CN103305539A - 棘孢木霉几丁质酶基因及其表达棘孢木霉几丁质酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体地说是一种利用毕赤酵母工程菌株表达棘孢木霉几丁质酶的方法。发明以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）为材料获得了1个几丁质酶基因，命名为tachi1，DNA序列为1679bp，含有3个内含子、1个1275bp的ORF，编码424个氨基酸。构建重组表达载体pPIC9K/tachi1，利用电击法转化Pichia pastoris GS115，工程菌株GS-tachi1-K接种于含BMMY培养基中，在28℃、200 rpm/min振荡培养7.5 d，几丁质酶活达到17.93 U/mL，蛋白表达量为6.19 g/L。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为44 kDa，酶反应最适的温度和pH分别为50 ℃和5.5，50 ℃以下保持较高的酶活力，在酸性条件下稳定。该酶活性高、稳定性好，有比较重要的经济价值和社会价值。

Description

棘孢木霉几丁质酶基因及其表达棘孢木霉几丁质酶的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说是一个棘孢木霉几丁质酶基因tachi1及其利用毕赤酵母工程菌株高效分泌表达。

背景技术

几丁质(chitin)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物，作为真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的重要结构物质，广泛存在于自然界中，为仅次于纤维素的第二大多糖，是最丰富的天然高分子化合物之一。几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶，具有重要的生理功能（Li 2006）。可参与真菌细胞壁溶解、孢子萌发、菌丝生长、菌丝自溶、孢子形成、几丁质同化及真菌寄生等诸多过程，在植物病虫害生物防治中发挥着重要作用；几丁质酶可用于制备真菌的原生质体，进行菌株改良；几丁质酶还可用于几丁质的生物转化，几丁质经几丁质酶部分水解后产生生物活性物质几丁寡糖，被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等许多领域，在几丁质资源开发利用领域具有广泛的应用前景。采用化学方法控制几丁质降解，难度大，成本高，对环境污染严重。采用生物降解不仅有效的克服了这些问题，而且可以提高资源利用，增加经济效益。

国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌，并从中分离提纯几丁质酶。但直接从原始产酶微生物中提取几丁质酶，因产酶菌株普遍产酶量较低、酶活性低、纯化困难、提取得率低、稳定性差，导致产品成本高，难以规模化生产，制约了几丁质酶在农业、工业上的应用。随着分子生物学技术的发展，人们希望得到编码这种酶的基因并转入表达宿主进行高效低成本的表达。因此利用重组微生物实现几丁质酶的工业化生产、提高几丁质酶活性和产量，是目前较为理想的方法，也是充分发挥几丁质酶功能和几丁质酶开发利用的关键。目前，表达真菌几丁质酶基因常用的有大肠埃希氏菌表达系统（刘玲玲等，2004） 、酿酒酵母表达系统（刘丕钢等, 2005）和巴斯德毕赤酵母表达系统（王艳君等,2008）。

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）是我国新记录的木霉种，可以产生几丁质酶降解几丁质，在几丁质资源开发利用和植物病虫害防治方面具有重要的作用和开发价值。直接从原始棘孢木霉菌中提取几丁质酶，因其产酶量较低、酶活性低、纯化困难、提取得率低，导致产品成本高，难以规模化生产，制约了几丁质酶在农业、工业上的应用。应用分子生物学手段是解决上述问题的有效途径，从T. asperellum中克隆出几丁质酶基因，将其导入毕赤酵母中高效分泌表达，利用酵母生长快、可高密度发酵、表达量高、产物易于纯化、重复性好等特点，使棘孢木霉菌几丁质酶基因快速、大量表达，期望达到降低产品成本和提高经济效益的目的。

发明内容

本发明以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）为材料获得一种几丁质酶基因，命名为tachi1，该基因DNA和mRNA序列在GenBank中的登录号分别为GU457410和GU457411。DNA为1679 bp，含有3个内含子，开放阅读框为1275bp，编码424个氨基酸，几丁质酶Tachi1属于糖苷水解酶18家族。

