BG62701B1 - Хитиназа,кодираща хитиназата днк,и растения,които съдържат такава днк - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нов клас растителни хитинази, които имат ендохитиназна и фунгицидна активност и молекулно тегло, приблизително от 40 до 43кDа, както е доказано с натриева додецилсулфат електрофореза. Изобретението се отнася и до фунгициден състав, включващ хитиназа като активен ингредиент. Изолирана е ДНК последователност, която съдържа отворена четяща рамка, кодираща новата хитиназа.Изобретението се отнася още до растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност, която включва ДНК последователност, кодираща посочената хитиназа, и до растителни клетки, в чийто геном е включена рекомбинантната ДНК.

Description

Изобретението се отнася до хитиназа от растителен източник, кодираща хитиназата ДНК, и растения, които са били така трансформирани, че да съдържат и експресират посочените рекомбинантни полинуклеотиди с оглед продуциране и свръхпродуциране на посочената хитиназа. Изобретението се отнася до методи за предпазване на растенията от въздействието на патогенни агенти, включително и на получените по посочения по-горе начин. Изобретението се отнася и до антипатогенни състави, съдържащи като активен ингредиент хитиназата съгласно изобретението.

Предшестващо състояние на техниката

Растенията реагират на стресове като въздействие на патогени, химикали и наранявания посредством акумулиране на голямо количество протеини. Един от най-добре изучените отговори на растенията е индуцираната експресия на така наречените патогенетично свързани протеини, PR-npoтеини (Bowles, D.1990, Annu.Rev.Biochem. 59, 873-907; Linthorst, H.J.M., 1991, Crit. Rev. Plant Sci. 10, 123-150).

PR-протеините могат да бъдат групирани в поне пет семейства (PR-1 до PR-5) на базата на тяхната структура и/или активност. У тютюна в рамките на всяко семейство PRпротеини се различават както интрацелуларни (клас-I), така и екстрацелуларни изоформи.

Според PR-протеините са хитиназите, които представляват семейството PR-3 (Legrand М., et al. 1987, Proc Natl.Acad.Sci. USA, 84, 6750-6754). Хитиназите от клас-I притежават антигъбна активност (Broekaert W.F. et al., 1988, Physiol.Mol. Plant Pathol. 33, 319-331), по-специално в комбинация c β-1,3глюканаза (Schlumbaum A. et al. 1986, Nature 324, 365-367), са от-несени към семейството PR-2 (Kauffmann S.et al. 1987, EMBO J. 6, 3209, 3212).

Наличието на хитинази и клонирането на съответстващите им сДНК е описано за много растителни видове както от дикотиледоне, така и монокотиледоне (най-последен обзор от Col-linge D.B. et al., 1993, The Plant Journal 3(1), 31-40). Съгласно тяхната първична структура хитиназите са групирани в три класа (Schinshi Н. et al. 1990, Plant Mol. Biol. 14, 357-368). Напоследък е установено, че някои хитинази не отговарят на тази класификация, предложено е те да формират клас IV. Хитиназите от клас I се характеризират с наличието на участък, богат на приблизително 40 молекули от аминокиселината цистеин.

Хитиназите от клас III не притежават секвенционно сходство с тези от класовете I или II. Хитиназите от клас IV, както е предложено от Collinge et al по-горе, включват хитиназа IV от захарно цвекло (Mikkelsen J. D. et al., 1992, In: Advances in Chitin and Chitosan I Brine, C.J.Sandford, P.A. and Zikakis, J.P.eds. Amsterdam Elsevier, in press) и основната хитиназа у ряпа ChB4 (Rasmussen U. et al., 1992, Planta, 187, 328-334), а така също и киселата хитиназа у бобови PR4 (MargisPinheiro M.et al., 1991, Plant. Moi.Biol. 17, 247, 253), показват секвенционно сходство c хитиназите от клас I по съдържанието на N-краен богат на цистеин участък, но са по-малки от хитиназите от клас I, дължащо се на множество делеции. Молекулните тегла на растителните хитинази граничат средно от около 26 до около 36 kDa.

Посредством клониране на гените, кодиращи PR-протеините, изменение на техните образци на експресия чрез поставяне на гените под контрола на изкуствени, т.е. конститутивни, регулаторни елементи, и повторното въвеждане на тези структури в растенията, става възможно редуцирането на възприемчивостта на растенията на въздействието на болестотворни агенти, в частност на гъби (ЕР application 0 440 304 Al; ЕР 0 460 753). Аналогична експресия на хитинази от клас I и β-1,3-Γπκ^ζ3Η33Η в трансгенни растения предизвиква подчертано повишение на устойчивостта спрямо гъбни заболявания у трансгенните растения, което показва степента на комбиниране на антипатогенни протеини.

Налице е постоянна необходимост от идентифицирането на нови хитинази за използване във фунгицидни състави и/или за клонирането на тези сДНК или гени в трансгенни растения и за оценка на податливостта на посочените растения спрямо въздействието на патогени, в частност въздействие на гъби.

Обект на изобретението е осигуряване на нови антипатогенни протеини, ДНК, която ги кодира, а така също и растения, които, съдържайки и експресирайки такава ДНК, да придаде на растенията редуцирана податливост спрямо атаките на патогени, в частност гъби.

Същност на изобретението

Изобретението представлява протеин, свободен от други растителни протеини, който притежава ендо-хитиназна активност, антигъбна активност и молекулно тегло от около 40 до 43 kDa, установено с Натриево-додецил сулфат полиакриламидна електрофореза. Предпочитан протеин е този, който се получава от листа на TMV-индуцирани тютюневи растения. Особено предпочитан е протеинът, притежаващ аминокиселинна последователност, както е представена в SEQIDNO:2 или 8, или негов фрагмент, притежаващ хитиназна активност. Съгласно изоб-ретението са предоставени и протеини, в които една или повече аминокиселини са заместени, делетирани или добавени без загуба на хитиназна активност.

Друг вариант на изобретението е фунгициден състав, включващ като активна съставка протеина съгласно изобретението. Предпочитаният състав е този, който включва и други протеини, действащи в синергизъм с него върху гъбите. Особено предпочитаните състави включват 3-1,3-глюканаза и/или хитиназа, за предпочитане хитиназа от клас I, по възможност от тютюн.

Друг вариант на изпълнение на изобретението е изолирана ДНК последователност, която включва отворена четяща рамка, кодираща протеина съгласно изобретението, за предпочитане такава, притежаваща последователността, показана на SEQIDNO:2 или SEQIDNO:8 или ДНК, хибридизиращи се с тях при строго определени условия.

Изобретението включва също растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност, която съдържа ДНК последователност, кодираща протеина съгласно изобретението, или прекурсор на този протеин, като ДНК последователността е присъединена към регулаторни елементи, необходими за експресирането й в растенията с оглед продуциране на посочения протеин. Предпочитаната растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност е такава, че кодира протеинов прекурсор с аминокиселинна последователност, представена на SEQIDNO:2 или SEQIDNO:7. Друга предпочитана растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност е посочената на SEQIDNO:1 или SEQIDNO:7.

Изобретението обхваща също среда за клониране или вектор, който съдържа ДНК последователност съгласно изобретението, както и бактериални щамове, съдържащи среда за клониране или вектор. Осигурени са бактериални щамове от рода Agrobacterium, съдържащи вектор, подходящ за трансфер на ДНК съгласно изобретението в растителни клетки или растения.

Друг вариант на изобретението предвижда растителни геноми, растителни клетки, включващи тези геноми и растения, регенерирани от такива растителни клетки, които в резултат на това продуцират или свръхпродуцират протеини съгласно изобретението. В идеалния случай експресията на ДНК кодиращи протеини съгласно изобретението е оптимизирано да доведе до получаване на растения, по-малко податливи на въздействие на патогени, по-специално на въздействието на болестотворни гъби.

Изобретението се отнася до растителен материал като луковици, цветове, плодове, листа, полен, корен или коренова култура, семена, стъбла или микростъбла или микростъбла и други, които имат една или повече клетки, съдържащи растителна експресионна ДНК съгласно изобретението.

Изобретението предвижда метод за селекция на сорт растение с редуцирана възприемчивост спрямо гъбни въздействия, характеризиращ се с това, че поне една от родителските линии притежава рекомбинантен ДНК геном съгласно изобретението, а така също и метод за намаляване опасността от увреждане на растенията при условията на култивиране. Други аспекти на изобретението, различни начини на приложението му и някои преимущества, са подчертани в подробното му описание. Изобрете-нието се илюстрира със следните фигури.

Описание на фигурите

Фигура 1 показва нуклеотидна последователност на Клустер-А гена и хомоложния сДНК клон. Пълната нуклеотидна и аминокиселина последователност на геномния Клустер-А клон са показани съответно на линия b и линия с. Над нуклеотидната последователност на линия а са показани само нуклеотидите, които са различни в сДНК клона. По аналогичен начин под Клустер-А протеиновата последователност в линия d са означени само аминокиселините, които са различни в сДНК последователността. Аминокиселинната последователност, определена чрез съгласуване на протеина, е подчертана. Вероятният сайт на разграждане на сигналния пептид между остатъците Ser (S) и Gin (Q) са посочени със стрелка.

Фигура 2 показва Southern blot анализ на три клона, съдържащи последователности, хомоложни на тютюневия Клустер-А ген. Три геномни клона на тютюна (клон 56; 59; 66) са пречистени и разградени с BamHI, Hindlll, PstI, SstI или Xbal, линии от 1 до 5 съответно, и са подложени на електрофореза върху 0,8% агарозен гел. Телът е оцветен и хибридизиран с Клустер-А сДНК и промит при 65°С в 0,1 х SSPE, 0,1% SDS.

