CN1131439A

CN1131439A - 几丁质酶、编码它的dna及含有它们的植物

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Publication number: CN1131439A
Application number: CN94193448A
Authority: CN
Inventors: M·阿伯泰克-德·格劳特; J·F·博尔; B·J·C·科尼里森; H·J·M·林索斯特; L·S·梅尔彻斯; A·S·庞斯坦; M·B·塞拉-博拉吉
Original assignee: Leiden National University; Mogen International NV
Current assignee: Leiden National University; Mogen International NV
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 1996-09-18
Also published as: BR9407352A; BG100360A; AU7500194A; HUT75073A; AU680935B2; JPH09501322A; CA2169833A1; IL110601A0; EP0639642A1; US5993808A; HUP9600362D0; EP0714446A1; WO1995005467A3; BG62701B1; WO1995005467A2

Abstract

本发明提供一种新的几丁质酶，其具有内切几丁质酶活性、抗真菌活性，且经SDS-聚丙烯酰胺电泳测定的分子量约为40-43KDa。本发明还提供一种含有本发明几丁质酶作为活性成分的抗真菌组合物；提供含编码新几丁质酶的开放读码框架的分离DNA序列；提供含编码本发明几丁质酶的DNA序列的植物可表达重组DNA序列，以及已将这种重组DNA插入其基因组的植物细胞和植物。

Description

几丁质酶、编码它的DNA及含有它们的植物

本发明涉及来自植物的几丁质酶、编码它的DNA和转化的植物，这些植物含有并表达所述重组多核苷酸产生或过量产生所述的几丁质酶。本发明还提供保护植物免受病原体攻击的方法和由此可得到的植物。本发明还包括抗病原体组合物，其含有本发明的几丁质酶作为活性成分。

植物对于象病原体攻击、化学物质处理以及损伤等刺激的反应，要积累大量的蛋白。其中研究较多的一种反应就是所谓“与疾病发生有关的蛋白”即PR-蛋白的诱导表达(Bowles.D. 1990.Annu.Rev.Biochem.59，873-907)；Linthorst，H.J.M.，1991，Crit.Rev.Plant Sci.10.123-150)。

根据结构和/或活性，PR-蛋白至少可以分为5簇(PR-1到PR-5)。对烟草植物，每簇PR-蛋白中又可分别出细胞内(I类)和细胞外(II类)两种异构体。

几丁质酶属于PR-蛋白，构成PR-3簇(Legrand M.，等.1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,6750-6754)。I类几丁质酶具有抗真菌活性(Broe Kaert W.F等，1988，physiol.Mol，PlantPathol.33，319-331)，特别是与定为PR-2簇的β-1，3-葡聚糖酶合用时更有抗真菌活性(Schlumbaum A.等，1986，Nature 324，365-367)、(Kauffmann S.等，1987，EMBO.J.6 3209-3212)。

对许多种植物，包括双子叶植物和单子叶植物，都介绍过出现的几丁质酶和相应的cDNA克隆(最近一篇综述，Vide CollingeD. B.等，1993，The Plant Journal3(1)，31-40)。根据几丁质酶的一级结构，又将它们分为3类(Shinshi H.等，1990，plant Mol.Biol.14，357-368)。最近，人们发现有些几丁质酶不宜作这样的分类，提出把它们称为第IV类。第I类几丁质酶以具有大约40个氨基酸的富含半胱氨酸功能区为特征。第II类几丁质酶类似于第I类，特别是它们的氨基酸序列同源性，但第II类缺乏富含半胱氨酸的功能区。第III类几丁质酶和第I类或第II类都没有序列相似性。如上述由Collinge等人提出的第IV类几丁质酶包括糖甜菜几丁质酶IV(Mikkelsen J.D.等，1992，在“几丁质和脱乙酰壳多糖进展”一书(Aolvances in chitin and chitosan(Brine，C.J.Sandford，P.A.and Zikakis.J.P.等Amsterdam Elsevier，inpress))和碱性油菜几丁质酶ChB4(Rasmussen U.等，1992，Planta，187，328-334)以及酸性蚕豆PR4几丁质酶(Margis—Pinheiro M.等，1991Plant Mol.Biol，17，247-253)，显示出和I类几丁质酶有序列相似性，都含有N-末端富含半胱氨酸的功能区，但由于缺失一些氨基酸，比I类几丁质酶要小。植物几丁质酶的分子量范围平均在26～36KDa左右。

通过克隆编码PR-蛋白的基因，并把它们放在非天然的调控序列之下(如组成型的，调控元件)，再把这些重组子引进植物中，改变它们的表达方式，就可能减小植物对病原体攻击的易感性，特别是对真菌的攻击(欧洲专利申请0440304A1；EP0460753)。转基因植物中、I类几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶同时表达，可明显提高转基因植物的抗真菌的能力，显示出联合使用抗病原体蛋白的价值。

仍然需要不断鉴定新的几丁质酶，以便用于抗真菌组合物中和/或克隆编码这些几丁质酶的基因或cDNA研究这些cDNA或基因在转基因植物中表达的效果，并评价上述植物对病原体攻击，特别是对真菌攻击的易感性。

本发明的一个目的是提供新的抗病原体蛋白，编码它们的DNA以及含有和表达这些DNA的植物，使得这些植物对病原体攻击，特别是真菌的攻击易感性降低。

本发明提供一种不含其他植物蛋白的蛋白、它具有内切几丁质酶活性、抗真菌活性，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量约为40-43KDa。更优选的蛋白是可从TMV诱导的烟草植物叶中得到的一种蛋白。一种更优选的蛋白是具有SEQIDNO：2或8中所示的氨基酸序列的一种蛋白，或它的具有几丁质酶活性的片段。本发明还提供了一些本发明的蛋白，其中有一个或几个氨基酸被取代、缺失或插入，但都不消除几丁质酶活性。

本发明另一个实施方案是一种抗真菌组合物，它含有本发明蛋白作为活性成分。优选的组合物是除含有上述蛋白外还含有与上述蛋白一起对真菌有协同作用的另一种蛋白的组合物。进一步优选的组合物含有β-1，3-葡聚糖酶，特别是碱性β-1，3-葡聚糖酶和/或几丁质酶，特别是I类几丁质酶，更优选来自烟草的。

本发明进一步的实施方案是一种分离出来的DNA序列，它含有编码本发明蛋白的开放读码框架，优选具有SEQIDNO：2或8中所示的序列或在严格条件下能与之杂交的DNA序列。

本发明还包括一种植物可表达的重组DNA序列，它含有编码本发明蛋白的DNA序列、或上述蛋白前体的DNA序列，此序列有效地连接到为在植物中表达上述DNA序列所必需的调节元件上，使之产生上述蛋白。优选的植物可表达重组DNA序列是编码具有SEQIDNO：2或7中所示氨基酸序列的蛋白前体的DNA序列。另一优选的植物可表达重组DNA序列含有SEQIDNO：1或7中所示的DNA序列。

