JPH09501322A

JPH09501322A - キチナーゼ、キチナーゼをコードするｄｎａおよびそのｄｎａを含有する植物

Info

Publication number: JPH09501322A
Application number: JP7506766A
Authority: JP
Inventors: グロート，マリオンアポテケル−デ; フェルディナントボル，ヨーン; ヨハネスクレメンスコルネリッセン，ベルナルドゥ; ヨゼフスマリアリントールスト，フベルトゥス; ショウルトメルヘルス，レオ; シレーネポンステイン，アンネ; ベアトリックスセラ−ブールラジェ，マリアンネ
Original assignee: モーゲンインターナショナルナームロゼフェンノートシャップ; レェイクスニヘルシテイトテレイデン
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 1997-02-10
Also published as: HUP9600362D0; EP0714446A1; WO1995005467A3; WO1995005467A2; EP0639642A1; CN1131439A; BR9407352A; AU680935B2; CA2169833A1; IL110601A0; BG62701B1; AU7500194A; HUT75073A; US5993808A; BG100360A

Abstract

(57)【要約】本発明は、エンド−キチナーゼ活性、抗菌活性及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により測定される場合、約40〜43KDa の分子量を有する新種の植物キチナーゼを提供する。本発明はさらに、本発明のキチナーゼを活性成分として含んで成る抗菌組成物を提供する。本発明の異なった観点によれば、単離されたDNA 配列が提供され、これは新規キチナーゼをコードする読み取り枠を含む。本発明はまた、本発明のキチナーゼをコードするDNA 配列を含んで成る植物発現性組換えDNA 配列、及びそのような組換えDNA をそれらのゲノム中に組込んでいる植物細胞及び植物も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】キチナーゼ、キチナーゼをコードするDNA およびそのDNA を含有する植物発明の技術分野この発明は、植物起源のキチナーゼ類、そのキチナーゼ類をコードするDNA 、および形質転換されて前記組換えポリヌクレオチドを含有し発現して前記キチナーゼを産生また過剰産生する植物に関する。さらにこの発明は、植物を病原体の攻撃から防護する方法ならびにその方法によって得ることができる植物に関する。さらに本発明には、この発明のキチナーゼを活性成分として含有する抗病原体組成物に関する。現在の技術水準植物は、多数種のタンパク質を蓄積することによって、病原体による攻撃、化学処理および障害などのストレスに対応する。最もよく研究されている植物の応答の一つはいわゆる発病関連タンパク質類（pathogenesis-related protein）すなわちPRタンパク質類の誘発発現である（Bowles，D.，Annu．Rev．Biochem.，5 9 巻， 873〜907 頁，1990年；Linthorst，H.J.M.，Crit．Rev．Plant Sci.，10 巻，123〜150 頁，1991年）。 PRタンパク質は構造および／または活性に基づいて少なくとも５種のファミリー（PR-1〜PR-5）に分類できる。タバコの場合、PRタンパク質類の各ファミリーの中で、細胞内（クラス−Ｉ）および細胞外（クラス−II）の両者のイソ型が分類されている。 PRタンパク質類のなかでキチナーゼ類はPR-3のファミリーを構成している（Legrand，M．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84巻，6750〜6754頁，1987年）。クラス−Ｉのキチナーゼ類は抗真菌性を有し（Broekaert，W.F．ら，Physiol．Mol．Plant Pathol.，33 巻， 319〜331 頁，1988年）、特に、PR-2 ファミリーとして分類される（Kauffmann，S．ら，EMBO J.，6巻，3209〜3212頁，1987年）β−１，３−グルカナーゼ（Schlumbaum，A.ら，Nature，324 巻， 3 65〜367 頁，1986年）と組合わせたときに抗真菌活性を有する。キチナーゼ類の発生とそれらの対応するcDNAのクローン化は、多数の植物の種すなわち双子葉類と単子葉類の両者の種について報告されている（最近の総説としてはCollinge，D.B.ら，The Plant Journal，3巻，41号、31〜40頁，1993年参照）。キチナーゼ類は、その一次構造によって３クラスに分類されている（Shin shi，H．ら，Plant Mol．Biol.，14巻， 357〜368 頁，1990年）。最近キチナーゼ類は、上記の分類に適合しないことが見出され、これらのキチナーゼはクラス −IVを形成すると提案されている。クラス−Ｉのキチナーゼ類は約40個のアミノ酸からなるシステインが豊富な領域が存在することが特徴である。クラス−IIのキチナーゼ類は、とりわけそのアミノ酸配列の相同性によってクラス−Ｉのキチナーゼに似ているが、前者はシステインが豊富な領域を欠いている。クラス−IIIのキチナーゼ類は、クラス−ＩまたIIのキチナーゼ類と比べて配列の類似性がない。クラス−IVのキチナーゼ類としては、Collingeらの上記文献で提案されているようにテンサイキチナーゼIV（Brine，C.J.，Sandford，P.A．およびZikakis，J.P．編集“Advances in Chitin and Chitosan”，Amsterdam E lsevier社印刷中のMikkelsen J.D.ら1992年の報告）、ならびに塩基性のなたね（rape）キチナーゼChB4（Rasmussen，U．ら，Planta，187 巻， 328〜 334 頁，1992年）および酸性のインゲン豆PR4 キチナーゼ（Margis-Pinheiro M. ら，Plant．Mol．Biol.，17 巻， 247〜253 頁，1991年）があり、このクラス− IVキチナーゼ類はクラス−Ｉキチナーゼ類に対して配列の類似性を示し、Ｎ末端システイン豊富領域を含有しているが、、欠失がいくつかあるのでクラス−Ｉキチナーゼ類より小さい。植物キチナーゼ類の分子量は、平均して約26〜約36KDa の範囲内にある。 PRタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、これら遺伝子を非天然の例えば構成要素、調節要素などの制御下においてそれら遺伝子の発現パターンを変え、次にこれらの構造体を植物中に再導入することによって、病原体の攻撃特に真菌の攻撃に対する植物の感受性を低下させることができる（ヨーロッパ特許願第 0440304A1号；ヨーロッパ特許第 0460753号）。形質転換された植物中にクラスＩキチナーゼ類とβ−１，３−グルカナーゼ類が同時に発現すると、形質転換植物の真菌に対する耐性が著しく強化され、抗病原体タンパク質類を組合わせた価値を示す。抗真菌組成物中で使用する新しいキチナーゼ類を同定しおよび／またはこのようなキチナーゼ類をコードするcDNAまたは遺伝子をクローン化するため、形質転換植物でこれらcDNAまたは遺伝子を発現させた場合の作用を試験して病原体の攻撃特に真菌の攻撃に対する前記植物の感受性を評価することが引続き必要である。本発明の目的は、新規な抗病原体タンパク質、それをコードするDNA およびかようなDNA を含有し発現する植物を提供し、かような植物の、病原体の攻撃特に真菌の攻撃に対する感受性を低下させることである。発明の要約この発明は、エンド−キチナーゼ活性と抗真菌活性を有し、かつドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法によって判定した分子量が約40〜43KD a であるタンパク質であって他のタンパク質を含有していないタンパク質を提供するものである。一層好ましいタンパク質は、TMV-誘導タバコ植物の葉から得ることができるタンパク質である。さらに一層好ましいタンパク質は、配列番号：２または８で表されるアミノ酸配列またはキチナーゼ活性を有する該アミノ酸配列のフラグメントを有するタンパク質である。また、本発明は、キチナーゼ活性を破壊することなく一つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したタンパク質も提供するものである。この発明の他の実施態様は、この発明のタンパク質を活性成分として含有する抗真菌組成物である。一層好ましい組成物は、真菌に対して前記タンパク質とともに相乗的に作用する別のタンパク質を、前記タンパク質に加えて含有する組成物である。さらに一層好ましい組成物は、β−１，３−グルカナーゼ、好ましくは塩基性β−１，３−グルカナーゼおよび／またはキチナーゼ、好ましくはクラスＩキチナーゼ、より好ましくはタバコ由来のものを含有している。この発明の別の実施態様は、この発明のタンパク質、好ましくは配列番号：２もしくは配列：８で表される配列を有するタンパク質をコードする読取り枠を含有する分離DNA 配列(isolated DNA sequence)、または緊縮条件下で前記DNA 配列とハイブリッドを形成するDNA 配列である。またこの発明には、この発明のタンパク質または前記タンパク質の前駆体をコードするDNA 配列を含有する、植物が発現可能な組換えDNA 配列が含まれており、前記DNA 配列は、このDNA 配列が植物中で発現して前記タンパク質を産生するのに必要な調節要素に物理的に連結されている。植物が発現できる組換えDNA 配列として好ましいのは、配列番号：２または配列：７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質前駆体をコードするDNA 配列である。植物が発現できる組換えDNA のもう一つの好ましいものは、配列番号：１または７で表されるDNA 配列を含有している。またこの発明には、この発明のDNA 配列を含有するクローン化伝達体またはクローン化ベクター、およびこのようなクローン化伝達体またはクローン化ベクターを含有する細菌株が含まれる。またこの発明のDNA を植物の細胞と植物に転移させるのに適切なベクターを含有しているアグロバクテリウム(Agrobacterium) 属の細菌株も提供される。この発明の他の実施態様には、植物ゲノム、そのゲノムを含有する植物細胞およびその植物細胞から再生される植物が含まれ、その結果その植物はこの発明のタンパク質を産生または過剰産生する。この発明のタンパク質をコードするDNA の発現は、病原体の攻撃、特に真菌の攻撃に対する植物の感受性を低くするよう最適化することが理想的である。さらにこの発明には、植物が発現できるこの発明のDNA が組込まれた一つ以上の細胞を含有する鱗茎、花、果実、葉、花粉、根もしくは根培養物、種子、柄、塊茎または微小塊茎などのような植物物質が含まれる。またこの発明は、両親系(parental line)の少なくとも一つがこの発明の組換えDNA ゲノムを含有していることを特徴とする真菌に対する感受性を低下させた植物品種を育種する方法、ならびに培養条件下で植物を損傷することが少ない方法を提供するものである。