Фигура 3 - Northern blot анализ на Клустер-А тРНК от тютюн при различни форми на стрес. Еднакви количества обща РНК, изолирана от нестресирани здрави листа на тютюн (Н) или от листа, инфектирани с TMV (Т), напръскани с ептефон (Е), наранени чрез срязване (W) или облъчени с UV-светлина (U), се хибридизират с Клустер-А сДНК сонда.

Фигура 4 - Подравняване на Клустер-А от Nicotiana tabacum с екзо-хитинази от Bacillus circulans, Serratia marcescens, Streptomyces plicatus, Brugia malayi (нематод) и Mus musculus (мишка). Черните кутии показват участъци с висока степен на идентичност съгласно множествения анализ за деспирализация по Schuler G.D.et al., 1991, Protein Struct.Funct.Genet. 9, 180-190.

Фигура 5 - Свръхпродукция на Cluster

А в E.coli (А). Върху различни 12,5% SDSполиакриламидни гелни проби се анализират обща фракция (Т), клетъчни дебриси (D) и разтворима фракция (S). (В): Имуноблот анализ на идентичен протеинов гел със специфично откриване на Cluster-A протеини.

Фигура 6 - Пречистване на Клустер-А протеина от инфектирани с TMV тютюневи листа. SDS-полиакриламидният гел показва протеиновият профил на различни пречистени фракции А: проба от листен екстракт, от който са отстранени солите, В: протеинов пул след S-сефарозо катийонообменна хроматография, С: протеинов пул след хелатообразузаща суперозна колона, D: пречистен КлустерА след гел-филтрационна хроматография. Линията “Мг” показва предва-рително оцветени маркери с молекулни тегла както е посочено.

Фигура 7 - Локализация на Клустер-А в клетките. Антисерумът срещу Клустер-А протеина се използва за определяне локализацията на Клустер-А в клетките. Анализирани са здрави неинфектирани тютюневи растения. Проби от обща протеинова фракция (линия а», листна фракция без екстрацелуларна промивна течност (линия в) и EF-фракция • линия с) са разделени върху 12,5% SDS-гел и се подлагат на разслояване с електрически ток върху PVDF мембрана. Използват се за откриване на Клустер-А протеини.

Фигура 8 - Инхибиране на растежа на Fusarium solani и синергичната активност на протеини от Клустер-А и Р-1,3-глюканазните протеини от клас I. Ефектът на Клустер-А върху растежа на гъбите in vitro се тестува чрез добавяне на Клустер-А към прегерминативни спори от Fusarium-solani както самостоятелно, така и в комбинация с р-1,3-глюканази от клас I. Означени са количествата на протеините (в gg). След инкубация в продължение на три дни при 20°С, гъбният мицел се визуализира чрез оцветяване с лактоферон котон блу.

Фигура 9 - Схематично представяне на вектора pMOG183, производно на pMOG181, където сайта на разпознаване EcoRI е заместен със сайта SstI. Този вектор може да бъде взет от MOGEN International N.V. при поискване.

Фигура 10 - Схематично представяне на вектора pMOG185, производно на P-MOG183, където сайта на разпознаване EcoRI е променен в сайт на разпознаване Xbal.

Фигура 11 - pMOG800: Подходящ бинарен вектор от опосредствана с Agrobacterium растителна трансформация, съдържаща растителен експресионен резистентен на канамицин ген за подбор на трансформантите и множествен сайт за инсерция на експресионни касети.

Подробно описание на изобретението

Съгласно изобретението са създадени нови класове хитинази, които могат да бъдат изолирани от растения. По-специално е създаден протеин с размер приблизително 40-43 kDa от индуциранг с TMV тютюневи растения. Установено е, че този протеин е кодиран от отворена четяща рамка, която е сходна с сДНК, по-рано наричана Клустер-А (Hooft van Huijsduijnen R.A.M. et al., The EMBO Journal 5 (9), 2057-2061). В тази публикация са описани шест клустера от шРНК (А до F), които са TMV- и салицилат-индуцируеми в тютюн. Авторите охарактеризират тези тРНК от шестте клустера чрез подбрани с хибридизация in vitro транслации. Транслационните продукти на подбраните чрез хибридизация тРНК, съответстващи на най-голимия Клустер-А сДНК клон, продуцират комплекс от образци на протеини от 40, 35, 31, 28 и 25 kDa съответно (виж линия 6, фиг. 3 на Hooft van Huijsduijen et al, n- горе). Действителният протеин, продуциран от тази сДНК последователност, никога не е бил определен. Нито един от протеиновите фрагменти не е бил пречистен, нито структурата на който и да е от тези фрагменти е била определена. Не е известна също и физиологичната активност на нито един от тези протеинови фрагменти.

Съгласно изобретението протеинът, съот-ветстващ на тази клустер-А сДНК се пречиства до хомогенност от TMV-индуцирани тютюневи листа с помощта на антисерум. Антисерумът се създава срещу пречистен протеин, продуциран в E.coli, трансформиран с сДНК клон от тютюн, хибридизиран с PROB40. За клона PROB40 е известно, че влиза в кръстосана хибридизация с клустер-А сДНК (Hoof van Huijsduinen et al., по-горе).

C помощта на този антисерум в процеса на идентификация и пречистване клустер-А протеинът може да бъде изолиран от инфектирани с TMV тютюневи листа в достатъчно количество за изучаване на неговата физиологична и антипатогенна активност. Частичната аминокиселинна последователност на изолираният протеин е получена при съгласуване на пречистения протеин от тютюн; тя е изцяло идентична с аминокиселинната последователност, изведена от сДНК (фиг. 1).

Установено е, че клустер-А протеинът притежава ниска хитиназна активност върху белязан с тритий хитин като субстрат, около 250-500 пъти по-ниска от хитиназите от клас I от тютюн. При тестуване с колориметрична проба върху разтворим хитинов субстрат е установено, че активността му е двукратно по-висока от тази на хитиназите от клас I. Не е установена екзохитиназна активност или лизозимна активност. Заключението е, че клустер-А представя една ендохитиназа, но със свойства, различни на присъщите за клас I ендохитинази. Клустер-А е първият член на един изцяло нов клас хитинази в растенията. Установено е също, че клустер-А протеинът е локализиран интрацелуларно.

Клустер-А протеинът проявява антигъбна активност в in vitro изследване срещу гъбата Trichoderma viride. В комбинация с β1,3-глюканази тази активност се повишава синергично, както може да се заключи по чувствителността на множество подложени на изпитване гъби. Инхибирането едновременно на лизиса и растежа може да бъде установено върху Fasarium solani и Alternaria radicina при използване на комбинацията за тестуване клустер-А плюс Р-1,3-глюконаза.

СДНК, получена след скрининг на сДНК библиотека с PROB40, се използва като сонда за скрининг на геномна библиотека за изолиране на гена, кодиращ Клустер-А протеина. Охарактеризиран с един хибридизационен клон и е определена неговата нуклеотидна последователност. Пълната последователност на клустер-А гена като част от промоторния участък е посочена на фиг. 1 (SEQIDNO:7). Анализът на изведената аминокиселина последователност показва, че клустер-А протеинът е вероятно продуциран като по-голям прекурсор, на който сигналният пептид е изрязан, предполагаемото място на срязване е означено със стрелка. Анализът по Southern (фиг. 2) показва, че клустер-А генът е част от малко генно семейство, състоящо се от 4 гена.

Тази нова хитиназа, наричана от тук нататък Клустер-А протеин, може удачно да бъде използвана като активен ингредиент в антипатогенни, по-специално фунгицидни състави, за предпочитане в комбинация с други протеини, с които действа в синергизъм, например Р-1,3-глюканази. Подходящите концентрации на Клустер-А протеина са от около 0,01 pg/ml до около 100 pg/ml, за предпочитане от около 0,1 pg/ml до около 10 pg/ml. Фунгицидните състави съгласно изобретението могат да бъдат прилагани в селското стопанство за борба с фитопатогенни гъби в най-широк смисъл - в растениевъдството, лесовъдството, художественото градинарство, домашното градинарство, растителните култури и други подобни. Фунгицидният ефект на Клустер-А протеина може да бъде приложен и в други области на промишлеността като консервиране на напитки, храни, козметични средства и др.

ДНК, кодираща Клустер-А протеина, независимо дали е сДНК или геномна последователност, може да бъде клонирана зад регулаторните последователности, необходими за експресия на ДНК в растенията, с оглед продуциране или свръхпродуциране на Клустерния-А протеин в растения, трансформирани с посочената ДНК. Необходимите регулаторни елементи включват поне транскрибционен иницииращ участък и транскрибционен иницииращ участък, функционален в растения. Регулаторните последователности могат да включват и допълнителни елементи като енхансери за промотиране на транс-крибцията. Енхансерите могат да повишават експресията по конститутивен начин или по тъканноспецифичен или еволюционен или регулиран от условията на околната среда начин.

Предпочитан начин за експресия съгласно изобретението е по същество регулативно-конститутивна експресия, за предпочитане при високи нива (за целите на това изобретение около 0,1% от разтворимия протеин в листата се отнася като относително високо експресионно ниво). С относително конститутивен образец на експресия се означава образец, който не е драстично регулиран съобразно стадия на развитие на растението и който не е тъканно-специфичен. Промотор, който най-общо се счита от специалистите в областта като относително конститутивен и нерегулиран драстично съобразно стадия на развитие, е промоторът CaMV35S. Предпочитана версия на такъв промотор съдържа така нареченият двоен енхансер. Други регулативно-консти-тутивни промотори. които са подходящи за при-ложение съгласно изобретението, могат да бъдат получени от растителни вируси (напр. CaMV19S промотор, промотора на Figwort Mosaic Virus и др.), а така също и от растителни гени. Относително конститутивни промотори са също извличаните от Т-ДНК участъка на Ti и Ri-плазмиди от Agrobacterium, независимо дали са фланкирани или не от транскрибционни фланкиращи последователности. Известно е от литературата, че последователността между -343 и -90 от CaMV35S промотора повишава активността на CaMV35S промотора (Kay R.et al. (1987), Science 236, 1299-1302) и вероятно на други конститутивни промотори (напр. манопин синтазен промотор: US 5 106 739).

