CN101307319B - 一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组基因的重组载体。本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，将该基因序列克隆至载体pPIC9K中，得到真核表达载体pSECH。通过电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115，根据生长情况快速筛选抗性较高的阳性克隆转化子，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组内切几丁质酶基因的重组载体。

背景技术

几丁质又称甲壳素，化学名为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的天然高分子氨基多糖类化合物，广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞和甲壳动物虾、蟹、昆虫外壳以及高等植物的细胞壁中。自然界中几丁质年生物合成量近一百亿吨，其中10％来自于海洋，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源，但遗憾的是这一资源未被充分利用而作为废物自然流失，不仅造成了巨大的浪费，而且还导致了严重的环境污染。大量的废弃几丁质资源由于没有行之有效的处理方法或因处理效果不好长期存在于自然环境中，在一定条件下会发生化学的、物理的或生物的转化，对周围环境造成一定的影响。污染成分不仅通过水、气、土壤、食物链等途径污染环境，成为大气、水体和土壤环境污染的“源头”；同时又是各种病源微生物的孽生地和繁殖场，形成病源型污染，严重危害人体健康。如何充分利用这些几丁质资源，使之变废为宝，消除其对环境的污染，成为目前急需解决的重要问题。

近年来人们逐渐发现几丁质的中间降解产物几丁寡糖具有区别于单糖的某些独特的生理功能：增强人体免疫机能；促进脾脏抗体的形成；抗肿瘤及抑制肿瘤转移；降低胆固醇和血脂的含量；抗血栓、降血压、降血糖、抗凝血、抗菌和抑菌等生物活性并能选择性地活化和增殖人体肠道内的有益菌；消除体内霉素，调节生理机能，延缓衰老；强化肝脏机能，阻碍病原菌生长繁殖和排除体内重金属等，已被科学界列为人的生命第六要素，是目前发现的唯一的阳离子动物性膳食纤维，在医药、保健、化工、食品、环境和农业等领域具有广泛的应用前景，附加值高，因此几丁寡糖的生产已成为开发利用几丁质原料的一条重要途径。

几丁质可通过酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度难以控制，降解产物主要为单糖，降解过程中产生的含硫酸或盐酸的废水直接排放或加碱中和后排放到环境中，对环境造成严重的二次污染。酶法降解具有反应条件温和，能耗低，无需昂贵设备和对环境友好等优点，因而具有良好的应用前景。几丁质可通过几丁质降解酶系作用而降解。根据反应初级产物类型和水解切口位置的不同，几丁质降解酶系可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和几丁二糖酶。内切几丁质酶从几丁质链的内部切割β-1，4糖苷键，产生几丁寡糖；外切几丁质酶从几丁质链的非还原性末端依次切割β-1，4糖苷键，产生几丁单糖；几丁二糖酶则专一性的将几丁二糖降解为几丁单糖，因此研制高效廉价的内切几丁质酶是催化几丁质降解成几丁寡糖的关键所在。

巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀表达系统，具有高表达、高稳定、高分泌、易适应大规模工业化发酵和培养成本低等优点。为了能够提高内切几丁质酶蛋白的表达量，本专利首先根据巴斯德毕赤酵母基因组中各种氨基酸密码子的使用频率，设计合适的引物，采用PCR技术合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的内切几丁质酶基因序列，然后构建了含有该目的基因序列的表达载体pSECH，最后将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶巴斯德毕赤酵母工程菌，实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，经济、生态环境效益将非常明显。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的又一个目的在于提供一种含有上述重组内切几丁质酶基因的重组载体和由该重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。

本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，

附图说明

图1表示重组内切几丁质酶基因的真核表达载体的构建。

具体实施方式

实施例1.基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列的获得

根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏爱性和内切几丁质酶的基因序列，设计以下引物：

F₁：5’-GAATTCGCTAGTGGTTACGCTAACGCTGTTTACTTTACTAACTGGGGTATTTACGGT-3’