构建重组表达载体pPIC9K/tachi1，利用电转仪电击转化Pichia pastoris GS115，经 MD和MM培养基上筛选、PCR鉴定、G418抗性鉴定筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-tachi1-K。该工程菌株接种于BMMY培养基中，在28℃ 200 rpm/min振荡培养7.5 d后，几丁质酶活达到17.93 U/mL，蛋白表达量为6.19 g/L。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为44 kDa，酶反应最适的温度和pH分别为50 ℃和5.5，50 ℃以下保持较高的酶活力，在酸性条件下稳定。该酶活性高、稳定性好，有比较重要的经济价值和社会价值。

酶活力单位（U）定义为每分钟产生相当于1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。蛋白含量测定采用Bradford法。

应用分子生物学手段从T. asperellum中克隆出几丁质酶基因，将其导入毕赤酵母中高效分泌表达，利用酵母生长快、可高密度发酵、表达量高、产物易于纯化、重复性高等特点，使棘孢木霉菌几丁质酶基因快速、大量表达，期望达到降低产品成本和提高经济效益的目的；本发明的得到的菌株可以在现有技术的常规菌株上通过基因工程技术改造得到，可操作性强、重复性。

附图说明：

图1 几丁质酶基因RT-PCR产物电泳图谱

注：M：DL2000 Marker，1：chit1和chit2的PCR产物

图2重组表达载体pPIC9K/tachi1双酶切验证

注：1：DL2000 Marker，2：pPIC9K/tachi1用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，3：λ-Hind Ⅲ digested DNA Marker.

图3纯化的重组几丁质酶Tachi1电泳图谱

注：M：低分子量标准蛋白； 1：纯化的重组几丁质酶Tachi1

具体实施方式

实施例1：棘孢木霉Trichoderma asperellum鉴定

采用CTAB法提取基因组DNA，用形态学和ITS序列分析方法鉴定。

实施例2：几丁质酶基因tachi1的克隆

（1）棘孢木霉Trichoderma asperellum总RNA的提取：参照Trizol试剂使用说明。

（2）cDNA第一条链的合成：参照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0试剂盒说明书进行：取1~2 μg总RNA，加RNaseFree dd H₂O至9.5 μL；10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl₂ 4 μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer 1 μL，RNase Inhibiter 0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，（Final Volume 20 μL），将反应液混合后，室温下放10 min，然后42℃温育60 min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的dd H₂O，稀释至200μL，混匀，保存于-80℃备用。

（3）中间片段的分离：根据几丁质酶的同源保守序列设计兼并引物。以cDNA为模板，分别以Ps1：5'-GCTBTCBATHGGHGGBTGGAC-3'、Ps2：5'-GATGGYATYGAYRTYGAYTGGGA-3'为上游引物，与下游引物为：Pa1：5'-GCAGADGCCTCCCARAACAT-3'进行巢式PCR扩增。

（4）3' 和5' 端侧翼序列的分离

几丁质酶基因5' 端侧翼序列克隆：根据已得到部分序列设计6个向外的特异巢式引物，使用Tail-PCR的方法，克隆5' 侧翼序列。上游引物为通用兼并引物AD_1-5，Tail-PCR所用的特异巢式引物及序列如下：

5T10ps1：5'-GCAGCGATGGAGAGAAGGAAGTGGTA-3'

5T10ps2：5'-CGGGTTGGCAAACAAGTTGGCATCGT-3'

5T10ps3：5'-CGGTGTTGTATGGTGAAGAGTTGGGATTG-3'，

52t10ps2：5'-GAAACTTACACAGTGCCGTCTGCTTGGA-3'

52t10ps3：5'-GGAATAGTGCTTCTGATAATCGGCGTAG-3'

52t10ps4：5'-GTCCAGCCACCGATAGAGAGCATAACT-3'

几丁质酶基因3' 端侧翼序列克隆：3' RACE-PCR的上游引物序列为：10pa1：5'-AGGCTACCACTTCCTTCTCT-3'，10pa2：5'-ATCCCAACTCTTCACCATA-3'，下游引物为M13M4: 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'

几丁质酶基因3' 端侧翼序列克隆：按照TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0（TaKaRa）和3 ' RACE Kit 使用说明进行。3 'RACE的上游引物序列为：10pa1：5'-AGGCTACCACTTCCTTCTCT-3'，10pa2：5'-ATCCCAACTCTTCACCATA-3'；下游引物为M13M4：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'。