Примери за слабо индуктивни промотори с високо ниво на експресия са малката субединица на рибулозо карбоксилазния промотор (rbcSSU) и хлорофил а/b свързващия протеин промотор (Cab), които могат да бъдат прилагани съвместно съгласно изобретението.

Желателано е известно ограничаване на експресията на въведените химерни гени за един или няколко предварително подбрани органи или тъкани, например тези, които са мишена за гъбна атака, например корени, епидермални клетки и др. Добре известен пример за тъканно-специфичен промотор е например пататиновия промотор от клас II. Могат да бъдат използвани и специфични за корените промотори. Подходящите промотори за приложение в метода съгласно изобретението могат да бъдат и такива, индуцирани при нараняване.

Изобретението обхваща също приложението на хибридни промотори, т.е. промотори, които включват елементи, получени от регулаторни елементи на различни гени.

Растителните експресионни гени обикновено обхващат така наречените терминаторни последователности, включващи сигнал за полиаденилация. Възможно е също да се използва терминатора съгласно изобретението.

Думата “ген”, както е използвана тук, има смисъла да включва сДНК, а така също и транскрибиран участък на геномна последователност, която може да бъде както синтетична, така и частично синтетична. По желание използването на кодона може да бъде изменено например в монокотиледонови растителни гостоприемници, или в гостоприемници, различни от растение.

“Растителен ген за експресия” означава ДНК последователност, която е оперативно свързана към регулаторни последователности, необходими за транскрибция в растителна клетка и която продуцира РНК, при чиято транскрибция, след съответния процес, може да се транслира в протеин. Генът е “растителен експресионен” ако е експресиран в поне една тъкан в една определена фаза на жизнения цикъл на растението. Генът се счита за растителен експресионен дори ако не е експресиран при всички възрасти на развитие или само след индукция с по същество вътрешни или външни стимули.

“Растителна рекомбинантна експресионна ДНК последователност” съгласно изобретението означава последователност, която включва която и да е последователност, която комбинира поне две последователности, които не са асоциирани в природата. Например растителна експресионна рекомбинантна ДНК може да обхваща гени, които включват комбинации от функционални участъци на еукариотни гени като енхансери, транскрибционно/транслационни иницииращи участъци, участъци за кодиране, нетранслационни лидери, сигнални последователности, вакуоларни мишенни последователности, терминаторни последователности, интрони, екзони и други или техни части. Всяко делетиране, добавяне или заместване на един от тези елементи, водещо до определено ниво на експресия или образец, различен от ситуацията в природата, е разгледано в изобретението. Модификацията не е задължително да доведе до повишаване нивата на експресия. Изобретението например разглежда срязването на С-крайната част от протеина съгласно изобретението с оглед пренасочване акумулирането му към апопластичното (екстрацелуларно) пространство, което може да бъде предпочитана локализация за един антипатогенен протеин. Модификации като това срязване може да бъдат самото модифициране на гена, оставящо спомена за отворената четяща рамка, като другите последователности, които детерминират неговото функциониране (като промотора, терминатора, интроните и екзоните и др.), вече водят до ДНК, кодираща протени съгласно изобретението под определението за растителна експресионна рекомбинантна ДНК.

Като ефективно място за действие на антигъбните протеини при защитата на трансформирани растения срещу растителни патогенни гъби се счита апопластичното пространство. Следователно растението може да бъде трансформирано с рекомбинантна ДНК структура, кодираща растителен ген за експресия съгласно изобретението, която определя действието й в апопластичното пространство на растението или по естествен път или посредством генетична модификация.

Гените, кодиращи протеини, които естествено се срещат във вакуолата на растителната клетка, са така модифицирани, че С-крайните аминокиселини, включени във вакуоларната мишена, не са представени в транслационния продукт (напр. чрез въвеждане на транслационен стоп кодон в С-края на кодиращия участък на гена, или по друг начин). Ефектът от това срязване е насочването на вакуоларния протеин към апопластичното пространство (за подробности от методиката виж ЕР 440 304 А1).

Всяка от отбелязаните по-горе манипулации са добре познати на специалиста в областта и ефекта им върху нивото на експресия, насочването и устойчивостта на заболявания могат да бъдат правилно оценени с помощта на стандартни техники.

Трансформираните растения се оценяват за наличието на желани свойства и/или разширяването на които желани свойства е експресирано. Първата оценка може да включва нивото на експресия на нововъведени гени, нивото на устойчивостта на трансформираните растения спрямо гъби, стабилно онаследяване на желаните свойства, изпитания на полето и други.

По желание трансформираните растения могат да бъдат кръстосвани с други сортове, например сортове с по-висока търговска стойност или сортове, в които вече са въведени други желани характеристики, или са използвани за развиване на хибридни семена, или да бъдат субект на друг начин на трансформация и т.н.

Комбинирането на Клустер-А протеина с тютюневата 3-1,3-глюканаза предизвиква синергичен фунгициден ефект in vitro. Аналогично на това синергичен фунгициден ефект се очаква когато и двата протеина се продуцират или суперпродуцират in planta. Това следва от факта, че когато комбинациите от хитинази и глюканази довеждат до синергичен ефект in vitro, те правят това и in vivo (ЕР 440 304 Al).

Примери за протеини, които могат да бъдат използвани в комбинации с антигьбни протеини съгласно изобретението включват, но не се ограничават до, β -1, 3-глюканази и други хитинази като тези, получени от ечемик (Swegle М. et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12, 403-412; Balance G. M. et al., 1976, Can. J. Plant Sci. 56, 459-466; Hoj Ρ. B. et al., 1988, FEBS Lett. 230, 67-71; Hoj Ρ. B. et al., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 31-42, 1989), боб (Boiler T. et al., 1983, Planta 157, 22-31; Broglie K. E. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 68206824; Vegeli U. et al., 1988 Planta 174, 364372); Maych F. & Staehelin L. A., 1989, Plant Cell 1, 447-457); краставица (Metraux J. P. & Boiler T. (1986), Physiol. Mol. Plant Pathol. 28, 161-169); праз-лук (Spanu P. et al., 1989, Planta 177, 447-455); царевица (Hasser W. etal., 1988, Plant Mol. Biol. 11, 529-538); овес (Fink W. et al., 1988, Plant Physiol. 88, 270-275); грах (Mauch F. et al., 1984, Plant Physiol. 76, 607611; Mauch F. et al., 1988, Plant Physiol. 87, 325-333); топола (Parsons, T. J. et al., 1989, P. N. A. S. 86, 7895-7899), картофи (Gaynor J. J. 1988, Nucl. Acids Res. 16, 5210; Kombrink E. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 782786; Laflamme D. and Roxby R., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 249-250), тютюн (напр. Legrand M. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6750-6754; Shinshi H. et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89-93), домати (Joosten M. H. A. & De Wit P, J. G. M. 1989, Plant Rhysiol. 89, 945-951), пшеница (Molano J. et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4901-4907) и др.

Клонирането на растителни гени, съответстващи на протеини, които удачно могат да бъдат използвани в комбинация с гените, кодиращи антигьбни протеини съгласно изобретението и супер-експресията на такива гени в трансгенни растения, както и манипулирането на експресията (включително бомбардирането) и преценяването на устойчивостта спрямо болести in planta е във възможностите на специалиста в областта, както това е посочено inter alia в ЕР № 0 440 304 А1 и в ЕР 0 460 753 А2.

Трансгенните растения, които носят повече от един химерен антигъбен ген, могат да бъдат получени по различни методи, включително следните:

A. Използването на един рекомбинантен полинуклеотид, например плазмид, с множество модифицирани гени, присъединени към един селекционен маркерен ген по физичен начин.

B. Кръстосано опрашване на трансгенни растения, които са вече способни да експресират един или повече химерни гени, присъединени към ген, кодиращ селективен маркер, с полен от трансгенно растение, което съдържа една или повече генни структури, присъединени към друг селективен маркер. След това семената, получени чрез това кръстосване, се подбират на базата на наличието на два маркера. Растенията, получени от подбраните семена, след това могат да бъдат използвани за по-нататъшно кръстосване.

C. Приложение на множество различни рекомбинантни полинуклеотиди, например плазмиди, всеки от които притежава един или повече химерни гени и един друг селективен маркер. Ако честотата на ко-трансформацията е висока, тогава подборът на базата само на един маркер е достатъчен. В други случаи се предпочита подбора да бъде осъществен на базата на повече от един маркер.

D. Последователно трансформация на трансгенни растения с нови, допълнителни химерни гени и селективни маркерни гени.

E. Комбинации от отбелязаните по-горе техники.

Съгласно изобретението може да бъде предложен какъвто и да е растителен сорт, обект на някаква форма на гъбна атака. И съобразно с това всяко растение, подложено на гъбното въздействие, може да бъде третирано със състав, включващ антигъбен протеин съгласно изобретението.

“Растения” за целите на това изобретение ще означава гимносперми, а също и ангиосперми, дикотиледонови, а също и монокотиледонови растения, независимо дали са използвани в селското стопанство, растениевъдството, лесовъдство, градинарство или която и да е друга форма на използване на растенията, независимо дали за директно използване като храна или фураж, или за по-нататъшно използване в който и да е вид на индустрията, за екстракция на вещества, за декоративни нужди, размножаване, кръстосване или други цели.