本发明还包括含有本发明的一种DNA序列的克隆载体，含有这种克隆载体的细菌菌株。还提供农杆菌属的菌株，它们含有适宜把本发明的DNA转移到植物细胞和植物中去的载体。

本发明的其他实施方案包括植物基因组、含有这种基因组的植物细胞，以及由这种植物细胞繁殖的植物，其结果是能产生或过量产生本发明的蛋白。理想的话，优化编码本发明蛋白DNA的表达使植物对病原体攻击，特别是对真菌的攻击易感性更小。

本发明还包括诸如鳞茎、花、果、叶、花粉、根或根的培养物，种子、主茎、块茎、或微块茎等植物材料，其包括有其中已插入植物可表达的本发明DNA的一个或多个细胞。

本发明还提供一种对真菌的易感性降低的植物变种的育种方法，其特征是至少一个亲代品系含有本发明重组DNA基因组。本发明还提供一种在栽培条件下减少植物损害的方法。本发明的其他方面、实施本发明的各种方法及某些优点都在详细描述部分阐明。

通过下列附图说明本发明。

图1：Cluster-A基因和同源cDNA克隆的核苷酸序列。基因组Cluster-A克隆的全部核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在b行和c行中。此核苷酸序列上面的核苷酸只是cDNA克隆中不同的核苷酸，在a行中标出。同样，在Cluster-A蛋白序列下面的只是在cDNA克隆的氨基酸序列中不同的氨基酸，在d行中标出。通过蛋白测序确定的氨基酸序列下面划了线。推定的信号肽切割位点(位于Ser(S)和Gln(Q)残基之间)用箭头表示。

图2：含有同烟草Cluster-A基因同源的序列的三个克隆的Southern印迹分析。纯化3个烟草基因组克隆(克隆-56；59；66)、并用BamHI，HindIII，PstI、SstI或XbaI酶切，分别见1～5电泳道，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳。将凝胶印迹下来并和Cluster-A cDNA杂交，并用0.1×SSPE、1％SDS在65℃下洗涤。

图3：不同形式刺激后烟草Cluster-A mRNAs的Northern印迹分析：H为末受刺激的健康烟草叶子中分离出来的总RNA，T为由TMV感染的烟草叶子中分离出来的总RNA，E为喷洒eptephon的烟草叶子中分离出来的总RNA，W为被刀割受伤烟草叶子中分离出来的总RNA，U为紫外线照射过烟草叶子中分离出来的总RNA，都用等量与Cluster-A cDNA探针杂交。

图4：烟草N.tabacum的Cluster-A与环状芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、褶皱链霉菌，Brugiamalayic(线虫纲)和Mus musculus小鼠的外切几丁质酶的排列比较：黑框表示按Schuter G.D等人(1991，Protein Struct.Funct.Genet.9.180-190)多重排列比较分析具有高度一致性的区域。

图5：Cluster-A在在肠杆菌中过量产生：(A)：为不同样品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分析结果，T为全部组分、D为细胞碎片、S为可溶性组分。(B)：同一蛋白胶用Cluster-A蛋白特异检测的免疫印迹分析结果。

图6：由TMV-感染的烟草叶中纯化的Cluster-A蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示不同纯化组分的蛋白图。A：为粗制叶提取物的脱盐样品，B：为过S-Sepharose阳离子交换层析柱后的蛋白合并物，C：为过螯合Seperose柱后的蛋白合并物、D：为凝胶过滤层析后的纯化Cluster-A。“Mr”泳道表示予先染色的分子量标记物，各分子量如图所示。

图7：Cluster-A在细胞中的定位。用抗Cluster-A蛋白的抗血清来检测烟草Cluster-A的细胞内定位。分析了健康未被感染和被TMV感染过的烟草植物。a道为总蛋白组分样品，b道为无细胞外洗液的叶组分，c道为EF-组分，它们在12.5％的SDS-凝胶中分离并电转印列PVDF膜上，用此检测Cluster-A蛋白。

图8：Cluster-A和I类β-1，3-葡聚糖酶蛋白协同活性对腐皮镰孢的生长抑制作用。通过把Cluster-A或单独或与I类β-1，3-葡聚糖酶一起加到予先使其发芽的腐皮镰孢孢子上，用来试验Cluster-A在体外对真菌生长的影响。标明了每孔的蛋白量(以μg表示)。在20℃培养3天后，通过用乳糖酚棉兰染色来观察菌丝体。

图9：载体pMOG183的示意图，它是pMOG181的一个衍生体，其中EcoR1的识别位点被一个SstI位点所取代，这个载体从MOGEN Iatenational N.V经请求可自由得到。

图10：载体pMOG185的示意图，它是pMOG183的一个衍生体，其中EcoR1识别位点变成一个XbaI识别位点。

图11，pMOG800质粒、它是一个适宜农杆菌介导的植物转化的双元载体，含有一个植物可表达的卡那霉素抗性基因(用于筛选转化子)和一个多克隆位点(用于插入表达盒)。

本发明提供一种可从植物分离出的新几丁质酶，特别是提供一种来自TMV-诱导的烟草叶的大约40～43KDa的蛋白。发现这种蛋白是由一个非常相似于以前称为Claster-A的cDNA的开放读码框架所编码(Hooft Van Huijsduijnen等、(Hooft VanHuijsduigene R.A.M等，The EMBO.Journal 5(9).2057-2061)。在这篇文献中介绍了6种Cluster(A到F)的mRNA，它们在烟草中都可被TMV-和水杨酸盐所诱导。作者通过杂种选择体外翻译鉴定了6种cluster的mRNA。与最大的Cluster-A cDNA克隆相应的杂种选出的mRNA，其翻译产物产生一组复杂的蛋白，分别为40、35、31和25KDa分子大小(见Hooft VanHuijsduijnen等的上述文献中图3第6泳道)。实际上，由这种cDNA序列产生的这种蛋白从来就没有测列过。既没有纯化出这种蛋白的片段，也没有测定出这些片段任一种结构。对这些蛋白的任一种片段的物理活性也一无所知。

根据本发明，从TMV-诱导的烟草叶子中用一种抗血清纯化出均一的和Cluster-A cDNA相应的蛋白，所用抗血清是由可与PROB40杂交的来自烟草的cDNA克隆转化的大肠杆菌中产生的一种纯化蛋白免疫获得的。已知PROB40克隆和Cluster-AcDNA能交叉杂交(Hooft Van Huijsduinen等同上)。

在鉴定和纯化过程中使用这种抗血清，就可以从TMV-感染的烟草叶子中分离出足够量的Cluster-A蛋白，来研究它的生理活性和抗病原体活性。根据对烟草中这种蛋白的测序得到了这种分离蛋白的部分氨基酸序列；它与由图1中的cDNA推演出来的氨基酸序列几乎完全一致。