この発明の別の態様、この発明を実施する各種の方法、およびいくつもの利点は詳細な説明の項で述べる。この発明を以下の図によって説明する。図面の説明図１．クラスターＡ遺伝子および相同cDNAクローンのヌクレオチド配列。ゲノムクラスターＡクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸の完全配列をそれぞれラインｂとｃに示す。上記ヌクレオチド配列の上方に、上記cDNAクローンの異なるヌクレオチドだけをラインａに示す。同様に、クラスターＡタンパク質の配列の下方に、上記cDNA配列の異なるアミノ酸だけをラインｄに示す。該タンパク質の配列を決定することによって測定したアミノ酸配列には下線を付してある。残基 Ser(S)とGln(Q)の間のシグナルペプチドの推定切断部位は矢印で示してある。図２．タバコのクラスターＡ遺伝子に相同の配列を含有する３種のクローンのサザンブロット分析結果。タバコの３種のゲノムクローン（クローン56；59；66 ）を精製し、次いでBamHＩ，HindIII，Pst Ｉ，Sst ＩまたはXba Ｉで消化し、それぞれレーン１〜５で 0.8％アガロースゲル上に電気泳動させた。そのゲルをブロットし、次いでクラスターＡのcDNAとハイブリッドを形成させ、次いで 0.1 ×SSPE、 0.1％SDS 中65℃で洗浄した。図３．異なる形態のストレスをかけたときのタバコのクラスターA mRNAのノーザンブロット分析結果。ストレスを加えられていない健康なタバコの葉（Ｈ）もしくはTMV が感染した葉（Ｔ）、エプテフォン（eptephon）をスプレーした葉（Ｅ）、切断によって傷付けられた葉（Ｗ）または紫外線を照射された葉（Ｕ）から単離された等しい量の全RNA を、クラスターA cDNAプローブとハイブリッドを形成させた。図４．バシラス・サーキュランズ（Bacillus circulans）、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、ストレプトマイセス・プリカタス(Streptomyces plicatus)、ブルギア・マライー(Brugia malayi)(線虫)およびムス・ムスクルス(Mus musculus)(マウス)由来のエキソ−キチナーゼ類によるニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)のクラスターＡのアライメント(alignm ent)。黒四角印は、Schuler，G.D．ら，Protein Struct．Funct．Genet.，9巻， 180〜190 頁，1991年の多重アライメント分析法(multiplealignment analysis) による高度の同一性を有する領域を示す。図５．イー・コリ(E．Coli)によるクラスターＡの過剰産生。（Ａ）：12.5％のSDS-ポリアクリルアミドゲルの各種試料について、全画分（Ｔ）、細胞残渣（Ｄ）および可溶性画分（Ｓ）を分析した。（Ｂ）クラスターＡタンパク質の特異的検出法による同じタンパク質ゲルの免疫ブロット分析。図６．TMV に感染したタバコの葉からのクラスターＡタンパク質の精製。SDS- ポリアクリルアミドゲルは異なる精製画分のタンパク質プロフィルを示す。Ａ：粗製の葉抽出物を脱塩した試料；Ｂ：Ｓ−セファロースカチオン交換クロマトグラフィーに付した後のタンパク質プール；Ｃ：キレートスーパロースカラムで処理した後のタンパク質プール；Ｄ：ゲル濾過クロマトグラフィーに付した後の精製クラスターＡ。レーン“Mr”は、表示された分子量を有する予め染色されたマーカーを示す。図７．クラスターＡの細胞局在(Cellular localization)。クラスターＡタンパク質に対する抗血清を用いて、タバコのクラスターＡの細胞局在を測定した。健康な未感染ののタバコ草本とTMV に感染したタバコ草本を分析した。全タンパク質の画分（レーンａ）、細胞外洗浄液なしの葉の画分（レーンｂ）、およびEF 画分（レーンｃ）の試料と、12.5％SDS-ゲルで分離し、PVDF膜に対して電気ブロットを行い、クラスターＡタンパク質類の検出に使用した。図８．クラスターＡとクラスＩβ−１，３−グルカナーゼタンパク質類の相乗活性によるフザリウム・ソラニ(Fusarium solani)の成長阻害。フザリウム・ソラニの予め発芽させた胞子単独またはこれにクラスＩβ−１，３−グルカナーゼ類と組合わせたものに、クラスターＡを添加することによって、クラスターＡの生体外での真菌の成長に対する作用を試験した。１ウェル当りのタンパク質の量（μｇ）を示してある。20℃で３日間培養した後、真菌菌糸体とラクトフェノールコットンブルーで染色することによって視覚化した。図９．ベクターpMOG183 の図式表示。このベクターは、pMOG181 のEcoRＩ認識部位をSst Ｉ部位で置換したpMOG181 の誘導体である。なおベクターpMOG183 は必要時にMOGEN International N.V.から自由に入手できる。図10．ベクターpMOG185 の図式表示。このベクターは、pMOG183 のEcoRＩ認識部位をXba Ｉ認識部位に変えたpMOG183 の誘導体である。図11．pMOG800 ：アグロバクテリウムによって植物を形質転換するのに適切なバイナリーベクターであり、形質転換体を選択するのに用いる植物が発現可能なカナマイシン耐性遺伝子、および発現カセットを挿入するのに用いる多重クローン化部位を含有している。発明の詳細な説明この発明は植物から単離することができる新規なクラスのキチナーゼ類を提供するものである。この発明は、特に、TMV 誘導タバコ葉由来の約40〜43KDa のタンパク質を提供するものである。このタンパク質は、さきにクラスターＡと呼称したcDNAとよく似ている読取り枠でコードされることが見出された（Hooft van Huijsduijnen R.A.M．ら， The EMBO Journal，5(9)巻，2057〜2061頁）。この文献では、タバコ内でTMV およびサリチレートによって誘発可能な、mRNAの６種のクラスター（Ａ〜Ｆ）が説明されている。その著者らは、ハイブリッド選択生体外翻訳によって上記６種のクラスターのmRNAの特性を決定した。最大のクラスターA cDNAのクローンに対応するハイブリッド選択mRNAの翻訳産物はそれぞれ、40，35，31，28および25KDa の複雑なパターンのタンパク質を産生した（Hooft van Huijsduijnenらの上記文献の図３のレーン６参照）。このcDNA配列によって実際に産生されたタンパク質は全く測定されなかった。これらタンパク質のフラグメントは精製されずまたこれらのフラグメントのいずれの構造も測定されなかった。これらのタンパク質フラグメントのどれについても生理活性は全く知られていなかった。この発明によって、このクラスターA cDNAに対応するタンパク質を、抗血清を用いTMV 誘導タバコの葉から等質に精製した。この抗血清は、PROB40とハイブリッドを形成する、タバコ由来のcDNAクローンで形質転換されたイー・コリで産生された精製タンパク質に対して生成した。そのクローンPROB40はクラスターA cD NAと交互ハイブリッド形成を行うことが知られている（Hooft van Huijsduijnen らの前掲の報告）。その同定と精製のプロセスでこの抗血清を用いれば、クラスターＡタンパク質を、その生理活性と抗病原体活性を試験するのに充分な量で、TMV に感染したタバコの葉から単離することができる。その単離されたタンパク質の部分アミノ酸配列は、タバコ由来の精製タンパク質の配列を決定することによって得られ、そのcDNAから推定されるアミノ酸配列とほとんど同一であった（図１）。クラスターＡタンパク質は、基質としてのトリチウムを入れたキチンに対するキチナーゼ活性が低く、タバコ由来のクラスＩキチナーゼ類のそれの約１／250 〜１／500 であることが見出された。しかし可溶性キチン基質に対して比色検定法で検定したところ、その活性はクラスＩキチナーゼ類の約２倍であることが見出された。エキソキチナーゼ活性またはリゾチーム活性は検出できなかった。全体的にみて、クラスターＡはエンドキチナーゼに相当するがクラスＩエンドキチナーゼ類に属するエンドキチナーゼとは異なる特性を有していると結論された。クラスターＡは植物中の全く新しいクラスのキチナーゼ類の最初のメンバーであると結論された。またクラスターＡタンパク質は主として細胞内に局在していることが見出された。クラスターＡタンパク質は、生体外検定法で、真菌のトリコデルマ・ビリデ（ Trichoderma viride）に対し抗真菌活性をもっているようである。β−１，３− グルカナーゼ類と組合わせると、上記活性は、多くの試験真菌の感受性から判断して、相乗的に強化された。クラスターＡタンパク質とβ−１，３−グルカナーゼを組合わせて試験したところ、溶菌と成長阻害がフザリウム・ソラニとアルテルナリア・ラディシナ(Alternaria radicina)について検出された。 cDNAライブラリーをPROB40で選別した後に得られたcDNAをプローブとして用いてゲノムライブラリーを選別して、クラスターＡタンパク質をコードする遺伝子を単離した。ハイブリッドを形成するクローン１種の特性を決定し、次にそのヌクレオチド配列を測定した。クラスターＡの遺伝子の完全配列およびプロモーター領域の部分を図１（配列番号：７）に示す。推定アミノ酸配列の分析結果は、クラスターＡタンパク質は、シグナルペプチド（約25個のアミノ酸）が切り離される大きな前駆体としておそらく産生されることを示している。なおその推定切断部位を矢印で示す。サザン分析の結果（図２）、クラスターＡの遺伝子が約４個の遺伝子の小遺伝子ファミリーの部分であることが分かった。この新規なキチナーゼは、以後クラスターＡタンパク質と呼称するが、抗病原体組成物特に抗真菌組成物の活性成分として、好ましくは、該キチナーゼが相乗的に作用する例えばβ１，３−グルカナーゼ類などの他のタンパク質と組合わせて用いるのに適している。クラスターＡタンパク質の適切な濃度範囲は、約0.01 μｇ／ml〜約 100μｇ／mlであり、好ましくは約 0.1μｇ／ml〜約10μｇ／mlである。この発明の抗真菌組成物は、農業に用いて広い意味で植物病原体の真菌と闘い、その実例は、園芸、樹芸、鑑賞造園、家庭造園、花卉栽培などにおける用途である。同様にクラスターＡタンパク質の抗真菌作用は飲料、食品、化粧品などに用いる防腐剤のような他の産業領域で有用であるさらに、クラスターＡタンパク質をコードするDNA すなわちcDNAまたはゲノム配列は、前記DNA で形質転換された植物中にクラスターＡタンパク質を産生もしくは過剰産生させるため、植物中でそのDNA を発現させるのに必要な調節配列の後ろにクローン化される。上記の必要な調節要素は、植物内で作動する少なくとも転写開始領域と翻訳開始領域を含有している。調節配列は、転写を促進するエンハンサーのような追加の要素を含有していてもよい。エンハンサーは、構成性方式（constitutive fashion）で、または組織特異的に、発育面もしくは環境面で調節された方式で発現を増大させる。この発明の発現の好ましいモードは、好ましくは高レベルでの特に比較的構成性モードの発現である（この発明の目的を達成するには、葉の中の可溶性タンパク質約 0.1％が比較的高い発現レベルとみなされる）。比較的構成性の発現パターンとは、植物の発育段階によって激烈に調節されないでかつ組織特異でないパターンを意味する。