По принцип може да бъде използван който и да е метод за трансформация за включване на растителен експресионен ген съгласно изобретението в избраните сортове растения. Най-общо се използва калциум/ полиетилен гликоловият метод за протопласти (Krens, F. A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), електропорация на протопласти (Shillito R. D. et al., 1985 Bio / Technol. 3. 1099-1102), микроинжектиране в растителен материал (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), частично бомбардиране на различни растителни материали (Klein Т. М. et al., 1987, Nature 327, 70), инфектиране с вируси и др.

В предпочитан вариант на изобретението приложението е осъществено чрез Agrobacterium-медииран ДНК трансфер. Специално се предпочита така наречената бинарна векторна технология, както е описана в ЕР 120 516 А и US 4 940 838.

След трансформация растителните клетки или експланти се селекционират по наличие на един или повече маркери, които са кодирани от растителни гени на експресия, трансферирани заедно с растителния ген на експресия съгласно изобретението, при което трансформираният материал се регенерира в цяло растение.

Макар монокотиледоновите растения да се считат за неподатливи на генетична трансформация, те все пак е възможно да бъдат трансформирани и да бъдат регенерирани фертилни трансгенни растения от трансформирани клетки или протопласти. Предпочитани методи за трансформация на монокотиледонови са микроинжекционно бомбардиране на експланти или суспензия от клетки, и директно взимане на ДНК или електропорация (Shimamoto et al., 1989, Nature 33S. 274-276). Трансгенни царевични растения са получени чрез въвеждане на Ьаг-ген от Streptomyces hygroscopicus, който кодира фосфинотрицин ацетилтрансфераза (ензим, който инактивира хербицида фосфинотрицин» в ембриогенни клетки на царевична суспензионна култура чрез микроинжекционно бомбардиране (Gordon-Kamm, 1990, Plant Ceil. 2, 603-618). Докладвано е за въвеждане на генетичен материал в алеуронови протопласти на други монокотиледонови зърнени растения като пшеница и ечемик (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21-30). Регенерирани са пшенични растения от ембриогенна суспензионна култура чрез подбор само на възрастни компактни и възлести ембриогенни калусни тъкани за получаване на ембриогенни суспензионни култури (Vasil, 1990 Bio/ Technol. 8. 429-434). Комбинирането с трансформационни системи за тези зърнени култури позволява прилагането на изобретението и към монокотиледонови растения.

Монокотиледоновите растения, включително търговски важните зърнени като пшеница и ориз, са податливи на трансформация с шамове на Agrobacterium (Gould J., Michael D.. Hasegawa 0., Ulian EC, Peterson G., Smith RH. (1991) Plant Phisiol. 95, 426-434) Hiei Y et al. (1994) Plant Journal 6, in press.).

Растения и растителни части, продуциращи или суперпродуциращи нови хитинази съгласно изобретението, както самостоятелно, така и в комбинация с други антигьбни гени, или гени, кодиращи протеини, които работят синергистично с хитиназите съгласно изобретението, могат да бъдат прилагани за оценка на устойчивостта спрямо патогенни агенти, в частност устойчивост срещу болестотворни гъби. Съответно могат да бъдат използвани по-устойчиви линии в селекционните програми за получаване на търговски сортове растения с повишена устойчивост на патогенни агенти, в частност болестотворни гъби.

Растенията с намалена чувствителност спрямо патогенни агенти или гъбни атаки могат да бъдат използвани на полето или в парниците, и съответно могат да бъдат използвани за храна на животните, за пряка консумация от хора, за продължително съхранение, за хранителната и други промишлености и др. Преимуществата на растенията или техните части съгласно изобретението са, че последните по-малко се нуждаят от фунгицидно третиране, означават по-ниски цени за материали, труд и по-слабо замърсяване на околната среда, както и удължен срок за съхранение на продуктите (плодове, семена и др.) на такива растения.

Загубите при събиране на реколтата могат да бъдат редуцирани благодарение на присъствието на повишени нива от хитиназата съгласно изобретението.

Могат да изникнат и други преимущества на изобретението за специалиста в областта, при което те да не излизат от обхвата на изобретението.

Изложените по-долу примери служат за подробна илюстрация на изобретението и тези примери или каквото и да е твърдение, направено в тях, не могат да служат за ограничаване обхвата на изобретението.

Пример 1. Изолиране на сДНК, съответстваща на Клустер-А

Известно е, че Клустерна-А тРНК е силно индуцирана след TMV-инфекция с Nicotiana tabacum cv. Samsun NN (Hooft van Huijsduijnen et al., 1986, по-горе) Скринингът на сДНК библиотека (виж Експерименталната част) от TMV-инфектирани тютюневи растения Samsun NN със сонда, получена от PROB40 (частичен Клустерен-А сДНК клон) води до изолиране на 11 позитивно хибридизиращи се клона. Анализът с рестрикционни ензими и (частичен) секвенционен анализ показва, че всички клонове са идентични. Заключението е, че клоновете съответстват на Клустерна-А сДНК. Определена е нуклеотидната последователност на един от тези клонове (сА-3) (експериментална част) и е показана на SEQIDNO: 1 и 2. В този клон липсват 7 кодона от 5’ частта на отворената четяща рамка.

Пример 2. Клониране на сДНК клон в бактериален експресионен вектор

Клонът сДНК е окомплектован чрез провеждане на PCR реакция (Експериментална част) върху клон сА-3 със следния праймер Т7:

5’-AATACGACTCACTATAG - (SEQIDNO: 3) и праймер pl: 5’ GTTTCCTTCTCCATGG AACTAGTTTGCAC (SEQIDNO: 4).

След разграждане на PCR-амплифицирания продукт с рестрикционните ензими

Ncol и Xhol, електрофореза и изолиране на фрагмента от агарозния гел, последният се прикрепва към междинния, разграден с Ncol/ Xhol вектор pGV84, последвано от трансформация с Е. coli DH5a . Фрагментът Ncol/Xhol от позитивните клонове, получени в резултат от тази трансформация, впоследствие се прикрепя към разграден с Ncol/Sall бактериален експресионен вектор (pJLA602, Medac, Hamburg, Germany) и се използва за трансформиране на DH5a от Е. coli. Позитивните трансформанти се скринират чрез хибридизация към белязания клон сА-3 и присъствието на правилния размер и ориентация на инсерта се определя чрез рестрикционен анализ. Полученият в резултат плазмид pJLA-A53 съдържа вероятната КлустерА отворена четяща рамка (ORF), включително кодоните 20-377, надолу от тандемната организация на репресивните p_R и p_L промотори на фага и на високоефективният транслационен участък на Е. coli. Плазмидът pJLAА53 се използва за трансформиране на Е. coli, щам КА1092 (trp65, Ion, sFiA-1, malB) (Johnson, B. F. et al., 1977, Mol. Gen. Genet. 157, 91-97) [protease ]. Този щам се използва за получаване на Клустер-А протеин и за генериране на антитела. Щам КА1092, приютяващ pJLA-A53, е депозиран в Centraal Bureau voor Schimmelcultures 12.08.1993 под номер CSB 415.93).

Пример 3. Експресия на Клустерна-А сДНК в Е.coli и продуциране на антитела срещу вероятният Clu-А протеин

Клустерният-А сДНК ген, кодони 20377, е поставен под контрола на λ p_R и p_L промотори (Schaulder В. et al., 1987, Gene 56, 279-283) за суперекспресия на гена в Е. coli. На фиг. 5 е показана суперпродукция на вероятния 40 kDa клустер-А протеин в щам КА1092 на Е. coli. След разрушаване на клетките с ултразвук, агрегатите на клустерА протеина се изолират чрез центрофугиране с клетъчните дебриси (фигура 5, линия D). Експресията на вероятния Клустер-А сДНК ген е индуцирана чрез стимулиране растежа на културите за 3 h при от 30°С до 45°С във водна баня и инкубиране за още 3 h. Бактериите се събират чрез центрофугиране и се разтварят в 1/25 обема буфер (25 mM Tris, 192 тМ глицин, 6 М пикочна киселина, 2,5% SDS, 10% глицерол, 5% β-меркаптоетанол).

Вероятният Клустер-А протеин, продуциран в Е. coli, се пречиства и се използва за получаване на антитела (Експериментална част).

Фигура 5 показва Westwrn blot анализа на сходни протеинови фракции, посочени на фиг. 5, и демонстрира факта, че изолираните протеини са специфично насочени срещу вероятният Клустер-А протеин. Силен сигнал за Клустер-А протеина е намерен в общата фракция (линия Т) и фракцията на клетъчните дебриси (линия D) от индуцирани клетки на Е. coli, които съдържат Клустер-А експресионната структура. Слабият сигнал, намерен в линия S, показва, че в разтворимата протеинова фракция е налице малко количество от Клустер-А протеина.

След нагряване за 3 min при 100°С пробите се подлагат на електрофореза върху SDS-полиакриламиден гел (Експериментална част) и протеините се визуализират чрез оцветяване с Coomassie Brilliant Blue. Сходни гелове се оцветяват с леден IM KCL и областите от гела, съдържащи суперпродуцирани 40 kDa протеини, се изрязват. След промиване с вода акриламидът се грундира и смесва с пълна имунизационна среда на Freund и суспензия с около 200 ng вероятен Клустер-А се инжектира субкутанно (подкожно) на зайци. След три допълнителни имунизации в интервали от по две седмици със сходни суспензии в непълна среда на Freund от зайците се събира по 50 ml кръв и серумните фракции се тестуват за антитела, насочени срещу вероятният Клустер-А протеин.