发现C luster-A蛋白对氚标记的几丁质底物具有较低的几丁质酶活性，大约要比来自烟草的I类几丁质酶活性低250～500倍。但是，当用一种可溶性几丁质作底物，以比色法检测时，发现它的活性又比J类几丁质酶活性大约高出2倍。未能测到外切几丁质酶活性或溶菌酶活性。虽然其结论是Cluster-A代表一种内切几丁质酶，但又与属于I类内切几丁质酶的那些有些不同特点。可得出这样的结论：Cluster-A是植物中一类全新几丁质酶的第一个成员。发现Cluster-A蛋白主要分布在细胞内。

Cluster-A蛋白在一个体外抗真菌绿色木霉的试验中显示出具有抗真菌活性。与β-1，3-葡聚糖酶结合，通过用许多试验真菌的敏感性来评价得出：这种活性协同提高。当把Cluster-A蛋白和β-1，3-葡聚糖酶联合一起测试时，能够检测出它们对腐皮镰抱和根链格孢两种真菌具有裂解和生长抑制两种作用。

用PROB40筛选cDNA文库后得到的cDNA被用作筛选基因文库的探针以分离编码Cluster-A蛋白的基因。鉴定出了一个杂交克隆并测定了它的核苷酸序列。Cluster-A基因的完整序列以及起动子区部分都描绘在图1(SEQIDNO7)中。分析推演的氨基酸序列显示，Cluster-A蛋白可能是以一个较大的前体产生出来的，从前体切下一个信号肽(大约25个氨基酸)：推定的切割位点以箭头标出。Southern分析表明(图2)：Cluster-A基因是大约由4个基因组成的小基因家族中一个部分。

这种新型的几丁质酶，以下称作Cluster-A蛋白，可能适宜用作抗病原体(特别是抗真菌)组合物的活性组分，优选与能与其协同作用的其他蛋白，如β-1、3-葡聚糖酶联合应用。Cluster-A蛋白的合适浓度范围大约为0.01μg/ml到100μg/ml，优选0.1μg/ml到10μg/ml。从广泛的意义上说，本发明的抗真菌组合物可用于农业以抗植物致病真菌；例如在园艺，树木栽培、观赏植物园艺、家庭园艺以及鲜花栽培等等方面的应用。同样，Cluster-A蛋白的抗真菌作用在其他工业领域，如饮料、食品、化妆品等的保存上可能也是有用的。

另外，编码Cluster-A蛋白的DNA，不管是cDNA还是基因组序列，都可以克隆在这种DNA在植物中表达所需调控序列的后面，以便在用上述DNA转化的植物中产生或过量产生Cluster-A蛋白。必需的调控元件至少包括一个转录起始区和一个在植物中有功能的翻译起始区。调控序列还可以包括象启动转录的增强子元件。增强子可以提高组成型的、或组织特异型的或发育型的或环境调节型的表达。

本发明优选的表达方式是一种主要相对组成型表达形式，可优选高水平表达(为本发明的目的，在叶子中大约0.1％的可溶性蛋白被看作是相对高的表达水平)。相对组成型的表达方式意味着它不随植物发育阶段而被剧烈调节，也不是组织特异性的。被本领域内技术人员看作是相对组成型而不受发育阶段剧烈调节的启动子是CaMV35s启动子。一个优选的这种启动子含有一个所谓的双增强子。其他适用于与本发明结合的相对组成型启动子可从植物病毒中得到(如CaMV 19s启动子，Figwort花叶病毒启动子等等)以及从植物基因中得到。相对组成型启动子还可从农杆菌(Agrobacterium)Ti-和Ri质粒的T-DNA区域里衍化出来，侧翼有或无转录增强子序列。从文献中人们知道CaMV35s启动子的-343和-90之间的序列会提高CaMV 35s启动子的活性(KayR.等1987，Sciencl236.1299-1302)，还可推测它提高其他组成型启动子的活性(如甘露氨酸合成酶启动子：美国专利5,106,739)。

光诱导型高水平表达的启动子例子是核糖双磷酸羧化酶小亚单位(rbcSSU)启动子和叶绿素a/b结合蛋白(Cab)启动子，本发明中可以使用这两种启动子。

理想的情况是把所引入嵌合基因的表达限制在一个或几个预先选定的器官或组织中，如那些真菌攻击的靶子，如根、表皮细胞等。组织特异性启动子了解比较清楚的一个例子就是patatinII类启动子。还可使用根特异性启动子。适宜在本发明方法中使用的启动子也可以是伤害诱导型的。

本发明还包括使用杂合启动子，即包含从不同基因调控元件所衍化元件的启动子。

植物可表达基因通常包括一个所谓的终止子序列。它包括一个poly(A)信号，也可以用本发明基因的终止子，这并不重要。

这里所用的“基因”一词意味着包括cDNA的及基因组序列中的转录区，这两者可以是合成的或是部分合成的。为了用在象单子叶植物宿主或非植物宿主中，需要的活，密码子的使用可以改变。“植物可表达基因”意指一段DNA序列，它可有效地连接到在植物细胞中转录所必需的调控序列上，并随转录产生RNA，转录加工后能被翻译成蛋白。假如一个基因至少在一个组织里在植物生活周期的一特定阶段里表达，这个基因就是“植物可表达基因”。即使一个基因在植物发育的所有阶段都不表达，或仅在某些内部或外部刺激诱导后才表达也可被理解为植物可表达基因。

本发明的植物可表达重组DNA序列意指包括至少兼有两个不是自然发生联系的序列的任何DNA序列。如植物可表达重组DNA序列包括那些含有真核基因下列功能区的结合物：如增强子、转录/翻译起始区，编码区、非翻译前导序列、信号序列、空泡靶序列、终止序列，内含子、外显子等或化们的部分序列组成的基因。本发明设想这些元件之一的任何缺失、增加或取代以产生不同于自然状态下的表达水平或表达型式。修饰并不一定要提高表达水平。例如，本发明清楚设计在本发明蛋白的C-末端部分截短，以便使其积累转到非原质体(细胞外)空间中，这是抗病原体蛋白一个优选的分布位置。象这样的截短修饰可能是基因的仅有修饰，而未触及开放读码框架的其余部分，象决定其功能的其他序列(如启动子，终止子，内含子，外显子等)，仍使编码本发明蛋白的DNA落在植物可表达的重组DNA的定义之内。

据信抗真菌蛋白保护转化植物抗植物病原性真菌的一个有效位点是非原质体空间。因此可用编码本发明植物表达性基因的重组DNA分子转化植物，此基因就可在植物的非原质体空间中发挥它的作用，或为天然的或为靠遗传修饰的作用。

修饰编码在植物细胞空泡中自然发生之蛋白的基因以使翻译产物中都没有靶向空泡所涉及的C-末端氨基酸(如通过把一个翻译终止密码子引进到本基因的编码区的C-末端，或其他方式)。这种截短的影响是把空泡蛋白引导到非原质体空间中去了(此程序的细节见EP440304A1)。