比較的構成性であるので発育段階では激烈に調節されることはないと当該技術分野の当業者が一般にみなしているプロモーターはCaMV358 プロモーターである。上記プロモーターの好ましい変形はいわゆる二重エンハンサー(double enhancer)を含有している。この発明とともに使用するのに適している他の比較的構成性のプロモーターは植物ウイルス類から得ることができ〔例えばCaMV19S プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（Figwort Mosaic Viurs）のプロモーターなど〕および植物遺伝子から得ることができる。また比較的構成性のプロモーターは、転写エンハンサー配列が隣接しているかまたは隣接していないアグロバクテリウム属細菌由来のTiプラスミドおよびRi−プラスミドのT-DNA 領域からも誘導することができる。CaMV35S プロモーターの−343 〜−90の配列はCaMV35S のプロモーターの活性を増大することは文献から公知であり（Kay，R．ら，Science，236 巻，1299〜1302頁，1987年）そして他の構成性プロモーター類も恐らくそうであろう〔例えばマンノピンシンターゼ（mannopine synthase）のプロモーター：米国特許第 5,106,739号〕。光誘導性高レベルプロモーターの例としては、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（rbc SSU）のプロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質(Cab)のプロモーターがあるが、両者はこの発明とともに使用することができる。例えば根、表皮細胞などのような、真菌の攻撃の標的である１種またはいくつかの予め選択された臓器または組織に導入されたキメラ遺伝子の発現を制限することが望ましい。組織特異的プロモーターの公知の例としては例えばパタチン(p atatin)クラスIIプロモーターがある。また根特異的プロモーターも使用できる。またこの発明のプロセスで使用するのに適したプロモーターは傷誘発性である。またこの発明には、ハイブリッドプロモーターすなわち異なる遺伝子の調節要素から誘導される要素を含んでなるプロモーターの使用も含まれている。植物が発現可能な遺伝子は一般に、ポリアデニル化シグナルを含有するいわゆる終止配列を含有している。この発明の遺伝子のターミネーターを使用することができるがこのことは臨界的なことではない。 “遺伝子”という用語は、本明細書で用いる場合、合成または部分的に合成でもよい、ゲノム配列のcDNAおよび転写された領域を含有していることを意味する。所望により、コドン使用頻度は、例えば単子葉植物の宿主または非植物の宿主で使用する場合に変えてもよい。“植物が発現できる遺伝子”とは、植物細胞内で転写するために必要な調節配列に作動可能に連結されかつ転写時にRNA を生成するDNA 配列を意味し、そのRNA はプロセシングの後タンパク質に翻訳される。遺伝子は、植物の生活環の一つの特定の段階で、少なくとも一つの組織中で発現する場合、“植物が発現可能”である。遺伝子が発育中のすべての段階で発現されなくてもまたは特定の内部刺激または外部刺激によって誘発された後にのみ発現される場合でも植物が発現できると解される。この発明の植物が発現できる組換えDNA 配列は、天然には連結されていない２種の配列を少なくとも兼ねそなえたDNA 配列を含んでなることを意味するものとする。例えば、植物が発現可能な組換えDNA は、エンハンサー、転写／翻訳開始領域、コーディング領域、非翻訳リーダー、シグナル配列、液胞ターゲティング配列、終止配列、イントロン、エキソンなどまたはその一部分のような真核遺伝子の機能領域の組合わせを含む遺伝子を含有していてもよい。天然の状態とは異なる発現のレベルまたはパターンを提供するこれらの要素のうちの一つを欠失、付加または置換することがこの発明で考えられる。修飾によって発現のレベルは必らずしも増大しなくてもよい。例えばこの発明では、抗病原体タンパク質の好ましい場所であるアポプラスト（細胞外）空間にこの発明のタンパク質を蓄積するよう再度誘導するため、この発明のタンパク質のＣ末端部分を切り取ることが明らかに考えられる。この切り取りのような修飾は、遺伝子の修飾に過ぎず読取り枠の残りの部分を残し、その機能を決定する他の配列（例えば、プロモーター、ターミネーター、イントロンおよびエキソンなど）は変化していないので、植物が発現できる組換えDNA の定義に基づいたこの発明のタンパク質をコードする DNA を依然としてもっている。植物病原体の真菌に対して形質転換植物を保護する場合の抗真菌タンパク質の有効な作用部位はアポプラスト空間であると考えられる。したがって、植物は、天然にまたは遺伝子の修飾によって植物のアポプラスト空間でその作用を発揮する、この発明の、植物が発現できる遺伝子をコードする組換えDNA 構造体で形質転換される。植物細胞の液胞中に天然に存在するタンパク質をコードする遺伝子は、液胞ターゲティングに関与するＣ末端アミノ酸が翻訳産物中に存在しないように修飾される（例えば遺伝子のコーディング領域のＣ末端部の末端に翻訳終止コドンを導入するなどの方法によって行う）。上記切取りの作用は、液胞タンパク質のアポプラスト空間へのターゲティングである（その手順の詳細はヨーロッパ特許願公開第440304A1号参照）。上記操作は各々当該技術分野の当業者にとって公知であり、発現レベル、ターゲティングおよび疾病抵抗性に対するそれら操作の効果は、標準の方法を用いて容易に評価することができる。一般に、形質転換された植物は、所望の特性の存在および／または所望の特性が発現される程度について評価される。最初に評価するのは、新たに導入された遺伝子の発現のレベル、形質転換された植物の耐真菌性のレベル、所望の特性の安定した遺伝力、圃場試験などである。第二に、所望により、形質転換された植物は、他の品種、例えば商業的価値が一層高い品種もしくは他の望ましい特性がすでに導入されている品種と交雑育種してもよく、または他のラウンドの形質転換などに付してもよい。クラスターＡタンパク質をタバコのβ−１，３−グルカナーゼと組合わせると、生体外で相乗抗真菌作用を起こす。同様に、植物中に上記両方のタンパク質が産生または過剰産生されると相乗抗真菌作用が期待される。このことは、キチナーゼ類とグルカナーゼ類を組合わせることによって生体外で相乗作用が起こる場合、生体内でも同じことが起こるという事実から推定される（ヨーロッパ特許願公開第440304A1号）。この発明の抗真菌タンパク質と組合わせて使用されるタンパク質の例としては、限定されないが、β−１，３−グルカナーゼ類および例えば次のようなものから得られる他のキチナーゼ類がある。すなわち大麦（Swegle，M.ら，Plant Mol ．Biol.，12巻， 403〜412 頁，1989年；Balance，G.M．ら，Can．J．Plant Sci .，56巻， 459〜466 頁，1976年；Hoj，P.B．ら，FEBS Lett.，230 巻，67〜71 頁，1988年；Hoj，P.B．ら，Plant Mol．Biol.，13巻，31〜42頁，1989年）；インゲン豆（Boller，T.ら，Planta，157 巻，22〜31頁，1983年；Broglie，K.E．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83巻，6820〜6824頁，1986年；V-geli U．ら，Planta，174 巻， 364〜37 2 頁，1988年；Mauch，F．およびStaehelin L.A.，Plant-Cell，１ ller，T.，Physiol．Mol．Plant Pathol.，28 巻， 161〜169 頁，1986年）；リーキ（Spanu，P．ら，Planta，177 巻， 447〜455 頁，1989年）；トウモロコシ（Nasser，W.ら，Plant Mol．Biol.，11巻， 529〜538 頁，1988年）；エンバク（Fink，W.ら，Plant Physiol.，88巻， 270〜275 頁，1988年）；エンドウ豆（ Mauch，F．ら，Plant Physiol.，76巻， 607〜611 頁，1984年；Mauch，F．ら， Plant Physiol.，87巻， 325〜333 頁，1988年）；ポプラ（Parsons，T.J．ら， P.N.A.S.，86巻，7895〜7899頁，1989年）；ジャガイモ（Gaynor，J.J.，Nucl． Acids Res.，16巻，5210頁，1988年；Kombrink，E.ら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，85巻， 782〜786 頁，1988年；Laflamme，D.およびRoxby，R.，Plant Mo l．Biol.，13 巻， 249〜250 頁，1989年）；タバコ（例えばLegrand，M．ら，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，84巻，6750〜6754頁，1987年；Shinshi，H．ら，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，84巻，89〜93頁，1987年）；トマト（Joosten，M. H.A．およびDe Wit P.J.G.M.，Plant Physiol.，89 巻， 945〜951 頁，1989年）；小麦（Molano，J.ら，J．Biol．Chem.，254 巻，4901〜4907頁，1979年）などから得られるキチナーゼ類である。この発明の抗真菌タンパク質をコードする遺伝子と組合わせて適切に使用できるタンパク質に対応する植物遺伝子のクローン化および形質転換植物内でのこのような遺伝子の過剰発現、ならびに発現の操作（ターゲティングを含む）と植物の疾病抵抗性の評価はすべて当該技術分野の技術の範囲内にあり、とりわけ、ヨーロッパ特許願公開第 0440304A1及び同第 0460753A2号に例示されている。両特許願公開は本明細書に援用するものである。２種以上のキメラ抗真菌遺伝子を有する形質転換植物は、以下に示す各種のプロセスによって得ることができる。すなわちＡ一つの選択マーカー遺伝子に物理的にカップリングされたいくつもの修飾遺伝子とともに一つの組換えポリヌクレオチド例えばプラスミドの使用。Ｂ選択マーカーをコードする遺伝子をカップリングされた１種以上のキメラ遺伝子を容易に発現することができる形質転換植物の、他の選択マーカーにカップリングされた１種以上の遺伝子構造体を含有する形質転換植物由来の花粉による他家受粉。その後、この受粉によって得られる種子を上記２種のマーカーの存在に基づいて選択する。その選択された種子から得られる植物はその後、さらに他家受粉させるのに使用できる。Ｃいくつもの各種組換えポリヌクレオチド類例えばプラスミド類の使用（各プラスミドは１種以上のキメラ遺伝子と１種の他の選択マーカーを有している）。同時形質転換の頻度が高い場合、１種だけのマーカーに基づいた選択で充分である。他の場合では２種以上のマーカーに基づいた選択が好ましい。Ｄ新しい追加のキメラ遺伝子および選択マーカー遺伝子による、形質転換植物の逐次形質転換。Ｅ上記方法の組合わせ。実際の方法は、上記発明に対して臨界的ではない。