CN104830910A - 利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，属于微生物絮凝剂。其工艺如下：A.将菌种纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)接种到斜面培养基上，并4℃保存；B.将菌种接种到种子液培养基中，37℃摇床培养制备种子液；C.将种子液按1％比例转接到以玉米秸秆为唯一碳源的发酵培养基中，37℃，180r/min摇床培养48小时；D.将发酵培养基在4℃，10000r/min离心10min，去除沉淀，上清液即为液体生物絮凝剂；E.向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物并冷冻干燥得到纯品生物絮凝剂。本发明的特点是利用廉价的玉米秸秆直接发酵生产微生物絮凝剂，能有效降低微生物絮凝剂的生产成本，适应大规模生产及工业化应用，具有很好的推广应用前景。

Description

利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，特别是一种利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法。
背景技术
我国是农业大国，每年农业生产过程中产生大量农业废弃物，如玉米秸秆，玉米芯，甘蔗渣，薯渣等，这些残渣中含有丰富的纤维素类物质，这些纤维素可以被微生物分解成糖类，从而转化为其他有价值的产品。如何有效将这些废弃物中的纤维素转化成有价值的产品具有重要的经济意义。
絮凝剂是一类可以凝聚沉降溶液中不易沉降的悬浮颗粒的物质，主要分为无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂。微生物絮凝剂是第三代絮凝剂，是由微生物产生的代谢产物，如糖蛋白、粘多糖、蛋白质、纤维素和DNA等，具有无毒无害，安全性高，生物易降解，无二次污染的特点，因此微生物絮凝剂可以被广泛应用于污水处理，尤其是在食品和发酵工业的后处理等工艺中具有独特的优势，其研究日益受到重视。
不同的菌株能够合成不同种类的生物絮凝剂，已报道的产微生物絮凝剂的菌株有几十种，如Bacillus sp.F19所产的絮凝剂主要有中性糖、糖醛酸、氨基糖和蛋白质等组成，其最佳发酵培养基：蔗糖20g/L，酵母粉2.5g/L；Proteus mirabilis TJ1能产生一种有多糖和蛋白质组成的生物絮凝剂，其培养基组成：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L；Bacillus firmus能产生一种多糖絮凝剂，其发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L；这些菌种所用培养基组分昂贵，造成生物絮凝剂生产成本高，目前未见有关本发明所用菌种纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulan)生产微生物絮凝剂的报道。专利检索未发现利用玉米秸秆直接发酵生产微生物絮凝的专利。
发明内容
本发明的目的是要提供一种能够有效降低微生物絮凝剂的生产成本的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法。
本发明的目的是这样实现的：该絮凝剂方法的工艺步骤如下：
步骤1、将菌种纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)接种到斜面培养基上，并4℃保存；
步骤2、将菌种接种到种子液培养基中，37℃摇床培养制备种子液；
步骤3、将种子液按1％比例转接到以玉米秸秆为唯一碳源的发酵培养基中，37℃，180r/min摇床培养48小时；
步骤4、将发酵培养基在4℃，10000r/min离心10min，去除沉淀，上清液即为液体生物絮凝剂；
步骤5、向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物并冷冻干燥得到纯品生物絮凝剂。
所述的步骤1中：将纤维化纤维微细菌种子液接种于发酵培养基中，摇瓶发酵48小时，提取微生物絮凝剂纯品。
所述的步骤2中，所述种子液接于发酵培养中的接种量为1％；所述发酵培养条件为：发酵液初始pH 8-10；所用菌种为纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulans；
所述的步骤5中，向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000r/min离心10min收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀后冷冻干燥，获得微生物絮凝剂纯品。
所述的种子液培养基组份为：葡萄糖2g/L，可溶性淀粉2g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨2g/L，水解酪蛋白2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L。
所述的发酵培养基组份如下：玉米秸秆粉为碳源20g/L、酵母粉为氮源3g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、碳酸钠0.4g/L。
有益效果，由于采用了上述方案，本发明首次提出利用纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulans生产生物絮凝剂，该菌种能产生较高的纤维素酶活和木聚糖酶活，分解玉米秸秆中的纤维素组分，直接发酵转化玉米秸秆生产微生物絮凝剂，降低微生物絮凝剂成本，安全性更高。利用纤维化纤维微细菌转化玉米秸秆直接发酵生产微生物絮凝剂，有效降低微生物絮凝剂的生产成本，实现玉米秸秆的资源化利用。
优点：利用纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulans在碱性条件下转化纤维素残渣产生高活性的生物絮凝剂的方法。该菌株具有生长速度快，高度耐碱性，发酵周期短，絮凝剂产量高等优点，能够有效降低微生物絮凝剂的生产成本。
a、本发明从秸秆还田土中分离得到一株纤维化纤维微细菌，该菌株生长速度快，发酵周期短，微生物絮凝剂产量高，以前的报道中未见关于纤维化纤维微细菌产生微生物絮凝剂的报道。
b、本发明所用菌种纤维化纤维微细菌具有很好的纤维素酶活和木聚糖酶活，能降解玉米秸秆中纤维素组分，直接生产微生物絮凝剂，避免了现有技术利用高温强酸水解秸秆产生的有毒物质；生产工艺相对简化，有利于进一步降低微生物絮凝剂成本。
c、本发明所用菌种纤维化纤维微细菌具有很好的耐碱性能，能在碱性条件下(pH8-10)生长，分解玉米秸秆。碱性条件下有利于玉米秸秆的膨胀，提高玉米秸秆中纤维素的分解转化生产微生物絮凝剂的效率。
具体实施方式
该絮凝剂方法的工艺步骤如下：
步骤1、将菌种纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)接种到斜面培养基上，并4℃保存；
步骤2、将菌种接种到种子液培养基中，37℃摇床培养制备种子液；
步骤3、将种子液按1％比例转接到以玉米秸秆为唯一碳源的发酵培养基中，37℃，180r/min摇床培养48小时；
步骤4、将发酵培养基在4℃，10000r/min离心10min，去除沉淀，上清液即为液体生物絮凝剂；
步骤5、向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物并冷冻干燥得到纯品生物絮凝剂。
所述的步骤1中：将纤维化纤维微细菌种子液接种于发酵培养基中，摇瓶发酵48小时，提取微生物絮凝剂纯品。
所述的步骤2中，所述种子液转接于发酵培养中的接种量为1％；所述发酵培养条件为：发酵液初始pH 8-10；所用菌种为纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulans。
所述的步骤5中，向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000r/min离心10min收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀后冷冻干燥，获得微生物絮凝剂纯品。
所述的种子液培养基组份为：葡萄糖2g/L，可溶性淀粉2g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨2g/L，水解酪蛋白2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L。
所述的发酵培养基组份如下：玉米秸秆粉为碳源20g/L、酵母粉为氮源3g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、碳酸钠0.4g/L。
实施例1：该微生物絮凝剂制备方法，具体步骤如下：
1、菌种分离：从秸秆还田土中分离出菌株，将分离出来的菌株放置在筛选培养基中进行筛选，所述的筛选培养基组份为：羧甲基纤维素钠4g/L，酵母粉0.5g/L，胰蛋白胨0.5g/L，水解酪蛋白0.5g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸氢二钾0.3g/L；
2、菌种鉴定：菌种分离获得后，通过微生物四区划线法纯化得到纯种，经16S rRNA序列分析确定本发明所用菌种为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulan)，并保存到了中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC 10811。
3、种子液制备：将纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulan菌种接种至种子液培养基中，种子液培养基组分如下：葡萄糖2g/L，可溶性淀粉2g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨2g/L，水解酪蛋白2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L。然后37℃，180r/min摇床培养12小时。
4、发酵制备微生物絮凝剂：将步骤3所获得的种子液按1％比例接种至发酵培养基中，发酵培养基组分如下：玉米秸秆粉为碳源20g/L、酵母粉为氮源3g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、碳酸钠0.4g/L；然后37℃，180r/min摇床发酵培养48小时；
5、微生物絮凝剂提取：将步骤4获得的发酵液在10000r/min条件下离心10min，去除沉淀后，收集上清液；向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000r/min离心10min收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀后冷冻干燥，获得微生物絮凝剂纯品。
6、絮凝活性测定：在100mL烧杯中配制5g/L高岭土悬浮液60mL，加入100uL待测发酵液；快速均匀搅拌2min，缓慢搅拌1min，静置沉降1min，取上清液用722型分光光度计测定OD550值，以加入100uL蒸馏水作为对照实验；通过计算OD550值的减少量来确定絮凝活性，用絮凝率表示絮凝活性：絮凝率＝(A-B)/A×100％，A代表加蒸馏水时上清液的OD550值，B代表加发酵液时上清液的OD550值。
所获得的微生物絮凝剂纯品对高岭土悬浊液进行絮凝，絮凝效果明显。