上述每一项操作对本领域内的技术人员都是熟知的，用标准技术容易评价其对表达水平、靶向作用及对疾病的抗性的影响。

通常，评价转化的植物是否存在目标性状及其所表达的目标性状的程度。第一个评价可能包括新引入基因的表达水平、转化植物抵抗真菌的水平、目标性状的稳定遗传力、以及田间试验等。

第二，需要时可把转化的植物与其他变种杂交育种，如与有较高商业价值的变种，或其中已经引进了其他目标性状的变种，或用以创造新的杂交种子，或进行另一轮的转化等。

Cluster-A蛋白和烟草β-1，3-葡聚糖酶合用在体外产生一种协同抗真菌作用。同样，这两种蛋白在植物中产生和过量产生时，预计也会有这种协同抗真菌作用。这是从几丁质酶和葡聚糖酶联合使用在体外可产生协同作用推衍出来的，它们在体内也会产生这种作用(EP440304A1)

可以与本发明的抗真菌蛋白合用的蛋白例子包括但不限于：β-1，3-葡聚糖酶和其他象来自大麦(Swegle M.等1989，PlantMol.Biol.12，403～412；Balance G.M等1976，Can.J.Plant Sci56，459-466；Hoj P.B.等，1988，FEBS Lett，230，67-71；HojP.B等1989，Plant Mol.Biol.，13，31-42，1989)、菜豆(BollerT.等，1983，Planta 157，22-31，Broglie K.E.等，1986.proc，Natl.Acad.Sci.USA83，6820-6824；V-geliu.等1988 Plant174，364-372；Mauch F.和Staehelin L.A.1989.Plant-Cell 1，447-457)、黄瓜(Metraux J.P.和Boller T.(1986).Physiol Mol.Plant Pathol.28，161-169)、韭葱(Spanu P.等1989，Planta177，447-455)、玉米(Nasser W.等，1988，Plant Mol，Biol.11，529-538)、燕麦(Fink.w，等1988，Plant Physiol，88，270-275)、豌豆(Mauch F.等1984，Plant Physiol.76，607-611；Mauch.F等1988.Pl ant Physiol，87，325-333)、白杨(Parsons T.J.等1989，P.N.A.S.86，7895-7899)、马铃薯(Gaynor J.J.1988，Nucl.Acids Res.16，5210，Kombrink E.等，1988，Proc.Natl.Acad.sci，USA85，782-786；Laflamme D.和Roxby R.，1989，Plant Mol.Biol.13，249-250)，烟草(如Legrand M.等，1987，Proc，Natl.Acad.Sci，USA84、6750-6754；Shinshi H等.1987.Proc，Natl.Acad.Sci.USA 84.89-93)、番茄(Joosten M.H.A和De Wit P.J.G.M，1989.Plant Physiol，89，945-951)、小麦(Molano J.等.1979，J.Biol，Chem.254，4901-4907)等等的几丁质酶。

适合与编码本发明抗真菌蛋白基因合用的相应蛋白的植物基因的克隆。在转基因植物中这些基因的过量表达、以及表达的遗传操作(包括靶向控制)和植物中对疾病抗性的评价等都是本领域内技术人员所掌握的范围，特别在欧洲专利申请0440304A1和0460753A2中举出了实例。这两件申请并入本文作为参考。

含有一种以上嵌合抗真菌基因的转基因植物可通过多种方法得到，包括A：使用一种带有多个修饰基因的重组多聚核苷酸如质粒，这些修饰基因与一个选择标记基因有效地偶联；B：已经能表达一种或几种与一选择标记编码基因偶联的嵌合基因的转基因植物，与来自含有1个或几个与另一选择标记偶联的基因重组子的转基因植物的花粉进行交叉授粉，之后根据有无这两种选择标记选出用这种杂交方法得到的种子。以后就可以用从选出的种子所得到的植物再进行杂交；C：用许多重组多聚核苷酸，如质粒，每个都有1个或几个嵌合基因和1个不同的选择标记。假如共转化频率高，那末仅用一个选择标记就足够了。在其他情况下，优选用几个标记来筛选；D：用新的、另外的嵌合基因和选择标记基因来连续转化转基因植物；E：上述方法联合起来使用。实际方法对本发明来说是不重要的。

对任何一种易受某种形式真菌攻击的植物都可以供以一种或几种本发明的植物可表达基因重组子。同样，任何一种易受某种形式真菌攻击的植物都可以用含有本发明的抗真菌蛋白的组合物来处理。

因此，本发明意义上的“植物”应指裸子植物及被子植物、双子叶植物和单子叶植物，它们被用于农业，园艺、林业、(室内)园艺、或涉及植物的活动，不管是直接被用作食物或饲料，还是用于在各种工业中进行进一步加工、用于提取物质、用于装饰、繁殖、杂交育种或任何其他用途。

原则上，可用任何转化方法把本发明的植物可表达基因引进选定的植物中。通常实用的方法有用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Kreus，F.A.等.1982，Nature296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)，原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985Bio/Tichnol.3，1099-1102)，微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986 Mol.Gen.Genet，202，179-185)，(DNA或RNA包被的)粒子轰击各种植物材料(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)，用病毒感染等。

在本发明的一种优选实施方案中，使用农杆菌介导的DNA转移法。特别优选的是使用象在EP-A120516和美国专利4,940,838中介绍的所谓双元载体技术。

通常，转化后通过用与本发明的植物可表达基因共转移的植物可表达基因编码的一个或几个标记物的存在来筛选出植物细胞或外植体，此后再把转化的材料繁殖成整株植物。

虽然认为单子叶植物的遗传转化多少更难以对付，但单子叶植物也能被转化。能从转化细胞或原生质体再生出有繁殖力的转基因植物。目前，对单子叶植物优选的转化方法是外殖体或悬浮细胞的微型射弹轰击和直接摄取DNA或电穿孔法(Shimamoto.等，1989，Nature 338，274-276)。通过把吸水链霉菌bar基因(它编码phosphinothricin乙酰基转移酶—一种灭活除莠剂phosphinothricin的酶)以微型射弹轰击法引进玉米悬浮培养的胚发生细胞里而得到转基因玉米植物(Gordon-Kamm，1990，Plantcell 2，603-618)。已有报导把遗传物质引进到其他单子叶作物如小麦和大麦中的籽朊粒原生质体中(Lee，1989，Plant Mol.Biol.13，21-30)。通过只选择成年结实和有结节的胚发生愈伤组织(颖托)以便建立胚发生悬浮培养(Vasil，1990 Bio/Technol.8，429—434)，而从中已再繁殖出小麦植物。对这些植物联合使用转化系统，能把本发明应用于单子叶植物。

单子叶植物，包括象谷物、水稻这样的重要经济作物都能通过农杆菌株很容易地转化(Gould J.Michael D.Hasegawa O.UlianEC.Peterson G.Smift RH.1991，Plant physiol.95，426-434，Hieiy等，1994，Plant Journal 6.待出版)。