（5）基因克隆验证：

利用一对验证引物： 5'－GCAACTTCTTCCCTTCAAAGCCTCT－3'、5'－GCTCCCTGCATAATCGTTTCCCAT－3'；分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增。

（6）连接转化：取0.5μl PCR回收产物与pMD18-T 载体进行连接，操作步骤按照TaKaRa公司的pMD^TM18-T Vector说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，在含有X－Gal、IPTG、氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上培养过夜，挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养。

（7）质粒DNA的提取：采用碱裂解法提取质粒DNA。

（7）序列测定：双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为M13启动子引物。

棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的DNA长1679 bp ，含有3个内含子，开放阅读框为1275bp，编码424个氨基酸。Tachi1属于糖苷水解酶第18家族，该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE。棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的DNA序列：SEQ.NO.1

1        gaaacttaca cagtgccgtc tgcttggaga gcttccattc aacagcaact tcttcccttc

61       aaagcctctt ttgataagct tcgccgaatc tcaaacgctt caccatgttg ggtttcctcg

121      gaaaatccgt ggccctgctt gctgcgctgc aggccactct cacctctgca actcctgtgt

181      ctacaaacga cgtctcagtt gagaagagag ccagcggata cacaaacgct gtctacttca

241      ccaactggtg agtgaagcta actcgtggtc atgaatttca gggctaacta tgggcaatta

301      aaggggtatc tatggccgca actttcaacc ccaggacctg gtggcgtcgg acatcactca

361      tgtcatctac tctttcatga acttccaagc agacggcact gtgtaagttt cgaagccaag

421      agttttctat ctatatccag tcgctgacct tttcaactat agtgtctctg gagatgccta

481      cgccgattat cagaagcact attccgacga ttgtatgaca actctttccc cttagtactc

541      caactttgag ccaatgcata taaactaaca tctacaacag cctggaatga cgtcggaaac

601      aacgcatacg gctgtgtgaa gcagctgttt aagttgaaga aggccaatcg caacttgaag

661      gttatgctct ctatcggtgg ctggacctgg tccaccaact tcccttctgc agcaagcacc

721      gatgccaacc gcaagaactt tgccaagacg gccatcacct tcatgaagga ctggggtttt

781      gatggtattg acgtcgactg ggagtaccct gccgatgaca ctcaggccac caacatggtt

841      cttctgctca aggagatccg atctcaacta gatgcctatg ctgcgcaata cgctccaggc

901      taccacttcc ttctctccat cgctgccccc gctggaccag agcactactc tgccctgcac

961      atggccgacc ttggtcaagt tcccgactat gtcaacctta tggcctatga ctatgctggt

1021     tcttggagca gctactctgg acacgatgcc aacttgtttgccaacccgtc caatcccaac

1081     tcttcaccat acaacaccga tcaggctatc aaggcttatatcaacggagg cgttcccgca

1141     agcaagatcg ttcttggcat gcctatctat ggacgatctttcgagagcac taatggcatt

1201     ggccaaacct acaatggaat tggatctgga agctgggagaacggtatctg ggactacaag

1261     gttcttccca aggccggcgc tacagtccag tacgactctgtcgcacaggc gtactacagc

1321     tatgattcta gcagcaagga gctcatctct ttcgatacccctgacatggt cagcaaaaag

1381     gtctcttacc tcaagaatct cggcctggga ggcagtatgttctgggaggc ttctgctgac

1441     aagactggct ccgactcctt gatcggaaca agccacagagcgctgggaag cctggactca

1501     actcagaact tgctgagcta ccccaactcc cagtatgataacatccgaaa cggtctcaac

1561     taaagaccct ttcttcttct tctatggttg taccaacatttcagacgtta tgggaaacga

1621     ttatgcaggg agcgttattt ttgagtaaat agtcgcctatttatatgaat ctgtacact