Claims (6)

1.一种利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：该絮凝剂方法的工艺步骤如下：
步骤1、将菌种纤维化纤维微细菌接种到斜面培养基上，并4 ℃保存；
步骤2、将菌种接种到种子液培养基中，37 ℃摇床培养制备种子液；
步骤3、将种子液按1%比例转接到以玉米秸秆为唯一碳源的发酵培养基中，37 ℃，180 r/min摇床培养48小时；
步骤4、将发酵培养基在4℃，10000 r/min离心10 min，去除沉淀，上清液即为液体生物絮凝剂；
步骤5、向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物并冷冻干燥得到纯品生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：所述的步骤1中：将纤维化纤维微细菌种子液接种于发酵培养基中，摇瓶发酵48小时，提取微生物絮凝剂纯品。
3.根据权利要求1所述的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：所述的步骤2中，所述种子液接于发酵培养中的接种量为1%；所述发酵培养条件为：发酵液初始pH 8-10；所用菌种为纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobiumcellulans。
4.根据权利要求1所述的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：所述的步骤5中，向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000 r/min离心10 min收集沉淀，70%乙醇洗涤沉淀后冷冻干燥，获得微生物絮凝剂纯品。
5.根据权利要求1所述的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：所述的步骤2中，种子液培养基组份为：葡萄糖2 g/L，可溶性淀粉2 g/L，酵母粉2 g/L，胰蛋白胨2 g/L，水解酪蛋白2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.2 g/L。
6.根据权利要求1所述的利用纤维化纤维微细菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是：所述的步骤3中，发酵培养基组份如下：玉米秸秆粉为碳源20 g/L、酵母粉为氮源3 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、磷酸氢二钾1.2 g/L、碳酸钠0.4 g/L。
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