可用能产生和过量产生本发明的新几丁质酶(无论是单独还是与其能发挥协同作用的其他抗真菌基因编码的蛋白质一起)的植物和植物部分来评价对病原体的抗性，特别是对真菌的抗性。然后，在育种计划中，使用多个抗性品系来产生增强抗致病菌(特别是抗真菌)的上市变种。

可在田间或温室使用对病原体或真菌攻击易感性降低的植物，然后用作动物饲料或人类(直接)消耗，用于长期储存，用于食品或其他工业加工等。本发明这些植物或它的组成部分的优点是不太需要杀真菌处理，降低了材料成本劳动力以及环境污染，或延长了这种植物的产品(如果实、种子等)的储存期。

而且，由于有本发明的几丁质酶等高水平存在，可以降低收割后的损失。

这里没有详细叙述的本发明的其他优点，本领域内技术人员都可以想象得到，而且这种优点不脱离本发明的范围。

下面的实施例仅仅是用作进一步说明本发明的，这些例子和对其所作的任何说明都不应看作对本发明范围的限制。

实施例 1：Cluster-A相应的DNA的分离：

已报导过Cluster-A mRNA是由TMV-感染烟草N.tabacum的Samsun NN品系后强诱导出来的(Hooft VanHuijsduijnen等，1986，Supra)。用从PROB40(一个部分Cluster-A cDNA克隆)衍化来的探针筛选TMV感染的Samsunn NN烟草植物的λZAP cDNA文库(见实验部分)，结果分离了11个阳性杂交克隆。限制性内切酶分析和(部分)序列分析表明，所有克隆都是一致的。结论是这些克隆都与Cluster-A cDNA对应。测定了其中一个克隆(cA-3)的核苷酸序列(实验部分)并表示在SEQIDNO：1和2中。这个克隆缺本开放读码框架5’端部分的7个密码子。

实施例2：以细菌表达型载体克隆完整的cDNA克隆

用b下列引物T7：5’-AATACGACTCACTATAG-(SEQIDNO：3)和引物P1： 5’-GTTTCCTTCTCCATGGAACTAGTTTGCAC(SEQIDNO：4)对克隆CA-3进行PCR反应(实验部分)来完成cDNA克隆。

用限制性内切酶NcoI和XhoI酶切PCR扩增产物之后，进行琼脂糖凝胶电泳并从中分离片段，把这个片段连接到NcoI/XhoI酶切的中间载体pGV84上，再转化到E.coli DH5a中。然后再把由这种转化子产生的阳性克隆的NcoI/xhoI酶切片段连接到一个NcoI/SalI酶切的细菌表达载体(pJLA602，Medac.Hamburg，Germany)上，并用以转化E.coli DH5a。通过和标记的克隆cA-3杂交来筛选阳性转化子，并用限制性内切酶分析来测定插入片段的正确大小和方向。得到的质粒pJLA-A53，含有推测的Cluster-A开放读码框架(ORF)，该读码框架包括20-377密码子，处于串联排列的λ-噬菌体可抑制P_R和P_L启动子和高度有效的E.coli翻译起始区的下游。最后用质粒pJLA-A53转化E.coli菌株KA1092(trp65.Lon，sFiA-1，malB)(Jahnson.B.F.等，1977.Mol.Gen.Genet.157，91-97)〔protease^-〕用此菌株产生Cluster-A蛋白并产生抗体。含有pJLA-A53的菌株KA1092于1993年8月12日保藏在Centraal Bureav Voor Schimmelcultures.登记号为CBS415,93。

实施例3：Cluster-A cDNA在E.Coli中的表达及抗推定的cluster-A蛋白抗体的产生。

把Cluster-A cDNA基因(20～377密码子)放在λ噬菌体P_R和P_L启动子的控制之下(Schauder B.等.1987.Gene56，279-283)，以便让这个基因在E.Coli中过量表达。图5显示的是在E.Coli KA1092菌株中过量产生的推定的40KDa的Cluster-A蛋白。通过超声破碎细胞后，经离心把Cluster-A蛋白聚集物与细胞碎片分离出来(图5，D道)。通过培养物在30℃生长3小时后转换到42℃水溶中再孵育3小时来诱导推定的Cluster-A cDNA基因在KA1092菌株中表达。离心收细菌并溶解在样品缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，6M尿素，2.5％SDS，10％甘油，5％β-巯基乙醇)中，纯化在E.Coli中产生的推定的Cluster-A蛋白并用以制备抗体(实验部分)。

图5表示图5中所示的类似蛋白组分的Western印迹分析结果，证实分离出来的抗体是特异性针对推定的Clnster-A蛋白的。在含有Cluster-A表达重组子的诱导大肠杆菌中，其总组分(T道)和细胞碎片组分(D道)都发现有Cluster-A蛋白的强信号。S道中出现的弱信号表明，在可溶性蛋白组分中存在着少量的Cluster-A蛋白。

100℃加热3分钟后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品(实验部分)并用考马斯亮兰染色观察蛋白。用冰冷的1M KCl染色相似的凝胶，并切出含有过量产生的40KDa的凝胶部分。水洗后，磨碎丙烯酰胺并和福氏完全佐剂混合、和大约200ng推定的Cluster-A做成悬浮液，皮下注射给兔子。以2周间隔在不完全福氏佐剂中的相似悬浮液中再免疫接种3次后、从兔子中采集50ml血液，试验其血清部分抗推定的Cluster-A蛋白的抗体活性。

实施例4：烟草中的推定Cluster-A蛋白的分离与鉴定：

用实施例3中介绍的方法得到的抗血清，通过免疫检测测试由TMV感染的烟草叶中推定Cluster-A蛋白的纯化(实验部分)

推定的C luster-A蛋白显出吸附到阳离子交换S-Sepharose层析柱上、表明这种蛋白呈碱性。在S-Sepharose柱的穿过峰里没发现有交叉反应蛋白。推定的Cluster-A蛋白是用75到140mM NaCl从S-Sepharose柱中洗脱下来的。仔细检查SDS-聚丙烯酰胺凝胶和免疫印迹结果，发现有2种分子量大约相同(41KDa和43KDa)的蛋白同上述抗血清有交叉反应。显然，这两种蛋白是相关的。由于在其cDNA序列中(3个潜在糖基化位点)和gDNA序列中(4个潜在糖基化位点)都有潜在的糖基化位点，这就促使我们研究推定的Cluster-A蛋白同Con-A、S epharose柱的结合。因此把蛋白对含有1.15M NaCl的50mM Tris-HCl(pH68)缓冲液透析并让它吸附到con-A Sepharose柱上。结果绝大部分41KDa的Cluster-A蛋白穿过Con-A柱，而在结合的蛋白中存在43KDa推定的Cluster-A蛋白。这表明后一种蛋白至少是部分糖基化的。在纯化推定的Cluster-A蛋白不用Con-ASepharose柱。而是使用螯合的Sepharose色谱法、从S-Sepharose层析柱上洗脱下来的含有推定的Cluster-A蛋白的流份对含150mM NaCl的50mM Tris Hcl pH8.0缓冲液透析，让其吸附到用Zn^{2+}离子活化的螯合Sepharose柱上、并用上述缓冲液平衡。通过这种活化基质，可以滞留大约20％的总蛋白。并显示主要由Cluster-A蛋白组成。第2次穿过这种螯合Sepharose柱得到几乎纯的蛋白制品(图5、D道)。通过随后的凝胶过滤层析就可把推定的Cluster-A蛋白纯化到匀一程度。表观天然分子量在约40至43KDa之间。