Пример 4. Изолиране и охарактеризиране на вероятния Клустер-А протеин от тютюн

Пречистването на вероятния КлустерА протеин от TMV-инфектирани тютюневи листа (Експериментална част) се наблюдават чрез имунодетекция с помощта на антисерум, получен съгласно пример 3.

Вероятният Клустер-А протеин очевидно се абсорбира към катионнообменника Sсефароза, показвайки базичната природа на протеина. Не са наблюдавани кръстосано свързващи се протеини при преминаването им през S-сефарозната колона. Вероятният Клустер-А протеин се елуира от S-сефарозната колона в присъствието на 75 до 140 тМ NaCl. По-детайлното изследване на SDSполиакриламидните гелове и имуноразслояванията показват, че два протеина с почти еднакви молекулни тегла (41 kDa и 43 kDa) показват кръстосана реакция спрямо антисерума. Очевидно двата протеина са свързани. Наличието на потенциални места за гликозилация в сДНК последователността (3 потенциални места за гликозилация) и в gAHK последователността (4 потенциални места за гликозилация) ни подсказа да изследваме свързването на предполагаемия Клустер-А протеин към СопА Сефароза. Поради това протеините се подлагат на диализа срещу 50 mM Tris, НС1, pH 6,8, съдържащ 1,15 NaCl, и се оставя за абсорбиране към Con-А сефароза. Повечето от 41 kDa Клустер-А протеин преминава през Con-А колоната, докато сред свързаните протеини присъства предполагаемия 43 kDa Клустер-А протеин, показвайки, че този покъсен протеин е поне частично гликозилиран. Con-А Сефароза не е прилагана при пречистването на вероятния Клустер-А протеин. Вместо това е използвана хелатна Сефарозна хроматография. Фракциите, съдържащи предполагаемия Клустер-А протеин, елуиран от S-сефарозната колона, се диализират срещу 50 mM Tris, НС1 буфер pH 8,0, съдържащ 150 тМ NaCl, и се оставят за абсорбиране срещу хелатираща Сефарозна колона, активирана с Zn²⁺ йони и се еквилибрират в горния буфер. Около 20% от общото количество на протеина се задържа от активирания матрикс и показва, че се състои предимно от Клустер-А протеин. Повторното прекарване през хелатираща Сефарозна колона довежда до получаване на почти чист протеин (фигура 5, линия D). Предполагаемият Клустер-А протеин се пречиства до хомогенност с последваща гелфилтрационна хроматография. Молекулното му тегло е между около 40 и 43 kDa.

Пример 5. Уточняване аминокиселинната последователност на предполагаемия Клустер-А протеин

Смес от двата Клустер-А протеина - 41 kDA и 43 kDa се разделя върху 12,5% SDSполиакриламиден гел и се оцветява електронно срещу PVDF мембрана. Сместа след това се използва за определяне на N-крайната аминокиселинна последователност чрез разграждане по Edman (Експериментална част).

Обаче N-краят бе блокиран, поради което не бе получена информация за последователността. Присъствието на уникален сайт, подходящ за кисела хидролиза, ни позволи да определим една междинна последователност от същия материал:

P-V-N-H-X1-S-G-S-D-X2-I-N-A-X3-I-Q (SEQID NO: 4). XI = V/I, Х2 = G, ХЗ = W.

Аминокиселината, предшестваща тази последователност, е най-вероятно един Asp (D) остатък, доколкото използваното разграждане е специфично за Asp-Pro (London 1977. sub). Допълнителна секвенционна информация е получена след разграждане на предполагаемия Клустер-А протеин с хидроксиламин. То довежда до формирането на два пептида с приблизително еднакво молекулно тегло, които са попити заедно върху PVDF мембраната. Секвенирането на тази проба показва следните последователности:

G-L-N-Y-P-V-E-S-V-A-R-N-L-N-W (SEQID NO: 5) и:

S-H-A-Q-L-F-D-P-V-N-H-X-S-G-S-DG-I-N-A-W-I-Q-A-G-V (SEQID N0: 6) където X = I/V.

Тези пептидни последователности показват пълна идентичност с аминокиселинната последователност, предположена от сДНК клона (фигура 1; SEQID NO: 1 и 2). Това може да се заключи от онези сходни данни, по които двата протеина, пречистени от тютюн, кореспондират с протеина, продуциран от Е. coli КА 1092, трансформирани с частичния Клустер-А ORF. Пептидната последователност, съответстваща на позиция 233 на кодона, показва, че двете аминокиселини (V/²) присъстват в тази позиция в съотношение 1:1. Възможно е да са пречистени два силно идентични Клустер-А протеина да са пречистени и да се отличават по една аминокиселинна позиция в съгласувания участък.

Сравняването на Клустер-А протеина със сходните протеини в базата данни показва хомология с бактериалните хитинази ChiA и ChiB от Bacillus circulans и Serratia marcescens, съответно. Макар общата идентичност на Клустер-А с Chi-А (31%) и ChiB (26%) да е ниска, специфични участъци са високо съхранени в рамките на всичките три аминокиселинни последователности, както е показано на фигура 4. В допълнение е установена хомология с хитинази от Streptomyces plicatus, Brugia malayi (нематоди) и със секреторен протеин от Mus musculus (Murinae). Не е установена структурна хомоложност с четирите отчетливи класа растителни хитинази (Lawton К. et al., 1992, Plant Mol. Biol. 19, 735-743; Collinge, 1993, no-rope).

Пример 6.

Ензимни активности и локализация на Клустер-А в клетката

Хомоложността на Клустер—А протеина от тютюн с бактериалните хитинази предполага, че този протеин е вероятно способен да катализира хидролизата на хитин, а-1,4свързан полимер от N-ацетил-О-глюкозамин. Възможността за пречистване на Клустер—А протеина от тютюнев материал с помощта на антитяло позволява да се изпробва тази хипотеза. Клустер-А бе тестуван за хитиназна активност. В една ендо-хитиназна проба, с помощта на белязан с тритий хитин като субстрат (Molano J. etal., 1977, Anal. Biochem. S3. 648 - 656), Клустер—А протеинът показва специфична активност от 40 ± 6 срш за pg протеин, която е около 250 до 500 пъти пониска от специфичните активности на клас² хитиназите (Legrand М. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6750 - 6754; Sela Buurlage Μ. B. et al., 1993, Plant Physiol. 101, 857 - 863). Ho измерената c колориметрична гроба хитиназна активност на Клустер-А с помощта на разтворим хитин, оцветяващ субстрат (Wirth and Wolf, 1990, J. Microbiol. Methd. 12, 197 - 205), бе двукратно по-висока от тази на хитиназа от клас-I (таблица 1). Изпитването на Клустер-А за допълнителна ензимна активност показа, че този протеин не притежава екзо-хитиназна активност, хитобиазна, Р-1,3-глюконазна или лизозимна активност.

Локализацията на Клустер-А в клетката бе анализирано с помощта на различни фракции от листа на TMV инфектирани тютюневи растения, включително (а) обща листна фракция, (Ь) листен материал, от който е отстранен екстрацелуларната течност ' EF) и (с) EF-фракцията. Анализът по Westwrn показва, че Клустер-А протеините са локализирани предимно екстрацелуларно, хакто е показано на фиг. 6. Силен сигнал за Клустер-А протеин е намерен във фракция (а) и във фракция (b). В екстрацелуларната течност на инфектираните с TMV инфекти рани листа не са намерени Клустер-А протеини (фракция-с).

на Клустер-А протеини

Таблица 1. Хитиназни активности

Хитиназни активности (изразени за pg)

Протеин	Н3-хитинова проба	СМ-хитинова проба
PR-За (PR P)	1180 ± 57 cpm	36,2 ± 1,10 ODe
PR-3b (PR Q)	1087 ± 35 cpm	30,9 ± 1,90 ODe
32 kDA (Chi-I)	11471± 347 cpm	1,0 ± 0,03 ODe
Клустер-А	40 ± 6 cpm	2,1 ± 0,03 ODe
екзохитиназа #	746 ± 60 cpm.	7,0 ± 0,34 ODe

СМ-хитин, карбоксиметил-хитин, свързан с Remazol Brilliant Violet & Белязан с тритий хитинов субстрат (Molano et al., 1977).

$ р-нитрофенил, освобождаваща проба, субстрат р-нитрофенил хитобиоза (Roberts and Selitrennikoff, 1988). # екзохитиназа от S.griseus (Sigma С-1650).

Пример 7.

Фунгицидна активност на Клустер-А протеина in vitro

В по-ранни доклади е показано, че хитиназите от клас-I (Chi-I) и 3-1,3-глюканазите (С1и-1) могат да инхибират растежа на гъбите in vitro (Mauch et al., 1988; SelaBuurlage et al., 1993). Двата хидролитични ензима играят важна роля в защитните механизми на растенията срещу гъбни инвазии. Антигъбната активност на Клустер-А е изследвана чрез изпитване на активността на лизиране на този протеин самостоятелно или в комбинация с Chi-I и Glu-I върху различни гъби. Клустер-А протеина самостоятелно причинява лизис и инхибиране на растежа на Trichoderma viride при концентрация 12μ/ητ1, Върху фитопатогенната гъба Alternaria radicina Клустер-А протеинът инхибира растежа на гъбата при 30 до 60 pg/ml. Дори при високи концентрации (600 pg/ml) 25 не е установено въздействие върху Fusarium solani. Но Клустер-А протеинът проявява потенциален фунгициден ефект върху F.solani в синергизъм с клас-I Р-1,3-глюканазни (и хитиназни протеини). Синергичното действие 30 на тези протеини причинява както лизис на прегерминативни спори, така и инхибиране на F.solani, виж фиг. 7. Клустер-I протеинът не проявява въздействие върху фитопатогенните гъби Septoria lycopersici u Phytophto35 ra infestans (данни не са приведени).