なんらかの形態の真菌の攻撃を受けやすい植物の種には、この発明の、植物が発現できる遺伝子構造体の１種以上を備えさせる。同様に真菌の攻撃をいくらか受けている植物は、この発明の抗真菌タンパク質を含有する組成物で処理する。したがって、この発明を達成するための“植物”とは、農業、園芸、林業、（屋内）園芸、または植物が関連する他の形態の活動（食品または飼料として直接使用するかまたは任意の種類の産業でさらに加工し、物質を抽出したり、装飾の目的、増殖、交雑育種などの他の用途に用いる活動）に用いられる場合の裸子植物と被子植物の単子葉植物と双子葉植物を意味する。この発明の植物が発現できる遺伝子を選択された植物の種に導入するのに、原則的に任意の形質転換法を利用できる。一般に、有用な方法は、原形質体に用いるカルシウム／ポリエチレングリコール法（Krens，F.A．ら，Nature，296 巻， 72〜74頁，1982年；Negrutiuら，Plant Mol．Biol.，８巻， 363〜373 頁，1987 年６月）；原形質体の電気穿孔法（Shillito，R.D.ら，Bio/Technol.，３巻，10 99〜1102頁，1985年）；植物物質への微量注入法（Crossway，A.ら，Mol．Gen． Genet.，202 巻， 179〜185 頁，1986年）；各種植物物質のDNA もしくはRNA でコートされた粒子による衝撃（Klein，T.M．ら，Nature，327 巻，70頁，1987年）；ウイルスの感染などの方法である。この発明の好ましい実施態様では、アグロバクテリウム属の細菌の仲介による DNA 転移が用いられる。特に好ましいのは、ヨーロッパ特許願公開第 A120516号および米国特許第 4,940,838号に開示されているようないわゆるバイナリーベクター法を使用することである。一般に、形質転換を行った後、植物の細胞または外植片を、この発明の植物が発現できる遺伝子とともに同時転移した植物が発現できる遺伝子がコードする１種以上のマーカーが存在するよう選択し、次にその形質転換された植物を全植物中に再生させる。単子葉植物は、遺伝形質転換を行うのにいくぶん操作しにくいと思われるが、形質転換され易く、そして稔性形質転換植物は、形質転換された細胞または原形質体から再生させることができる。単子葉植物を形質転換するのに現在好ましい方法は、外植片または懸濁細胞のマイクロプロジェクティルボンバードメント法(microprojectile bombardment)および直接DNA 取込み法または電気穿孔法（Shimamoto ら，Nature，338 巻， 274〜27 6 頁，1989年）である。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosp hinothricin acetyltransferase)(除草剤のホスフィノトリシンを不活性化する酵素)をコードするストレプトマイセス・ハイグロスコピクスのバー遺伝子(Stre ptomyces hygroscopicus bar -gene)を、トウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞（embryogenic cell）中に、マイクロプロジェクタイルボンバードメント法（Go rdon-Kamm，Plant Cell，2巻， 603〜618 頁，1990年）によって導入することによって形質転換トウモロコシ植物を得た。小麦と大麦のような他の単子葉植物の作物のこ粉プロトプラスト中への遺伝物質の導入については報告されている（Le e，Pant Mol．Biol.，13巻，21〜30頁，1989年）。小麦の植物は、胚形成懸濁培養物を樹立するために用いる、熟成したコンパクトな結節型の胚形成カルス組織だけを選択することによって、胚形成懸濁培養物から再生されている（Vasil，B io/Technol.，8巻， 429〜434 頁，1990年）。これらの作物のため形質転換システムを組合わせると、この発明を単子葉植物に適用することができる。トウモロコシとコメのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物は、アグロバクテリウム属の菌株によって容易に形質転換され易い（Gould，J.，Michael， D.，Hasegawa，O.，Ulian，E.C.，Peterson，G.，Smith，R.H.，Plant．Physiol .，95 巻， 426〜434 頁，1991年；Hiei．Y.ら，Plant Journal，6巻，印刷中， 1994年）。単独でまたは他の抗真菌遺伝子もしくはこの発明のキチナーゼと相乗的に作用するタンパク質をコードする遺伝子を組合せてこの発明の新規なキチナーゼを産生または過剰産生する植物と植物の一部を用い、耐病原体性特に耐真菌性を評価する。続いて、一層耐性が高い系統を育種計画に用いて、耐病原体性、特に耐真菌性を強化された商業的に品種を得ることができる。病原体または真菌の攻撃に対する感受性が低下した植物は、圃場または温室で利用することができ次に動物の飼料、ヒトによる（直接）消費、長期保存用に用いることができ、また食品などの工業的加工などに用いることができる。この発明の植物またはその一部の利点は、殺真菌剤による処理を余り必要とせず、原料、労力および環境汚染またはこのような植物の産物（例えば果実、種子など）の棚持ちの延長に対する費用が少なくなることである。さらに、この発明のキチナーゼが高められたレベルで存在しているので、収穫後の損失を少なくすることもできる。この明細書では明らかに述べなかったこの発明の他の利点は当該技術分野の当業者であれば考えつくことができ，そしてこれらの利点はこの発明の真の範囲から逸脱するものではない。以下の実施例は単にこの発明をさらに例示することだけを目的とするものであるので、これらの実施例またはこの明細書のいずれの記載事項もこの発明の範囲を限定するとみなすべきではない。実施例１クラスターＡに対応するcDNAの単離ニコチアナ・タバカムcvサムスンNN(Nicotiana tabacum cv．Samsun NN)がTMV に感染した後、クラスターA mRNAが強く誘発されると報告されている（Hooft v an Huijsduijnenらの1986年の上記文献）。TMV に感染したサムスンNNタバコ植物のλZAPcDNA ライブラリー（実験の項参照）を、PROB40（部分クラスターA cD NAクローン）由来のプローブで選別した結果、積極的にハイブリッドを形成する11個のクローンが単離された。制限酵素による分析と（部分）配列分析によってすべてのクローンが同一であることが分かった。これらのクローンがクラスターＡのcDNAに相当すると結論された。これらのクローン（cA-3）のうちの一つのヌクレオチド配列を決定し（実験の項参照）、配列番号：１と２に示す。このクローンは、読取り枠の５′部分の７個のコドンを欠いている。実施例２細菌の発現ベクター内での完全cDNAクローンのクローン化下記のプライマーＴ７：５′-AATACGACTCACTATAG- （配列番号：３）とプライマーＰ１：５′-GTTTCCTTCTCCATGGAACTAGTTTGCAC- （配列番号：４）を用いて、クローンcA-3に対してPCR 反応を実施することによってcDNAクローンを完成した（実験の項参照）。 PCR で増幅した産生物を制限酵素Nco ＩとXho Ｉで消化し、電気泳動を行いアガロースゲルからフラグメントを単離した後、そのフラグメントを、中間体の、 Nco Ｉ／Xho Ｉで消化したベクターpGV84 に連結し、次いでこのベクターでイー・コリ DH5αを形質転換した。この形質転換で得た正のクローン由来のNco Ｉ／ Xho Ｉフラグメントを次いでNco Ｉ／Sal Ｉで消化した細菌発現ベクター(pJLA6 02、ドイツハンブルグ所在のMedac 社)に連結し、これを用いてイー・コリ DH5 αを形質転換した。正の形質転換体を、標識をつけたクローンcA-3とハイブリッドを形成させて選別し、次に制限酵素分析によって、正しい大きさと配向の挿入物が存在していることを測定した。得られたプラスミドpJLA-A53は、ファージλ の抑制性のＰ_R とＰ_L のプロモーターと高度に効率的なイー・コリ翻訳開始領域との縦列配列の下流に、コドン20〜377 を含む推定クラスターＡ読取り枠(ORF) を含有している。最後に、プラスミドpJLA-A53を用いてイー・コリ菌株KA1092（trp65，lon，sFiA-1，malB）を形質転換した（Johnso n，B.F．ら，Mol．Gen．Genet.，157 巻，91〜97頁，1977年）〔プロテアーゼ〕。この菌株を用いて、クラスターＡタンパク質を産生させ、抗体を生成させた。 pJLA-A53を保有する菌株KA1092は、1993年８月12日付けで受託番号CBS415.93 で Centraal Bureau voor Schimmelcultures に寄託されている。実施例３イー・コリ内でのClu-A cDNAの発現、および推定Clu-A タンパク質に対する抗体の生成クラスターＡのcDNA遺伝子、コドン20−377 をλＰ_R とＰ_L のプロモーター（ Schauder，B.ら，Gene，56巻， 279〜283 頁，1987年）の制御下において、イー・コリ内で上記遺伝子が過剰発現されるようにした。イー・コリ菌株KA1092内での推定40KDa のクラスターＡタンパク質の過剰産生を図５に示す。上記細胞を音波処理で破裂させた後、細胞の残渣とともに遠心分離することによってクラスターＡタンパク質の凝集体を単離した（図５のレーンＤ）。推定クラスターA cDNA 遺伝子の発現をKA1092内で誘発させた（これは30℃で３時間増殖させた培養物を、42℃の水浴に切換えてさらに３時間インキュベートして行った）。細菌を遠心分離によって集め、１／25容積の試料緩衝液（25mMトリス、 192mMグリシン、６Ｍ尿素、 2.5％SDS 、10％グリセリン、５％β−メルカプト−エタノール）に溶解した。イー・コリ内に産生された推定クラスターＡタンパク質を精製し、抗体を生成させるために使用した（実験の項参照）。図５は、図５に示した類似のタンパク質画分のウェスタンブロット分析結果を示し、かつ単離された抗体が推定クラスターＡタンパク質に対して特異的であることを示している。クラスターＡタンパク質に対する強いシグナルが全画分（レーンＴ）およびクラスターＡ発現構造体を含有する誘導されたイー・コリ細胞の細胞残渣画分（レーンＤ）に見られた。レーンＳに見られる弱いシグナルは、少量のクラスターＡタンパク質が可溶性タンパク質の画分中に存在していることを示す。試料を 100℃で３分間加熱した後、SDS ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行わせ（実験の項）、クーマシーブリリアントブルーで染色することによってタンパク質類を可視化した。同様のゲルを氷冷の１Ｍ KClで染色し、過剰産生された40KDa のタンパク質を含有するゲルの領域を切取った。そのアクリルアミドを水中で洗浄した後、すりつぶし、フロイントの完全免疫化媒体と混合し、約 2 00ngの推定クラスターＡを含有する懸濁液を、ウサギの皮下に注射した。フロイントの不完全媒体の同じ懸濁液で２週間の間隔をおいて３回追加の免疫化を行った後、そのウサギから50mlの血液を集め、その血清画分を、推定クラスターＡタンパク質に対する抗体について試験した。