实施例5：推定的Cluster-A蛋白氨基酸序列的阐明：

用12.5％S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离41KDa和43KDaCluster-A蛋白的混合物。并电转移印迹到PVDF膜上。然后以Edma降解法(实验部分)，用这种混合物进行N-末端氨基酸序列测定、但是N-末端被封闭了，没有得到序列信息。由于存在一个对酸水解敏感的唯一位点，使我们从相同材料中测定出一个中间序列：

P-V-N-H-X1-S-G-S-D-X2-I-N-A-X3-I-Q(SEQID NO：4)X1＝V/I，X2＝G，X3＝W；

这一序列前面的氨基酸最可能是Asp(D)残基，因为所用的水解对Asp-Pro键是特异的(Landon，1977.Sub)。用羟胺切割推定的Cluster-A蛋白之后，得到了另一些序列信息。这造成分子量大致相同的两种肽形式，它们在一起被印迹到PVDF膜上。对这个样品测序得出下列序列：

G-L-N-Y-P-V-E-S-V-A-R-N-L-N-W(SEQID NO：5)和

S-H-A-Q-L-F-D-P-V-N-H-X-S-G-S-D-G-I-N-A-W-I-Q-A-G-V(SEQID NO：6)，其中X＝I/V。

这些多肽序列和由cDNA克隆推衍出来的氨基酸序列是完全一致的(图1；SEQID NO：1和2)。从这些相配的资料得出的结论是，由烟草中纯化的这两种蛋白是和由部分Cluster-A开放读码框架转化的E.Coli KA1092菌株产生的蛋白相一致。与233位的密码子相应的多肽序列显示，两种氨基酸(V/I)在这一位置上是以1∶1比例出现的。可能纯化出两种高度一致的Clustet-A蛋白，它们在测定序列的范围里有1个氨基酸位置不同。

将Cluster-A蛋白和与一数据库中匹配蛋白相比较表明：它们分别来自环状芽孢杆菌及粘质沙雷氏菌的细菌几丁质酶ChiA和ChiB是同源的。虽然Cluster-A同chiA一致性为31％，同chiB的一致性为26％，都是比较低的，但在这三种氨基酸序列中都高度保留有特异区域，如图4中所示。此外，还发现与来自褶皱链霉菌、Brujia malayi(线虫纲)的几丁质酶以及来自MuS musculus(Murinae)的一种分泌蛋白都有同源性。与4类不同植物几丁质酶没发现有结构上的同源性(Lawton k.等，1992.plant Mol.Biol.19，735-743；collinye，1993 Supre)。

实施例6：Cluster-A的细胞内定位及酶活性：

烟草Clustet-A蛋白和细菌几丁质酶的同源性提示，这种蛋白有可能催化几丁质(一种N-乙酰基-P葡糖胺的a-1，4-连接的聚合物)水解。用抗体从烟草材料中有可能纯化Clustet-A蛋白，使我们能去验证这种假说。试验了Cluster-A的几丁质酶活性。在内切几丁质酶活性检测中，用氚标的几丁质作为底物(Molano J.等1977 Anal Biochem.83.648～656)，Clustet-A蛋白显示比活性为每μg蛋白40±6 cpm，这比I类几丁质酶的比活性大约低250～500倍(Legrand.M.等1987.proc.Natl.Acad.Sci，USA 84 6750-6754；Sela-Buur-lage M.B.等1993 plantphysiol.101.857-863)。但是，用可溶性几丁质染料作底物，由比色法测定的Clustet-A的几丁质酶活性(wirfh和woff.1990J.Microbiol、Mefhol、12.197-205)，要比I类几丁质酶活性高出2倍(表1)。检测Cluster-A其他酶活性表明：这种蛋白不具有外切几丁质酶活性、壳二糖酶活性以及β-1，3-葡聚糖酶或溶菌酶活性。

用TMV感染的烟草植物不同叶子组分来分析Cluster-A细胞内定位，包括用(a)：叶子总组分，(b)去掉细胞外液体(EF)的叶子材料，(c)EF部分。Western分析表明：Cluster-A蛋白主要是细胞内分布，如图6所示。(a)、(b)组分都发现有很强的Cluster-A蛋白信号。在TMV感染的叶子细胞外液中(C组分中)没有发现Cluster-A蛋白。

表1

Cluster-A蛋白几丁质酶活性

几丁质酶活性(以每g表示)蛋白氚标几丁质检测 CM-几丁质检测PR-3a(PR P) 1180 ± 57 cpm 36.2±1.10 0DePR-3b(PR Q) 1087 ± 35 cpm 30.9±1.90 0De32kDA(Chi-I) 11471 ± 347 cpm 1.0±0.03 0DeCluster-A 40 ± 6 cpm 2.1±0.03 0De外切几丁质酶# 746 ± 60 cpm 7.0±0.34 0De

CM-几丁质：与Remazol亮紫结合的羟甲基几丁质。

&氚标记的几丁质底物(Molano等，1977)。

$对硝基苯释放试验，底物为对硝基苯基壳二糖(Roberts和Selitrennikoff，1988)。

#来自S.griseus的外切几丁质酶(Sigma c-1650)。根据Roberts W.K.和Selitrenni Koff C.P.(1988.J.Gen，Micro-biol.134.169-176)介绍的方法，用对硝基苯基壳二糖作底物，以对硝基苯释放试验来检测所有几丁质酶的外切几丁质酶活性。对于PR-3a、PR-3b、32KDa Chi-I和Cluster-A，它们释放出的对硝基苯量小于0.05nmole，相反对于外切几丁质酶可释放出4.50＋0.1nmole(表中未表示)。试验都是在37℃、pH6.0下进行的。保温时间通常是30分钟，但在低的溶菌酶活性情况下，要延长保温时间。分别以释放的cpm值和以OD值增加测定的所释放兰色底物表示此活性。实施例7，Cluster-A蛋白体外抗真菌活性。