棘孢木霉几丁质酶基因tachi1编码的氨基酸序列：SEQ.NO.2

1        MLGFLGKSVA LLAALQATLT SATPVSTNDV SVEKRASGYT NAVYFTNWGI YGRNFQPQDL

61       VASDITHVIY SFMNFQADGT VVSGDAYADY QKHYSDDSWN DVGNNAYGCV KQLFKLKKAN

121      RNLKVMLSIG GWTWSTNFPS AASTDANRKN FAKTAITFMK DWGFDGIDVD WEYPADDTQA

181      TNMVLLLKEI RSQLDAYAAQ YAPGYHFLLS IAAPAGPEHY SALHMADLGQ VPDYVNLMAY

241      DYAGSWSSYS GHDANLFANP SNPNSSPYNT DQAIKAYING GVPASKIVLG MPIYGRSFES

301      TNGIGQTYNG IGSGSWENGI WDYKVLPKAG ATVQYDSVAQ AYYSYDSSSK ELISFDTPDM

361      VSKKVSYLKN LGLGGSMFWE ASADKTGSDS LIGTSHRALG SLDSTQNLLS YPNSQYDNIR

421      NGLN

实施方式3：表达载体的构建

（1）根据分离出的tachi1基因的核苷酸序列设计一对表达引物，在引物的5 ' 端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点：

上游引物： chit1：5 '-CCGAATTCACTCCTGTGTCTACAAACGACG-3 '

下游引物： chit2：5 '-GGGCGGCCGCTTAGTTGAGACCGTTTCGGAT-3 '

(2) 棘孢木霉总RNA的提取

利用Trizol试剂从诱导培养的棘孢木霉菌丝体中提取总RNA。

（3）反转录合成cDNA第一条链：按照TaKaRa公司的TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明书进行，以Oligo dT-Adaptorprimer为引物合成cDNA第一链。

（4）PCR反应（25μL）：cDNA 2 μL, 10 × Buffer 2.5 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, 25 mmol/L MgCl₂  2 μL， 引物chit1和chit2各1 μL， Taq DNA 聚合酶0.5 μL (5 U/μL), ddH₂O 14 μL。 反应条件为94℃ 4 min预变性； 94℃0.5 min，53℃ 0.5 min，72℃ 2 min, 36个循环；72℃延伸10 min。

（5）基因克隆：取0.5μL PCR产物与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，经蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获得重组质粒pMD18-T/tachi1。

（6）用Eco RⅠ和NotⅠ对重组质粒 pMD18-T/tachi1进行双酶切，同时用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切酵母表达质粒pPIC9K，利用DNA胶回收试剂盒回收纯化tachi1基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，转化大肠杆菌JM109，经蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定、提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获得重组质粒pPIC9K/tachi1。

实施例3.转化毕赤酵母及酵母工程菌的筛选

（1）重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒pPIC9K/tachi1用限制性内切酶StuⅠ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d，挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子点种于分别含G418浓度为1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL和4.00 mg/mL的YPD平板上筛选多拷贝转化子，提取多拷贝转化子基因组DNA，进行PCR鉴定。通过在BMMY培养基中诱导表达分析，获得高效分泌表达Tachi1的毕赤酵母工程菌株GS-tachi1-K。

实施方式4：毕赤酵母工程菌株GS-tachi1-K的诱导表达和活性检测

（1）将毕赤酵母工程菌株GS-tachi1-K接种于含25 mL BMGY培养基中，28℃ 200 rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2~6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，28℃ 200rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为1%。每24h取样一次，室温10，000g 离心5 min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用DNS法，蛋白含量测定采用Bradford法。酶活力单位（U）定义为每分钟产生相当于1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。

（3）重组几丁质酶Tachi1的酶学性质

诱导表达的重组几丁质酶经过SephadexG-100阴离子交换柱层析，获得纯化蛋白，用纯化的重组几丁质酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组几丁质酶的酶活力，分析几丁质酶Tachi1最适反应温度、pH；将几丁质酶在不同的温度下保温不同的时间（10 min，20min，30 min，40 min，50 min，60min）后，检测剩余酶活力，分析Tachi1的热稳定性；将几丁质酶在不同的pH下处理1小时，检测剩余酶活力，分析Tachi1的pH稳定性。

