специфичной для семенной кожуры и волокон (Hou et al., 2008), промотор волокно-специфичного гена R2R3 MYB хлопка (Pu et al., 2008), промотор гена экспансина хлопка (WO9830698), промотор гена хитиназы хлопка (US2003106097), промотор CesA1 (US6271443), промотор F286 (см. US2003/106097), промотор Е6 хлопка (см. US6096950) или промоторы волокно-специфичных генов, описываемые в US6259003, или US6166294, или

- 6 036403

WO96040924, корне-специфичным промоторам (Keller et al., 1989), промоторам, специфичным для сосудистых тканей (Peleman et al), семя-специфичным промоторам (Datla, R. et al., 1997), в частности промотор напина (ЕР255378 A1), промотор фазеолина, промотор глютенина, промотор FBP7 петунии, промотор гелиантинина (WO92/17580), промотор альбумина (WO98/45460), промотор олеозина (WO98/45461), промотор SAT1 или промотор SAT3 (PCT/US98/06978) и т.п.

Также можно использовать индуцибельный промотор, преимущественно выбранный из промоторов фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), HMG-CoA-редуктазы (HMG), хитиназы, глюканазы, ингибитора протеиназ (PI), гена семейства PR1, нопалинсинтазы (nos) и vspB (US5670349, табл. 3), промотора HMG2 (US5670349), промотора бета-галактозидазы яблок (ABG1) и промотора аминоциклопропан-карбоксилатсинтазы (АСС-синтазы) яблок (WO98/45445).

В этой области хорошо известны подходящие промоторы для (индуцибельной) экспрессии в бактериях, и они включают промоторы Т3 или Т7 (применительно к экспрессии РНК-полимеразы Т3 или Т7), промотор lac, промоторы trc и tac, фаговый промотор pL, промотор tetA и промоторы PPBAD или rhaPBAD.

В этой области хорошо известны промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжах, и они включают промотор TEF, промотор CYC1, промотор ADH1, промотор AOX1 (метанол-индуцибельный) и промотор GAL и их варианты.

(Экспрессирующийся в растениях) промотор, например, можно изменять так, чтобы он содержал, например, ДНК-энхансер для содействия повышению экспрессии гена. Как хорошо известно в этой области, для повышения транскрипции ДНК можно использовать конкретные элементы ДНК. Эти энхансеры часто обнаруживают в 5'-направлении к началу транскрипции в промоторе, функционирующем в эукариотических клетках, но его часто можно встраивать выше (5') или ниже (3') кодирующей последовательности. В некоторых случаях, этими энхансерными элементами ДНК являются интроны. Среди интронов, применимых в качестве ДНК-энхансера, есть 5'-интроны гена актина риса 1 (см. US5641876), гена актина риса 2, интрон гистона 4 резуховидки, гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, гена белка теплового шока 70 (см. US5593874) кукурузы, гена shrunken 1 кукурузы, гена светочувствительности 1 Solanum tuberosum и гена белка теплового шока 70 Petunia hybrida (см. US5 659122). Таким образом, как предусмотрено в настоящем описании, промотор или промоторная область включает варианты промоторов, полученные посредством инсерции или делеции регуляторных областей, подвергания промотора случайному или сайт-специфическому мутагенезу и т.д. Активность или силу промотора можно измерять в терминах количества РНК, которую он продуцирует, или степени накопления белка в клетке или ткани относительно промотора, транскрипционную активность которого оценивали ранее.

Химерный ген в соответствии с изобретением также содержит последовательность терминации транскрипции или полиаденилирования, например, функционирующую в растительной клетке. В качестве последовательности терминации транскрипции или полиаденилирования можно использовать любую соответствующую последовательность бактериального происхождения, такую как, например, терминатор nos Agrobacterium tumefaciens, вирусного происхождения, такую как, например, терминатор CaMV 35S, или растительного происхождения, такую как, например, гистоновый терминатор, как описано в опубликованной патентной заявке ЕР0633317 А1.

В объеме настоящего изобретения в комбинации с промотором и нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем описании, также можно использовать другие регуляторные последовательности, находящиеся между указанным промотором и указанной нуклеиновой кислотой. Неограничивающие примеры таких регуляторных последовательностей включают активаторы транскрипции (энхансеры) или интроны, как описано где-либо в настоящей заявке. Другие подходящие регуляторные последовательности включают 5'-UTR. Как применяют в настоящем описании, 5'-UTR, также обозначаемая как лидерная последовательность, является конкретной областью матричной РНК (мРНК), находящейся между участком начала транскрипции и инициаторным кодоном кодирующей области. Она связана со стабильностью мРНК и эффективностью трансляции. Например, для повышения устойчивых уровней экспрессии репортерного гена можно использовать 5'-нетранслируемую лидерную последовательность гена хлорофилл а/Ь-связывающего белка петунии ниже участка начала транскрипции 35S (Harpster et al., 1988). В WO95/006742 описывают использование 5'-нетранслируемых лидерных последовательностей, полученных из генов, кодирующих белки теплового шока, для повышения экспрессии трансгена. В настоящем изобретении также можно использовать активаторы трансляции лидерной последовательности вируса табачной мозаики (TMV), описываемые в заявке WO87/07644, а также лидерной последовательности вируса гравировки табака (TEV), описываемые в Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597.

Химерный ген дополнительно может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность локализации белка для транспорта экспрессируемого белка в конкретные органеллы или компартменты в клетке-хозяине или для секреции.

Последовательность локализации белка является короткой (3-60 аминокислот в длину) аминокислотной последовательностью, направляющей транспорт белка внутри или вне клетки. Пептиды локализации белка также можно называть сигнальными пептидами (для секреции), транзитными пептидами (для локализации в пластидах) или последовательностями удержания белка.

- 7 036403

Подходящей сигнальной последовательностью для секреции белка, экспрессируемого в дрожжах, таких как Pichia pastoris, является сигнальная последовательность а-фактор-сопряженного белка (Cregg et al., 1993). Примером сигнального пептида для секреции слитых белков в растениях является сигнальный пептид белка PR1a Nicotiana tabacum (Cornelissen et al. 1986).

Слияние таких сигнальных последовательностей с белком, представленным в настоящем описании, посредством соединения фрагментов ДНК, кодирующей соответствующий белок и сигнальную последовательность, можно осуществлять стандартными способами рекомбинантной ДНК.

Вектор, содержит химерный ген, представленный в настоящем описании.

Вектор, например, может являться плазмидой, космидой, вирусом, бактериофагом или другим вектором, общепринято используемым, например, в генетической инженерии.

Молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно встраивать в несколько коммерчески доступных векторов. Неограничивающие примеры включают прокариотические плазмидные векторы, такие как серия pUC, pBluescript (Stratagene), серия экспрессирующих векторов рЕТ (Novagen) или pCRTOPO (Invitrogen), lambda gt11, pJOE, серия pBBR1-MCS, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1 и векторы, совместимые с экспрессией в эукариотических клетках, таких как дрожжи или клетки млекопитающих, подобные pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 1Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, plZD35, вектору Окаяма-Берга pcDV1, экспрессирующему кДНК (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) и pCINeo (Promega). Примеры плазмидных векторов, подходящих для дрожжей Pichia pastoris, включают, например, плазмиды рА0815, pPICZ, pPICZa, pPIC9K и pPIC3.5K (все Invitrogen).

Подходящие векторы для введения в растения включают векторы, описываемые в Cornelissen and Vandewiele (1989), Lindbo (2007), Gritch et al. (2006) или Wagner et al. (2004).

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей химерный ген или вектор, представленный в настоящем описании. Подходящие прокариотические клетки-хозяева включают, например, бактерии родов Escherichia, Streptomyces, Salmonella или Bacillus. Подходящими эукариотическими клетками-хозяевами являются, например, дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris. Клетками насекомых, подходящими для экспрессии, являются, например, клетки S2 Drosophila или Sf9 Spodoptera. Растительные клетки, подходящие для настоящего изобретения, включают любую растительную клетку, содержащую, главным образом, генетическую информацию, необходимую для определения растения, которую, помимо химерного гена, представленного в настоящем описании, можно дополнять одним или несколькими дополнительными трансгенами. Клетки можно получать из различных органов и/или тканей, образующих растение, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоды, семена, зародыши, репродуктивную ткань, меристемные области, каллюсную ткань, листья, корни, побеги, цветы, сосудистую ткань, гаметофиты, спорофиты, пыльцу и микроспоры.

В одном из примеров клетка-хозяин по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный химерный ген, содержащий (экспрессирующийся в растениях) промотор, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, способный синтезировать ксилоглюкан в указанной клетке-хозяине, и область терминации транскрипции и полиаденилирования. Например, один химерный ген может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CslC4 из резуховидки (Cocuron et al., 2007), в комбинации с другим химерным геном, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую альфаксилозилтрансферазу ХТ1 из резуховидки (Faik et al., 2002). Как описано далее, этот вариант осуществления служит для продукции целлюлозы, ковалентно связанной с ксилоглюканом (олигосахаридами), в случае, когда клетка-хозяин сама по себе не продуцирует ксилоглюкан.

Кроме того, настоящее изобретение относится к растению, части растения или семени, содержащему химерный ген, представленный в настоящем описании, вектор, представленный в настоящем описании, или растительную клетку, представленную в настоящем описании.

Растение по настоящему изобретению может являться любым растением. Неограничивающие примеры растений по изобретению включают пшеницу, хлопок, канолу и другой масличный рапс, рис, кукурузу, сою, сорго, подсолнечник, табак, сахарную свеклу, кукурузу, ячмень, томат, манго, персик, яблоко, грушу, клубнику, банан, дыню, картофель, морковь, салат-латук, капусту, лук, тростник, горох, конские бобы, тополь, виноград, цитрусовые, люцерну, рожь, овес, газонные и кормовые травы, лен, орехоплодные растения и растения, из которых получают древесину, такие как Pinus, Prunus, Pseudotsuga, Eucalyptus, Picea, Larix, Thuja, Abies, Khaya, Acer, Lophira, Fagus, Diospyros, Quercus, Tilia, Populus, Platanus, Tectona, Robinia, Ulmus и Juglans.

В дополнение к примерам, указанным выше для растительных клеток, части растений включают клетки, ткани или органы, семянки, семена, отделенные части, такие как корни, листья, цветы, пыльцу и т.д. Термин растение также включает потомство растений, сохраняющее отличительные характеристики родителей, такое как семя, полученное самоопылением или скрещиванием, например гибридное семя, гибридные растения и полученные из них части растений.

Семя образовано зародышевым растением, заключенным вместе с накопленными питательными

- 8 036403 веществами в семенную кожуру. Оно является продуктом созревшего семязачатка голосеменных и покрытосеменных растений, к последним из которых принадлежит соя, возникающим после оплодотворения и, до некоторой степени, растущим в материнском растении. Семя, представленное в настоящем описании, сохраняет отличительные характеристики родителей, такое как семя, полученное самоопылением или скрещиванием, например гибридное семя (полученное скрещиванием двух инбредных растительных линий).

Растительная клетка, часть растения, растение или семя могут быть из растений, указанных выше, а также из генетически модифицированных гомологов этих растений.

В случае хлопка растительная клетка, часть растения, растение или семя хлопка может быть из любого существующего сорта хлопка. Например, растительная клетка хлопка может быть из сорта, применимого для выращивания хлопка. Наиболее общеупотребительными сортами хлопка являются Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum и G. herbaceum. Дополнительные сорта включают G. africanum и G. raimondii.

Кроме того, изобретение относится к потомству растения по изобретению или семени по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения, включающему (а) получение химерного гена, представленного в настоящем описании; и (b) встраивание указанного химерного гена в растение.

Встраивание применительно к настоящей заявке относится к помещению генетической информации в растительную клетку или растение искусственными способами. Это можно осуществлять любым известным в этой области способом встраивания РНК или ДНК в растительные клетки, ткани, протопласты или целые растения. Кроме того, встраивание также включает интрогрессию генов, как описано ниже.

Доступен ряд способов переноса ДНК в растительные клетки. Опосредуемую агробактериями трансформацию хлопка описывают, например, в патенте США № 5004863, патенте США № 6483013 и WO2000/71733.

Растения также можно трансформировать с помощью бомбардировки частицами: частицы золота или вольфрама покрывают ДНК, а затем бомбардируют ими клетки молодых растений или зародыши растений. Этот способ также делает возможной трансформацию пластид растений. Трансформацию хлопка посредством бомбардировки частицами описывают, например, в WO92/15675.

Вирусную трансформацию (трансдукцию) можно использовать для транзиторной или стабильной экспрессии гена в зависимости от природы вирусного генома. Желаемый генетический материал упаковывают в подходящий вирус растений и модифицированному вирусу позволяют инфицировать растение. Потомство инфицированных растений не содержит вирус, а также не содержит встроенный ген. Подходящие способы вирусной трансформации описывают, например, в WO90/12107, WO03/052108 или WO2005/098004.

Термин интрогрессия означает интеграцию гена в растительный геном природными способами, т.е. посредством скрещивания растения, содержащего химерный ген, представленный в настоящем описании, с растением, не содержащим указанный химерный ген. Можно выбирать потомка, содержащего химерный ген.

Дополнительные способы трансформации и интрогрессии также можно найти в патенте США № 7172881.

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении описывают способ получения растения или укрепления растения или его части, такой как стенка растительной клетки, включающий: встраивание химерного гена, содержащего промотор, экспрессирующийся в растениях, нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании выше (т.е. кодирующую белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы), и область терминации транскрипции и полиаденилирования; или выращивание растения, представленного в настоящем описании, или выращивание растения из семени, представленного в настоящем описании. Встраиваемый химерный ген может являться химерным геном, как представлено в настоящем описании выше, включающим все относящиеся к нему варианты.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу изменения по меньшей мере одного свойства волокна в растении, продуцирующем волокна, или укрепления растения, содержащего экспрессируемый химерный ген, представленный в настоящем описании, или вектор, представленный в настоящем описании, в указанном растении, продуцирующем волокна, или растении.

В одном из примеров свойство волокна является прочностью волокна и/или устойчивостью к ферментативному расщеплению. В одном из примеров повышают прочность волокна и/или устойчивость к ферментативному расщеплению.

В другом примере укрепление растения включает укрепление его стебля, повышение устойчивости к полеганию (например, наводнению, ливневому дождю или повреждению ветром) и повышение устойчивости к инфицированию патогенами.

В дополнительном примере описываемого выше способа получения растения или укрепления растения он дополнительно включает выращивание указанного растения до получения семян.

- 9 036403

Настоящее изобретение также относится к способу получения белка, включающему культивирование клетки-хозяина, представленной в настоящем описании, в подходящих условиях и выделение продуцируемого белка. Указанная клетка-хозяин экспрессирует или гиперэкспрессирует белок по изобретению, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, как описано выше. Таким образом, указанный белок по изобретению продуцируется в клетке-хозяине, и его выделяют из нее. В случае, когда клетка-хозяин продуцирует белок по изобретению и секретирует его в окружающую среду, например, благодаря подходящему сигнальному пептиду, соединенному с белком, выделение означает отделение сред, содержащих белок из клетки-хозяина. Затем указанные среды можно подвергать дальнейшим этапам очистки (см. ниже).

Подходящие условия культивирования прокариотического или эукариотического хозяина хорошо известны специалистам в этой области. Например, подходящими условиями культивирования бактерий является их выращивание в среде Луриа-Бертани (LB) с аэрацией. Для повышения выхода и растворимости продукта экспрессии среду можно забуферивать или дополнять подходящими добавками, о которых известно, что они повышают или облегчают их. Е. coli можно культивировать при температуре от 4 до приблизительно 37°С, точная температура или последовательность температур зависит от молекулы, подлежащей гиперэкспрессии. В целом, специалисту также известно, что эти условия, возможно, необходимо адаптировать к потребностям хозяина и требованиям в отношении экспрессируемого полипептида. В случае, когда индуцибельный промотор контролирует нуклеиновую кислоту по изобретению в векторе, присутствующем в клетке-хозяине, экспрессию полипептида можно индуцировать добавлением соответствующего индуцирующего средства. Подходящие способы и стратегии экспрессии известны специалисту в этой области.

Подходящие способы экспрессии в случае эукариотических клеток хорошо известны специалисту в этой области, и их можно найти, например, в Sambrook, 2001.

Подходящими средами для культуры клеток насекомых являются, например, TNM+10% FCS или среда SF900. Как правило, клетки насекомых выращивают при 27°С в виде адгезионной или суспензионной культуры.

Способы выделения продуцируемого полипептида хорошо известны в этой области, и они включают, в качестве неограничивающих примеров, такие этапы способа, как осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию (эксклюзионную хроматографию), аффинную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), обращенно-фазовую ВЭЖХ, диск-электрофорез в геле или иммунопреципитацию, см., например, в Sambrook, 2001.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу выращивания растения, включающему (a1) получение трансгенного растения, представленного в настоящем описании или получаемого способом получения растения, представленным в настоящем описании; или (а2) встраивание химерного гена, представленного в настоящем описании, в растение; и (b) выращивание растения (a1) или (а2); и, необязательно, (с) сбор пригодных для сбора частей, продуцируемых указанным растением.

Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности по изобретению можно использовать для идентификации других белков, таких как ортологичные белки или гомологичные белки, с активностью HTG или, более конкретно, с активностью СХЕ. Гомологичные или ортологичные последовательности, кодирующие белки HGT, можно идентифицировать известными в этой области способами. Гомологичную нуклеотидную последовательность можно идентифицировать и выделять посредством гибридизации в строгих условиях с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 5 и 7 или ее часть, в качестве зондов. Другие последовательности, кодирующие белки HTG, также можно получать посредством амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидов, специфичных для генов, кодирующих HTG, в качестве праймеров, таких как, в качестве неограничивающих примеров, олигонуклеотиды, содержащие или состоящие из от приблизительно 20 до приблизительно 50 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ ID NO: 1, 5 и 7 или комплементарных им последовательностей. Гомологичные гены, кодирующие белки HTG, можно идентифицировать in silico с помощью поиска гомологии с помощью Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) с использованием других нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей. Функциональность идентифицированных гомологичных генов, кодирующих HTG, и, в частности, их активности МХЕ и СХЕ можно подтверждать способами, представленными в настоящем описании.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу детекции экспрессии нуклеиновой кислоты или белка, включающему (а) получение растительной клетки или растения, представленного в настоящем описании, где указанный трансген является нуклеиновой кислотой или белком, представленным в настоящем описании (т.е. кодирующей белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюканэндотрансглюкозилазы); и (b) детекцию уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или белка.

Термин экспрессия нуклеиновой кислоты или белка относится к транскрипции и, необязательно, трансляции транскрибируемой и транслируемой части химерного гена, представленного в настоящем

- 10 036403 описании, с использованием соответствующих элементов контроля экспрессии, функционирующих в растительных клетках.

Детекцию экспрессии нуклеиновой кислоты или белка можно осуществлять множеством способов. Белок имеет активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы. Таким образом, экспрессию можно определять с использованием субстрата, который может превращаться в визуально определяемый продукт, где указанный продукт можно определять соответствующими способами, зависящими от цвета указанного продукта или длины волны света, испускаемого указанным продуктом. Подходящие способы детекции описывают в разделе Примеры. Кроме того, экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты можно измерять способами ПЦР, включая способ, описываемый в Zanoni et al. (2009) и в Logan, Edwards and Saunders (2009), способами секвенирования, включая описываемые в техническом описании Illumina mRNA expression analysis (2010), доступном в http://www.illumina. com/documents/продукты/datasheets/datasheet_ mrna_expression.pdf, и способами гибридизации, хорошо известными в этой области.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения целлюлозного материала с улучшенными свойствами, включающему приведение целлюлозного материала, например, в водной среде в контакт с эффективным количеством белка по изобретению в присутствии ксилоглюкана или ксилоглюканового олигосахарида или ксилоглюкана или ксилоглюканового олигосахарида, с которым ковалентно связана органическая или неорганическая молекула.

Улучшенные свойства включают повышенную прочность или реакционную способность или другие свойства, такие как цвет (например, устойчивое окрашивание одежды, пиломатериалов, находящихся на открытом воздухе, и т.д.)/заряд (кислый или основный), необычные бумажные поверхности, например, для банкнот и юридических документов, медицинские вещества, например антибиотики или лекарственные средства, лабораторные реагенты, например индикаторную бумагу, не теряющую индикатор при длительном воздействии воды.

Белок по изобретению можно использовать для ковалентного присоединения целлюлозы или целлоолигосахаридов к ксилоглюкану или ксилоглюкановым олигосахаридам, где указанный ксилоглюкан или ксилоглюкановые олигосахариды, необязательно, содержат связанные с ними, например, на восстанавливающем конце различные органические или неорганические соединения, которые повышали бы полезность целлюлоз.

В одном из примеров целлюлозный материал выбран из или содержится в ткани (текстильных изделиях, таких как хлопковые или льняные), бумаге, производных целлюлозы, таких как карбоксиметилцеллюлоза или ацетат целлюлозы, упаковке, такой как картон, строительном материале (например, пиломатериалах и древесностружечных плитах), загустителях, таких как включающие и полученные из ксантановой камеди, медицинском перевязочном материале, таком как хлопковая вата и марля, целлофане, диализных трубках и смоле для хроматографических колонок.

Например, для изменения цвета материала молекула, связанная с ксилоглюканом, будет красителем. Такая комбинация может приводить к устойчивому окрашиванию, например, одежды или пиломатериалов, находящихся на открытом воздухе, получаемому в очень мягких условиях и без загрязняющих окружающую среду побочных продуктов.

Другие свойства, которые можно изменять в результате присоединения молекулы с соответствующими свойствами к ксилоглюкану в рамках способа получения целлюлозного материала с улучшенными свойствами, включают заряд (кислый или основный), необычные бумажные поверхности, например, для банкнот и юридических документов, медицинские вещества, например антибиотики или лекарственные средства, лабораторные реагенты, например индикаторную бумагу, не теряющую индикатор при длительном воздействии воды, и многие другие.

Таким образом, в одном из примеров способ получения целлюлозного материала с улучшенными свойствами включает присоединение молекулы, имеющей или придающей желаемое свойство ксилоглюкану или ксилоглюкановым олигосахаридам, не содержащим такую присоединенную молекулу, при этом указанное присоединение осуществляют до приведения указанного ксилоглюкана или ксилоглюкановых олигосахаридов в контакт с указанным целлюлозным материалом и белком по изобретению. Молекула может являться органической или неорганической. Присоединение органических веществ к восстанавливающему концу ксилоглюканового олигосахарида можно осуществлять способом с использованием олигосахаридил-1-амино-1-дезоксиальдита, описываемым в WO97/011193.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения целлюлозного материала с улучшенными свойствами, включающему получение растения по изобретению и сбор целлюлозного материала из указанного растения.

Сбор целлюлозного материала может являться сбором растения по изобретению, содержащего целлюлозный материал, общепринятыми способами. Сбор целлюлозного материала также может являться сбором частей растений, содержащих целлюлозный материал по изобретению, общепринятыми способами, такими как использование стандартных уборочных машин.

Целлюлозный материал дополнительно можно выделять из собранного материала.

Также описывают целлюлозный материал, получаемый способом получения целлюлозного мате

- 11 036403 риала, представленным в настоящем описании.

Кроме того, настоящее изобретение относится к целлюлозному материалу, содержащему целлюлозный материал, ковалентно присоединенный к ксилоглюкану или ксилоглюкановым олигосахаридам через гликозидную связь. В частности, указанный целлюлозный материал содержит целлюлозу или целлоолигосахариды, соединенные через бета-глюкозидную связь с ксилоглюканом или его олигосахаридом.

В одном из примеров указанного целлюлозного материала органическую или неорганическую молекулу ковалентно присоединяют к указанному ксилоглюкану или ксилоглюкановому олигосахариду, как описано выше. Эффект такой модификации обсуждают в другой части настоящей заявки.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему (а) целлюлозный материал, не содержащий связанный с ним ксилоглюкан или ксилоглюкановый олигосахарид, и (b) ксилоглюкан и/или ксилоглюкановый олигосахарид. Набор предназначен для предоставления компонентов для производства целлюлозного материала по изобретению, как описывают где-либо в настоящей заявке. Необязательно, набор дополнительно может содержать белок по изобретению, как представлено в настоящем описании.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против белка по изобретению. Антитело относится к интактным молекулам или их фрагментам, способным связывать эпитоп белка по изобретению. Антитела, связывающие белок по изобретению, можно получать с использованием интактных полипептидов или фрагментов, содержащих небольшие интересующие пептиды для иммунизации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения пищи или корма, таких как масло, мука крупного помола, зерно, крахмал, мука или белок, или промышленного продукта, такого как биотопливо, волокно, промышленные химикаты, фармацевтического или нутрицевтического средства, при этом указанный способ включает получение растения или его части по изобретению и получения пищи, корма или промышленного продукта из растения или его части.

Условия высокой строгости или условия гибридизации высокой строгости можно обеспечивать, например, посредством гибридизации при 65 °С в водном растворе, содержащем 6-кратный SSC (20кратный SSC содержит 3,0 М NaCl, 0,3 М цитрат Na, pH 7,0), 5-кратный раствор Денхардта (100-кратный раствор Денхардта содержит 2% фиколл, 2% поливинилпироллидон, 2% бычий сывороточный альбумин), 0,5% додецилсульфат натрия (SDS) и 20 мкг/мл денатурированную ДНК-носитель (одноцепочечную ДНК спермы рыбы со средней длиной 120-3000 нуклеотидов) в качестве неспецифического конкурента. После гибридизации можно осуществлять промывку высокой строгости в несколько этапов с конечной промывкой (приблизительно 30 мин) при температуре гибридизации в 0,2-0,1-кратном SSC, 0,1% SDS.

Термин условия умеренной строгости или условия гибридизации умеренной строгости относится к условиям, эквивалентным гибридизации в описываемом выше растворе, но приблизительно при 6062°С. Промывку в условиях умеренной строгости можно осуществлять при температуре гибридизации в 1-кратном SSC, 0,1% SDS.

Термин условия низкой строгости или условия гибридизации низкой строгости относится к условиям, эквивалентным гибридизации в описываемом выше растворе приблизительно при 50-52°С. Промывку в условиях низкой строгости можно осуществлять при температуре гибридизации в 2-кратном SSC, 0,1% SDS. См. также Sambrook et al. (1989) и Sambrook and Russell (2001).

В дополнение к описываемому химерному гену, трансформированные растительные клетки и растения, представленные в настоящем описании или полученные способами, представленными в настоящем описании, могут содержать по меньшей мере один другой химерный ген, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий продукт экспрессии. Примеры такого продукта экспрессии включают молекулы РНК или белки, такие как, например, фермент для устойчивости к гербициду. Устойчивыми к гербициду растениями хлопка являются, например, глифосат-устойчивые растения, т.е. растения, полученные устойчивыми к гербициду глифосату или его солям. Растения можно делать устойчивыми к глифосату различными способами. Например, глифосат-устойчивые растения можно получать посредством трансформации растения с использованием гена, кодирующего фермент 5-енолпирувилшикимат-3фосфатсинтетазу (EPSPS).

Примерами таких генов EPSPS являются ген AroA (мутант СТ7) бактерии Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221, 370-371), ген СР4 бактерии Agrobacterium sp. (Barry et al., 1992), гены, кодирующие EPSPS Petunia (Shah et al., 1986), EPSPS томата (Gasser et al., 1988) или EPSPS Eleusine (WO01/66704). Он также может являться мутантным EPSPS, как описано, например, в ЕР 0837944, WO00/66746, WO00/66747 или WO02/26995. Глифосат-устойчивые растения также можно получать посредством экспрессии гена, кодирующего фермент глифосат-оксидоредуктазу, как описано в патентах США №№ 5776760 и 5463175. Глифосат-устойчивые растения также можно получать посредством экспрессии гена, кодирующего фермент глифосат-ацетилтрансферазу, как описано, например, в WO02/36782, WO03/092360, WO05/012515 и WO07/024782. Глифосат-устойчивые растения также можно получать посредством селекции растений, содержащих природные мутации указанных выше генов, как

- 12 036403 описано, например, в WO01/024 615 или WO03/01322 6. Растения, экспрессирующие гены EPSPS, придающие устойчивость к глифосату, описывают, например, в патентных заявках США №№ 11/517991, 10/739610, 12/139408, 12/352532, 11/312866, 11/315678, 12/421292, 11/400598, 11/651752, 11/681285, 11/605824, 12/468205, 11/760570, 11/762526, 11/769327, 11/769255, 11/943801 или 12/362774. Растения, содержащие другие гены, придающие устойчивость к глифосату, такие как гены декарбоксилазы, описывают, например, в патентных заявках США №№ 11/588811, 11/185342, 12/364724, 11/185560 или 12/423926.

Другими устойчивыми к гербицидам растениями хлопка являются, например, растения, полученные устойчивыми к гербицидам, ингибирующим фермент глутаминсинтазу, таким как биалафос, фосфинотрицин или глуфосинат. Такие растения можно получать посредством экспрессии фермента, нейтрализующего гербицид, или мутантного фермента глутаминсинтазы, устойчивого к ингибированию, например, описываемого в патентной заявке США № 11/760602. Одним из таких эффективных нейтрализующих ферментов является фермент, кодирующий фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (такой как белок bar или pat из видов Streptomyces). Растения, экспрессирующие экзогенную фосфинотрицинацетилтрансферазу, описывают, например, в патентах США №№ 5561236; 5648477; 5646024; 5273894; 5637489; 5276268; 5739082;5908810 и 7112665.

Дополнительными гербицид-устойчивыми растениями хлопка также являются растения, полученные устойчивыми к гербицидам, ингибирующими фермент гидроксифенилпируватдиоксигеназу (HPPD). HPPD является ферментом, катализирующим реакцию, в которой пара-гидроксифенилпируват (НРР) превращается в гомогентизат. Растения, устойчивые к ингибиторам HPPD, можно трансформировать с использованием гена, кодирующего природный устойчивый фермент HPPD, или гена, кодирующего мутантный или химерный фермент HPPD, как описано в WO96/38567, WO99/24585, WO99/24586, WO2009/144079, WO2002/046387 или US6768044. Устойчивости к ингибиторам HPPD также можно достигать посредством трансформации растений с использованием генов, кодирующих конкретные ферменты, делающие возможным образование гомогентизата, несмотря на ингибирование нативного фермента HPPD ингибитором HPPD. Такие растения и гены описывают в WO99/34008 и WO02/36787. Устойчивость растений к ингибиторам HPPD также можно улучшать посредством трансформации растений с использованием гена, кодирующего фермент, имеющий активность префенат-дегидрогеназы (PDH), в дополнение к гену, кодирующему HPPD-устойчивый фермент, как описано в WO2004/024928. Кроме того, растения можно делать более устойчивыми к гербицидам-ингибиторам HPPD, добавляя в их геном ген, кодирующий фермент, способный метаболизировать или подвергать деградации ингибиторы HPPD, такой как ферменты CYP450, представленные в WO2007/103567 и WO2008/150473.

Другими устойчивыми к гербицидам растениями хлопка являются растения, полученные устойчивыми к ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS). Известные ингибиторы ALS включают, например, гербициды сульфонилкарбамид, имидазолинон, триазолопиримидины, пиримидинокси(тио)бензоаты и/или сульфониламинокарбонилтриазолинон. Известно, что различные мутации в ферменте ALS (также известном как синтетаза ацетогидроксикислот, AHAS) придают устойчивость к различным гербицидам и группам гербицидов, как описано, например, в Tranel and Wright (2002), а также в патентах США №№ 5605011, 5378824, 5141870 и 5013659. Получение сульфонилкарбамид-устойчивых растений и имидазолинон-устойчивых растений описывают в патентах США №№ 5605011; 5013659; 5141870; 5767361; 5731180; 5304732; 4761373; 5331107; 5928937 и 5378824; и международной патентной публикации № WO96/33270. Другие имидазолинон-устойчивые растения также описывают, например, в W02004/040012, WO2004/106529, WO2005/020673, WO2005/093093, WO2006/007373, WO2006/015376, WO2006/024351 и WO2006/060634. Дополнительные сульфонилкарбамид-и имидазолинон-устойчивые растения также описывают, например, в WO07/024782 и патентной заявке США № 61/288958.

Другие растения хлопка, устойчивые к имидазолинону и/или сульфонилкарбамиду, можно получать посредством индуцированного мутагенеза, селекции в культурах клеток в присутствии гербицида или мутационной селекции, как описано, например, для сои в патенте США № 5084082, для риса - в WO97/41218, для сахарной свеклы - в патентах США № 5773702 и WO99/057965, для салата-латука - в патенте США № 5198599 или для подсолнечника - в WO01/065922.

Дополнительные интересующие продукты экспрессии придают растению хлопка устойчивость к насекомым, т.е. устойчивость к поражению конкретными насекомыми-мишенями. Такие растения можно получать посредством генетической трансформации или селекции растений, содержащих мутацию, обеспечивающую такую устойчивость к насекомым.