Таблица 2. Антигьбна активност на Клустер-А протеина

Лизисна активност на Клустер-А протеина върху Fusarium solani u Alternaria radicina

Fusarium solani	Alternaria radicina
Клустер-А	Chi-I	Glu-I	Chi-I	Glu-I
pg/knafleH4e	0	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5
0	0	0	0	5	56	0	0	42	54
2	0	0	0	26	96	0	0	45	34
5	0	0	5	34	95	0	0	45	38

10	0	0	5	95	95	0	0	35 30
10 den.	0	-	-	-	-		-	-

Таблица 3. Антигъбна активност на различни протеинови препарати, изразена в % лизис и инхибиране на растежа (GI)
	Fusarium solani	Alternaria radicina
протеин	добавен пр. μg/kлaдeнчe	7 /о лизис	GI	7 /0 лизис	GI
Клустер-А	5-10	0 %	0	ND	4
Клустер-А	100	о %	0	ND	ND
Глюканаза	0,1	о %	0	ND	ND
Клу-А+Гл.	10 : 0,1	0 %	2-3	ND	ND
Хитиназа	0,1	0 %	0	ND	ND
Клустер-А	10 : 0,1	5 %	1	ND	ND

+ Хитин

Данни за денатурирани контролни проби са дадени в скоби, но само в случай, когато 25 те се отличават от 0 % лизис и/или Gi = 0.

Пример 8.

Изолиране на геномен клон, кодиращ Клустер-А протеин

Геномна библиотека от Nicotiana tabacum е скринирана с помощта на КлустерА сДНК инсерт на клона сА като сонда. Пречистени са три рекомбинантни λ фаги, всеки от които съдържат различни рестрикционни фрагменти, хибридизиращи се към $$ Клустер-А сДНК. Геномният Клустер-А хомолог на сА се амплифицира чрез полимеразна верижна реакция с помощта на специфични олигонуклеотидни праймери, съответстващи на 5’ крайния кодиращ участък LS42: ₄θ

5’-TCTCCGGCAACTAGTTTGCAC-3’ (SEQIDNO : 10) и 3’ крайния, не-кодиращ участък на Клустер-А сДНК LS42:

5’-GTCATAGTTCACATATCTGTTG СС-3’ (SEQIDNO : 11). ₄₅

Само един от трите фага показва особено силна амплификация на специфичните последователности с тези праймери, поради което е подбран за по-нататъшни анализи. Пълната нуклеотидна последователност на Клустер-А сДНК, включваща изведената първична структура на Клустер-А протеина и последователностите от 5’-фланкиращите и 3’-фланкиращите участъци на гена, са показани на SEQIDNO : 7 и 8. Сравняването на сДНК участъка с Клустер-А гена показва, че тези последователности споделят висока степен на идентичност (94 %). В рамките на 5’ крайния участък е намерен един мотив “СААТ” (позиция 391) и един “ТАТААТ” мотив (позиция 428). В 3’ крайния некодиращ участък е установен потенциален сигнал за полиаденилация (5’-DDJDDD-3’) при позиция 2971. Кодиращият участък на Клустер-А гена се съдържа в два екзона и поражда прекурсорен протеин от 377 аминокиселини. Клустер-А прекурсорен протеин съдържа предполагаем сигнален пептид от 25 аминокиселини, който е включен в транспорта през мембраната на ендоплазматичния ретикулум, а така също и 4 потенциално Nсвързани места за гликозилация (N-X-S/T). Предсказаният зрял протеин има изчислено молекулно тегло от 39,033 Da. Интервентните последователности от 952 bp и 349 Ьр в дължина присъстват след кодон 151 и 364 съответно. За оценка на множеството от гени, кодиращи Клустер-А подобните протеини в тютюна, геномна Southern blot проба се сондира с сДНК клон. Образците от хибридизационните свързвания към сондата при ограничаващи условия показват, че КлустерА е част от малко генно семейство с поне 4 различни члена (фиг. 2). Тютюневи растения се подлагат на различни стресови състояния и се анализират по Northern за определяне индуцирането на Клустер-А генната експресия. Пробите от различни третирания се взимат три дни след инокулация с TMV, два дни след нараняване, 1 ден след третиране с етефон и 1 ден след облъчване с ултравиолетови лъчи. При тези пунктове във времето е докладвана максимална експресия на PR гените (PR-1 до PR-5) от Brederode и сътрудници (1991, Plant Mol. Biol. 17, 1117 1125) и се използва тук за изследване на Клустер-А генна експресия. Фигура 3 показва, че в нестресирани тютюневи листа няма установена експресия на Клустер-А гена. TMV инфекция на тютюневи листа с етефон за продуциране на етилен или облъчване с ултравиолетова светлина води до повишаване на Клустер-А тРНК (фиг. 3, линия Е и U). В противовес на това е установена слаба индукция на Клустер-А експресия след нараняване на листата. Тези резултати, взети заедно, показват, че Клустер-А може да бъде класифициран като нов свързан с патогенезата ген на тютюна.

Пример 9.

Конструиране на експресионна структура и бинарни вектори

Клустер-А генът е клониран като един приблизително 5,5 kb Sstl-фрагмент. Цялата отворена четяща рамка е локализирана в този фрагмент, като заема около две трети от фрагмента; 5’ краят на отворената четяща рамка стартира приблизително от позиция 453 от един SstI сайт. С помощта на PCR се въвежда BamHI сайт нагоре от 5’ края на ORF, както следва. Оригиналната последователност (фиг. 1, позиция 406) 5’-TTTAAACTCGAAGT САСАААТТААА-3’ (SEQIDNO : 12) (позиция 432) се модифицира в (позиция 406) 5’TTTAAACTCGGATCCACAAATTAAA-3’ (SEQIDNO : 13) (позиция 432).

По аналогичен начин EcoRI сайта в pMOG182 (фиг. 9) се модифицира в Xbalсайт с помощта на следната адапторна последователност:

5’-AATTGTCTAGAC-3’ (SEQIDNO : 14). Модифицираната клонираща среда е наречена pMOG185 и съдържа CaMV 35S промотор и nos-терминатор и BamHI-сайт за инсерция на Клустер-А гена помежду. Към този край се клонира отворената четяща рамка на Клустер-А гена като един приблизително 5,1 kb BamHI-SstI сайт с помощта на новосъздаден BamHI сайт на Клустер-А фрагмента, в BamHI сайта на модифицирания експресионен вектор pMOG185. Клустер-А генът е фланкиран нагоре от 35s CaMV промотор с двоен енхансер и надолу от nosтерминатор, сега е локализиран в Xbal-SstI фрагмент. Този фрагмент съответно се клонира в бинарен вектор pMOG800 (фиг. 10). Бинарният вектор pMOG800 съдържа растителния експресионен ген за резистентност на канамицин между ляв и десен ТДНК край, както и мултиплен клониращ сайт за инсерция на рестрикционни фрагменти. В Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands, nog N CBS 414. 93 e депозиран един щам от Е.coli, приемащ този вектор, с помощта на подходяща синтетична двойноверижна, частично комплементарна, адаптерна последователност (напр. 5’AGCTCACG-3’ 3’-GTGCTTAA-5’). Така полученият бинарен вектор съдържа както по същество конститутивно експресионен Клустер-А ген. така и растителен ген за експресия ΝΡΤΠ като маркер, локализиран между ТДНК последователностите отляво и отдясно.

С помощта на плазмида pRK2013 този pMOG800 бинарен вектор след това се мобилизира от Е.coli DH5a в Agrobacterium tumefaciens, щам MOG101, който приема хелперен плазмид с Vir-функциите. Трансконюгантите се изолират от селекционната среда, съдържаща 40 mg/1 рифамицин, 250 mg/1 спектиномицин и 100 mg/1 канамицин (за подробности виж Експерименталната част). Клетките от Argobacterium, които са получили бинарния вектор, се използват за трансформация на растения.

Пример 10.

Трансформация на растения и анализ на експресията

а. Домати

Трансформацията на домати (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) c щамове на Argobacterium MOG101, приемащи pMOG800, получили бинарен вектор, се провежда по същество както е описано от McCormick et а!.. (1986, Plant Cell Rep. 5, 81 - 84).

b. Тютюн

За трансформация на тютюн се използва метода на листните дискове (1985, Horsch et al., Science 227, 1229- 1231). Листните дискове се култивират заедно с щам на Agrobacterium MOG101, приемащ бинарния вектор, и растат върху селекционна среда със 100 mg/ml канамицин. Трансгенните кълнове регенерират до цели растения и се анализират за експресия на нововъведените гени. За целите на анализа се използва разслояване по Westwrn с помощта на антисерум срещу Клустер-А протеина и/или глюканаза.

c. Картофи cv. Kardal

Картофените клубени следва да бъдат съхранявани при +4°С. Седем дни преди трансформацията те следва да бъдат прехвърлени на стайна температура.

Ден 1. Инокулира се щам Agrobacterium от прясна паничка в 10 ml LB + 100 mg/1 канамицин + 20 mg/1 рифампицилин.

Оставя се една нощ при 29°С.

Ден 2. Суспензията от Agrobacterium се разрежда 1 : 10 в минимална среда +100 mg/ 1 канамицин. Оставя се за една нощ при 29°С. Отливат се паничките със среда 1.

Ден 3. Суспензията от Agrobacterium се разрежда до OD₆₀₀ ±0,15 в минимална хранителна среда без антибиотици и расте до OD₆₀₀ 0,30 - 0,70 (това отнема около 4 h). Културата се обръща и се приготвя разреждане 1 : 10 в MS₃₀R3. Картофите се обелват.