実施例４タバコ由来の推定クラスターＡタンパク質の単離と特性決定 TMV に感染したタバコの葉からの推定クラスタータンパク質の精製（実験の項）は、実施例３に記載されているようにして得た抗血清を用いて免疫検出法で監視した。推定クラスターＡタンパク質は、このタンパク質の基本的性質を示すカチオン交換性Ｓ−セファロースに吸収するようである。Ｓ−セファロースカラムを流動中に交差反応を行うタンパク質は観察されなかった。推定クラスターＡタンパク質は75〜140mM NaClの存在下、Ｓ−セファロースカラムから溶出された。SDS-ポリアクリルアミドゲルと免疫ブロットを厳密に検査した結果、分子量がほゞ同じ (41KDaと43KDa)の２種のタンパク質が抗血清に交差反応することが分かった。この両方のタンパク質は明らかに類縁タンパク質である。そのcDNA配列（３個の潜在グリコシル化部位）とそのgDNA配列（４個の潜在グリコシル化部位）の両者に潜在グリコシル化部位があるので、我々は推定クラスターＡタンパク質のCon-A セファロースに対する結合性を試験するよう促がされた。したがって、タンパク質を1.15Ｍ NaCl を含有する50mMトリスHCl pH6.8 に対して透析し、次にCon-A セファロースに吸収させた。41KDa のクラスターＡタンパク質の大部分はCon-A カラムを通過したが、捕捉されたタンパク質中に、43KDa の推定クラスターＡタンパク質が存在していた。このことは、後者のタンパク質が少なくとも一部分がグリコシル化されていることを示している。Con-A セファロースは推定クラスターＡタンパク質の精製には用いなかった。代わりに、キレートセファロースクロマトグラフィーを利用した。Ｓ−セファロースカラムから溶出する推定クラスターＡタンパク質を含有する画分を、150mM NaClを含有する50mMトリスHCl 緩衝液pH8.0 に対して透析させ、次にZn²⁺イオンで活性化させて上記緩衝液と平衡化させたキレートセファロースカラムに吸収させた。タンパク質の全量の約20％が活性化されたマトリックスによって遅らされ（retard）、主としてクラスターＡタンパク質で構成されているようであった。上記キレートセファロースカラムを二番目に通過したのはほとんど純品のタンパク質製剤（図５、レーンＤ）であった。推定クラスターＡタンパク質は続いてゲル濾過クロマトグラフィーに付すことによって均質に精製された。見掛けの未変性分子量（apparent nat ive molecular weight）は約40〜43KDa であった。実施例５推定クラスターＡタンパク質のアミノ酸配列の解明 41KDa と43KDa のクラスターＡタンパク質の混合物を12.5％SDS- ポリアクリルアミドゲル上に分離し、PVDF膜に対して電気ブロットを行った。次にこの混合物を用いて、エドマン分解法によってＮ末端のアミノ酸配列を測定した（実験の項）。しかしそのＮ末端はブロックされていたので配列の情報は得られなかった。酸加水分解を受けやすい固有部位が存在しているので、同じ物質から下記の内部配列を決定することができた。 P-V-N-H-X1-S-G-S-D-X2-I-N-A-X3-I-Q（配列番号：４）X1＝Ｖ／Ｉ，X2＝Ｇ， X3＝Ｗ、この配列に先行しているアミノ酸は、恐らくAsp(D)残基であろう。なぜなら利用した消化がAsp-Pro 結合に対して特異的な消化であるからである(Landonの197 7年Sub)。追加の配列情報は推定クラスターＡタンパク質をヒドロキシルアミンで開裂した後に得られた。その結果、分子量がほゞ同じ二つのペプチドが生成し、ともにPVDF膜にブロットした。その試料の配列決定を行って下記の配列を得た。 G-L-N-Y-P-V-E-S-V-A-R-N-L-N-W(配列番号：５)および S-H-A-Q-L-F-D-P-V-N-H-X-S-G-S-D-G-I-N-A-W-I-Q-A-G-V(配列番号：６)但しＸ＝Ｉ／Ｖこれらのペプチド配列は、cDNAクローンから推定したアミノ酸配列と完全に同一であることを示した（図１の配列番号：１と２）。タバコ由来の精製した２種のタンパク質は、部分クラスターA OR Fで形質転換されたイー・コリKA1092が産生するタンパク質に相当すると、これらの整合データから結論した。コドンの 2 33位に対応するペプチド配列は、２種のアミノ酸（Ｖ／Ｉ）がこの位置に１：１の比率で存在していることを示した。恐らく高度に同一の２種のクラスターＡタンパク質が精製され、配列が決定された領域の一つのアミノ酸の位置が異なっているのであろう。クラスターＡタンパク質をデータベースの適合タンパク質と比較した結果、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）とセラチア・マルセッセンス(S erratia marcescens)それぞれ由来の細菌キチナーゼChiAとChiBとの相同性が明らかになった。クラスターＡのChiA（31％）とChiB（26％）に対する全体の同一性は低いが、特定の領域が、図４に示すように、３種のアミノ酸配列だけで高度に保存されている。さらに、ストプトマイセス・プリカタス、ブルギア・マライー（線虫）由来のキチナーゼ類、およびムス・ムスクリス（ネズミ）由来の分泌タンパク質との相同性が見出された。４種の別個のクラスの植物キチナーゼ類との構造相同性は全く見られなかった（Lawton，K.ら，Plant Mol．Biol．19 巻， 735〜743 頁，1992年；Collingeの1993年の前掲文献）。実施例６クラスターＡの酵素活性と細胞局在タバコのクラスターＡタンパク質が細菌キチナーゼ類と相同であるということは、このタンパク質が、キチンすなわちＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのα− １，４−連結ポリマーの加水分解反応を触媒することができることを示唆した。抗体を用いて、タバコ物質からクラスターＡタンパク質を精製する可能性があるので我々は上記の仮説を試験した。クラスターＡをキチナーゼ活性について試験した。基質としてトリチウムを入れたキチンを用いるエンド−キチナーゼ検定法で（Molano，J.ら，Anal．Biochem.，83巻， 648〜656 頁，1977年）、クラスターＡタンパク質は、40±６cpm ／μｇタンパク質の比活性を示したが、この比活性はクラスＩキチナーゼ類の比活性（Legrand，M．ら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，84巻，6750〜6754頁，1987年；Sela-Buurlage，M.B．ら，Plant Physiol .，101 巻， 857〜863 頁，1993年）の約１／250 〜１／500 である。しかし可溶性キチン色素基質を用いる比色検定法(WirthおよびWolf，J．Micro biol，Methd.，12巻， 197〜205 頁，1990年)で測定したクラスターＡのキチナーゼ活性はクラスＩキチナーゼの２倍であった（表１）。追加の酵素活性についてクラスターＡを試験したところ、このタンパク質には、エキソ−キチナーゼ活性がなく、キトビアーゼ、β−１，３−グルカナーゼまたはリゾチーム活性もないことが分かった。クラスターＡの細胞局在を、TMV に感染したタバコ植物の以下の各種の葉の画分を用いて分析した。（ａ）全葉の画分；（ｂ）細胞外液（EF）を除いた葉の物質、および（ｃ）EF画分である。ウェスタン分析を行ったところ、クラスターＡタンパク質は図６に示すように主として細胞内に局在していることが分かった。クラスターＡタンパク質についての強力なシグナルが画分ａと画分ｂに見られた。TMV に感染した葉の細胞外液中にはクラスターＡタンパク質は全く見られなかった（画分ｃ）。 (Roberts，W.K.およびSelitrennikoff，C.P.，J．Gen，Microbiol.， 134巻， 169〜176 頁，1988年)にしたがって、基質としてｐ−ニトロフェニルキトビオースを用い、ｐ−ニトロフェニル放出検定法により、すべてのキチナーゼ類のエキソキチナーゼ活性を試験した。PR-3a，PR-3b，32KDa のChi-ＩおよびクラスターＡの場合、放出されたｐ−ニトロフェニルの量は、エキソ−キチナーゼの場合の4.50＋0.1nmoleとは対照的に 0.05nmole未満であった（表には示していない）。検定はすべて pH6.0，37℃で行った。インキュベーション時間は通常30分であったが、リゾチーム活性が低い場合、これらのインキュベーションは時間を延長した。比活性は放出されたcpm で表し、放出された青色基質をそれぞれODの増大値として測定した。実施例７クラスターＡタンパク質の生体外での抗真菌活性今までの報告に、クラスＩキチナーゼ類（Chi-Ｉ）とβ-1，3-グルカナーゼ類（Glu-Ｉ）が生体外で真菌の成長を阻害できることが示されている（Mauch らの 1988年の文献；Sela-Buurlage らの1993年の文献）。これら加水分解酵素は両者とも、侵入する真菌に対する植物の防御機構に関与して重要な役割をはたしている。クラスターＡの抗真菌活性は、このタンパク質単独またはChi-ＩもしくはGl u-Ｉと組合わせて、各種の真菌に対する溶解活性を試験して調べた。クラスターＡタンパク質は単独で、12μｇ／mlの濃度にて、トリコデルマ・ピリデを溶解しかつその成長を阻害した。植物病原体の真菌のアルテルナリア・ラディシーナ(A lternaria radicina)に対して、クラスターＡは30〜60μｇ／mlで真菌の成長を阻害した。高濃度(600μｇ／ml)でも、フザリウム・ソラニには全く効果がみられなかった。しかしクラスターＡタンパク質は、クラスＩのβ−１，３−グルカナーゼ（およびキチナーゼ）タンパク質と協同して、エス・ソラニに対して強力な抗真菌作用を示した。これらタンパク質の相乗作用によって、エフ・ソラニの発芽前の胞子の溶解および成長阻害が起こった（図７参照）。クラスターＡタンパク質は、植物病原体の真菌のセプトリア・リコペルシシ（Septoria lycopersici）およびフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora intestans）に対して全く効果を示さなかった（データは示していない）。変性対照試料のデータは、溶解が０％および／またはGI＝０でない場合のみ括弧内に示す。実施例８クラスターＡタンパク質をコードするゲノムクローンの単離クローンcA-3のクラスターAcDNA 挿入物をプローブとして用いてエヌ・タバカムのゲノムライブラリーを選別した。３種の組換えλファージ（各々、クラスターAcDNA とハイブリッドを形成する異なる制限フラグメントを含有している）を精製した。cA-3に相同のゲノムクラスターＡを、下記の特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。すなわち５′末端コーディング領域LS42：５′-TCTCCGGCAACTAGTTTGCAC-3′（配列番号：10）およびクラスターAcDNA の３′末端非コーディング領域LS42：５′-GTCATAGTTCACATATCTGTTGCC-３′（配列番号：11）に対するプライマーを用いた。上記３種のファージのうち１種だけが、これらプライマーによる特定の配列の非常に強力な増幅を示し、その後の分析を行うため選択した。クラスターＡタンパク質の推定一次構造およびその遺伝子の５′フランキング領域と３′フランキング領域の配列を含む、クラスターAcDNA の完全ヌクレオチド配列を配列番号：７と８に示す。