Устойчивые к насекомым растения включают любое растение, содержащее по меньшей мере один трансген, содержащий кодирующую последовательность, кодирующую:

1) инсектицидный кристаллический белок из Bacillus thuringiensis или его инсектицидную часть, такой как инсектицидные кристаллические белки, указанные в Crickmore et al. (1998), обновление в Crickmore et al. (2005) по номенклатуре токсинов Bacillus thuringiensis, он-лайн на http://www.lifesci.Sussex.ас.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/, или их инсектицидные части, например белки из классов белков Cry Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1F, Cry2Ab, Оу3Аа или Cry3Bb или их инсектицидные части (например, ЕР 1999141 и WO2007/107302), или такие белки, кодируемые синтети

- 13 036403 ческими генами, например, как описано в патентной заявке США № 12/249016; или

2) кристаллический белок из Bacillus thuringiensis или его часть, являющийся инсектицидным в присутствии другого второго кристаллического белка из Bacillus thuringiensis или его части, такой как бинарный токсин, полученный из кристаллических белков Cry34 и Cry35 (Moellenbeck et al. 2001; Schnepf et al. 2006), или бинарный токсин, полученный из белков Cry1A или Cry1F и белков Cry2Аа или Cry2Aa или Сгу2Ае (патентная заявка США № 12/214022 и ЕР 080107915); или

3) гибридный инсектицидный белок, содержащий части различных инсектицидных кристаллических белков из Bacillus thuringiensis, таких как гибрид белков по п.1) выше или гибрид белков по п.2) выше, например белок Cry1A.105, продуцируемый объектом кукурузы MON89034 (WO2007/027777); или

4) белок по любому из пп.1)-3) выше, где некоторые аминокислоты, в частности от 1 до 10, заменяют другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности по отношению к видам насекомых-мишеней, и/или для расширения диапазона поражаемых видов насекомых-мишеней, и/или по причине изменений, вносимых в кодирующую ДНК при клонировании или трансформации, такой как белок СгуЗВ1 в объектах кукурузы MON863 или MON88017 или белок СгуЗА в объекте кукурузы MIR604; или

5) инсектицидный секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus или его инсектицидная часть, такой как вегетативные инсектицидные белки (VIP), представленные в http://www.lifesci.Sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip.html, например белки из класса белков VIP3Aa; или

6) секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, являющийся инсектицидным в присутствии второго секретируемого белка из Bacillus thuringiensis или В. cereus, такой как бинарный токсин, полученный из белков VIP1A и VIP2A (WO94/21795); или

7) гибридный инсектицидный белок, содержащий части из различных секретируемых белков из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, такой как гибрид белков по п.1) выше или гибрид белков по п.2) выше; или

8) белок по любому из пп.5)-7) выше, где некоторые аминокислоты, в частности от 1 до 10, заменяют другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности по отношению к видам насекомых-мишеней, и/или для расширения диапазона поражаемых видов насекомых-мишеней, и/или по причине изменений, вносимых в кодирующую ДНК при клонировании или трансформации (но все равно кодирующую инсектицидный белок), такой как белок VIP3Aa в объекте хлопка СОТ102; или

9) секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, являющийся инсектицидным в присутствии кристаллического белка из Bacillus thuringiensis, такой как бинарный токсин, полученный из VIP3 и Cry1A или Cry1F (патентная заявка США №№ 61/126083 и 61/195019), или бинарный токсин, полученный из белка VIP3 и белков Сгу2Аа или Cry2Ab или Сгу2Ае (патентная заявка США № 12/214022 и ЕР 080107915);

10) белок по п.9), где некоторые аминокислоты, в частности от 1 до 10, заменяют другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности по отношению к видам насекомыхмишеней, и/или для расширения диапазона поражаемых видов насекомых-мишеней, и/или по причине изменений, вносимых в кодирующую ДНК при клонировании или трансформации (но все равно кодирующую инсектицидный белок).

Также включены устойчивые к насекомым трансгенные растения, содержащие комбинацию генов, кодирующих белки любого из указанных выше классов от 1 до 10. В одном из вариантов осуществления устойчивое к насекомым растение содержит несколько трансгенов, кодирующих белок любого из указанных выше классов от 1 до 10, для расширения диапазона поражаемых видов насекомых-мишеней при использовании различных белков, направленных против различных видов насекомых-мишеней, или для задержки развития устойчивости к насекомым у растений с использованием различных белков, инсектицидных по отношению к тем же видам насекомых-мишеней, но имеющих другой механизм действия, такой как связывание с другими участками связывания рецептора у насекомого.

Устойчивые к насекомым растения дополнительно включают растения, содержащие по меньшей мере один трансген, содержащий последовательность, приводящую после экспрессии к образованию двухцепочечной РНК, которая после потребления насекомым-вредителем растений ингибирует рост этого насекомого-вредителя, как описано, например, в WO2007/080126, WO2006/129204, WO2007/074405, WO2007/080127 и WO2007/035650.

Дополнительные признаки придают устойчивость к абиотическим стрессам. Растения с такой устойчивостью можно получать посредством генетической трансформации или селекции растений, содержащих мутацию, обеспечивающую такую устойчивость к стрессу. Особенно пригодные устойчивые к стрессу растения включают:

1) растения, содержащие трансген, способный снижать экспрессию и/или активность гена поли(ДЦФ-рибоза)полимеразы (PARP) в растительных клетках или растениях, как описано в WO00/04173, WO/2006/045633, ЕР 040779845 или ЕР 060098365.

2) растения, содержащие повышающий устойчивость к стрессу трансген, способный снижать экс

- 14 036403 прессию и/или активность генов, кодирующих PARG, в растениях или растительных клетках, как описано, например, в WO2004/090140.

3) растения, содержащие повышающий устойчивость к стрессу трансген, кодирующий функциональный в растениях фермент реутилизационного пути синтеза никотинамидадениндинуклеотида, включая никотинамидазу, никотинат-фосфорибозилтрансферазу, мононуклеотидаденилтрансферазу никотиновой кислоты, никотинамидадениндинуклеотидсинтазу или никотинамидфосфорибозилтрансферазу, как описано, например, в ЕР040776247, WO2006/133827, РСТ/ЕР07/002433, ЕР1999263 или WO2007/107326.

Растения или культивары растений (которые можно получать способами биотехнологии растений, такими как генетическая инженерия), которые также можно обрабатывать по изобретению, являются растениями, такими как растения хлопка, с измененными характеристиками волокон. Такие растения можно получать посредством генетической трансформации или селекции растений, содержащих мутацию, обеспечивающую такие измененные характеристики волокон, и они включают:

a) растения, такие как растения хлопка, содержащие измененную форму генов целлюлозосинтазы, как описано в WO98/00549;

b) растения, такие как растения хлопка, содержащие измененную форму rsw2- или rsw3гомологичных нуклеиновых кислот, как описано в WO2004/053219;

c) растения, такие как растения хлопка, с повышенной экспрессией сахарозо-фосфатсинтетазы, как описано в WO01/17333;

d) растения, такие как растения хлопка, с повышенной экспрессией сахарозосинтазы, как описано в WO02/45485;

e) растения, такие как растения хлопка, где изменен временной режим транспорта через плазмодесмы в основании клетки, например, посредством негативной регуляции волокно-селективной β-1,3глюканазы, как описано в WO2005/017157, или как описано в ЕР080755143 или патентной заявке США № 61/128938;

f) растения, такие как растения хлопка, имеющие волокна с измененной реакционной способностью, например, благодаря экспрессии гена N-ацетилглюкозаминтрансферазы, включая nodC, и генов хитинсинтазы, как описано в WO2006/136351;

Трансформированные растительные клетки и растения, полученные способами, представленными в настоящем описании, далее можно использовать в способах селекции, хорошо известных в этой области, таких как скрещивание, самоопыление и обратное скрещивание. Программы селекции могут включать скрещивание для получения поколения F1 (первого поколения гибридов), а затем нескольких поколений посредством самоопыления (поколения F2, F3 и т.д.). Программа селекции также может включать этапы обратного скрещивания (ВС), при этом потомка скрещивают с одной из родительских линий, обозначаемой как рекуррентный родитель.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения растения, содержащего химерный ген, представленный в настоящем описании, включающему этап скрещивания растения хлопка, представленного в настоящем описании, с другим растением или самим собой и селекции потомка, содержащего указанный химерный ген.

Трансформированные растительные клетки и растения, полученные способами, представленными в настоящем описании, дополнительно можно использовать в последующей трансформации, например, для встраивания дополнительного химерного гена.

Растения или семя, содержащее химерный ген, представленный в настоящем описании, или полученное способами, представленными в настоящем описании, дополнительно можно обрабатывать хлопковыми гербицидами, такими как диурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралин, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобакнатрия, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глуфосинат, флумиоксазин, тидиазурон; хлопковые инсектициды, такими как ацефат, алдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетамиприд, эмамектина бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, лямбда-цигалотрин, спиносад, тиодикарб, гаммацигалотрин, спиромезифен, пиридалил, флоникамид, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, бетацифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетофуран, флубендиамид, циазипир, спиносад, спиноторам, гамма-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромезифен, сульфоксафлор; и хлопковые фунгициды, такие как азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, медь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенамидон, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флуксапироксад, ипродион, изопиразам, изотианил, манкозеб, манеб, метоминостробин, пентиопирад, пикоксистробин, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, хинтозин, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин.

Список последовательностей, содержащийся в файле под названием BCS13-2019_ST25.txt, составляющем 30 килобайт (размер, измеряемый в Microsoft Windows®), содержит 8 последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 8, поданных, таким образом, посредством электронной подачи и вклю

- 15 036403 ченных в настоящее описание в качестве ссылок.

На чертежах представлено.

Фиг. 1 - зимограмма нативного электрофореза в ПААГ экстракта с активностью МХЕ. Неочищенный экстракт (А) или преципитат сульфата аммония (ASP) (В) подвергали нативному электрофорезу в ПААГ. Одну дорожку окрашивали кумасси синим (СВ). Три дорожки подвергнутых электрофорезу гелей вырезали и дважды промывали 0,3-М цитратным буфером (рН 6,3) в течение 15 мин. Определяли активности ферментов, накладывая дорожку на бумагу, пропитанную MLG и XXXG-SR (конъюгатом сульфородамина и гептасахарида ксилоглюкана (Xyl3.Glc4)) (М), XyG (ксилоглюканом) и XXXG-SR (X) или только XXXG-SR (С). Светлые полосы на темном фоне свидетельствуют о трансглюкозилировании между полисахаридом и олигосахаридом; в случае (С) используемым полисахаридом являлась целлюлоза из самой бумаги.

Фиг. 2 - бумага для дот-блоттинга, подтверждающая активность СХЕ. А) Три полоски индикаторной бумаги нагружали (по 3 мкл каждая, 8 пятен) серией 2-кратных разведений фермента ASP в цитратном буфере (0,3 М, рН 6,3). Полоски инкубировали во влажных условиях в течение 1 ч, затем сушили при комнатной температуре. Полоски промывали в этаноле/муравьиной кислоте/воде (EFW) и фотографировали. В) Полоски промывали в 6 М NaOH при 37°С в течение ночи, промывали водой, сушили и снова фотографировали. При промывке бумага уменьшалась в размере. Кругами показан оставшийся крепко связавшийся продукт эндотрансглюкозилазы, присущий трансгликозилированию целлюлозы в XXXG. С=СХ;, М=МХЕ; Х=ХЕТ.

Фиг. 3 - природная целлюлоза в качестве донора для HTG. Культуру клеток в состоянии покоя и зрелые побеги промывали в 75% EtOH до удаления хлорофилла и сушили. Часть AIR (нерастворимого в спирте осадка) инкубировали в 6 М NaOH при 37°С в течение ночи, затем промывали водой для удаления щелочи, лиофилизировали и хранили. Каждый субстрат (10 мг) регидратировали в течение ночи и перед анализом удаляли избыток жидкости. Твердый субстрат смешивали с [³H]XXXGol (восстановленным XXXG (т.е. Ху13Ьк3.сорбитом)) (2 кБк), ASP и цитратным буфером буфер (0,3 М, рН 6,3, 97 мкл). Через 2 ч реакцию останавливали муравьиной кислотой (FA) (30 мкл) и твердые вещества промывали водой до удаления оставшегося свободного [³H]XXXGOL. Твердые вещества (в 1 мл воды) переносили в сцинтилляционные флаконы и инкубировали со сцинтиллятором в течение ночи до анализа ³Н. Каждый образец тестировали в трех повторениях, представлено ±SD. * n=1.

Фиг. 4 - потенциал активностей ковалентного связывания целлюлозных микрофибрилл.

Фиг. 5 - скорректированная радиоактивность (импульсы/мин в случае МХЕ и ХЕТ, импульсы/мин/6 в случае СХЕ) фракций 1-20, имеющих три активности эндотрансглюкозилаз (ХЕТ (столбики, заштрихованные по диагонали), МХЕ (черные столбики), СХЕ (белые столбики)) после изоэлектрофокусирования осажденных сульфатом аммония белков Equisetum.

Фиг. 6 - временная шкала активности ХЕТ, МХЕ и СХЕ белка HTG, экспрессируемого в Pichia. Активность ХЕТ указана ромбами, активность МХЕ указана квадратами, и активность СХЕ указана треугольниками. Ось X: время (мин); ось Y: включенная радиоактивность (импульсы/мин).

Фиг. 7 - специфичность рекомбинантного HTG к акцепторному субстрату в анализе, в котором в качестве донора использовали глюкан со смешанными связями ячменя. Процент включения представлен для потенциальных акцепторных субстратов (все ³Н-меченые) (1^4)-в-манногексит (1), целлогексит (2), (1^4)-в-галактогексит (3), (1^4)-а-галактуроногексит (4), XXLGol (5), GGXXXGol (6), XXXGol (7), GXXGol (8), мальтогексит (9), полученные с помощью целлюлазы гептасахариды и октасахариды MLG (10), (1^4)-в-ксилогексит (11), полученные с помощью лихеназы олигосахариды MLG от гепта- до декасахаридов (12), полученный с помощью лихеназы октасахарид MLG (13), полученный с помощью лихеназы гептасахарид MLG (14) и ламинаритетрит (15). Номенклатура аббревиатур ксилоглюкановых олигосахаридов (XXLGol, GGXXXGol, XXXGol, GXXGol) является такой, как описано в Fry et al. (1993).

Фиг. 8 - выравнивание нуклеотидных (А) и аминокислотных (В) последовательностей SEQ ID NO: 1, 5 и 7 и SEQ ID NO: 2, 6 и 8 соответственно.

Фиг. 9 - временная шкала активности ХЕТ, МХЕ и СХЕ белка HTG, экспрессируемого в Pichia, в присутствии и отсутствие BSA. Активность ХЕТ с BSA: белые квадраты; активность ХЕТ без BSA: черные квадраты; активность МХЕ с BSA: белые треугольники; активность МХЕ без BSA: черные треугольники; активность СХЕ с BSA: белые круги; активность СХЕ без BSA: черные круги. Ось X: время инкубации (ч); ось Y: включенная ³Н-радиоактивность (импульсы/мин/кБк восполняемого субстрата).

Фиг. 10 - катализируемое HTG трансгликозилирование с использованием [³H]XXXGo1 в качестве акцепторного субстрата и различных донорных субстратов, включая глюкан со смешанными связями (MLG) (крестики); ксилоглюкан (треугольники) водорастворимый ацетат целлюлозы (WSCA) (ромбы); немелованную бумагу (РР) (черные квадраты); предварительно обработанную щелочью бумагу (АР) (черные круги); предварительно обработанную щелочью бумагу + бычий сывороточный альбумин (AP+BSA) (белые круги), немелованную бумагу + бычий сывороточный альбумин (PP+BSA) (белые квадраты). Ось X: время инкубации (ч); ось Y: включенная ³Н-радиоактивность (Бк/кБк восполняемого субстрата).

- 16 036403

Фиг. 11 - трансгликозилирование с использованием [³H]XXXGol (черные символы) или [³Н]целлотетрита (GGGGol) (белые символы) в качестве акцепторов и различных донорных субстратов, включая предварительно обработанную щелочью бумагу + BSA (AP+BSA) (ромбы; черные ромбы - с XXXGol, белые ромбы - с GGGGol), глюкан со смешанными связями (MLG) (треугольники; черные треугольники - с XXXGol, белые треугольники - с GGGGol) и ксилоглюкан (круги; черные круги - с XXXGol, белые круги - с GGGGol). Ось X: время инкубации (ч); ось Y: включенная ³Н-радиоактивность (Бк/кБк восполняемого субстрата).

Фиг. 12 - скорости катализируемого HTG трансгликозилирования с использованием MLG (серые столбики) или ксилоглюкана (черные столбики) в качестве донорного субстрата и различных ³Нолигосахаридов в качестве потенциальных акцепторов. Скорость реакции с использованием XXXGol принимали за 100%. А, В, и С представляют собой три независимых эксперимента. В экспериментах В и С использовали HTG, очищенный с помощью аффинной хроматографии. В эксперименте С в качестве донора использовали только MLG. 1: XXXGol, 2: GXXGol; 3: GGXXXGol; 4: XXLGol; 5: XLLGol; 6: Cell4-ol; 7: Man6-ol; 8: Xyl6-ol; 9: MLGO-ol A; 10: MLGO-ol B; 11: MLGO-ol C; 12: Cell6-ol; 13: MLGO-ol D; 14: MLGO-ol E; 15: MLGO-ol F; 16: Lam4-ol; 17: Gal6-ol; 18: GalA6-ol; 19: Malt6-ol. MLGO-ol A-F не идентифицировали в отдельности, они представляли собой олигосахариды MLG ячменя от гепта- до декасахаридов, расщепленные лихеназой (А-С), или целлюлозу (D-F).