- Промиване 1 min с етанол 70 %.

- Промиване 20 min в разреден 1 : 5 Teepol + 0,1 % Tween 20.

- Еднократно промиване със стерилна вода.

- Добавяне на ±100 ml смес 1 : 1 от RK : KI (Синьото оцветяване следва да се задържи около 2 min).

- Отмиване на синьото оцветяване със стерилна вода.

- Клубените се нарязват на резенчета с дебелина около 2 mm.

- Изрязват се малки дискчета от васкуларната тъкан.

- Дискчета се събират в големи петриеви панички (15 cm) с течен MS₃₀R3 (около 400 за една паничка).

- Изсушават се около 40 диска върху стерилна филтърна хартия и се поставят в среда 1 като контрола (2 панички).

- Средата MS_3OR3 се отстранява с пипета.

- Суспензията от Agrobacterium се премества за течни MS_3OR3.

- Дискчетата се изсушават на стерилна филтърна хартия и се прехвърлят в петриеви панички със среда (20 диска за паничка).

- Дисковете се затварят с парафин и се поставят в стая за възстановяване.

Ден 4. Паничките със среда 2 се отливат.

Ден 5. Дискчетата се прехвърлят в панички със среда 2 (20 диска за паничка).

Ден 8. Отливат се паничките със среда

3.

Ден 9. Прехвърлят се дискчетата в панички със среда 3 (10 диска за паничка).

От дисковете, които не са потънали на 3-тия ден, се изготвят следните контроли:

1. Не са потънали и няма селекция (20 диска, 2 панички).

2. Не са потънали и със селекция (20 диска, 2 панички).

Правят се допълнителни контроли:

3. Потънали и няма селекция (20 диска, 2 панички).

Дисковете се прехвърлят всеки три седмици в свежа среда. След 3 седмици могат да се видят първите кълнове.

Когато кълновете станат достатъчно големи, те се нарязват и се поставят в епруветки със среда 4 (образуването на корени може да отнеме 3 седмици).

Необходима стерилна среда: Получаване на основната среда:

- За 1 1 MS₃₀R3 100 ml 10 * MS соли ml 100 * R3 витамини g захароза g диахинов arap pH се довежда до 5,8 с КОН и се стерилизира в продължение на 20 min на 110°.

Изготвяне на среда за картофения шок:

- За 1 1 1/2 MS₂₀R3: 50 ml 10 * MS соли 5 ml * MS витамини g захароза g диахинов arap pH се довежда до 5,8 с КОН и се стерилизира 20 min при 110°С

Базична хранителна среда с хормони и антибиотици:

1. MS_3nR3 + 3,5 mg/1 разтвор на Zeatin Ribosid 500 μ 1 (3,5 mg/ml) за 500 ml;

0,03 mg/11.A.A. 15 μ 1 разтвор (0,1 mg/ml) за 500 ml.

2. MS_3OR3 + 3,5 mg/1 Zeatin Riboside,

0,03 mg/1 I.A.A.,

200 mg/J Cefotaxime, 500 μ 1 разтвор (200 mg/ml) за 500 ml,

100 mg/1 Vancomycin

500 μΐ разтвор (100 mg/ml) за 500 ml

3. MS₃₀R3 + 3,5 mg/1 Zeatin Riboside 0,03 mg/1 I.A.A.

200 mg/1 Cefotaxime

100 mg/1 Vancomycin

100 mg/1 Kanamycin 500 μΐ разтвор (100 mg/ml) за 500 ml

Колекционна среда c хормони и антибиотици:

4. 1/2 MS₃₀R3 + 100 mg/1 Cefotaxime mg/1 Vancomycin

100 mg/1 Kanamycin

d. Анализ на генната експресия

Трансгенни растения могат да бъдат анализирани за присъствие на Клустер-А протеина чрез разслояване по Western с помощта на анти-Клустер-А антисерум. Ако нивата на тРНК се тестват по Northern като сонда за Клустер-А се използва сДНК фрагмент. Растения с повишена продуктивност на Клустер-А протеин се тестват за повишени нива на резистентност спрямо гъби.

Растения, които показват аналогично повишени нива на Клустер-А и Р-1,3-глюканаза, се очаква да притежават повишена резистентност срещу гъбна инфекция.

Експерименти

Полимеразна верижна реакция

ДНК амплификация се осъществява в продължение на 35 цикъла на секвенционни иткубации при 94°С за 0,5 min, 50°Сза 2 min и 72°С за 1,5 min в 50 μΐ реакционна смес, съдържаща 1 ng от Клустер-А ДНК, 0,2 μ М от праймер pl и 2 единици от Thermus aquaticus ДНК полимераза (Perkin - Elmer Cetus, Gouda, The Netherlands). Част от реакционните продукти (4 %) се подлагат на електрофореза върху агарозен гел за потвърждаване синтезата на ДНК фрагмента с правилния размер. Остатъкът от PCR ДНК продуктите се преципитират с етанол и се промиват за отстраняване на излишъка от соли.

Синтеза и анализ на сДНК библиотеки

Изолирането на поли (А) + - РНК от инфектиран тютюн, синтезата на сДНК и конструирането на сДНК библиотека, индиректно клонирана в λ вектора Uni-ZAP XR, се осъществява съгласно инструкциите на производителя (Stratagene, La Jolla Са.). Рекомбинантни фаги се скринират с помощта на белязани с Р³² инсерти на сДНК клона PROB40 като сонда (Hooft van Huijsduijen R. A. M. et al., 1986, EMBO J. 5, 2057 - 2061). След като се избавят от сДНК - съдържащите pBluescript плазмиди от изолирания λ фаг чрез едновременно инфектиране с помощния фаг R408 (Stratagene), сДНК инсерта на КлустерА се субклонира в М13 производни и се съгласува с помощта на М13 праймер и праймера се основава на сДНК последователност, получена с праймера М13.

Обратно, сДНК се съгласува директно от денатурирана плазмидна ДНК с помощта на праймерите ТЗ или Т7 (Promega, Madison WI; Chen & Seeburg, 1985, DNA 4, 165 - 170).

Пречистване на протеина

Протеините се екстрахират от тютюневи листа 7 дни след инфектиране с вируса на мозаичната болест по тютюна и солите се отстраняват чрез прекарване през колоната G-25, еквилибрират се в 40 тМ NaOAc, pH 5,2 (Woloshuk С. Р. et al., 1991, The Plant Cell 3, 619 - 628). Протеиновият разтвор, от който са отстранени солите, се оставя за една нощ върху лед преди центрофугиране за 50 min при 20 000 g. Получената в резултат супернатанта се натоварва върху S-Сефарозна колона (fast flow, Pharmacia) (5x5 cm), еквилибрирана в 40 mM NaOAc, pH 5,2. Адсорбираните протеини се елуират с линеарен градиент на солта от 0 до 0,3 М NaCl в горния буфер. Всяка трета фракция се анализира чрез имунологично разслояване и Клустер-А съдържащите фракции се прибавят и диализират в 50 тМ Tris, НС1 pH 8,0. Този разтвор се прекарва през хератираща Сефарозна колона (HR 10/2; Pharmacia), активирана от слабо кисел разтвор (50 ml) на 0,1 М ZnCl₂ (pH = 5,4). Колоната екстензивно се промива с вода (500 ml) и след това се еквилибрира в горния Tris-буфер преди използване. Клустер-А съдържащият пул се натоварва в няколко опита, всеки от които съдържа от 3 до 4 mg протеин. Пикът на задържания протеин се събира и се подлага отново на хелатираща Сефарозна хроматография. Макар че най-тясно свързване да се наблюдава след активиране на хелатиращата Сефарозна колона с Си²⁺-йони, пречистване при тези условия е по-малко ефективно (данни не са приведени). Крайният етап на пречистване се състои от гелфилтрация през колона Сефадекс - 75 (HR 10/30; Pharmacia), еквилибрирана в 50 тМ КНРО₄ буфер, pH 7,0, съдържащ 200 тМ NaCl. Гелфилтрацията се провежда при бавна скорост, възлизаща на 0,5 ml за минута, и фракциите от 0,5 ml се събират. Фракциите се анализират чрез SDSРАА гелелектрофореза и имунологично разслояване.

SDS-гелелектрофореза, имунологично разслояване и определяне на последователността

Протеиновите проби се разделят върху 12,5 % SDS-PAA гелове, както е описано от Laemmi (Laemmi U. К., 1970, Nature 227, 680 685). Имунологично разслояване и детекция (откриване) се провежда съгласно ECLWestern методиката, предоставена от A. Mersham, U К. Антисерумът срещу PR-4a,b хомолог от домати (PR-P2) е любезно предоставен от Matthieu Joosten, Wageningen, The Netherlands. За имунодетекция антисерумът спрямо предполагаемия Клустер-А протеин се прилага с разреждане 1 : 2000.

За целите на съгласуването протеинът се отделя, както е описано от Moos (Moos М. et al, 1988, J. Biol. Chem.263, 6005-6008) и се подлага на разслояване с електрически ток върху PVDF мембрана, както е описано от Matsudaira et al. (Matsudaira et al., 1987, J.Biol. Chem.262, 10035-10038).

Протеините се визуализират чрез оцветяване по Coomassie Brilliant Blue R-250 (Marsudaira et al., 1987, по-горе). Доколкото предполагаемият Клустер- А протеин e Nкрайно блокиран, той се подлага на кисела хидролиза върху PVDF мембрана, както е описано от Landon М., 1977, Methods of Enz. 47, 145-149). Фрагментите се съгласуват чрез Eurosequence, Groningen, The Netherlands c помощта на разграждане по Edman върху Applied Biosystems 477А протеинов секвенатор.