そのcDNAクローンをクラスターＡ遺伝子と比較したところ、これらの配列は高度の同一性（94％）を共有していることが明らかになった。５′末端の上流領域内に“CAAT”モチーフ(391位)と“TATAAT”モチーフ(428位)が見られる。３′末端の非コーディング領域には、潜在的ポリアデニル化シグナル（５ ′-AATAAA-３′）が2971位に存在している。クラスターＡ遺伝子のコーディング領域は二つのエキソン中に含まれており、 337個のアミノ酸からなる前駆タンパク質を生成する。このクラスターＡ前駆タンパク質は、小胞体の膜を横切る輸送に関与する25個のアミノ酸からなる推定シグナルペプチド、ならびに４個の潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を含有している。予想成熟タンパク質の計算分子量は 39,033KDaである。長さが 952bpと 349bpの介在配列がそれぞれコドン 151と 364のうしろに存在している。タバコ内のクラスターＡ様タンパク質類をコードする遺伝子の数を評価するため、ゲノムサザーンブロットとcD NAクローンでプローブした。緊縮条件下でこのプローブとハイブリッドを形成するバンドのパターンは、クラスターＡが少なくとも４種のメンバーを有する小さな遺伝子ファミリーの一部分であることを示している（図２）。クラスターＡ遺伝子の発現の誘発を測定するため、タバコ植物を各種のストレス条件下で処理し、ノーザンブロット法で分析した。各種処理の試料を次のように採取した。すなわちTMV を接種してから３日後、傷を付けてから２日後、エセフォン（ethephon ）で処理してから１日後、および紫外線を照射してから１日後に採取した。これらの時点でPR遺伝子類（PR-1〜PR-5）の発現が最大であることはBrederode と協同研究者がすでに報告していたので（ Plant Mol．Biol.，17巻，1117〜1125頁，1991年）、こゝでクラスターＡ遺伝子の発現を試験するのに利用した。図３は、ストレスがかかっていないタバコの葉には、クラスターＡ遺伝子の検出可能な発現が全くないことを示している。エチレンを生成するエセフォンで処理するかまたは紫外線を照射したタバコの葉のTM V 感染によってクラスターAmRNA が大きく増大した（図３のレーンＥとＵ）。これとは対照的に、葉を傷付けた後のクラスターＡの発現の誘発は少なかった。これらの試験結果はともに、クラスターＡはタバコの新規な病原関連遺伝子として分類できることを示した。実施例９発現構造体とバイナリーベクターの構築クラスターＡの遺伝子は約 5.5KbのSst Ｉフラグメントとしてクローン化される。その全読取り枠はこのフラグメント上にその約２／３を占めて位置し、その読取り枠の５′末端は一方のSst Ｉ部位から約 453位の部位で始っている。PCR を用いて、BamHＩ部位を、ORF の５′末端のすぐ上流に次のように導入する。元の配列（図１）（406位）５′-TTTAAACTCGAAGTCACAAATTAAA-3′（配列番号：12 ）（432位）を修飾して（406位）５′-TTTAAACTCGGATCCACAAATTAAA-3′（配列番号：13）（432位）にする。同様に、PCR 反応で次のアダプター配列：５′-AATTGTCTAGAC-３′（配列番号：14）を用いて、 pMOG183のEcoRＩ部位（図９）を修飾してXba Ｉ部位にする。その修飾クローン化伝達体は pMOGl85と命名され、CaMV35S プロモーターとnos ターミネーターおよびこれらの間にクラスターＡ遺伝子を挿入するのに用いるBa mHＩ部位を含有している。この目的のため、クラスターＡ遺伝子の読取り枠は、クラスターＡフラグメントの新しく作製されたBamHＩ部位を利用し、修飾発現ベタクー pMOG1 85のBamHＩ部位に、約 5.1kbのBamHＩ−Sst Ｉ部位としてクローン化される。その結果、二重エンハンサーを有する358CaMV プロモーターが上流に隣接し、nos ターミネーターが下流に隣接したクラスターＡ遺伝子がXba Ｉ−Sst Ｉフラグメント上に位置している。このフラグメントは次にバイナリーベクター pMOG800中にクローン化される（図10）。バイナリーベクターpMOG800 は、左と右のT-DNA ボーダー（T-DNA border）間の植物が発現できるカナマイシン耐性遺伝子、ならびに制限フラグメントを挿入するのに用いる多重クローン化部位を含有している。このベクターを保有するイー・コリ菌株は、適切な合成の二本鎖の部分的に相補的なアダプター配列（例えば５′-AGCTCACG-３′および３′-GTGCTTAA-５′など）によって、Centraal Bureau voor Schimmelcultures/Baarn,オランダ，No.C BS414.93）に1993年８月12日付けで寄託されている。このようにして得られたバイナリーベクターは、特に構成上発現可能なクラスターＡ遺伝子および植物がマーカーとして発現できるNPT II遺伝子の両者を含有し、これらの遺伝子は左と右のT-DNA ボーダー配列の間に位置している。次に、このPMOG800 由来のバイナリーベクターを、プラスミドpRK2013 によって、イー・コリDH52から、Vir 機能(Vir-functions)を有するヘルパープラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacie ns)菌株MOG101中に移動させる。そのトランスコンジュガント（transconjugant ）は、40mg／ｌのリファンピシン、 250mg／ｌのスペクチノマイシンおよび 100 mg／ｌのカナマイシンを含有する選択培地上でこれらのメイティング（mating）から単離する（詳細は実験の項を参照）。上記バイナリーベクターを受け入れた上記アグロバクテリウム属細菌の細胞を用いて植物の形質転換を行う。実施例10 植物の形質転換および発現の分析ａ．トマト pMOG800 由来のバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウム属菌株MOG1 01による、トマト〔リコペルシコン・エスクレンタムCVマネーメーカー（Lycope rsicon esculentum cv．Moneymaker）〕の形質転換を、特にMcCormick ら（Plan t Cell Rep.,５巻，81〜84頁，1986年）が報告しているようにして実施する。ｂ．タバコタバコを形質転換するため、葉−ディスク浸漬法（leaf-disc dip method）（ Horsch ら，Science，227巻，1229〜1231頁，1985年）を使用する。葉−ディスクを、上記バイナリーベクターを保有するアグロバクテリウム菌株MOG101とともに同時培養し、100 mg／mlのカナマイシンを含有する選択培地上で増殖させる。形質転換シュートを全植物中に再生させ、新たに導入した遺伝子の発現について分析する。この分析を行うのに、クラスターＡタンパク質および／またはグルカナーゼに対する抗血清を使用してウェスタンブロット法を利用する。ｃ．ジャガイモcv．カーダル（Kardal）ジャガイモの塊茎は＋４℃で貯蔵しなければならず、そして形質転換を行う７日前に室温まで移行させねばならない。１日目。アグロバクテリウム菌株を、フレッュプレートから、10mlLB＋ 100mg ／ｌカナマイシン＋20mg／ｌリファンピシン中に接種する。 29℃で一夜増殖させる。２日目。アグロバクテリウムの懸濁液を、最少培地＋100 mg／ｌのカナマイシンで、１：10の比率で希釈する。29℃で一夜増殖させる。培地１に関してはプアープレート。３日目。アグロバクテリウム懸濁液を、抗体なしの最少培地でOD₆₀₀±0.15まで希釈し、OD₆₀₀ 0.30〜0.70まで増殖させる（これを行うのに約４時間かかる）。培養物を遠心分離し、MS₃₀R3で１：10に希釈する。ジャガイモをはがす。 −70％エタノールで１分間洗浄する。 −１：５希釈のTeepol＋ 0.1％ Twecn20で20分間洗浄する。 −滅菌水で一回洗浄する。 −RK：KIの１：１混合物± 100mlを添加する（青色が２分間保持されねばならない）。 −滅菌水で青色を洗い流す。 −塊茎を切断して約２mmの厚みのスライスにする。 −維管束組織の小ディスクをボア（bore）で切取る。 −これら小ディスクを、大きいペトリ皿（15cm）に、液体MS₃₀R3を用いて集める（約400個／皿）。 −40個のディスクを滅菌濾紙上で乾燥し、次にディスクを培地１の上に置いてコントリル(contril)とする（２個の皿）。 −MS₃₀R3培地をピペットで除いて、アグロバクテリウム・モックス（Agrobacter ium mox）で置換する。 −20分後、そのアグロバクテリウム懸濁液を液体MS₃₀R3で置換する。 −これらディスクを滅菌濾紙上で乾燥し、次いでそのディスクを培地１が入っているペトリ皿に移す（20個ディスク／プレート）。 −これらディスクをパラフィルムで密封して再生室に入れる。４日目。培地２に関してはプアープレート。５日目。ディスクを培地２が入っているプレートに移す（20ディスク／プレート）。８日目。培地３に関してはプアープレート。９日目。ディスクを培地３が入っているプレートに移す（10ディスク／プレート）。３日目に浸漬されないディスクで下記の対照を作製する。１．浸漬なしで選択なし（20ディスク、２プレート）２．浸漬なしで選択あり（20ディスク、２プレート）追加の対照として次のものを作製する。３．浸漬ありで選択なし（20ディスク、２プレート）これらディスクは３週間毎に新しい培地中に移す。３週間後に第一シュートが目視可能になる。シュートが充分大きくなったとき、それを切り離して培地４が入っている試験管内に入れる（発根するのに３週間かかる）。必要な滅菌培地基礎培地の製造： −1L MS₃₀R3 の場合、100ml 10^* MS塩類 10ml 100^* R³ビタミン類 30ｇスクロース８ｇ Diachin寒天 KOH でpHを 5.8に調節し、 110℃で20分間滅菌する。ジャガイモのストックコレクション（stock collection）に用いる培地の製造： −１ｌの1/2MS₂₀R3 の場合、50ml 10^* MS塩類 5 ml 100^* MSビタミン類 30ｇスクロース 8 ｇ Daichin寒天 KOH でpHを 5.8に調節し、 110℃で20分間滅菌する。適性なホルモン類と抗体類を含有する基礎培地：１．MS₃₀R3＋ 3.5mg／ｌ Zeatin Riboside 500μｌストック溶液（3.5mg／ml）／500ml； 0.03mg／ｌ I.A.A．15μｌストック溶液(1.0mg／ml)／500ml 。２．MS₃₀R3＋ 3.5mg／ｌ Zeatin Riboside 0.03mg／ｌ I.A.A.， 200 mg／ｌセホタキシム、500μｌストック溶液(200mg／ml) ／500ml，100mg／ｌバンコマイシン 500μｌのストック溶液(100mg／ml)／500ml ３．MS₃₀R3＋ 3.5mg／ｌ Zeatin Riboside 0.03mg／ｌ I.A.A. 200 mg／ｌセホタキシム 100 mg／ｌバンコマイシン 100 mg／ｌカナマイシン 500μｌストック溶液（100mg／ml）／ 500ml、適性なホルモン類と抗体類を含有するストックコレクション培地；４．