在以前的报导中，有人证实I类几丁质酶(chi-I)和β-1，3-葡聚糖酶(Glu-I)体外都能抑制真菌生长(Maach等，1988，Sela-Buurlage等、1993)。这两种水解酶在植物抗真菌侵袭的防卫机制中发挥着重要作用。通过试验这种蛋白单独或与chi-I或Glu-I联合使用对不同真菌的裂解活性来研究Cluster-A的抗真菌活性。浓度为12μg/ml的Cluster-A蛋白单独可引起木霉属viride的裂解和生长抑制。对植物致病真菌根链格孢Cluster-A在每ml30到60μg浓度下会抑制其生长。对腐皮镰孢菌即使在高浓度下(600μg/ml)也无效。但是，Cluster-A蛋白与I类β-1，3-葡聚糖酶(和几丁质分解酶)蛋白协同使用表现出对腐皮镰孢菌强抗真菌作用。这些蛋白的协同作用会引起腐皮镰抱菌芽前孢子裂介和生长抑制的双重作用，见图7。Cluster-A蛋白对植物致病性真菌番茄壳针孢和致病疫霉没有显示出效果(资料未显示)。

表2

Cluster-A蛋白的抗真菌活性

Cluster-A对腐皮镰孢和根链格抱的裂解活性

腐皮镰孢根链格孢Cluster A Chi-I Glu-I Chi-I Glu-Iμg/孔 0 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.50 0 0 0 5 56 0 0 42 542 0 0 0 26 95 0 0 45 345 0 0 5 34 95 0 0 45 3810 0 0 5 95 95 0 0 35 3010 den 0 - - - - - - - -

表3

不同蛋白制品的核真菌活性，以裂解百分率及生长抑制(GI)率表示

腐皮镰孢根链格孢蛋白加入蛋的量％ GI ％ GI

(μg/孔) 裂解裂解Clu-A 5-10 0％ 0 ND 4Clu-A 100 0％ 0 ND ND葡聚糖酶 0.1 0％ 0 ND NDClu-A＋葡聚糖酶 10∶0.1 0％ 2-3 ND ND几丁质酶 0.1 0％ 0 ND NDClu-A＋几丁质酶 10∶0.1 5％ 1 ND ND

变性对照样品的结果放在括号里，但只在它们不是0％裂解和/或Gi-0时。实施例8：分离编码Cluster-A蛋白的基因组克隆。

用Cluster-A c DNA的cA-3克隆的插入片段作探针来筛选烟草N.tabacum的基因组文库、纯化出3个重组λ-噬菌体而每个都含有与Cluster-A cDNA杂交的不同内切酶片段。用相应于LS42编码区5’端的特异性寡核苷酸引物：

5’-TCTCCGGCAACTAGTTTGCAC-3’(SEQID NO：10)和Cluster-A cDNA LS42 3’端非编码区的引物：5’-GTCATAGTTCACATATCTGTTGCC-3’(SEQ ID NO：11)、通过PCR技术扩增同cA-3同源的基因组Cluster-A。用这两种引物、3个噬菌体中只有1个表现出特异序列有明显的扩增。挑出这个噬菌体以便作进一步分析。Cluster-A cDNA的完整的核苷酸序列，包括推衍的Cluster-A蛋白的一级结构和基因5侧翼及3’-侧翼的序列显示在SEQID NO：7和8中。把这一cDNA克隆和Cluster-A基因比较表明，两者序列具有高度一致性(94％)。在5’端上游区内发现了“CAAT”(位于391)和“TATAAT”(位于428)基元。在3’端非编码区2971位上存在一个潜在的poly(A)信号(5’-AATAAA-3’)。在两个外显子中含有Cluster-A基因的编码区，该编码区产生一个377个氨基酸的前体蛋白。Cluster-A前体蛋白含有一个25个氨基酸的推定信号肽(在穿过内织网膜运输时涉及到它)以及4个潜在的N相连糖基化位点(N-X-S/T)。预期成熟蛋白的理论分子量为39.033Da。在密码子151和364之后分别有952bp和349bp长的插入序列。为了确定在烟草中编码Cluster-A样蛋白的基因数目，用这一cDNA克隆探测了基因组Southern印迹。在严格条件下与这一探针杂交的带型表明：Cluster-A至少有4个成员的小基因家族的一部分(图2)。为测定Cluster-A基因表达的诱导，用不同刺激条件处理烟草植物并作Northern印迹分析。接种TMV后3天、损伤后2天、ethphon处理后1天以及紫外光照射后1天取不同处理的样品。以前Brederode和其同事报告过在这样的时间里，PR-基因(PR-1到PR-5)有最大的表达(1991.plant Mol，Biol.17，1117-1125)，这里用其研究Cluster-A基因的表达。图3显示在未刺激的烟草叶中没有检测到Cluster-A基因表达。TMV感染并加之ethephon(为产生乙烯)或紫外光处理的烟草叶子，两者都造成Cluster-AmRNA大大增加(图3，E和U道)。相反，叶子受伤后。Cluster-A表达的诱导较低。综上结果表明：可以把Cluster-A归类为烟草的一种与致病相关的新基因。

实施例9：表达结构和二元载体的构建：

Cluster-A基因是以大约5.5kb的SstI-酶切片段被克隆的。整个开放读码框架位于该片段中并约占这个片段的2/3。这个ORF的5’端大约起始于1个SstI位点的453位上。按下列方法，用PCR技术把BamHI位点引入到ORF5’端的紧上游。把原来的序列(图1)(406位)5’-TTTAAACTCGAAGTCACAAATTAAA-3’(SEQIDNO：12)(432位)、改变为(406位)5’-TTTAAACTCGGATCCACAAATTAAA-3’(SEQIDNO：13(432位)。

与此相似，在PCR反应中，用下列接头序列把质粒pMOG183(图9)上的EcoRI位点更换成xbaI-位点：5’-AATTGTCTAGAC-3’(SEQIDNO：14)。修饰的克隆载体命名为pMOG185，它含有CaMV35s启动子和nos-终止子以及在两者之间是为插入Cluster-A基因的BamHI位点。为此，利用Cluster-A基因片段上新引进的BamHI位点，将作为约5.1Kb BamHI-SstI片段的Cluster-A基因ORF克隆到修饰过的表达载体pMOG185的BamHI位点上。这样，上游接有带有双重增强子的35sCaMV启动子且下游接有NOS-终止子的Cluster-A基因就被定位到一个xbaI-SstI片段上。随后把这一片段再克隆到二元载体pMOG800(图10)中。二元载体pMOG800含有一个植物可表达的卡那霉素抗性基因(它位于T-DNA左右边界之间)和一个能插入多种内切酶片段的多克隆位点。含有这种载体的E.coli菌株于1993年8月12日保藏在荷兰Baarn的Centraal BureauVoor Schi mml cultures.登记号为(CBS414，93)，借助于适当合成的双链、部分互补的接头序列(如5’-AGCTCACG-3’和3’-GT G CTTAA-5’)，这样得到的二元载体含有主要组成型可表达Cluster-A基因和定位在T-DNA左右边界序列间的作为标记的植物可表达的NPTII基因。