На всем протяжении настоящей заявки делают ссылки на следующие последовательности:

SEQ ID NO: 1: нуклеотидная последовательность HTG Equisetum fluviatile,

SEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность белка, кодируемого SEQ ID NO: 1,

SEQ ID NO: 3: нуклеотидная последовательность слитого белка HTG, используемого для экспрессии в Pichia pastoris,

SEQ ID NO: 4: аминокислотная последовательность белка, кодируемого SEQ ID NO: 3,

SEQ ID NO: 5: нуклеотидная последовательность HTG Equisetum hyemale,

SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность белка, кодируемого SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 7: нуклеотидная последовательность HTG Equisetum diffusum,

SEQ ID NO: 8: аминокислотная последовательность белка, кодируемого SEQ ID NO: 7.

С помощью примеров иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Материалы и способы.

1.1. Общие сведения.

Если не указано иначе, осуществляемые этапы клонирования, такие как, например, расщепление рестриктазами, электрофорез в агарозном геле, очистка фрагментов ДНК, соединение фрагментов ДНК, трансформация бактериальных или дрожжевых клеток, выращивание бактерий или дрожжей и анализ последовательности рекомбинантной ДНК, осуществляли, как описано в Sambrook (2000). Секвенирование молекул рекомбинантной ДНК осуществляли с использованием лазерного флуоресцентного ДНКсеквенатора ABI по способу Сэнгера.

1.2. Выделение ферментов из растительного материала.

Сырые смеси ферментов выделяли из свежей растительной ткани в CaCl₂ (10 мМ), янтарной кислоте (0,3 М) и аскорбиновой кислоте (20 мМ), полученные в свежем виде с рН 5,5. Поликлар AT (3% мас./об.) добавляли к смеси с фенолами. Свежую ткань гомогенизировали в пищевом блендере с 5 мл указанного выше экстрагента на 1 г массы сырой ткани. Ткань и экстрагент перемешивали на льду в течение 2,5 ч. Экстракт фильтровали через два слоя Miracloth и центрифугировали в центрифуге Sorvall Evolution RC (10 мин, 10000 об/мин, 4°С). Супернатант собирали и аликвотировали, затем замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

1.3. Изоэлектрофокусирование (IEF) Rotofor.

Bio-Rad Rotofor Cell собирали и подготавливали по инструкциям производителя. Rotofor использовали с программным обеспечением BioRad PowerPac HV. Амфолиты смешивали с водой и смесью маркеров, содержащей фикоцианин, гемоглобины А и С и цитохром с, или диализированным образцом белка. Разделение осуществляли при постоянной мощности 10 Вт до стабилизации напряжения и собирали фракции по инструкциям производителя. Для измерения рН фракций использовали рН-метр Sartorius PB11. Также анализировали активность трансглюкозилаз.

1.4. Флуоресцентный анализ трансглюкозилирования.

Получение бумаги для анализа.

Бумагу для дот-блоттинга, или индикаторную бумагу, получали согласно Fry (1997). Индикаторную бумагу получали с использованием хроматографической бумаги Whatman 1CHR. Получали ХЕТиндикаторную бумагу, погружая ее в 1,0% XyG, высушивая, затем погружая в 5 мкМ XXXG-SR (конъюгат XXXG и сульфородамина (SR)) в 75% ацетоне или 75% этаноле. Другую бумагу погружали в 1,0% MLG, сушили, затем погружали в XXXG-SR для получения МХЕ-индикаторной бумаги. Получали контрольную бумагу, не содержащую иной полисахаридный донорный субстрат, кроме самой бумаги, включающую акцепторный субстрат. Конечная концентрация акцепторного субстрата для всей индикаторной бумаги составляла ~125 пмоль/см²

- 17 036403

Анализ индикаторной бумаги.

Индикаторную бумагу, вырезанную по размеру, использовали двумя способами: растворы ферментов наносили на бумагу маленькими точками (дот-блот-анализ) или бумагу приводили в тесный контакт с гелями, подвергнутыми нативному электрофорезу в ПААГ (анализ зимограммы). Образец для анализа инкубировали во влажных условиях между двумя запечатанными стеклянными пластинами. Затем бумагу сушили при комнатной температуре и промывали в этаноле:FA:воде (EFW) 1:1:1 в течение 1 ч. Полоски сушили, зажимали под прессом в течение ночи и фотографировали с использованием UVP Multi DocIt Digital Imaging System. О положительном трансглюкозилировании свидетельствовала флуоресценция, возбуждаемая под воздействием ультрафиолета при 254 нм.

Флуоресцентный дот-блот-анализ.

На сухую индикаторную бумагу наносили аликвоты раствора активного фермента [как правило, в сукцинатном буфере, рН 5,5, содержащем 10 мМ CaCl₂] по 3 мкл в виде пятен (с расстоянием от центра до центра 9 мм, т.е. в формате 96-луночного планшета).

Быстро помещали бумагу между 2 листами политена или стекла, зажимали под прессом (телефонным справочником) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-24 ч. Пятна фермента должны оставаться влажными. Для достижения этого полезно размещать пятна раствора фермента (или контрольного буфера) по всей площади бумаги, не заходя за края.

Позволяли бумаге сушиться на открытом воздухе, затем промывали в политеновом контейнере, содержащем этанол:90% муравьиную кислоту:воду (EFW) 1:1:1 или 10%-ный водный раствор муравьиной кислоты с осторожным встряхиванием в течение 1 ч.

Если есть какие-либо вопросы о том, что также могут образовываться продукты ХЕТ или МХЕ (несмотря на то, что не добавляли умышленно соответствующие донорные субстраты для этих активностей), может быть полезным промывать бумагу в 6 М NaOH (с очень осторожным встряхиванием, т.к. бумага становится очень хрупкой).

Тщательно промывали в водопроводной воде.

Сушили.

Наблюдали под УФ-освещением (254 или 310 нм) или светом, генерируемым зеленым лазером, и регистрировали оранжевую флуоресценцию пятен продукта реакции СХЕ.

1.5. Анализы целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы (СХЕ).

Хроматографическую бумагу Whatman 1CHR (10-35 мг; предварительно обработанную*) инкубировали с экстрактом или фракцией фермента, [³H]XXXGol (2 кБк), и цитратным буфером (рН 6,3, конечный объем 100 мкл) в течение установленного времени, как правило, 0-24 ч. Реакцию останавливали добавлением 90% муравьиной кислоты (30 мкл), затем бумагу промывали посредством повторяемого добавления воды, центрифугирования и удаления супернатанта, пока супернатант не перестанет содержать радиоактивную метку. Как правило, в случае целлюлозы необходимо приблизительно шесть промывок для удаления растворимой радиоактивной метки. Оставшуюся целлюлозу суспендировали в 0,5 мл воды, переносили в сцинтилляционный флакон с 5 мл смешивающегося с водой сцинтиллятора и анализировали на 47 радиоактивность посредством сцинтилляционных измерений.

^Предварительная обработка бумаги: добавить 3 г бумаги к 45 мл 6 М NaOH, инкубировать при 37°С в течение ночи с осторожным встряхиванием, промывать в воде до почти нейтрального состояния, затем сукцинатным буфером (рН 5,5), затем большим количеством воды; в конце концов, сушить бумагу.

6.6. Нативный электрофорез в ПААГ.

Нативные полиакриламидные гели получали аналогично ПААГ с SDS, но с некоторыми отличиями. Получали концентрирующий гель с концентрацией 4,3% акриламида с трис-(гидроксиметил)аминометаном (Tris) (67 мМ, рН 6,7 с Н₃РО₄). Концентрация разделяющего геля составляла 7,5% акриламида с Tris (376 мМ, рН 8,9). Подвижный буфер содержал Tris (5 мМ) и глицин (38 мМ). Гели подвергали электрофорезу при 6°С в течение 25 мин при 20 мА, затем в течение 3 ч при 40 мА.

1.7. Растворение целлюлозы в DMA/LiCl.

Этот способ адаптировали из Gurjanov et al. (2008) с модификациями. Активировали молекулярное сито (4 А) (100°С, 3 ч). Диметилацетамид (DMA) сушили над ситом в течение по меньшей мере 5 дней. LiCl (8 г) сушили (180°С, 4 ч) и растворяли в сухом DMA (100 мл). Куски Whatman 1CHR увлажняли водой в течение 1 ч, затем фильтровали на нейлоновой сетке. Куски бумаги промывали в ацетоне, затем инкубировали в ацетоне в течение 1 ч. Куски снова отфильтровывали с использованием нейлоновой сетки, промывали в DMA и инкубировали в течение ночи в сухом DMA. DMA удаляли и заменяли 8% LiCl в DMA таким образом, что бумага составляла 1% (мас./об.). Бумагу растворяли посредством перемешивания при комнатной температуре. Для снижения вязкости раствора целлюлозы добавляли равный объем сухого DMA. Раствор медленно добавляли с помощью перистальтического насоса к быстро перемешиваемому 6 М NaOH, в котором осаждалась целлюлоза, но ожидали, что гемицеллюлозы из бумаги останутся в растворе.

Пример 2. Целлюлоза в качестве донорного субстрата для МХЕ.

При поиске ферментов с активностью трансглюкозилазы, в частности МХЕ (MLG:ксилоглюкан

- 18 036403 эндотрансглюкозилазы) и ХЕТ (ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы), наблюдали, что ферменты из Equisetum fluviatile, частично очищенные с использованием осаждения сульфатом аммония и изоэлектрофокусирования (Rotator), проявляли активность МХЕ и/или активность ХЕТ. В отрицательном контроле на полоске бумаги, обработанной XXXG-SR (конъюгатом сульфородамина и XXXG (гептасахарида ксилоглюкана)), но без добавления полисахаридного донорного субстрата, ожидали отсутствие остаточной флуоресценции, свидетельствующей о ферментативной активности (фиг. 1). Однако полоса, соответствующая предполагаемой активности трансглюкозилазы, отображалась на всех трех индикаторных бумагах для ХЕТ (ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы), МХЕ и контроля. Т.к. целлюлоза являлась единственным известным полисахаридом, присутствующим в контролях, исследовали возможность действия β(1^4)-глюкана в качестве донорного субстрата в реакции трансглюкозилировании.

Индикаторная бумага, пропитанная XXXG-SR.

Сначала наблюдение образования предполагаемого продукта трансглюкозилирования без донорного субстрата (иного, чем бумага) повторяли в немного другом эксперименте. Частично очищенный фермент, имеющий активность МХЕ и ХЕТ, наносили в виде серии разведений на три индикаторных бумаги, пропитанных MLG (1,3;1,4-в^-глюканом со смешанными связями), XyG (ксилоглюканом) или без добавления полисахарида и XXXG-SR. Бумагу держали во влажных условиях в течение 1 ч, затем промывали от XXXG-SR и фотографировали под УФ-освещением для демонстрации флуоресцентного продукта трансглюкозилирования (фиг. 2а). Затем три бумаги инкубировали в 6 М NaOH для удаления гемицеллюлоз из бумаги и снова фотографировали (фиг. 2 b).

Фактически, в этом эксперименте воспроизводили исходное наблюдение того, что бумага в отдельности без добавления донорного субстрата может являться субстратом для трансглюкозилирования. Во всех из трех индикаторных бумаг наблюдали продукт трансглюкозилирования, о чем свидетельствуют флуоресцентные пятна, даже когда фермент разбавляли в буфере в 16 раз. Гемицеллюлозы, включая продукты МХЕ и ХЕТ, вымывались бы в 6 М NaOH. Как и ожидали, тестовые полоски, соответствующие МХЕ и ХЕТ, содержали значимо меньше продукта, оставшегося на бумаге, возможно, вообще не содержали. Контрольная бумага удерживала продукт после промывки NaOH, хотя его оставалось меньше. Целлюлоза и некоторые маннаны не растворяются в водном растворе NaOH (Moreira and Filho, 2008), и они являлись вероятными кандидатами на роль донорного субстрата.

Использовали хроматографическую бумагу Whatman 1CHR. Она сделана из хлопка, но нельзя получить информацию об обработке материала в процессе получения бумаги. Наиболее распространенным присутствующим полисахаридом, который может являться донором энергии, необходимой для реакции трансгликозилирования, несомненно, являлась целлюлоза. После анализа посредством гидролиза TFA и Driselase® (препарата фермента грибов, содержащего экзо- и эндогидралазы полисахаридов, включая целлюлазу, пектиназу, бета-ксиланазу и бета-маннаназу) исключали другие полисахариды на роль донорных субстратов.

В целом, при гидролизе TFA и Driselase наблюдали, что Whatman 1CHR состоит, главным образом, из глюкозы, более вероятно - из целлюлозы. При гидролизе TFA (трифторуксусной кислотой) также наблюдали следы ксилозы. Аналогично, при расщеплении Driselase® получали ксилозу в качестве наиболее распространенного сахара после глюкозы и целлобиозы. Кроме того, при расщеплении не наблюдали следов изопримверозы, что свидетельствует об отсутствии XyG. Некоторые из гликопротеинов, содержащих смесь Driselase®, аутолизировались при инкубации, давая следы глюкозы и маннозы.

Анализы целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы с использованием радиоактивной метки.

Для анализа новой активности трансглюкозилаз с использованием целлюлозы в качестве донорного субстрата, предварительно обозначенной как СХЕ, использовали радиоактивный акцептор [³H]XXXGol (восстановленный XXXG, Ху13Ьк3.сорбит).

Природная целлюлоза в качестве донора.

Для определения того, относится ли эта активность к росту растений Equisetum, в качестве потенциального донорного субстрата использовали растительный материал. Сначала получали нерастворимый в спирте остаток (AIR) клеток каллюсной культуры и стеблей зрелых растений. Остаток инкубировали в 6 М NaOH для удаления гемицеллюлоз, некоторые из которых также могут являться донорными субстратами. AIR и промытый в NaOH остаток тестировали в качестве потенциальных донорных субстратов (фиг. 3).

Как показано ранее, бумага Whatman может являться донорным субстратом для реакции трансглюкозилирования. Клетки культуры богаты XyG, но не MLG (фиг. 1), и ожидали, что они будут поставлять донорный субстрат для ХЕТ. Зрелые побеги, богатые MLG и XyG, содержали субстраты МХЕ, ХЕТ и СХЕ. Однако, что примечательно, все образцы, промытые NaOH, включали больше акцепторного субстрата, чем непромытая бумага или AIR. Если с помощью 6 М NaOH удаляют все гемицеллюлозы, покрывающие целлюлозные микрофибриллы, и если с помощью него можно снижать кристалличность микрофибрилл, то возможно, что целлюлоза являлась более подходящим субстратом для доминантной трансглюкозилазы, чем любой другой субстрат.

Солюбилизация и восстановление целлюлозы и продукта СХЕ.

- 19 036403

Предполагают, что гемицеллюлозы могут быть захваченными внутри аморфных областей целлюлозных микрофибрилл (Rose and Bennet, 1999). Такие захваченные гемицеллюлозы могут быть более сильно соединены с целлюлозой, оставаясь связанными с микрофибриллами в теплой щелочи. Можно утверждать, что эти гипотетические гемицеллюлозы являются настоящим донорным субстратом для наблюдаемого трансгликозилирования с бумагой.

Другим способом подтверждения того, что [³H]XXXGol являлся ковалентно связанным с целлюлозой, являлось растворение целлюлозного продукта. Если целлюлозные микрофибриллы восстанавливали в щелочи, гемицеллюлозы более не могли быть захваченными внутри микрофибриллы и оставались бы растворимыми.

Целлюлозу солюбилизировали с использованием хлорида лития (LiCl) в диметилацетамиде (DMA). Продукт СХЕ растворяли в растворе 8% LiCl в DMA. Вязкий раствор медленно переносили в большой объем 6 М NaOH, в котором целлюлоза переосаждалась. Твердую целлюлозу отделяли от супернатанта и в каждой фракции определяли радиоактивный продукт (табл. 1).

Таблица 1

Восстановление продукта СХЕ

Растворимый в б М NaOH	Осажденная целлюлоза
6500 импульсов/мин	14000 импульсов/мин

Продукт СХЕ (40 мг, полученный с использованием эксклюзионной хроматографии) вымачивали в воде в течение 1 ч с последующей заменой растворителя на ацетон. Бумагу вымачивали в ацетоне в течение 1 ч, затем заменяли DMA, не содержащим Н2О (над молекулярным ситом Sigma, 4 А , в течение 5 дней), и вращали в течение 16 ч. Удаляли DMA и инкубировали продукт СХЕ в сухом DMA (4 мл) с 8% (мас./об.) LiCl в течение 16 ч. Затем добавляли дополнительные 4 мл DMA для снижения вязкости. Медленно добавляли раствор целлюлозы к перемешиваемому 6 М NaOH (80 мл) с помощью перистальтического насоса со скоростью 3,2 мл/ч. Полученную смесь перемешивали в течение 48 ч. Часть смеси удаляли и центрифугировали. Супернатант отделяли от осаждающих средств; оба из них нейтрализовали с помощью НОАс и осуществляли сцинтилляционные измерения. Регистрировали количество импульсов/мин всего супернатанта и всех осадков.