1/2 MS₃₀R3＋ 100mg／ｌセホタキシム 50mg／ｌバンコマイシン 100mg／ｌカナマイシンｄ．遺伝子発現の分析抗クラスターＡ抗血清を用いウェスタンブロット法で、形質転換植物をクラスターＡタンパク質について分析することができる。mRNAのレベルをノーザンブロット法で試験する場合は、クラスターＡ由来の適切なcDNAフラグメントをプローブとして使用する。クラスターＡタンパク質の産生を増大させた植物を、真菌に対して高められた耐性のレベルについて試験する。クラスターＡとβ−１，３−グルカナーゼの同時に高められたレベルを示す植物は、真菌の感染に対して一層高い抵抗性を有すると期待される。実験ポリメラーゼ連鎖反応 DNA の増幅は、１ngのクラスターA DNA，0.2μＭのＴ７プライマー， 0.2μＭのプライマーｐ１および２単位のテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus )のDNA ポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus社，オランダ Gouda）を含有する反応混合物50μｌ中で、94℃で 0.5分間、50℃で２分間および72℃で 1.5分間の逐次インキュベーションの35サイクルで行った。反応生成物の一部（４％）をアガロースゲル中で電気泳動を行わせて、正しい大きさのDNA フラグメントが合成されたことを確認した。PCR DNA 生成物の残りをエタノールで沈澱させ、次いで洗浄して過剰の塩を除いた。 cDNAライブラリーの合成と分析 TMV に感染したタバコからのポリ（Ａ）±RNA の単離、cDNAの合成、およびλ ベクターUni-ZAP XR中に一方向にクローン化されたcDNAライブラリーの構築を、メーカー（米国，カリフォルニア州，ラ・ホーヤ所在のStratagene社）の説明にしたがって実施した。cDNAクローンPROB40の³²P 標識挿入物をプローブとして用いて組換えファージ類を選別した（Hooft van Huijsduijnen，R.A.M.ら，EMBOJ. ，５巻，2057〜2061頁，1986年）。ヘルパーファージR408（Stratagene社）による同時感染によって、cDNAを含有するpBluescript プラズマを単離されたλファージから放出させた後、クラスターＡのcDNA挿入物をＭ13誘導体中にサブクローン化し、次いでＭ13プライマーおよびＭ13プライマーによって得たcDNA配列に基づいたプライマーを用いて配列を決定した。あるいは、cDNAは、Ｔ３またはＴ７のプライマーを用いて変性プラスミドDNA から直接配列を決定した（米国，ウィスコンシン州，マジソン所在のPromega 社；Chen & Seeburg，DNA，4巻，165〜170頁，1985年）。タンパク質の精製タバコモザイクウィルスに感染させてから７日後に、タバコの葉からタンパク質を抽出し、40mM NaOAc，pH5.2 内で平衡させたG-25カラムを通過させて脱塩を行った（Woloshuk，C.P.ら，The Plant Cell，３巻， 619〜 628頁，1991年）。その脱塩されたタンパク質溶液を氷上に一夜放置し、次いで20,000ｇで50分間遠心分離に付した。得られた上澄み液を、40mM NaOAc pH5.2内で平衡させたＳ−セファロース（fast flow，Pharmacia社）のカラム（５×５cm）に注入した。吸着されたタンパク質を、上記緩衝液中０〜0.3M Nacl の塩直線勾配液で溶離した。３番目毎の画分を免疫ブロット法で分析し、クラスターＡを含有する画分をプールし、次に50mMトリスHCl pH8.0 中に対して透析した。この溶液を、0.1M 2nCl₂ (pH＝5.4)のわずかに酸性の溶液（50ml）によって活性化されたキレートセファロースカラム(HR 10/2； Pharmacia社)を通過させた。そのカラムを水(500ml)で充分に洗浄し、使用する前に上記トリス−緩衝液内で平衡させた。各々３〜４mg のタンパク質を含有するクラスターＡ含有プールを、いくつもの試験で注入した。遅延タンパク質ピークをプールして、キレートセファロースクロマトグラフィーに再度付した。キレートセァロースカラムをCu²⁺イオンで活性化すると一層強固な結合が観察されたが、これらの条件下での精製は余り有効でなかった（データは示していない）。最後の精製ステップは、200mM NaClを含有する50mM KHPO₄ 緩衝液pH7.0 内で平衡させたSuperdex -75 カラム（HR 10/30：Pharmacia 社）を通過させるゲル濾過法であった。ゲル濾過は 0.5ml／min の流量で実施し、 0.5mlづつの画分を集めた。これらの画分を、SDS-PAA ゲル電気泳動法と免疫ブロッティング法で分析した。 SDS-ゲル電気泳動法、免疫ブロッティング法および配列決定法タンパク質試料を、Laemmli が報告しているようにして12.5％SDS-PAA ゲルで分離した（Laemmli，U.K.，Nature，227巻， 680〜 685頁，1970年）。免疫ブロッティングと検出は、Amersham社（英国）が提供しているECL ウェスタンブロッティングプロトコルにしたがって実施した。PR-4a,b トマト由来の同族体(PR-P2 )に対する抗血清はオランダのWageningen在住のMatthieu Joosten氏から提供されたものである。免疫検出を行う際には、推定クラスターＡタンパク質に対する抗血清を１：2000の比率で希釈して使用した。配列を決定するため、タンパク質は、Moosが報告しているようにして分離し（ Moos，M.ら，J．Biol．Chem.,263巻，6005〜6008頁，1988年）次いでMatsudaira らが報告しているようにしてPVDF膜に対し電気ブロッティングを行った（Matsud airaら，J．Biol.Chem.，262巻，10035 〜10038 頁，1987年）。クーマシーブリリアントブルーR-250 で染色することによってタンパク質を目視可能にした（Ma tsudairaらの1987年の前掲文献）。その推定クラスターＡタンパク質はＮ末端がブロックされていたので、Landonが報告しているようにしてPVDF膜上で酸加水分解を行った（Landon，M.,Methods of Enz.，47巻， 145〜149 頁，1977年）。生成した消化産物（２種のペプチドで構成されている）は、Applied Biosystems 4 77A タンパク質配列決定装置で、エドマン分解を利用し、Eurosequence，Gronin gen,オランダによって配列を決定した。酵素検定法キチナーゼ活性の測定は、Molanoらが報告しているようにして通常どおりに実施した（Molanoらの1977年の前掲の文献）。WithおよびWolfが報告した青色基質検定法（Wirth，S.J．およびWolf，G.A.，J．Microbiol，Meth.， 12巻， 197〜 205 頁，1990年）：Roberts およびSelitrennikoffが報告したｐ−ニトロフェニル放出検定法（Roberts W.K.およびSetitrennikoff，C.P.，J．Gen．Microbiol. ， 134巻， 169〜176 頁，1988年）：ならびにMcCreathおよびGoodayが報告した４−メチルウンベリフェロン放出検定法（McCreath，K.J.およびGooday，G.W.， J．Microbiol．Meth.，14 巻， 229〜237 頁，1991年）のような他の方法も使用した。リゾチーム活性は、Selsted とMartinezが報告したようにして50mM KPO4 緩衝液pH6.0 中で測定した（Anal，Biochem.， 109巻，67〜70頁，1980年）。キチナーゼ検定法 cA-3タンパク質を発現するよう誘導された細菌と対照の細菌を、遠心分離によって10mlの培養物から集め、得られたペレットを１mlのTBS(20mM トリス-HCl，p H7.5，150mM NaCl)中に再懸濁させた。その懸濁液を音波で処理した後、−20℃ で貯蔵した。キチナーゼ活性を検定する前に、１％のTriton X-100を添加した。健康なタバコの葉またはTMV に感染したタバコの葉の全タンパク質抽出液を５ml のTBS 内でホモジナイズすることによって得た。そのホモジネートを短時間遠心分離して不溶性物質を除き−20℃で貯蔵した。葉に水（nanopure）を真空浸透させる(Vaccum infiltration)ことによって細胞外タンパク質を得た。浸透された葉をシリンジ中に入れ、卓上遠心分離器で3000rpm にて５分間遠心分離に付した。細胞外タンパク質を含有する無色の洗浄液は−20℃で貯蔵した。50μｌの充分に洗浄した ³Ｈ標識キチン懸濁液、50μｌの細菌もしくは植物の抽出物、および 100μｌの50mMリン酸カリウムpH6.4 を含有する 200μｌの反応混合物のキチン加水分解活性を検定した。30℃で30分間インキュベートした後、 1 0％トリクロロ酢酸 0.5mlを添加した後、その混合物を遠心分離に付して沈降物質を除き、上澄み液 0.5mlを取り出してガラスウールで濾過した。可溶化された放射能を液体シンチレーション計数器で測定した。 RNA ブロット分析法とDNA ブロット分析法ストレスを受けていないかまたはストレスを受けたタバコ由来の全RNA を、凍結した葉の組織から、抽出緩衝液(１Ｍトリス-HCl，0.1MLiCl，10mM EDTA，1％ SDS，pH9.0)中でホモジネートすることによって抽出した。そのホモジネートをフェノールとクロロホルムで抽出し、次いでRNA を2M LiCl で沈澱させた。その RNA をグリオキシル化した後、 1.5％アガロースゲル中で電気泳動を行わせ、次にナイロン膜（Genescreen，New England Nuclear or Hybond-N，Amersham ）に対しブロットした。Cornelissen らが報告しているようにして（Nucl，Acids Re s.，15巻，6799〜6811頁，1987年）。タバコのゲノムDNA を単離し、消化し、電気泳動を行わせ、次にブロットさせた。タバコ核酸は、５×SSC，2％SDS， 50％ホルムアミド， 100μｇ／mlニシン精液DNA 中42℃で（１×SDS，50℃），クラスターＡの³²P標識cDNA挿入物とハイブリッドを形成させ、次いでオートラジオグラフィに付した。アグロバクテリウム菌株MOG101の獲得オクトピンTi−プラスミドpTiB６由来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス・ビルレント機能を付与するヘルパープラスミド、すなわちMOG101を構築した。MOG101は、全Ｔ領域がトランスポゾンTn1831由来の細菌のスペクチノマイシン耐性マーカーで置換された非腫瘍性Tiプラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌株である（Hooykassら，Plasmid，4巻，64〜75頁，1980年）。そのTiプラスミドpTiB６は２種の隣接するＴ領域すなわちTL（Ｔ−左）および TR（Ｔ−右）を含有している。TL領域とTR領域を欠いた誘導体を得るため、この発明の発明者らは中間ベクターpMOG579を構築した。プラスミドpMOG621 はpBR32 2の誘導体であり、Ｔ領域の外側の左右に位置する二つのTiプラスミドフラグメントを含有している（図２）。