本发明的得到的菌株可以在现有技术的常规菌株上通过基因工程技术改造得到，可操作性强、重复性高。

Claims (4)

1.一种以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）为材料获得的几丁质酶基因，命名为tachi1，其特征在于：该基因DNA为1679 bp，含有3个内含子和一个由1275个核苷酸构成的开放阅读框，编码424个氨基酸，其具体的核甘酸序列为SEQ.NO.1。

2.如权利要求1所述的基因编码的几丁质酶，其特征在于：该几丁质酶属于糖苷水解酶18家族，具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE，其具体的氨基酸序列为SEQ.NO.2。

3.如权利要求1所述的几丁质酶基因tachi1的克隆方法，其特征在于：该方法按以下步骤依次进行：

（1）提取棘孢木霉（Trichoderma asperellum）总RNA和基因组DNA;

（2）合成cDNA第一条链；

（3）中间片段的分离：根据几丁质酶的同源保守序列设计兼并引物。以cDNA为模板，分别以Ps1：5'-GCTBTCBATHGGHGGBTGGAC-3'、Ps2：5'-GATGGYATYGAYRTYGAYTGGGA-3'为上游引物，与下游引物为：Pa1：5'-GCAGADGCCTCCCARAACAT-3'进行巢式PCR扩增；

（4） 3' 和5' 侧翼序列的分离

几丁质酶基因5' 端侧翼序列克隆：根据已得到部分序列依次设计6个向外的特异巢式引物，使用Tail-PCR的方法，克隆5' 侧翼序列。Tail-PCR所用特异巢式引物及序列如下：

5T10ps1：5'-GCAGCGATGGAGAGAAGGAAGTGGTA-3'

5T10ps2：5'-CGGGTTGGCAAACAAGTTGGCATCGT-3'

5T10ps3：5'-CGGTGTTGTATGGTGAAGAGTTGGGATTG-3'，

52t10ps2：5'-GAAACTTACACAGTGCCGTCTGCTTGGA-3'

52t10ps3：5'-GGAATAGTGCTTCTGATAATCGGCGTAG-3'

52t10ps4：5'-GTCCAGCCACCGATAGAGAGCATAACT-3'

几丁质酶基因3' 端侧翼序列克隆：3' RACE-PCR的上游引物序列为：10pa1：5'-AGGCTACCACTTCCTTCTCT-3'，10pa2：5'-ATCCCAACTCTTCACCATA-3'；下游引物为M13M4：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；

（5）基因克隆验证：

利用一对验证引物： 5'－GCAACTTCTTCCCTTCAAAGCCTCT－3'、5'－GCTCCCTGCATAATCGTTTCCCAT－3'；分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增；

（6）连接转化：取0.5~1.0 μl PCR回收产物与pMD18-T 载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，在含有X－Gal、IPTG、氨卞青霉素(100 μg/mL)的LB平板上培养过夜，挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养；

（7）质粒DNA的提取：采用碱裂解法提取质粒DNA；

（8）序列测定：双脱氧法测定核苷酸序列。

4.一种含有如权利要求1所述的基因的工程菌株的构建表达方法，其特征在于：按照以下步骤依次进行

（1）重组表达载体构建和线性化：利用RT-PCR扩增Tachi1基因序列，将其定向插入到pPIC9K质粒中，构建重组表达载体pPIC9K/tachi1，并用限制性内切酶StuⅠ线性化；

（2）转化：电击转化毕赤酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞；

（3）筛选：在MD/MM平板上筛选转化子；挑取转化子分别点种于含有1.00 mg/mL~4.00 mg/mL G418的YPD平板上筛选多拷贝转化子，获得高效分泌表达Tachi1的毕赤酵母工程菌株GS-tachi1-K；

（4）将转化子接种于BMMY培养基中，在28℃、200 rpm/min振荡培养7.5 d，每24h补充甲醇至终浓度为1%，几丁质酶活达到17.93 U/mL，蛋白表达量为6.19 g/L；

（5）重组几丁质酶Tachi1特征：SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为44kDa，反应最适的温度和pH分别为50 ℃和5.5，50 ℃以下保持较高的酶活力，在酸性条件下稳定。

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