Т.к. основная часть ³Н-продукта осаждалась, целлюлоза фактически может являться настоящим субстратом для реакции трансглюкозилирования с бумагой. Основная часть ³Н следовала ожидаемому профилю осаждения целлюлозы в 6 М NaOH после растворения в LiCl и DMA. Хотя измеряемое соотношение трития в осадке и трития в супернатанте составляло 2,2:1, это соотношение могло являться более высоким с учетом Бк, т.к. твердые частицы подсчитывают с меньшей эффективностью, чем раствор.

Радиоактивность, оставшаяся в растворе, могла соответствовать продуктам распада XXXGol или присоединенным к XXXGol коротким фрагментам β-(1 ^4)-глюкана с повышенной растворимостью благодаря XGO.

В целом, продукт СХЕ, растворенный с помощью LiCl в DMA, осаждался после восстановления целлюлозы в 6 М NaOH, что свидетельствует о том, что продукт трансглюкозилирования не являлся гемицеллюлозой.

СХЕ является активностью частично очищенного HTG Показано, что многочисленные белки во фракциях, осажденных сульфатом аммония, из Equisetum были способны к трансглюкозилированию, некоторые из них проявляли активность ХЕТ, и по меньшей мере еще один фермент, МХЕ, способен использовать MLG или XyG в качестве донорного субстрата. Частично очищенные фракции экстракта Equisetum, полученные с использованием изоэлектрофокусирования (Rotofor) и имеющие две ферментативные активности МХЕ и ХЕТ, тестировали на их способность использовать целлюлозу в качестве донорного субстрата (табл. 2).

Таблица 2

Активность СХЕ из частично очищенного HTG

Фермент	Образовавшийся продукт (импульсы/мин)
рр МХЕ	1825
рр ХЕТ	18
ASP	1217
только буфер	13

Частично очищенную (рр) МХЕ, рр ХЕТ, ASP или только буфер (0,3 М цитрат, рН 6,3) инкубировали с [³H]XXXGol (2 кБк), цитратным буфером (до 100 мкл) и 10 мг бумаги Whatman 1CHR (необработанной) в течение 3,3 ч. Реакцию останавливали с помощью FA (30 мкл) и неиспользованные реагенты вымывали водой.

Бумагу (в 5 мл воды) инкубировали в сцинтилляторе и анализировали на ³Н.

Фракция частично очищенного HTG имела высокие уровни активности СХЕ, но только фракция с активностью ХЕТ не использовала целлюлозу в качестве донорного субстрата. Хотя фракция МХЕ не

- 20 036403 являлась одним чистым белком, она содержала лишь несколько из них и была очень богата одним белком. В другом эксперименте серию очищенных с помощью Rotofor фракций, имеющих активность МХЕ, тестировали на активность СХЕ, и профили высокой активности СХЕ напрямую коррелировали с профилями высокой активности МХЕ и ХЕТ (фиг. 5). Этот фермент может являться относительно неспецифической трансглюкозилазой, способной использовать β-(1 ^4)-глюканы, независимо от их боковых цепей или других связей остова.

Характеристика активности МХЕ при использовании различных донорных и акцепторных субстратов.

Частично очищенная фракция МХЕ была способна использовать целлюлозу, MLG или XyG в качестве донорных субстратов с множеством акцепторных субстратов (табл. 3). Хотя MLG являлся более подходящим донорным субстратом, чем XyG, прямое сравнение степеней активности с использованием целлюлозы в качестве донорного субстрата являлось затруднительным. Концентрацию полисахарида в растворе, такого как MLG или XyG, нельзя сравнивать со схожей концентрацией твердого вещества в воде. Кроме того, тритий, включенный в твердый субстрат, такой как целлюлоза, или на нем, подсчитывали с более низкой эффективностью, чем тритий в растворе, что снижало возможность определения продукта СХЕ. Таким образом, активность МХЕ и ХЕТ можно сравнивать напрямую, но их можно лишь приблизительно сравнивать с активностью СХЕ.

Таблица 3

Характеристика активности МХЕ с использованием различных донорных и акцепторных субстратов. Относительная скорость реакции при использовании. Донор акцептора

XXXGol MLGO Cello₆ol XXLGol XLLGol XX FG

XyG +++ + + ++

MLG ++++ + + ++ ++

Целлюлоза++

Лихенан±

ЛаминарииМаннанGM± (сокращения: GM = глюкоманнан, XyG = ксилоглюкан, MLGO = глюкановый олигосахарид со смешанными связями, Cello₆ol = целлогексит, XXFG = нонасахарид ксилоглюкана, имеющий композицию глюкоза4.ксилоза3.галактоза1. фукоза1).

Активность СХЕ.

Множество наблюдений приводят к подтверждению активности целлюлоза:ксилоглюканэндотрансглюкозилазы.

Если ту же молекулу ксилоглюкана можно присоединять к двум соседним целлюлозным микрофибриллам, сами микрофибриллы могут ковалентно соединяться через промежуточный XyG (фиг. 4). Ковалентно связанная целлюлозная сеть может быть крепче, чем сеть на основе водородных связей.

Пример 3. Отслеживание и секвенирование генов, кодирующих белки HTG с активностью СХЕ.

РНК получали из зрелого побега Е. fluviatile с использованием реагента тризол (Invitrogen). С помощью набора для синтеза кДНК Evrogen Mint-Universal получали кДНК, нормировали ее с использованием набора Evrogen Trimmer kit и секвенировали с использованием технологии секвенирования 454. Исходные данные собирали в контиги и изотиги с использованием Newbler assembler версии 2.5, запатентованного Roche.

Для идентификации белков, имеющих активность СХЕ в Equisetum, использовали следующие подходы.

HTG выделяли из неочищенного экстракта Е. fluviatile с помощью четырех последовательных способов: дифференциального осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрационной хроматографии, аффинной хроматографии с лектинами и изоэлектрофокусирования. Полученный образец разделяли с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, из которого вырезали одну преобладающую полосу, соответствующую ~30 кДа. Образец расщепляли трипсином и анализировали с помощью MALDI-ToF и LC-MS.

Для идентификации генов-мишеней транскриптом Equisetum подвергали трансляции и предполагаемые белки подвергали расщеплению трипсином in si1ico. Из фракции ~30 кДа, полученной из частично очищенной фракции IEF, два изотига, имевших наибольшие баллы, являлись частичными последовательностями генов белков, гомологичных ХТН. Полноразмерную последовательность двух геновкандидатов идентифицировали с использованием результатов 5'- и 3'-RACE, показавших, что они являлись двумя частями одного и того же полноразмерного гена. Белок имел прогнозируемую pI 4,66 и прогнозируемую массу 29,5 кДа. Кодирующая последовательность представлена в SEQ ID NO: 1, a последо

- 21 036403 вательность кодируемого белка - в SEQ ID NO: 2. Прогнозировали, что аминокислоты 1-21 SEQ ID NO: 2 соответствуют сигнальному пептиду, а аминокислоты 22-280 соответствуют зрелому белку, и, таким образом, нуклеотиды 1-63 SEQ ID NO: 1 кодируют сигнальный пептид, а нуклеотиды 64-840 кодируют зрелый белок.

Последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 использовали для поиска в общедоступной базе данных последовательностей. Обнаруживали два гомологичных гена, один из Equisetum hyemale (SEQ ID NO: 5 для кодирующей последовательности, имеющей 83% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, и SEQ ID NO: 6 для кодируемого белка, имеющего 75% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2), и один из Equisetum diffusum (SEQ ID NO: 7 для кодирующей последовательности, имеющей 94% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, и SEQ ID NO: 8 для кодируемого белка, имеющего 91% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2). Выравнивание нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей белков HTG Equisteum представлено на фиг. 8. Прогнозировали, что аминокислоты 1-25 SEQ ID NO: 6 соответствуют сигнальному пептиду, а аминокислоты 26283 - зрелому белку, и что аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 8 соответствуют сигнальному пептиду, а аминокислоты 29-287 - зрелому белку. Таким образом, нуклеотиды 1-75 SEQ ID NO: 5 кодируют сигнальный пептид, а нуклеотиды 76-849 SEQ ID NO: 5 кодируют зрелый белок, и нуклеотиды 1-84 SEQ ID NO: 7 кодируют сигнальный пептид, а нуклеотиды 85-8 61 SEQ ID NO: 7 кодируют зрелый белок. Прогнозируемый зрелый белок, т.е. аминокислоты 26-283, SEQ ID NO: 6, имеет 79% идентичности последовательности по отношению к прогнозируемому зрелому белку, т.е. аминокислотам 22-280, SEQ ID NO: 2, в то время как прогнозируемый зрелый белок, т.е. аминокислоты 29-287, SEQ ID NO: 8 имеет 94% идентичности последовательности по отношению к зрелому белку, т.е. аминокислотам 22-280, SEQ ID NO: 2.

Пример 4. Активность МХЕ, ХЕТ и СХЕ рекомбинантного HTG, экспрессирующегося в Pichia.

Зрелый белок HTG Equisetum fluviatile (аминокислоты 22-280 SEQ ID NO: 2) экспрессировался с вектора pPICZaA после инсерции посредством трансформации в Pichia pastoris (SMD1168H) в виде слитого белка с сигнальной последовательностью α-фактора на N-конце и эпитопом c-myc и полигистидиновой меткой на С-конце. Кодирующая последовательность экспрессируемого слитого белка представлена в SEQ ID NO: 3, а кодируемый белок - в SEQ ID NO: 4. В SEQ ID NO: 4 аминокислоты 1-89 соответствуют сигнальной последовательности α-фактора, аминокислоты 92-350 соответствуют зрелому белку HTG, аминокислоты 353-362 - эпитопу c-myc, а аминокислоты 368-373 - полигистидиновой метке.

Трансформированные клетки Pichia, экспрессирующие слитый белок HTG, выращивали в жидкой среде для выращивания (90% (об./об.) низкосолевого LB, 1% (мас./об.) глицерина, 0,00004% (мас./об.) биотина, 100 мкг/мл зеоцина). Экспрессию стимулировали посредством центрифугирования и ресуспендирования культуры в среде для экспрессии (идентичной среде для выращивания, но с заменой глицерина 10% (об./об.) метанолом). Через 24 ч среду для культивирования собирали и анализировали на активность эндотрансглюкозилаз.

Анализ ХЕТ и МХЕ.

Активность ХЕТ анализировали с использованием реакционной смеси, состоящей из 10 мкл экстракта секретируемого Pichia фермента, 1 кБк [³H]XXXGol (высушенного для получения нулевого объема) и 10 мкл 1% донорного ксилоглюканового (XyG) полисахарида. Донорный, ферментативный и акцепторный компоненты находились в 50 мМ буфере MES, рН 6,0. Реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 50% (мас./об.) муравьиной кислоты. Каждый образец нагружали на фильтровальную бумагу Whatman 3MM, сушили и затем тщательно промывали проточной водой для удаления непрореагировавшего [³H]XXXGol. Время, затраченное на удаление избытка [³H]XXXGol, определяли посредством анализа квадрата бумаги отрицательного контроля, промываемого в тех же условиях, что и бумагу, содержащую акцепторный олигосахарид, получая уровни радиоактивности, эквивалентные фоновым.

Каждый квадрат бумаги сушили на воздухе, инкубировали со сцинтиллятором (2 мл) и дважды анализировали на радиоактивность в течение 5 мин. Ферментативные контроли включали добавление муравьиной кислоты перед добавлением фермента для получения условий, в которых он не может функционировать.

Анализ активности МХЕ отличался от анализа ХЕТ использованием 1% MLG в качестве донорного полисахарида вместо XyG.

Анализ СХЕ.

Тщательно смешивали 1 кБк высушенного [³H]XXXGol и 33 мкл ферментативного экстракта (в 50 мМ MES; рН 6,0) и добавляли к 10 мг предварительно обработанной сухой бумаги Whatman 1CHR и инкубировали при комнатной температуре в течение до 24 ч. Реакцию останавливали добавлением 300 мкл 10% (мас./об.) муравьиной кислоты перед повторной промывкой в течение 8-16 ч для удаления непрореагировавшего [³H]XXXGol. После последней промывки и удаления избытка воды целлюлозу собирали в 400 мкл воды с 4 мл смешиваемого с водой сцинтиллятора и переносили в сцинтилляционный флакон

- 22 036403 перед анализом на радиоактивность.

Результаты.

Активности ХЕТ, МХЕ и СХЕ 10 мкл раствора рекомбинантно экспрессируемого белка после инкубации в течение 1 и 3 ч представлены в табл. 4.

Таблица 4

Активность ХЕТ (в качестве донора использовали ксилоглюкан (Тх) тамаринда), МХЕ (в качестве донора использовали MLG) и СХЕ (в качестве донора использовали целлюлозу) рекомбинантно экспрессируемого белка HTG

Активность	Время инкубации	Акцептор	Фермент	Донор	Импульсы /мин (i)	Импуль сы /мин (ϋ)	Импуль сы/мин (av)
Контроль	1 ч.	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	12, 60	11,00	11,80
ХЕТ	1 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Тх	1592,00	1594,60	1593,30
МХЕ	1 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	MLG	2143,01	2097,21	2120,11
Контроль	1 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Контроль	20,40	25, 60	23, 00
Контроль	3 ч.	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	12, 60	11,00	11,80
ХЕТ	3 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Тх	2267,63	2256, 43	2262,03
МХЕ	3 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	MLG	3141,65	3100,45	3121,05
Контроль	3 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Контроль	14,00	14,00	14,00
Контроль	1 ч.	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	3, 51	2, 91	3, 21
СХЕ	1 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Целлюлоза	226, 85	233,70	230,27
Контроль	3 ч.	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	Отрицательный контроль	3, 51	2, 91	3, 21
СХЕ	3 ч.	[³H]XXXGol	HTG Pichia	Целлюлоза	549, 28	559,70	554,49

Для определения исходных степеней активности МХЕ, ХЕТ и СХЕ белка HTG, экспрессируемого в Pichia, осуществляли анализ МХЕ, ХЕТ и СХЕ в течение 16 ч и измеряли активность в несколько моментов времени.

Результаты по временной шкале представлены на фиг. 6. Исходные степени определяли по временной шкале, и они представлены в табл. 5.

Таблица 5

Исходные степени активностей ХЕТ, МХЕ и СХЕ белка HTG, экспрессируемого в Pichia

ХЕТ	43 импульсов/мин/мин
МХЕ	112 импульсов/мин/мин
СХЕ	11,7 импульсов/мин/мин

В табл. 4 и 5 и на фиг. 6 показано, что рекомбинантно экспрессируемый белок HTG Equisetum имеет активность МХЕ и ХЕТ, а также значительную активность СХЕ.

Активности СХЕ, МХЕ и ХЕТ белка HTG, экспрессируемого в Pichia, также тестировали в присутствии BSA в реакционной смеси.

В кратком изложении, куски бумаги Whatman № 1 (каждый 2,0x1,15 см) предварительно обрабатывали 6 М NaOH (содержащем 1% мас./об. NaBH₄) при комнатной температуре в течение ночи, затем промывали проточной водопроводной водой, затем 1% уксусной кислотой и деионизированной водой и, в конце, сушили.

Смесь субстратов содержала (конечные концентрации):

[³H]XXXGol 50 кБк/мл (специфическая активность 900 МБк/мкмоль), мМ цитрат (Na⁺), pH 6,3,

32,4% (об./об.) использованной среды из экспрессирующей HTG линии Pichia, или 0,11% мас./об. BSA и донорный субстрат-полисахарид, как подробно описано ниже.

Для анализа СХЕ 20 мкл (=1,00 кБк) смеси (без добавления полисахарида) наносили на высушенную бумагу (средняя масса сухого вещества бумаги=18,6 мг), сосуд плотно закрывали и осуществляли инкубацию при 20°С. В желаемые моменты времени реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты до 20% об./об. Затем куски бумаги промывали проточной водопроводной водой, сушили и анализировали на включенную радиоактивность посредством сцинтилляционных измерений.

Для анализов МХЕ или ХЕТ 20 мкл (=1,00 кБк) реакционной смеси, дополненной 0,5% (мас./об.; конечная концентрация) β-глюкана ячменя со смешанными связями или ксилоглюкана тамаринда соответственно, инкубировали в виде свободного раствора при 20°С. Через интервалы реакцию останавливали добавлением NaOH до 0,1 М. Позднее смеси немного подкисляли уксусной кислотой и сушили на фильтровальной бумаге Whatman № 3; затем бумагу промывали в течение ночи в проточной водопроводной воде, сушили и анализировали на радиоактивность посредством сцинтилляционных измерений.