pMOG579 内で、これら二つのフラグメント（黒色で示す）は、スペクチノマイシン耐性マーカーを有する。トランスポゾンTn1831 由来の2.5Kb BamHＩ−HindIIIフラグメント（Hooykaasら，Plasmid，4巻，64〜7 5頁，1980年）によって隔てられている（図２）。そのプラスミドを、ヘルパーとしてHB1018(pRK2013)を用い、イー・コリから三親交配を行って、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株LBA1010 〔C58-C9(pTiB6)＝pTiB6 が導入されたキュアＣ58菌株（cured C58 strain）（Koekmans，Plasmid，７巻， 119〜132 頁，1982年）〕に導入した。トランスコンジュガントを、リファンピシン（20m g／ｌ）とスペクチノマイシン(250mg／ｌ)に対する耐性について選択した。pMOG 579 とpTiB6 の間の二重組合えによってカルベニシリン耐性（pBR322マーカー）が失われかつ全Ｔ領域が欠失した。カルベニシリン(100mg／ｌ)上にプレートした5000個のスペクチノマイシン耐性トランスコンジュガントのレプリカのうち２個が感受性であることが分かった。サザーン分析を行ったところ、二重乗換えを行った結果、全Ｔ領域が欠失したことが分かった（データは示していない）。得られた菌株をMOG101と命名した。この菌株とその構造は菌株GV2260（Deblaereら，Nucl．Acid Res.,13巻，4777〜4788頁，1985年）に類似している（MOG101は、 Hood，E.,Gelvin，S.B.，Melchers，L.S．およびHoekema，A.,Transg ene Research，２巻， 208〜218 頁，1993年に一層詳細に記載されており、請求のあり次第、MOGEN International N.V.から自由に入手できる）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月１５日【補正内容】請求の範囲１．エンド−キチナーゼ活性、抗菌活性及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により測定される場合、約40〜43KDa の分子量を有する、他の植物タンパク質から単離された植物タンパク質。２．エキソ−キチナーゼ活性を実質的に有さない請求の範囲第１項記載の植物タンパク質。３．植物キチナーゼクラスＩの活性よりも 200倍以上低い、基質としてのキチンに対するキチナーゼ活性、及び植物キチナーゼクラスＩの活性よりも高い、基質としての可溶性キチンに対するキチナーゼ活性を有する請求の範囲第１又は２項記載の植物タンパク質。４． TMV−誘発されたタバコ植物の葉から得られる請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の植物タンパク質。５．配列番号１又は７で表わされるようなアミノ酸配列、又はキチナーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の植物タンパク質。６．１又は複数のアミノ酸が、キチナーゼ活性を阻止することなく、置換され、欠失され又は付加されている請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の植物タンパク質。７．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の植物タンパク質を活性成分として含んで成る抗菌組成物。８．β−１，３−グルカナーゼ及び／又はキチナーゼをさらに含んで成る請求の範囲第７項記載の抗菌組成物。９．前記タンパク質の他に、前記タンパク質と共に菌類に対して相剰的に作用する追加のタンパク質を含んで成る請求の範囲第７項記載の抗菌組成物。 10．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードする読み取り枠を含んで成る単離されたDNA 配列。 11．配列番号１又は７のアミノ酸配列をコードする読み取り枠、及び緊縮条件下でそれらとハイブリダイズするDNA 配列を含んで成る単離されたDNA 配列。 12．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードするDNA 配列、又は前記タンパク質の前駆体を含んで成る、植物発現性組換えDNA 配列であって、前記タンパク質の形で植物において前記DNA 配列の発現のために必要な調節要素に物理的に連結されていることを特徴とするDNA 配列。 13．前記DNA 配列が、配列番号１又は７により表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質前駆体をコードする請求の範囲第12項記載のDNA 配列。 14．配列番号１又は７で表わされるようなDNA 配列を含んで成る請求の範囲第 12項記載のDNA 配列。 15．請求の範囲第12項記載のDNA 配列を含む、クローニングビークル又はベクター。 16．請求の範囲第15項記載のクローニングビークル又はベクターを含む細菌株。 17．請求の範囲第15項記載のベクターを含むアグロバクテリウム属の細菌株。 18．請求の範囲第12項記載の植物発現性組換えDNA 配列をそこに組込んでいる植物ゲノム。 19．請求の範囲第18項記載の組換え植物ゲノムを有する植物細胞又はその細胞のプロトプラスト。 20．請求の範囲第19項記載の１又は複数の細胞を含む植物又はその材料、たとえば球根、花、果実、葉、花粉、根又は根培養物、種子、茎、塊茎又は微小塊茎及び同様のもの。 21．実質的にすべての細胞が請求の範囲第18項記載の組換え植物DNA ゲノムを有する、植物又はその材料、たとえば球根、花、果実、葉、花粉、根又は根培養物、種子、茎、塊茎又は微小塊茎及び同様のもの。 22．菌感染に対してほとんど敏感でない請求の範囲第21項記載の植物又はその材料。 23．菌に対して低められた感受性を有する植物種を育てるための方法であって、親系の少なくとも１種が請求の範囲第18項記載の組換えDNA ゲノムを有することを特徴とする方法。 24．菌類の増殖及び／又は育成を阻害するための方法であって、請求の範囲第１項記載のキチナーゼの有効量と、前記菌類とを接触せしめ、又は前記菌類とキチナーゼの有効量との接触を引き起こすことを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボル，ヨーンフェルディナントオランダ国，エヌエル―2341 カーアーオエフストヘースト，ランジェボールト 34 (72)発明者コルネリッセン，ベルナルドゥヨハネスクレメンスオランダ国，エヌエル―2361 エーベーウァルモント，ヘレンウェッヒ 29 (72)発明者リントールスト，フベルトゥスヨゼフスマリアオランダ国，エヌエル―2331 ハーエスレイデン，アンクファンデルムウルストラート 70 (72)発明者メルヘルス，レオショウルトオランダ国，エヌエル―2331 ベーゼットレイデン，ウィルヘルミナブラデルフルーンウェッヒ 45 (72)発明者ポンステイン，アンネシレーネオランダ国，エヌエル―2318 エムエルレイデン，メールフォレル５ (72)発明者セラ−ブールラジェ，マリアンネベアトリックスオランダ国，エヌエル―3817 ベーペーアメルスフォールト，エディソンストラート 59

Claims

【特許請求の範囲】１．エンド−キチナーゼ活性、抗菌活性及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により測定される場合、約40〜43KDa の分子量を有する、他の植物タンパク質から単離された植物タンパク質。２． TMV−誘発されたタバコ植物の葉から得られる請求の範囲第１項記載の植物タンパク質。３．配列番号１又は７で表わされるようなアミノ酸配列、又はキチナーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る請求の範囲第１項記載の植物タンパク質。４．１又は複数のアミノ酸が、キチナーゼ活性を阻止することなく、置換され、欠失され又は付加されている請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の植物タンパク質。５．請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の植物タンパク質を活性成分として含んで成る抗菌組成物。６．β−１，３−グルカナーゼ及び／又はキチナーゼをさらに含んで成る請求の範囲第５項記載の抗菌組成物。７．前記タンパク質の他に、前記タンパク質と共に菌類に対して相剰的に作用する追加のタンパク質を含んで成る請求の範囲第５項記載の抗菌組成物。８．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードする読み取り枠を含んで成る単離されたDNA 配列。９．配列番号１又は７のアミノ酸配列をコードする読み取り枠、及び緊縮条件下でそれらとハイブリダイズするDNA 配列を含んで成る単離されたDNA 配列。 10．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードするDNA 配列、又は前記タンパク質の前駆体を含んで成る、植物発現性組換えDNA 配列であって、前記タンパク質の形で植物において前記DNA 配列の発現のために必要な調節要素に物理的に連結されていることを特徴とするDNA 配列。 11．前記DNA 配列が、配列番号１又は７により表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質前駆体をコードする請求の範囲第10項記載のDNA 配列。 12．配列番号１又は７で表わされるようなDNA 配列を含んで成る請求の範囲第 10項記載のDNA 配列。 13．請求の範囲第10項記載のDNA 配列を含む、クローニングビークル又はベクター。 14．請求の範囲第13項記載のクローニングビークル又はベクターを含む細菌株。 15．請求の範囲第13項記載のベクターを含むアグロバクテリウム属の細菌株。 16．請求の範囲第10項記載の植物発現性組換えDNA 配列をそこに組込んでいる植物ゲノム。 17．請求の範囲第16項記載の組換え植物ゲノムを有する植物細胞又はその細胞のプロトプラスト。 18．請求の範囲第20項記載の１又は複数の細胞を含む植物又はその材料、たとえば球根、花、果実、葉、花粉、根又は根培養物、種子、茎、塊茎又は微小塊茎及び同様のもの。 19．実質的にすべての細胞が請求の範囲第16項記載の組換え植物DNA ゲノムを有する、植物又はその材料、たとえば球根、花、果実、葉、花粉、根又は根培養物、種子、茎、塊茎又は微小塊茎及び同様のもの。 20．菌感染に対してほとんど敏感でない請求の範囲第19項記載の植物又はその材料。 21．菌に対して低められた感受性を有する植物種を育てるための方法であって、親系の少なくとも１種が請求の範囲第16項記載の組換えDNA ゲノムを有することを特徴とする方法。 22．菌類の増殖及び／又は育成を阻害するための方法であって、請求の範囲第１項記載のキチナーゼの有効量と、前記菌類とを接触せしめ、又は前記菌類とキチナーゼの有効量との接触を引き起こすことを含んで成る方法。