F₂：5’-ACTGGGGTATTTACGGTCGTAACTTTCAACCACAAAACCTTGTTGCTTCTGATATTACT-3’

F₃：5’-TGTTGCTTCTGATATTACTCATGTTATTTACTCTTTTATGAACTTTCAAGCTGATGGTACT-3’

F₄：5’-TTCAAGCTGATGGTACTGTTGTTTCTGGTGATGCTTACGCTGATTACCAAAAGCATTAC-3’

F₅：5’-ATTACCAAAAGCATTACGATGATGATTCTTGGAACGATGTTGGTAACAACGCTTACGGT-3’

F₆：5’-GTAACAACGCTTACGGTTGTGTTAAGCAACTTTTTAAGTTGAAGAAGGCTAACCGTAAC-3’

F₇：5’-AGAAGGCTAACCGTAACTTGAAGGTTATGCTTTCTATTGGTGGTTGGACTTGGTCTACT-3’

F₈：5’-GTTGGACTTGGTCTACTAACTTTCCATCTGCTGCTAGTACTGATGCTAACCGTAAGAAC-3’

F₉：5’-ATGCTAACCGTAAGAACTTTGCTAAGACTGCTATTACTTTTATGAAGGATTGGGGTTTT-3’

F₁₀：5’-TGAAGGATTGGGGTTTTGATGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCAGCTGATGATACT-3’

F₁₁：5’-ACCCAGCTGATGATACTCAAGCTACTAACATGGTTCTTCTTCTTAAGGAAATTCGTTCT-3’

F₁₂：5’-TTAAGGAAATTCGTTCTCAACTTGATGCTTACGCTGCTCAATACGCTCCAGGTTACCAT-3’

F₁₃：5’-ACGCTCCAGGTTACCATTTTCTTCTTTCTATTGCTGCTCCAGCTGGTCCAGAACATTAC-3’

F₁₄：5’-CAGCTGGTCCAGAACATTACTCTTTTCTTCATATGTCTGATCTTGGTCAAGTTCTTGAT-3’

R₁：5’-AGCGGCCGCTTAGTTAAGACCACTACGAATGTTATCGTATTGAGAGTT-3’

R₂：5’-TTATCGTATTGAGAGTTTGGGTAACCAAGCAAGTTTTGAGTAGAATCAAGACTACCAAG-3’

R₃：5’-GAATCAAGACTACCAAGAGCTCTATGACTAGTACCAATCAAAGAATCAGAACCAGTCTT-3’

R₄：5’-GAATCAGAACCAGTCTTATCAGCAGAAGCTTCCCAAAACATACTACCACCAAGACCAAG-3’

R₅：5’-CTACCACCAAGACCAAGGTTCTTAAGGTAAGAAACCTTAGTGTTAATCATAGCTGGAGT-3’

R₆：5’-TTAATCATAGCTGGAGTATCAAAAGAAATAAGTTCCTTACTACTTGGATCGTAACTGTA-3’

R₇：5’-CTTGGATCGTAACTGTAGTAAGCTTGAGCAGTAGAATCGTATTGAACAGTAGCACCAGC-3’

R₈：5’-TGAACAGTAGCACCAGCCTTTGGAAGAACCTTGTAATCCCAAATACCGTTTTCCCAACT-3’

R₉：5’-ATACCGTTTTCCCAACTACCAGAACCAATACCACTGTAAGTTTGACCAATACCACCAGT-3’

R₁₀：5’-TGACCAATACCACCAGTACTTTCAAAAGAACGACCGTAAATTGGCATACCAAGAACAAT-3’

R₁₁：5’-GGCATACCAAGAACAATCTTACTAGCTGGAACACCACCCTTAATGTAATCCTTAATAGC-3’

R₁₂：5’-ATGTAATCCTTAATAGCTTGATCAGTGTTGTATGGAGAAGAGTTAGAGTTAGATGGGTT-3’