- 23 036403

Графики зависимости от времени представлены на фиг. 9, и скорости реакций представлены в табл. 6 (вычисленные как импульсы/мин ³Н, включенного в полисахарид, на кБк восполненного акцепторного субстрата, на 1 ч инкубации).

BSA сильно стимулировал реакцию СХЕ, вероятно, противодействуя необратимому связыванию белка HTG с поверхностью бумаги; BSA имел относительно небольшой эффект в отношении скоростей МХЕ и ХЕТ.

Согласно данным +BSA, скорости находились в соотношении МХЕ:СХЕ:ХЕТ=100:38,4:38,2.

Согласно данным -BSA, скорости находились в соотношении МХЕ:СХЕ:ХЕТ=100:2,3:39, 1.

Таким образом, HTG является высокоактивным СХЕ-ферментом.

Таблица 6

Средние скорости реакций для трех ферментативных активностей HTG, экспрессируемого Pichia, в условиях, сделанных настолько прямо сопоставимыми, насколько это осуществимо

Параметр	СХЕ -BSA	СХЕ +BSA	МХЕ -BSA	МХЕ + BSA	ХЕТ -BSA	ХЕТ +BSA
Средняя скорость (импульсов/ мин/кБк/ч.)	0, 88	17, 20	38, 65	44,85	15, 11	17, 14
Скорость (%) относительно МХЕ + BSA	1,96	38, 36	86, 17	100,00	33, 69	38, 21
Скорость (%) относительно МХЕ - BSA	2, 27	44,51	100,00	116, 05	39, 10	44,35

Специфичность рекомбинантного HTG в отношении акцепторного субстрата.

Специфичность рекомбинантного HTG в отношении акцепторного субстрата тестировали в анализах (в отсутствие BSA) с использованием глюкана со смешанными связями из ячменя (BMLG) в качестве донора. Используемым ферментом являлся рекомбинантный фермент HTG, очищенный посредством аффинной хроматографии с использованием полигистидиновой метки. Все точки данных являются скорректированными средними значениями для трех независимых реакций.

Для акцепторных субстратов, демонстрирующих относительно низкую аффинность к бумаге, использовали общепринятый способ промывки бумаги (проточной водопроводной водой, в течение ночи). Для акцепторов, проявляющих высокую аффинность к бумаге (а именно целлогексита, манногексита, ксилогексита и олигосахаридов MLG), использовали стекловолоконный, в котором продукты реакции сушили на предварительно термически обработанной стекловолоконной бумаге Whatman GF/A, а затем промывали в 75% этаноле.

Результаты представлены на фиг. 7. Единственными акцепторными субстратами, которые рекомбинантный HTG был способен соединять до какой-либо значительной степени, являлись ксилоглюкановые олигосахариды. В следующем эксперименте специфичность в отношении акцепторного субстрата определяли для глюкана со смешанными связями и ксилоглюкана в качестве донора. Результаты представлены на фиг. 12. Наблюдали, что негликозилированные XGO являлись предпочтительными. Тот факт, что белок HTG использовал GXXGol также хорошо или лучше, чем XXXGol, отличает его от общепринятых ХЕТ, для которых необходимо ксилозилирование в положении заместителя +1; наоборот, в этом случае HTG, по-видимому, предпочтительно использует негликозилированные остатки Glc. Однако, несмотря на это предпочтение в отношении отсутствия ксилозилирования в положении +1, полная неспособность использовать GGXXXGol свидетельствует о том, что ксилозилирование в положении +2 является необходимым для активности белка HTG. Эта необходимость ксилозилирования в положении +2 соответствует неспособности белка использовать родственные нексилозилированные олигосахариды, такие как целлогексит и различные олигосахариды MLG.

Учитывая, что результаты, касающиеся специфичности в отношении донорного субстрата, свидетельствуют о том, что белок HTG предпочтительно использует MLG в качестве донорного субстрата относительно ксилоглюкана, эти результаты подтверждают, что он является преобладающей гетеротрансглюканазой. Хотя он способен катализировать активность ХЕТ (ксилоглюкан-ксилоглюкановую; фиг. 6), по-видимому, он полностью неспособен катализировать эндотрансгликозилирование MLG-MLG, как показано на фиг. 7 по его неспособности использовать олигосахариды MLG.

Вероятно, белок HTG имеет схожую специфичность в отношении акцепторного субстрата при использовании целлюлозы в качестве донора.

Это делает HTG первым растительным ферментом, преимущественной реакцией которого является гетеро-эндотрансгликозилирование, и первой эндотрансгликозилазой, предпочтительно использующей

- 24 036403

MLG в качестве субстрата.

Специфичность в отношении акцепторного субстрата также тестировали для различных донорных субстратов, обработанной щелочью бумаги, глюкана со смешанными связями и ксилоглюкана. Наблюдали, что XXXGol являлся сильным акцептором при использовании обработанной щелочью бумаги и глюкана со смешанными связями в качестве донора, но трансгликозилирование при использовании GGGGol являлось гораздо менее эффективным (см. фиг. 11).

Субстратная специфичность рекомбинантного HTG в отношении различных целлюлозных субстратов.

Катализируемое HTG трансгликозилирование с использованием [³H]XXXGo1 в качестве акцепторного субстрата и различных донорных субстратов тестировали в присутствии и отсутствие BSA и с использованием глюкана со смешанными связями в качестве контроля (см. фиг. 10). Наблюдали, что в оптимизированных условиях HTG имел соотношение активности ХЕТ:МХЕ ~1:7. Также наблюдали, что водорастворимый ацетат целлюлозы являлся лишь слабым донором, но HTG имел исключительную активность СХЕ в отношении (нерастворимой) целлюлозы. Более 94% радиоактивного продукта СХЕ не подвергалось солюбилизации в 6 М NaOH при 37°С (данные не представлены), что свидетельствует об устойчивой целостности волокон. BSA сильно стимулирует реакцию СХЕ на обработанной щелочью бумаге и на немелованной бумаге.

Аффинность рекомбинантного HTG к XXXGol.

Аффинность рекомбинантного HTG к XXXGol определяли по скорости реакции (фмоль/ч) с глюканом со смешанными связями и ксилоглюканом в качестве донора при разных концентрациях XXXGol. Обнаруживали, что KM для XXXGol с глюканом со смешанными связями в качестве донорного субстрата составляла 0,52±0,06 мкМ, и KM для XXXGol с ксилоглюканом в качестве донорного субстрата составляла 3,4±0,4 мкМ. Это свидетельствует о том, что HTG имеет гораздо более высокую аффинность к XXXGol, чем ХТН (Km ~50-200 мкМ).

Аффинность рекомбинантного HTG к растворимым донорным полисахаридам определяли посредством измерения степени включения ³Н при разных концентрациях полисахаридов. Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7

Значения Vmax и KM рекомбинантного HTG для различных растворимых донорных полисахаридов

Донорный полисахарид	Vmax (Бк/кБк/ч.)	Км (мг/мл)

Ксило глюкан	0, 62610, 057	0, 22610, 077
Глюкан со смешанными связями из ячменя	7, 5910, 60	1,2510, 32
Водорастворимый ацетат целлюлозы	0, 2910, 03	1,6510,60
Глюкан со смешанными связями из исландского мха	0,09810,014	3,0511,15

В табл. 7 показано, что HTG имеет более низкую аффинность к MLG ячменя, чем к ксилоглюкану. MLG из исландского мха, в основном содержащий повторяющиеся целлотриозиловые звенья, являлся плохим донорным субстратом. Таким образом, HTG, вероятно, распознает повторяющиеся целлотриозиловые звенья, встречающиеся в MLG ячменя и преобладающие в MLG Equisetum.

Пример 5. Трансформация растений с использованием HTG.

Конструировали вектор Т-ДНК, кодирующий слитый белок из 27 аминокислот сигнальной последовательности гена альфа-амилазы 3 риса (Sutcliff et al., 1991, Plant Mol Biol 16:579) и аминокислот 22280 SEQ ID NO: 2 под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты.

Растения пшеницы трансформировали с использованием вектора Т-ДНК, кодирующего слитый белок HTG. Наблюдали, что трансформированные растения пшеницы имели повышенную прочность стеблей, приводящую к улучшенной устойчивости к полеганию стеблей, и повышенную устойчивость к патогенам.

Ссылки.

Abdel-Massih RM, Baydoun ЕА, Brett СТ (2003) . In vitro biosynthesis of 1,4-beta-galactan attached to a pectinxyloglucan complex in pea. Blanta 216(3), 275-286.

Ait-Mohand F, Farkas V (2006) Screening for hetero- 25 036403 transglycosylating activities in extracts from nasturtium (Tropaeolum majus). Carbohydrate Research 341: 577-581.

An YQ, Huang S, McDowell JM, McKinney EC, Meagher RB (1996). Conserved expression of the Arabidopsis ACT1 and ACT 3 actin subclass in organ primordia and mature pollen. Plant Cell 8: 1530.

Bacic, A., Harris, P. J., and Stone, B. A. (1988) in The Biochemistry of Plants (Priess J., ed) pp. 297-371, Academic Press, New York.

Barry, G., Kishore, G., Padgette, S. et al. Inhibitors of amino acid biosynthesis: strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. Curr Topics Plant Physiol 7:139-145 (1992).

Baumann MJ, Eklbf JM, Michel G, Kallas AM, Teeri TT, Czjzek M, Brumer H 3rd. (2007). Structural evidence for the evolution of xyloglucanase activity from xyloglucan endotransglycosylases: biological implications for cell wall metabolism. Plant Cell. 2007 Jun;19(6):1947-63.

Benfey PN, Ren L, Chua NH. (1989) . The CaMV 35S enhancer contains at least two domains which can confer different developmental and tissue-specific expression patterns. EMBO J. 8:2195-2202.

Chaboute et al., 1987. Polyadenylation of histone H3 and H4 mRNAs in dicotyledonous plants. Gene, Volume 71, Issue 1, 15, pp 217-223.

Cocuron, J.C., Lerouxel, 0., Drakakaki, G., Alonso, A.P., Liepman, A.H., Keegstra, K. , Raikhel, N. and Wilkerson, C.G. (2007) A gene from the cellulose synthase-like C family encodes a b-1,4 glucan synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 85508555.

Comai L, Sen LC, Stalker DM. (1983) . An Altered aroA Gene Product Confers Resistance to the Herbicide Glyphosate. Science 221, 370-371.

Cornelissen BJ, Hooft van Huijsduijnen RA, Van Loon LC, Bol JF. (1986). Molecular characterization of messenger RNAs for 'pathogenesis related' proteins la, lb and 1c, induced by TMV

- 26 036403 infection of tobacco. EMBO J 5:37-40.

Cornelissen M. and Vandewiele M. (1989). Nucleic Acids Research, 17, 19-25.

Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC (1993). Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Biotechnology (N Y) 11(8):905-10.

Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH (1998) Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813.

Cumming CM, Rizkallah HD, McKendrick KA, Abdel-Massih RM, Baydoun EA, Brett CT. (2005). Biosynthesis and cell-wall deposition of a pectin-xyloglucan complex in pea.Planta 222, 546-555.

Datla R, Anderson J W, Selvaraj G (1997). Plant promoters for transgene expression. Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296.

Falk A, Price NJ, Raikhel NV, Keegstra K. (2002). An Arabidopsis gene encoding an alpha-xylosyltransferase involved in xyloglucan biosynthesis. PNAS 99(11): 7797-7802.

Frankova L and Fry SC (2013) Darwin Review: Biochemistry and physiological roles of enzymes that 'cut and paste' plant cellwall polysaccharides. J Exp Bot 64: 3519-3550.

Fry SC, Smith RC, Renwick KF, Martin DJ, Hodge SK, Matthews KJ (1992) Xyloglucan Endotransglycosylase, A New Wall-Loosening Enzyme-Activity from Plants. Biochemical Journal 282: 821-828.

Fry SC, Mohler KE, Nesselrode BHWA, Frankova L (2008 a) Mixed-linkage beta-glucan : xyloglucan endotransglucosylase, a novel wall-remodelling enzyme from Equisetum (horsetails) and charophytic algae. Plant Journal 55: 240-252.

Fry SC, York WS, Albersheim P, Darvill A, Hayashi T, Joseleau J-P, Kato Y, Perez Lorences E, Maclachlan GA, McNeil M, Mort AJ, Reid JSG, Seitz HU, Selvendran RR, Voragen AGJ, White AR (1993) An unambiguous nomenclature for xyloglucan-derived oligosaccharides. Physiologia Plantarum 89: 1-3.

Gasser, C.S., J.A. Winter, C.M. Hironaka, D.M. Shah (1988). Structure, expression, and evolution of the 5- 27 036403 enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes of petunia and tomato. J. Biol. Chem. 263: 4280-4289.

Gritch et al (2006). PNAS 103(40), 14701-14706.

Gurjanov OP, Ibragimova NN, Gnezdilov 01, Gorshkova TA (2008) Polysaccharides, tightly bound to cellulose in cell wall of flax bast fibre: Isolation and identification. Carbohydrate Polymers 72: 719-729.

Harpster et al., 1988, Mol Gen Genet. 212(1):182-90.

Holtorf S, Apel K, Bohlmann H. (1995). Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 29:637-649.

Hou et al., 2008, Chinese Science Bulletin 53, pp 2639-2645.

Hrmova, M., Farkas, V., Lahnstein, J., Fincher, G. B. (2007). A Barley Xyloglucan Xyloglucosyl Transferase Covalently Links Xyloglucan, Cellulosic Substrates, and (1,3;1,4)-β-DGlucans. JBC 282 (17); pp. 12951-62.

Keller B, Sauer N, Lamb CJ (1988) . Glycine-rich cell wall proteins in bean: gene structure and association of the protein with the vascular system. EMBO J. 7(12): 3625-3633.

Keller B, Lamb CJ. (1989) . Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Dev. 3: 1639-1646.

Lindbo (2007). Plant Physiology 145, 1232-1240.

Logan, Edwards and Saunders (Editors; Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Caister Academic Press 2009, ISBN: 978-1-904455-39-4.

Maris A, Kaewthai N, Eklof JM, Miller JG, Brumer H, Fry SC, Verbelen JP, Vissenberg К (2011) Differences in enzymic properties of five recombinant xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) proteins of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany 62: 261-271.

Moellenbeck DJ, Peters ML, Bing JW, Rouse JR, Higgins LS, Sims L, Nevshemal T, Marshall L, Ellis RT, Bystrak PG, Lang BA, Stewart JL, Kouba K, Sondag V, Gustafson V, Nour K, Xu D,

- 28 036403

Swenson J, Zhang J, Czapla T, Schwab G, Jayne S, Stockhoff BA, Narva K, Schnepf HE, Stelman SJ, Poutre C, Koziel M, Duck N.

(2001). Insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis protect corn from corn rootworms. Nat. Biotechnol. 19: 668-72.

Moreira A (2004) Genetic Algorithms for the imitation of genomic styles in protein backtranslation. Theor Comput Sci 332: 297-312.

Moreira LRS, Filho EXF (2008) An overview of mannan structure and mannan-degrading enzyme systems. Applied Microbiology and Biotechnology 79: 165-178.

Needleman and Wunsch (1970). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 48, p.443-453.

Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 6,-313(6005):810-2.

Pearson and Lipman (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci 85, p.2444-48.

Peleman J, Saito K, Cottyn B, Engler G, Seurinck J, Van Montagu M, Inze D (1989). Structure and expression analyses of the S-adenosylmethionine synthetase gene family in Arabidopsis thaliana. Gene 84: 359-369.

Pu L, Li Q, Fan X, Yang W, Xue Y (2008). The R2R3 MYB transcription factor GhMYB109 is required for cotton fiber development. Genetics 180, pp 811-820.

Rose JKC, Bennett AB (1999) Cooperative disassembly of the cellulose-xyloglucan network of plant cell walls: parallels between cell expansion and fruit ripening. Trends in Plant Science 4: 176-183.

Sambrook, J.F., Russell, D.W. and Irwin, N. (2000). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition Volumes 1 , 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Samac DA, Tesfaye M, Dornbusch M, Saruul P, Temple SJ (2004). A comparison of constitutive promoters for expression of transgenes in alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Res. 13(4):349-61).

- 29 036403

Sanger M, Daubert S, Goodman RM (1990). Characteristics of a strong promoter from figwort mosaic virus: comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic virus and the regulated mannopine synthase promoter. Plant Mol Biol. 14(3):433-43).

Schnepf HE, Lee S, Dojillo J, Burmeister P, Pencil K, Morera L, Nygaard L, Narva KE, Wolt JD. (2006) . Characterization of Cry34/Cry35 Binary Insecticidal Proteins from Diverse Bacillus thuringiensis Strain Collections. Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774.