Ензимни изпитвания

Измерванията за хитиназна активност се извършват рутинно, както е описано от Molano et al (1977, по-горе). Използвани са алтернативни изпитвания като синята стандартна проба, описана от Wirth и Wolf (Wirth S.J.and Wolf G.A.1990, J.Microbiol. Meth. 12. 197-205), пробата за освобождаване на р-нитрофенила, описана от Roberts и Roberts и Selitrennikoff (Roberts and Selitrennikoff C.P., 1988, J.Gen.Microbiol. 134, 169-176) и пробата за освобождаване на 4-метилумбелиферон, описана от McCreath и Gooday G.W. (McCreath K.J.and Gooday G. W., 1991, J.Microbiol. Meth. 14.229-237).

Лизозимната активност се определя в 50 тМ КРО₄, буфер, pH 6.0, както е описано от Selsted and Martinez (1980, Anal Biochem. 109, 67-70).

Хитиназни проби

Бактерия, индуцирана да се експресира и контролира сА-3 протеин, и контролна бактерия се вземат от 10 ml култури чрез центрофугиране и утайката се ресуспендира з 1 ml TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 тМ NaCl). След обработка с ултразвук суспензиите се съхраняват при -20°С. Преди изпитването за хитиназна активност се добавя 1 % Triton Х-100. Тоталните протеинови екстракти на здрави или TMV-инфектирани тютюневи листа се получават чрез хомогенизация в 5 ml TBS. Хомогенатите се центрофугират за кратко време за отстраняване на неразтворимия материал и се съхраняват при 20°С. Екстрацелуларните протеини се получават чрез вакуумна инфилтрация на листата с вода (наночиста). Инфилтрираните листа се поставят в спринцовка и се центрофугират за 5 min при 3 000 rpm в table top центрофуга. Безцветните води от промиването, съдържащи екстрацелуларните протеини, се съхраняват на -20°С. Хитинхидроизолиращата активност се изпитва в 200 μΐ реакционни смеси, съдържащи 50 μΐ от старателно промити, белязани с Н³ хитинова суспензия, 50μ1 бактериален или растителен екстракт и 100 μΐ 50 mM натриев фосфат, pH 6.4. След инкубация за 30 min при 30°С се добавят 0.5 ml 10% трихлороцетна киселина, сместа се центрофугира за отстраняване на преципитирания материали 0.5 ml от супернатантата се отстранява и филтрува през стъклена вата. Разтворената радиоактивност се измерва в течен сцинтилационен брояч.

РНК разслояване и ДНК анализ

Тоталната РНК от нестресирани или стресирани тютюневи растения се екстрахира от замразени листни тъкани чрез хомогенизация в екстракционен буфер (1 М TrisНС1,0.1 MLiCl, 10 mM EDTA, 1% SDC, pH 9.0). Хомогенатът се екстрахира с фенол и хлороформ и РНК преципитира с 2М LiCl. РНК се подлага на електрофореза в 1.5% агарозни гелове след глиоксилация и се разслоява върху найлонови мембрани (Genenscreen, New England Nuclear or HybondN, Amsterdam). Изолира се геномна ДНК на тютюн, разгражда се, подлага се на електрофореза и се разслоява, както е описано (Cornelissen et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 67996811). Хибридизация на нуклеинови киселини от тютюн се провежда с Р^з: -белязан сДНК инсерт на Клустер- А в 5х SSC, 2%SDS, 50% формамид, 100 μg/ml спермална ДНК от херинга при 42°С (lx SDS при 50Ό и се авторадиографира.

Ориентация на щам MOG101 от вида Agrobacterium

Конструиран с хелперен плазмид, получен от плазмида pTiB6, който придава вирулентните функции на Agrobacterium tumefaciens, MOG101.

Щамът Agrobacterium tumefaciens MOG101 носи не- онкогенен Ti- плазмид, от който целия Т-участък е заместен от бактериален Spectinomycin резистентен маркер от транспозона Тп 1831 (Hooykaas et al, 1980, Plasmid 4, 64-75).

Ti-плазмидът pTiB6 съдържа два съседни Т-участъка, TL (Т-ляво) и TR (Тдясно). За получаване на производни, в които липсват TL- и TR-участъци е създаден междинният вектор pMOG579. Плазмидът pMOG621 е pBR322 производно което съдържа 2 Ti -плазмидните фрагменти, които са локализирани отляво и отдясно, извън Т-участъците (фигура 2). В pMOG579 двата фрагмента (показани в тъмно) се разделят от 2.5 kb BamHI-Hindlll фрагмент от транспозон Tnl831 (Hooykaas et al, 1980 Plasmid 4,64-75), който носи маркера за резистентност спрямо спектиномицин (фигура 2). Плазмидът бе въведен в щам LBA1010 Agrobacterium tumefaciens (С58-С9 5 (pTiB6) = а лечебен C58 щам, в който е въведен pTiB6 (Коектап et al (1982), Plasmid 7, 119-132) чрез трипарентално кръстосване от E.coli, с помощта на НВ1018 (pRK2013) като хелпер. Трансконюгантите са подбрани 10 по резистентност спрямо Rifampicin (20 mg/1) и Spectinomycin (250 mg/1). Двойно рекомбиниране между pMOG579 и pTiB6 води до загуба на резистентност спрямо карбеницилин (pBR322 маркер) и делеция на целия Т-учас15 тък. От 5 000 трансконюганти, резистентни на спектиномицин, двойно наслоени върху карбеницилин (100 mg/1), са намерени два чувствителни. Анализът по Southern показва, че събитията на двоен кросинг овер на 20 делетирали целия Т-участък (не е показано).

Полученият в резултат щам е наречен MOG101. Този щам и неговата структура са аналогични на щам GV2260 (Deblaere et al 1985, Nucl.Acid Res. 13, 4777-4788). (MOG101 е описан no25 подробно в Hood E. Gelvin S.B., Melchers L.

S.and Hoekema A., 1993, Transgene Research

2. 208-218) и свободно може да бъде доставен от MOGEN International N.V. при поискване.

Claims (13)

1. Растителен протеин, изолиран от други растителни протеини, който протеин

35 притежава ендохитиназна активност, фунгицидна активност и молекулно тегло от около 40 до 43 kDa, както е установено с натриева додецилсулфат полиакриламидна електрофореза, характеризиращ се с това, че факти40 чески не проявява екзохитиназна активност.

2. Растителен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хитиназната активност в обработен с тритий хитин като субстрат е > 200 пъти по-ниска, ако рас-

45 тителната хитиназа е от клас I и хитиназна активност в разтворим хитин като субстрат и е по-висока от тази на растителната хитиназа от клас I, за предпочитане получавана от листа на TMV- индуцирани тютюневи 50 растения.

3. Изолиран протеин съгласно която и да е от претенции 1-2, характеризиращ се с това, че включва аминокиселинна последователност, както е представена на SEQIDNO: 1 или 7, или негов фрагмент, притежаващ хитиназната активност на този протеин, където една или повече аминокиселини са 5 заместени, делетирани или добавени без загуба на хитиназна активност.

4. Фунгициден състав, включващ като активен компонент протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 3, характеризиращ 10 се с това, че за предпочитане включва и 1,3глюканаза, и най-добре включващ в допълнение към посочения протеин друг такъв, действащ в синергизъм върху гъбите.

5. Изолирана ДНК последователност, 15 характеризираща се с това, че включва отворена четяща рамка, която кодира протеин съгласно претенция 1, за предпочитане отворена четяща рамка, кодираща аминокиселинната последователност от SEQIDNO: 1 или 20 SEQIDNO:7 и ДНК последователност, хибридизираща се с нея при строго определени условия.

6. Растителна експресионна ДНК последователност, която включва ДНК последо- 25 вателност, кодираща протеин съгласно претенция 1, или прекурсор на дадения протеин, характеризиращ се с това, че тази ДНК последователност е свързана по физичен начин с регулаторни елементи, необходими за 30 експресия на посочената ДНК последователност в растения под формата на този протеин, за предпочитане ДНК последователност, която кодира протеинов прекурсор с аминокиселинна последователност, предста- 35 вена от SEQIDNO: 1 или 7, за предпочитане ДНК последователност, която включва ДНК последователността, както е представена на SEQIDNO: 1 или 7.

7. Среда за клониране или вектор, характеризиращ се с това, че съдържа ДНК последователност съгласно претенция 6.

8. Бактериален щам, съдържащ среда за клониране или вектор съгласно претенция 7. характеризиращ се с това, че за предпочитане бактериалният щам от рода Agrobacterium.

9. Растителен геном, характеризиращ се с това, че в него е инкорпорирана растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност съгласно претенция 6.

10. Растителна клетка, която притежава растителен рекомбинантен геном съгласно претенция 9, или протопласт на тази клетка.

11. Растение или материал от него като луковица, цвят, плод, листо, полен, корен или коренова култура, семе, стебло, грудка или микрогрудка и др., съдържащи една или повече клетки съгласно претенция 10, характеризиращо се с това, че за предпочитане всички клетки притежават рекомбинантен растителен ДНК геном съгласно претенция 9, още повече растение или материал от него, който е по-малко възприемчив на гъбна инфекция.

12. Метод за селекциониране на растителен сорт с намалена възприемчивост спрямо гъби, характеризиращ с се това, че поне една от родителските линии притежава рекомбинантен ДНК геном съгласно претенция 9.

13. Метод за инхибиране на растежа и/или развитието на гъби, характеризиращ се с това, че ефективно количество от хитиназата съгласно претенция 1 се поставя в контакт с гъбите.