R₁₃：5’-TTAGAGTTAGATGGGTTAGCAAACAAGTTAGCATCATGACCAGAGTAACTACTCCAAGA-3’

R₁₄：5’-GAGTAACTACTCCAAGAACCAGCGTAATCGTAAGCCATAAGGTTAACGTAATCAAGAACTTGACCAA-3’

其中正向引物为F₁-F₁₄，反向引物为R₁-R₁₄。引物F₁与F₂，F₂与F₃，F₃与F₄，F₄与F₅，F₅与F₆，F₆与F₇，F₇与F₈，F₈与F₉，F₉与F₁₀，F₁₀与F₁₁，F₁₁与F₁₂，F₁₂与F₁₃，F₁₃与F₁₄以及引物R₁与R₂，R₂与R₃，R₃与R₄，R₄与R₅，R₅与R₆，R₆与R₇，R₇与R₈，R₈与R₉，R₉与R₁₀，R₁₀与R₁₁，R₁₁与R₁₂，R₁₂与R₁₃，R₁₃与R₁₄之间分别存在长度为17-20nt的相同序列片段。

将上述引物混合，各条引物的浓度为10μM，然后进行PCR反应扩增编码内切几丁质酶的基因序列。

PCR反应体系为(25μl)：10×PCR Buffer 2.5μl，MgCl₂ 1.5μl，dNTP 1μl，DNA2μl，Taq酶0.25μl，引物混合物2μl，双蒸水14.75μl。

反应参数为：94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃1min)共30个循环，最后在72℃延伸10min，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，经DNA序列比对分析，该序列测序结果与预期序列结果一致。由SEQ ID NO.1编码的重组内切几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2.重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

用EcoRI和NotI分别双酶切PCR扩增产物和原始表达质粒pPIC9K，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T₄DNA连接酶连接回收的目的条带，得到真核表达载体pSECH，用CaCl₂法42℃热激90秒将其转化到大肠杆菌DH5α。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序，具体操作流程见图1。

实施例3.重组巴斯德毕赤酵母的转化和筛选

将鉴定正确的重组表达载体pSECH质粒DNA经内切酶XbaI线性化处理，电击转化毕赤酵母GS115。电击结束后，立即加入1ml预冷的1mol/l山梨醇，3000rpm离心5min，菌体重悬于400μl预冷的1mol/l山梨醇中，取200μl涂布于MD平板(1.34％酵母氮碱，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖，2％琼脂糖)上，30℃培养至菌落出现。随机挑取菌落点种到含不同浓度抗生素G418(0，0.25mg/ml，0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.00mg/ml，1.50mg/ml，1.75mg/ml，2.00mg/ml，3.00mg/ml，4.00mg/ml)的YPD平板上，30℃培养2～5d，每天检查菌落生长情况。根据生长情况快速筛选出G418抗性较高的阳性克隆转化子。测定酶活条件：用1％胶态几丁质作为底物，pH＝7缓冲液，37℃反应1小时，加入3mL DNS，100℃反应10min中止反应，迅速用冷水冷却，离心取上清测定其OD540nm值。酶活定义：pH＝7缓冲液环境，37℃，每分钟催化胶态几丁质生成1mg NAG(乙酰氨基葡萄糖)定义为一个酶活单位。根据该测定方法，测得筛选的转化子产内切几丁质酶的酶活为837U/mL。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

                序列表

Claims (3)

1.一种重组内切几丁质酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种含有权利要求1中所述重组内切几丁质酶基因的重组载体，其特征在于，在质粒pSECH中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列，所述质粒pSECH由下列方法制得：用EcoRI和NotI分别双酶切如SEQ ID NO.1所示的PCR扩增产物和原始表达质粒pPIC9K，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T₄DNA连接酶连接回收的目的条带，得到真核表达载体pSECH。

3.一种由权利要求2所述重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。

Images