Schramm, G, Bruchhaus, I and Roeder, T (2000). A simple and reliable 5'-RACE approach. Nucleic Acids Research 28: e96.

Shah, DM, Horsch, RB, Klee, HJ, Kishore, GM, Winter, JA, Turner, NE, Hironka, CM, Sanders, PR, Gasser, CS, Aykent, S, Siegel, NR, Rogers, SG and Fraley, RT (1986). Engineering Herbicide Tolerance in Transgenic Plants. Science 233, 478-481.

Somerville C, Bauer S, Brininstool G, Facette M, Hamann T, Milne J, Osborne E, Paredez A, Persson S, Raab T, Vorwerk S, Youngs H (2004) Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science 306: 2206-2211.

Sorensen I, Pettolino FA, Wilson SM, Doblin MS, Johansen B, Bacic A, Willats WGT (2008) Mixed-linkage (1^3), (1^ 4)-betaD-glucan is not unique to the poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant Journal 54: 510-521.

Thompson, JE and Fry, SC (2000) . Evidence for covalent linkage between xyloglucan and acidic pectins in suspensioncultured rose cells. Planta 211, 275-286.

Tranel PJ, Wright TR (2002) Resistance of weeds to ALSinhibiting herbicides: what have we learned? Weed Sci 50:700712.

Wagner et al (2004). Methods 32, 227-234.

Waterman, M. S. (1995). Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London.

Zanoni I, Ostuni R, Capuano G, Collini M, Caccia M, Ronchi AE, Rocchetti M, Mingozzi F, Foti M, Chirico G, Costa B, Zaza A, Ricciardi-Castagnoli P, Granucci F. (2009). CD14 regulates the dendritic cell life cycle after LPS exposure through NFAT activation. Nature 460, p:264-268, see also Nature Protocols: mRNA expression analysis by Real-Time PCR; ISSN: 1754-2189.

- 30 036403

Список последовательностей < 110> Bayer CropScience NV

The University Court of the University of Edinburgh Meulewaeter, Frank Brande, Ilse Van den Fry, Stephen C Mohler, Kyle E Frankova, Lenka Simmons, Tom J Holland, Claire Hudson, Andrew < 120> БЕЛОК С АКТИВНОСТЬЮ ЦЕЛЛЮЛОЗАЖСИЛО ГЛЮКАН ЭНДОТРАНСГЛЮКОЗИЛАЗЫ (СХЕ) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ < 130> BCS13-2019 < 160> 8 < 170> Patentin version 3.5 < 210> 1 < 211> 843 < 212> ДНК <213> Equ i setum fluviatile <220>

<221> CDS <222> (1)..(843) <220>

<221 > сигнальный пептид <222> (1)..(63) <400> 1

atg ctg ggt ctg

gtg Vai 5

ttt gga atg ttg gtg

ate atg ctg geg

tct Ser 15

cca Pro

48

Met Leu 1

Gly Leu

Phe Gly Met

Leu Vai 10

lie Met

Leu

Ala

aaa

tta

gca

atg

gca

ggt

ttc

tat

ggg

gac

ttt

cag

gta

gaa

ecg

gtt

96

Lys

Leu

Ala

Met 20

Ala

Gly

Phe

Tyr

Gly Asp 25

Phe

Gin

Vai

Glu 30

Pro

Vai

ccc

gac

cac

gtg

ata

ate

caa

age

gat

age

etc

caa

etc

acc

atg

144

Pro

Asp

His 35

Vai

He

Gin

Ser 40

Asp

Ser

Leu

Gin 45

Leu

Thr

Met

gat

aag

aac

tct

ggt

ggc

tea

gtt

gtc

tec

aaa

agt

aat

tat

ctg

ttt

192

Asp

Lys 50

Asn

Ser

Gly

Ser 55

Vai

Ser

Lys

Ser 60

Asn

Tyr

Leu

Phe

- 31 036403 ggc tac ttc aac atg aag atg aag etc ata tea gga aac tot gca ggg240

Gly Tyr Phe Asn Met Lys Met Lys Leu lie Ser Gly Asn Ser AlaGly

70 7580 аса gta асе аса ttc tat ate ttc tet gat gaa gca aac cac gat gag288

Thr Vai Thr Thr Phe Tyr lie Phe Ser Asp Glu Ala Asn His AspGlu

9095 ata gac ttt gag ttc ett ggc aac tat tea ggg gat cct tat ett ttg336 lie Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Tyr Ser Gly Asp Pro Tyr LeuLeu

100 105110 cat act aat att ttt gca agt ggt gtt gga aat aga gaa caa caa ttt384

His Thr Asn lie Phe Ala Ser Gly Vai Gly Asn Arg Glu Gin GinPhe

115 120125 ttt etg tgg ttt gac cct аса get gac ttc cat gat tat аса ata att432

Phe Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ala Asp Phe His Asp Tyr Thr lielie

130 135140 tgg aac cct caa caa ata ttg ttt ett gtt gat gga agg get gtt aga480

Trp Asn Pro Gin Gin lie Leu Phe Leu Vai Asp Gly Arg Ala VaiArg

145 150 155160

tet

ttt

ecg

aat

gag

get

ata

ggt

gtc

cct

tac

tta

aaa

agt

caa

528

Ser

Phe

Pro

Asn

Glu

Ala

He

Gly

Vai

Pro

Tyr

Leu

Lys

Ser

Gin

165

170

175

tgg

atg

aat

gta

cat

tta

agt

ett

tgg

aat

ggc

gag

act

tgg

gec

аса

576

Trp

Met

Asn

Vai

His

Leu

Ser

Leu

Trp

Asn

Gly

Glu

Thr

Trp

Ala

Thr

180 185 190 eta gga ggg ttg aga agg ata gat tgg aat tea gee cct ttt gta get624

Leu Gly Gly Leu Arg Arg lie Asp Trp Asn Ser Ala Pro Phe Vai Ala

195 200205

tcc tat tet act ttt	gta gga gac tea tgc ttc gat age gca gat tcc	672
Ser Tyr Ser 210	Thr Phe	Vai Gly Asp 215	Ser	Cys	Phe	Asp 220	Ser Ala Asp Ser
ccg tgc atg	gcc tea	aaa tgg tgg	aac	caa	get	gca	tat caa tet tta	720
Pro Cys Met 225	Ala Ser	Lys Trp Trp 230	Asn	Gin	Ala 235	Ala	Tyr Gin Ser Leu 240

- 32 036403

Arg Glu Cys Ser Asn Arg Gly Phe

275 280 <210> 2 <211> 280 < 212> Белок < 213> Equisetum fIuviatiIe < 400> 2

Met Leu Gly Leu Vai Phe Gly Met 1 5

Leu Vai He Met Leu Ala Ser Pro

15

Lys Leu Ala Met Ala Gly Phe Tyr 20

Gly Asp Phe Gin Vai Glu Pro Vai

30

Pro Asp His Vai lie lie Gin Ser

40

Asp Ser Leu Leu Gin Leu Thr Met 45

Asp Lys Asn Ser Gly Gly Ser Vai

55

Vai Ser Lys Ser Asn Tyr Leu Phe 60

Gly Tyr Phe Asn Met Lys Met Lys

70

Leu He Ser Gly Asn Ser Ala Gly

80

Thr Vai Thr Thr Phe Tyr He Phe

Ser Asp Glu Ala Asn His Asp Glu

95 lie Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn

100

Tyr Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Leu

105 110

His Thr Asn lie Phe Ala Ser Gly

115 120

Vai Gly Asn Arg Glu Gin Gin Phe

125

Phe Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ala

130 135

Asp Phe His Asp Tyr Thr He He

140

Trp Asn Pro Gin Gin He Leu Phe

145 150

Leu Vai Asp Gly Arg Ala Vai Arg

155 160

Ser Phe Pro Asn Asn Glu Ala He

165

Gly Vai Pro Tyr Leu Lys Ser Gin

170 175

- 33 036403

Trp Met Asn Vai His Leu Ser Leu Trp Asn Gly Glu Thr Trp Ala Thr

180 185190

Leu Gly Gly Leu Arg Arg He Asp Trp Asn Ser Ala Pro Phe Vai Ala

195 200205

Ser Tyr Ser Thr Phe Vai Gly Asp Ser Cys Phe Asp Ser Ala Asp Ser

210 215220

Pro Cys Met Ala Ser Lys Trp Trp Asn Gin Ala Ala Tyr Gin Ser Leu

225 230 235240

Ser Thr Ser Asp Ala Ser Ser He Gin Trp Vai Arg Glu Asn Tyr Leu

245 250255

Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr Lys Leu Tyr Pro Asn Gly Phe Pro

260 265270

Arg Glu Cys Ser Asn Arg Gly Phe

275280 <210> 3 <211> 1122 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> кодирующая последовательность слитого белка СХЕ для экспрессии в Pichia <220>

<221> CDS <222> (1)..(1122) <220>

<221 > сигнальная последовательность альфафактора <222> (1)..(267) <220>

<221> HTG <222> (274)..(1050)

- 34 036403 <220>

<221 > эпитоп c-myc <222> (1057)..(1086) <220>

<221 > <222>

поли (1102)..

ГИСТ (1119)

и Д

И H

о в а я

m e

T к

a

<400> : atg aga

3 ttt

cct

tea

att

ttt

act

get

gtt

tta

ttc

gca

tcc

48

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

He

Phe

Thr

Ala

Vai

Leu

Phe

Ala

Ser

1 gca

tta

get

5 cca

gtc

aac

act

аса

10 аса

gaa

gat

gaa

acg

15 gca

caa

96

Ala

Leu

Ala

Pro

Vai

Asn

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

att

cog

get

20 gaa

get

gtc

ate

ggt

25 tac

tea

gat

tta

gaa

30 ggg

gat

ttc

144

He

Pro

Ala

Glu

Ala

Vai

He

Gly Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

gat

gtt

35 get

gtt

ttg

cca

ttt

40 tcc

aac

age

аса

aat

45 aac

ggg

tta

ttg

192

Asp

Vai

Ala

Vai

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Gly

Leu

ttt

50 ata

aat

act

att

55 gee

age

att

get

60 aaa

gaa

ggg

gta

240

Phe

He

Asn

Thr

He

Ala

Ser

He

Ala

Lys

Glu

Gly

Vai

65 tct

etc

gag

aaa

aga

70 gag

get

gaa

get

gaa

75 ttc

ggt

ttc

tat

ggg

80 gac

288

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Phe

Gly

Phe

Tyr

Gly Asp

ttt

cag

gta

gaa

85 ecg

gtt

ccc

gac

cac

90 gtg

ata

ate

caa

age

95 gat

age

336

Phe

Gin

Vai

Glu

Pro

Vai

Pro

Asp

His

Vai

He

Gin

Ser

Asp

Ser

etc

caa

100 etc

acc

atg

gat

aag

105 aac

tct

ggt

ggc

tea

110 gtt

gtc

tcc

384

Leu

Gin

Leu

Thr

Met

Asp

Lys

Asn

Ser

Gly Gly

Ser

Vai

Ser

aaa

agt

115 aat

tat

etg

ttt

ggc

120 tac

ttc

aac

atg

aag

125 atg

aag

etc

ata

432

Lys

Ser

Asn

Tyr

Leu

Phe

Gly

Tyr

Phe

Asn

Met

Lys

Met

Lys

Leu

He

tea

130 gga

aac

tct

gca

ggg

135 аса

gta

acc

аса

ttc

140 tat

ate

ttc

tct

gat

480

Ser

Gly

Asn

Ser

Ala

Gly

Thr

Vai

Thr

Phe

Tyr

He

Phe

Ser

Asp

145 gaa

gca

aac

cac

gat

150 gag

ata

gac

ttt

gag

155 ttc

ett

ggc

aac

tat

160 tea

528

Glu

Ala

Asn

His

Asp

Glu

He

Asp

Phe

Glu

Phe

Leu

Gly

Asn

Tyr

Ser

165 170 175

- 35 036403 ggg gat cot tat ctt ttg cat act aat att ttt gca agt ggt gtt gga

Gly Asp Pro Tyr Leu Leu His Thr Asn lie Phe Ala Ser Gly Vai Gly

180 185190 aat aga gaa caa caa ttt ttt ctg tgg ttt gac cct аса get gacttc

Asn Arg Glu Gin Gin Phe Phe Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ala AspPhe

195 200205 cat gat tat аса ata att tgg aac cct caa caa ata ttg ttt cttgtt

His Asp Tyr Thr lie lie Trp Asn Pro Gin Gin lie Leu Phe LeuVai

210 215220 gat gga agg get gtt aga tet ttt ccg aat aat gag get ata ggtgtc

Asp Gly Arg Ala Vai Arg Ser Phe Pro Asn Asn Glu Ala lie GlyVai

225 230 235240 cct tac tta aaa agt caa tgg atg aat gta cat tta agt ctt tggaat

Pro Tyr Leu Lys Ser Gin Trp Met Asn Vai His Leu Ser Leu TrpAsn

245 250255 ggc gag act tgg gcc аса eta gga ggg ttg aga agg ata gat tggaat

Gly Glu Thr Trp Ala Thr Leu Gly Gly Leu Arg Arg lie Asp TrpAsn

260 265270 tea gcc cct ttt gta get tec tat tet act ttt gta gga gac teatgc

Ser Ala Pro Phe Vai Ala Ser Tyr Ser Thr Phe Vai Gly Asp SerCys

275 280285 ttc gat age gca gat tcc ccg tgc atg gcc tea aaa tgg tgg aaccaa

Phe Asp Ser Ala Asp Ser Pro Cys Met Ala Ser Lys Trp Trp AsnGin

290 295300 get gca tat caa tet tta age аса agt gat gcc age agt att caatgg

Ala Ala Tyr Gin Ser Leu Ser Thr Ser Asp Ala Ser Ser lie GinTrp

305 310 315320 gtt agg gaa aat tat etc aaa tat gac tat tgt tat gat аса aaaetc

Vai Arg Glu Asn Tyr Leu Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr LysLeu

325 330335 tat ccg aac ggc ttt ccc aga gaa tgc tea aac cgt ggt ttc tateta

Tyr Pro Asn Gly Phe Pro Arg Glu Cys Ser Asn Arg Gly Phe TyrLeu

340 345350 gaa caa aaa etc ate tea gaa gag gat ctg aat age gcc gtc gaccat

Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Vai AspHis

355 360365 cat cat cat cat cattga

His His His HisHis

370

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1122

- 36 036403 <210> 4 <211> 373 <212> Белок <213> искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 4

Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser Ser 15 1015

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

2530 lie Pro Ala Glu Ala Vai lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

4045

Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

5560

Phe lie Asn Thr Thr lie Ala Ser He Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai 65 70 7580

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Gly Phe Tyr Gly Asp 85 9095

Phe Gin Vai Glu Pro Vai Pro Asp His Vai He He Gin Ser Asp Ser

100 105110

Leu Leu Gin Leu Thr Met Asp Lys Asn Ser Gly Gly Ser Vai Vai Ser

115 120125

Lys Ser Asn Tyr Leu Phe Gly Tyr Phe Asn Met Lys Met Lys Leu He

130 135140

Ser Gly Asn Ser Ala Gly Thr Vai Thr Thr Phe Tyr He Phe Ser Asp

145 150 155160

Glu Ala Asn His Asp Glu He Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Tyr Ser

165 170175

- 37 036403

Gly Asp Pro Tyr Leu Leu His Thr Asn lie Phe Ala Ser Gly Vai Gly

180 185190

Asn Arg Glu Gin Gin Phe Phe Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ala Asp Phe

195 200205

His Asp Tyr Thr lie lie Trp Asn Pro Gin Gin lie Leu Phe Leu Vai

210 215220

Asp Gly Arg Ala Vai Arg Ser Phe Pro Asn Asn Glu Ala lie Gly Vai

225 230 235240

Pro Tyr Leu Lys Ser Gin Trp Met Asn Vai His Leu Ser Leu Trp Asn

245 250255

Gly Glu Thr Trp Ala Thr Leu Gly Gly Leu Arg Arg lie Asp Trp Asn

260 265270

Ser Ala Pro Phe Vai Ala Ser Tyr Ser Thr Phe Vai Gly Asp Ser Cys

275 280285

Phe Asp Ser Ala Asp Ser Pro Cys Met Ala Ser Lys Trp Trp Asn Gin

290 295300

Ala Ala Tyr Gin Ser Leu Ser Thr Ser Asp Ala Ser Ser lie Gin Trp

305 310 315320

Vai Arg Glu Asn Tyr Leu Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr Lys Leu

325 330335

Tyr Pro Asn Gly Phe Pro Arg Glu Cys Ser Asn Arg Gly Phe Tyr Leu

340 345350

Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Vai Asp His

355 360365

His His His His His

370

- 38 036403 <210> 5 <211> 852 <212> ДНК <213> Equisetum hyemale <220>

<221 > сигнальный пептид <222> (1)..(75) <220>

<221> CDS <222> (1)..(852) <400> 5

atg Met 1

aag aag aag

att gga

atg gtg Met Vai

etg Leu

ett ttg ggg ett

ttc atg

ate He

48

Lys

He 5

Gly

Leu 10

Leu Gly

Leu

Phe

Met 15

ate

ata

geg

tet

ccc

aaa

gca

gag

gca

aat

ttc

tat

caa

gat

ttc

gtc

96

Не

He

Ala

Ser 20

Pro

Lys

Ala

Glu

Ala 25

Asn

Phe

Tyr

Gin

Asp 30

Phe

Vai

gta

gtt

аса

get

cct

gac

cat

gtc

caa

ate

ett

aat

gat

aac

etc

144

Vai

Thr 35

Ala

Pro

Asp

His

Vai 40

Gin

He

Leu

Asn

Asp 45

Asn

Leu

cag

ett

acc

atg

gat

aag

aat

act

ggt

age

tea

att

age

tcc

acc

agt

192

Gin

Leu 50

Thr

Met

Asp Lys

Asn 55

Thr

Gly

Ser

He 60

Ser

Thr

Ser

aaa

tac

etg

ttt

ggc

tac

ttc

aac

atg

agg

atg

aag

etc

ata

gca

ggc

240

Lys 65

Tyr

Leu

Phe

Gly

Tyr 70

Phe

Asn

Met

Arg

Met 75

Lys

Leu

He Ala

Gly 80

aac

tet

gca

ggg

аса

gtg

acc

ttc

tat

etc

ttc

tec

agt

gaa

ccc

288

Asn

Ser

Ala

Gly

Thr 85

Vai

Thr

Phe

Tyr 90

Leu

Phe

Ser

Glu 95

Pro

aac

cat

gat

gag

eta

gac

ttt

gag

ttc

ett

ggc

aat

ett

tea

ggg

gaa

336

Asn

His

Asp

Glu 100

Leu

Asp

Phe

Glu

Phe 105

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser 110

Gly

Glu

cct

tat

gtt

ttg

cat

аса

aat

gtt

ttt

gca

agt

ggt

gtt

gga

aat

aga

384

Pro

Tyr

Vai 115

Leu

His

Thr

Asn

Vai 120

Phe

Ala

Ser

Gly

Vai 125

Gly Asn

Arg

gaa

caa

ttt

etg tgg

ttt

gac

cct

аса

act

gac

ttc

cac

gac

432

Glu

Gin 130

Gin

Phe

Leu

Trp 135

Phe

Asp

Pro

Thr

Thr 140

Asp

Phe

His

Asp

tat

аса

ata

att

tgg

aac

cct

caa

gta

ttg

ttt

gtt

gat

gga

480

Tyr

Thr

He

Trp

Asn

Pro

Gin

Vai

Leu

Phe

Vai

Asp Gly

145 150 155160 agg act gtt aga tct ttc cca aat aat gag get ata ggt gtc cot tac528

Arg Thr Vai Arg Ser Phe Pro Asn Asn Glu Ala He Gly Vai ProTyr

165 170175 tta aaa agt caa tgg atg aat gta tat gca age ett tgg aat ggt gag576

Leu Lys Ser Gin Trp Met Asn Vai Tyr Ala Ser Leu Trp Asn GlyGlu

180 185190 tct tgg gcc аса eta gga ggg etg ata aag ata gat tgg agt gta tee624

Ser Trp Ala Thr Leu Gly Gly Leu He Lys He Asp Trp Ser VaiSer

195 200205 cct ttt gtg get tec tat get gat ttt gca gca gac tea tgc ttt gat672

Pro Phe Vai Ala Ser Tyr Ala Asp Phe Ala Ala Asp Ser Cys PheAsp

210 215220 agt gca gat tcc tea tgc atg gcc аса aag tgg tgg aac caa cct gca720

Ser Ala Asp Ser Ser Cys Met Ala Thr Lys Trp Trp Asn Gin ProAla

225 230 235240 tat caa ttt tta age аса aat gat gca age agt att caa tgg gtt agg768

Tyr Gin Phe Leu Ser Thr Asn Asp Ala Ser Ser He Gin Trp VaiArg

245 250255 gca aat tat etc aaa tac gac tat tgt tat gat acg gaa etc tat cca816

Ala Asn Tyr Leu Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr Glu Leu TyrPro

260 265270 act cct ccc ate gaa tgt cag aac cgt ggc ttc tag852

Thr Pro Pro He Glu Cys Gin Asn Arg Gly Phe

275280 <210> 6 <211> 283 < 212> Белок < 213> Equisetum hyemale < 400> 6

Met Lys Lys Lys He Gly Met Vai Leu Leu Leu Gly Leu Phe Met He

10 15

He He Ala Ser Pro Lys Ala Glu Ala Asn Phe Tyr Gin Asp Phe Vai

25 30

Gin Leu Thr Met Asp Lys Asn Thr

55

Gly Ser Ser lie Ser Ser Thr Ser 60

Lys Tyr Leu Phe Gly Tyr Phe Asn 65 70

Met Arg Met Lys Leu lie Ala Gly

80

Asn Ser Ala Gly Thr Vai Thr Thr

Phe Tyr Leu Phe Ser Ser Glu Pro

95

Asn His Asp Glu Leu Asp Phe Glu

100

Phe Leu Gly Asn Leu Ser Gly Glu

105 110

Pro Tyr Vai Leu His Thr Asn Vai

115 120

Phe Ala Ser Gly Vai Gly Asn Arg

125

Glu Gin Gin Phe Phe Leu Trp Phe

130 135

Asp Pro Thr Thr Asp Phe His Asp

140

Tyr Thr lie lie Trp Asn Pro Gin

145 150

Gin Vai Leu Phe Vai Vai Asp Gly

155 160

Arg Thr Vai Arg Ser Phe Pro Asn

165

Asn Glu Ala lie Gly Vai Pro Tyr

170 175

Leu Lys Ser Gin Trp Met Asn Vai

180

Tyr Ala Ser Leu Trp Asn Gly Glu

185 190

Ser Trp Ala Thr Leu Gly Gly Leu

195 200

He Lys He Asp Trp Ser Vai Ser

205

Pro Phe Vai Ala Ser Tyr Ala Asp

210 215

Phe Ala Ala Asp Ser Cys Phe Asp

220

Ser Ala Asp Ser Ser Cys Met Ala

225 230

Thr Lys Trp Trp Asn Gin Pro Ala

235 240

Tyr Gin Phe Leu Ser Thr Asn Asp

245

Ala Ser Ser He Gin Trp Vai Arg

250 255

- 41 036403

Ala Asn Туг Leu Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr Glu Leu Tyr Pro

260 265 270

Thr Pro Pro He Glu Cys Gin Asn Arg Gly Phe

275 280 <210> 7 <211> 864 <212> ДНК <213> Equisetum diffusum <220>

<221 > сигнальный пептид <222> (1)..(84) <220>

<221> CDS <222> (1)..(864) <400> 7

atg Met 1

aag aag aag

acc geg teg atg

etg ggt ttg geg ttt ggg

atg Met 15

ttg Leu

48

Lys

Lys Lys

Thr 5

Ala

Ser Met

Leu

Gly 10

Leu

Ala

Phe

Gly

ttg

ate

atg etg

geg

tet

cca

aaa

tta

gca

ata

gca

ggt

ttc

tat

gag

96

Leu

He

Met

Leu 20

Ala

Ser

Pro

Lys

Leu 25

Ala

He

Ala

Gly

Phe 30

Tyr

Glu

gac

ttt

gac

gta

gat

cca

cct

ccc

gac

cac

gtg

ata

ate

caa

agt

gat

144

Asp

Phe

Asp 35

Vai

Asp

Pro

Pro 40

Asp

His

Vai

He

He 45

Gin

Ser

Asp

age

etc

gaa

etc

acc

atg gat

aag

aac

tet

ggt

age

аса

gtt

gtc

192

Ser

Leu 50

Leu

Glu

Leu

Thr

Met 55

Asp

Lys

Asn

Ser

Gly 60

Ser

Thr

Vai

too

ace

cgt

aaa

tat

etg

ttt

ggc

tac

ttc

aac

atg

aag

atg

aag

etc

240

Ser 65

Thr

Arg Lys

Tyr

Leu 70

Phe

Gly

Tyr

Phe

Asn 75

Met

Lys

Met

Lys

Leu 80

ata

tea

ggc

aac

tet

gca

ggg

аса

gta

acc

аса

ttc

tat

ate

ttc

tet

288

He

Ser

Gly

Asn

Ser 85

Ala

Gly

Thr

Vai

Thr 90

Thr

Phe

Tyr

He

Phe 95

Ser

gag

gaa

gca

aac

cac

gat

gag

ata

gac

ttt

gag

ttc

ett

ggc

aac

tat

336

Glu

Ala

Asn 100

His

Asp

Glu

He

Asp 105

Phe

Glu

Phe

Leu

Gly 110

Asn

Tyr

tea

ggg

gat

cct

tat

ett

ttg

cat

act

aat

att

ttt

gca

agt

ggt

gtt

384

Ser

Gly Asp

Pro

Tyr

Leu

His

Thr

Asn

He

Phe

Ala

Ser

Gly

Vai

115 120125 gga aat aga gaa caa caa ttt ttt ctg tgg ttt gac cct аса get gac432

Gly Asn Arg Glu Gin Gin Phe Phe Leu Trp Phe Asp Pro Thr AlaAsp

130 135140 ttc cat gat tat аса ata att tgg aac cct caa caa ata ttg ttt ett480

Phe His Asp Tyr Thr He He Trp Asn Pro Gin Gin He Leu PheLeu

145 150 155160 gtt gat gga agg get gtt aga tet ttt ccg aat aat gag get ata ggt528

Vai Asp Gly Arg Ala Vai Arg Ser Phe Pro Asn Asn Glu Ala HeGly

165 170175 gtc cct tac tta aaa agt caa tgg atg aat gta cat tta agt ett tgg576

Vai Pro Tyr Leu Lys Ser Gin Trp Met Asn Vai His Leu Ser LeuTrp

180 185190 aat ggc gag act tgg gcc аса eta gga ggg ttg aga agg ata gat tgg624

Asn Gly Glu Thr Trp Ala Thr Leu Gly Gly Leu Arg Arg He AspTrp

195 200205 aat tea gcc cct ttt gta get tec tat tet act ttt gta gga gac tea672

Asn Ser Ala Pro Phe Vai Ala Ser Tyr Ser Thr Phe Vai Gly AspSer

210 215220 tgc ttc gat age gca gat tec ccg tgc atg gcc tea aaa tgg tgg aac720

Cys Phe Asp Ser Ala Asp Ser Pro Cys Met Ala Ser Lys Trp TrpAsn

225 230 235240 caa get gca tat caa tet tta age аса agt gat gcc age agt att caa768

Gin Ala Ala Tyr Gin Ser Leu Ser Thr Ser Asp Ala Ser Ser HeGin

245 250255 tgg gtt agg gca aat tat etc aaa tat gac tat tgt tat gat аса aaa816

Trp Vai Arg Ala Asn Tyr Leu Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp ThrLys

260 265270 etc tat ccg aac ggc ttt ccc age gaa tgc tea aac cgt ggt ttc tag864

Leu Tyr Pro Asn Gly Phe Pro Ser Glu Cys Ser Asn Arg GlyPhe

275 280285 <210> 8 <211> 287 < 212> Белок < 213> Equisetum diffusum < 400> 8

Met Lys Lys Lys Thr Ala Ser

Met Leu Gly Leu Ala Phe Gly Met Leu

10 15

- 43 036403

Leu lie Met Leu Ala Ser Pro Lys 20

Leu Ala He Ala Gly Phe Tyr Glu

30

Asp Phe Asp Vai Asp Pro Pro Pro

40

Asp His Vai He He Gin Ser Asp

Ser Leu Leu Glu Leu Thr Met Asp

55

Lys Asn Ser Gly Ser Thr Vai Vai

Ser Thr Arg Lys Tyr Leu Phe Gly

70

Tyr Phe Asn Met Lys Met Lys Leu

80 lie Ser Gly Asn Ser Ala Gly Thr

Vai Thr Thr Phe Tyr He Phe Ser

95

Glu Glu Ala Asn His Asp Glu lie

100

Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Tyr

105 110

Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Leu His

115 120

Thr Asn He Phe Ala Ser Gly Vai

125

Gly Asn Arg Glu Gin Gin Phe Phe

130 135

Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ala Asp

140

Phe His Asp Tyr Thr He He Trp

145 150

Asn Pro Gin Gin He Leu Phe Leu

155 160

Vai Asp Gly Arg Ala Vai Arg Ser

165

Phe Pro Asn Asn Glu Ala He Gly

170 175

Vai Pro Tyr Leu Lys Ser Gin Trp

180

Met Asn Vai His Leu Ser Leu Trp

185 190

Asn Gly Glu Thr Trp Ala Thr Leu

195 200

Gly Gly Leu Arg Arg He Asp Trp

205

Asn Ser Ala Pro Phe Vai Ala Ser

210215

Cys Phe Asp Ser Ala Asp Ser Pro

225230

Tyr Ser Thr Phe Vai Gly Asp Ser 220

Cys Met Ala Ser Lys Trp Trp Asn

235240

Gin Ala Ala Tyr Gin Ser Leu Ser

245

Thr Ser Asp Ala Ser Ser He Gin

250 255

Trp Vai Arg Ala Asn Tyr Leu Lys

260

Tyr Asp Tyr Cys Tyr Asp Thr Lys

265 270

Leu Tyr Pro Asn Gly Phe Pro Ser

275 280

Glu Cys Ser Asn Arg Gly Phe

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Белок, имеющий активность целлюлоза:ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы, содержащий:

(а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 6 или 8; или (b) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности SEQ ID NO: 2, 6 или 8; или (c) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности аминокислот 22-280 SEQ ID NO: 2, или последовательности аминокислот 26-283 SEQ ID NO: 6, или последовательности аминокислот 29-287 SEQ ID NO: 8.
2. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок по п.1.
3. Выделенная нуклеиновая кислота по п.2, выбранная из:

(a) нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, 5 или 7 или комплементарную любой из них последовательность;

(b) нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеотидов 64-840 SEQ ID NO: 1 или комплементарную ей последовательность, или последовательность нуклеотидов 76-849 SEQ ID NO: 5 или комплементарную ей последовательность, или последовательность нуклеотидов 85-861 SEQ ID NO: 7 или комплементарную ей последовательность.
4. Химерный ген, содержащий следующие функционально связанные элементы:

(a) промотор, экспрессирующийся в растениях;

(b) нуклеиновую кислоту по п.2 и (c) область терминации транскрипции и полиаденилирования.
5. Химерный ген по п.4, где указанный промотор является конститутивным промотором, семяспецифичным промотором, стебле-специфичным промотором или волокно-специфичным промотором.
6. Клетка-хозяин, содержащая химерный ген по п.4.
7. Трансгенное растение, содержащее химерный ген по п.4 или часть указанного растения.
8. Способ получения трансгенного растения по п.7, включающий:

(a) получение химерного гена по п.4;

(b) встраивание указанного химерного гена в растение.
9. Способ изменения по меньшей мере одного свойства волокна в растении, продуцирующем волокна, или укрепления клеточных стенок растения, включающий встраивание химерного гена по п.4 в указанное растение и обеспечение экспрессии указанного химерного гена, где указанное свойство волокна выбирают из прочности волокна и устойчивости к ферментативному расщеплению.
10. Способ по п.9, где укрепление клеточных стенок растения приводит к укреплению его стебля, повышению устойчивости к полеганию и повышению устойчивости к инфицированию патогенами.
11. Способ по п.9, включающий выращивание указанного растения до получения семян.
12. Способ получения целлюлозного материала с присоединенным ксилоглюканом (ксилоглюкановым олигосахаридом), включающий приведение целлюлозного материала в контакт с эффективным количеством белка по п.1 в присутствии ксилоглюкана (ксилоглюканового олигосахарида) или в присутствии ксилоглюкана (ксилоглюканового олигосахарида), ковалентно связанного с органической или неорганической молекулой.
13. Способ получения целлюлозного материала, включающий получение растения по п.7 и сбор указанного растения или его части и выделение целлюлозного материала из указанного собранного растения или части растения.
14. Способ по п.12, где целлюлозный материал применяется для получения ткани, бумаги, материала упаковки, строительного материала, загустителей, медицинского перевязочного материала, целлофана, диализных трубок и смолы для хроматографических колонок.
15. Способ получения белка по п.1, включающий культивирование клетки-хозяина по п.6 и выделение продуцируемого белка.
16. Способ производства пищевого, кормового или промышленного продукта, включающий:

a) получение растения или его части по п.7 и

b) получение пищевого, кормового или промышленного продукта из растения или его части, где:

a) пищевой или кормовой продукт является маслом, мукой крупного помола, зерном, крахмалом, мукой или белковым продуктом; а

b) промышленный продукт является биотопливом, волокном, промышленными химикатами, фармацевтическим или нутрицевтическим средством.