借助于质粒pRK2013，把这种pMOG800衍化出来的二元载体从E.coli DH 5a菌株中移进到含有Vir-功能的辅助质粒的根瘤农杆菌菌株MOG101中。在含有40mg/L利福平，250mg/L壮观霉素和100mg/L卡那霉素的选择培养基上、从这些交配物中分离出转移结合子(细节见实验部分)。用接受了这种二元载体的农杆菌细胞转化植物。

实施例10：植物的转化及表达分析：a.番茄：用含有pMOG800衍化的二元载体的农杆菌MOG101菌株转化番茄(lycopersicon esculentum cv.Moneymaker)，基本按Mccormick等(1986，Plant Cell Rep.5、81-84)介绍的方法进行。b.烟草：为转化烟草，使用叶圆片浸渍法(leat-disc dip method)(1985，Horsch等，Science227，1229-1231)。叶圆片和含有二元载体的农杆菌MOG101株一起培养，并长在含100mg/ml卡那霉素的选择培养基上。转基因幼芽再长成整株植物，并分析新转进基因的表达，用Western印迹进行这种分析，其中使用针对Cluster-A蛋白和/或葡聚糖酶的抗血清。c.马铃薯cv.Kardal：马铃薯块茎必须保存在+4℃，转化前7天，块茎必须转移到室温下。第1天，把新鲜培养板中的农杆菌株接种到10ml LB＋100mg/L卡那霉素+20mg/L利福平中，29℃培养过夜。第2天，用基础培养基+100mg/L卡那霉素按1∶10稀释农杆菌悬液，29℃培养过夜。用1号培养液铺平板。第3天，用不含抗生素的基础培养基把农杆菌悬液稀释到OD600+0.15、并让其长到OD600 0.30-0.70(约需4小时)。离心培养物，用MS₃₀R₃按1∶10稀释。削去马铃薯皮。——用70％酒精洗一分钟。——用1∶5稀释的Teepol＋0.1％Tween20洗20分钟。——用无菌水再洗一次。——加入约100ml 1∶1混合的RK∶KI(兰色必须保持2分钟)。——用无菌水洗去兰色。——把块茎切成约2mm薄片。——用钻孔器将此脉管组织切成小园片。——将小园片收集在盛有液体MS₃₀R₃的大平皿(15cm)(每平皿约400个)。——在无菌滤纸上干燥40个小园片，并把它们放在1号培养基上作为对照(2个平皿)。——用吸管去掉MS₃₀R₃培养液，并用农杆菌悬液替换这种培养液。——20分钟后，用液体MS₃₀R₃替换农杆菌悬液。——在无菌滤纸上干燥小园片，并把它们转移到含有1号培养液的平皿中(每板20个园片)。——用封闭膜封住小园片，并把它们放到再生室中。——第4天用2号培养液铺平板。——第5天，把园片转移到含有2号培养液的平板中(每板20个)。——第8天，用3号培养液铺平板。——第9天，把园片转移到含有3号培养液的平板中(每板10个园片)。由第3天没有浸渍的园片作以下对照：

1.没浸渍和不选择的(2个平板，20个园片)

2.没浸渍而选择的(2个平板20个园片)

又作一个附加对照：3.浸渍了而不选择的(2个平板，20个园片)。每3周把园片转移到新鲜培养基中。3周后，可见第一批幼芽。当这些幼芽足够大时，切下它们并把它们放到含有4号培养液的试管里(长根可能需要3周时间)。

所需的无菌培养基：

制备基础培养基：

每升MS₃₀R₃：100ml 10^*MS盐

10ml 100^*R₃维生素

30g葡萄糖

8g Diachin琼脂

用KOH调pH5.8，110℃灭菌20分钟。

马铃薯块茎收集培养基的制备：

每升1/2 MS₂₀R₃：50ml 10^*MS盐

5ml 100^*MS维生素

30g葡萄糖

8g Daichin琼脂

用KOH调pH5.8，110℃灭菌20分钟。

含有适宜激素和抗生素的基础培养基：1. MS₃₀R₃＋3.5mg/L玉米素核糖苷，每500ml加500μl储液(3.5mg/ml)；

+0.03mg/L I.A.A.，每500ml加15μl储液(1.0mg/ml)。2. MS₃₀R₃＋3.5mg/L玉米素核糖苷0.03mg/L I.A.A

200mg/L cefotaxime，每500ml加500μl储液(200mg/ml)

100mg/L万古霉素，每500ml加500μl储液(100mg/ml)。3. MS₃₀R₃＋3.5mg/L玉米素核糖苷

0.03mg/L I.A.A

200mg/L cefotaximl

100mg/L万古霉素

100mg/L卡那霉素，每500ml加500μl储液(100mg/ml)。

含有适宜激素和抗生素的块茎收集培养基：4. 1/2MS₃₀R₃＋100mg/L cefotaxime

50mg/L万古霉素

100mg/L卡那霉素d，基因表达的分析：

对Cluster-A，可用一种抗Custer-A的抗血清在Western印迹试验中分析转基因植物的Cluster-A蛋白。如果要对mRNA水平作Northern印迹分析，就要用Cluster-A的适宜cDNA片段作探针。用提高了Cluster-A蛋白产量的植物进行提高抗真菌性的分析。同时表现出提高Cluster-A和β-1，3-葡聚糖酶水平的植物可望具有更高的抗真菌感染的能力。实验：聚合酶链反应：在50μl含有1ng Cluster-A DNA.0.2μM T7引物、0.2μM P 1引物和2单位的栖热水生菌DNA聚合酶(perkin-Elmer cetus，Gouda，荷兰)的反应混合液中，连续在94℃0.5分钟，50℃2分钟，72℃1.5分钟孵育35个循环进行DNA扩增。在琼脂糖凝胶中进行部分反应产物(4％)的电泳，以证实合成了一条正确大小的DNA片段。其余PCR DNA扩增产物用酒精沉淀并洗去过量的盐份。cDNA基因文库的合成和分析：

从TMV感染的烟草中分离Poly(A)⁺-RNA；合成cDNA并构建cDNA文库，在λ-载体Uni-2AP XR上进行单向克隆，均根据厂家说明(Stratagene，La Joua Ca.)来进行。用³²p标记的插入cDNA克隆pROB40作为探针筛选重组噬菌体(Hooft VanHnijsduijnen.R.A.M.等，1986 EMBO.J.5，22057-2061)。通过和辅助噬菌体R408(Stratagene)共感染从分离的λ-噬菌体中挽救出含有cDNA的pBluesclipt质粒后，把Cluster-A的cDND插入片段再克隆到M13衍生物中并用M13引物和一个基于M13引生物所得到的cDNA序列的引物进行测序。或者，用T3或T7引物(Promega，Madison WI；chen和Seeburg.1985，DNA4，165～170)由变性质粒DNA直接对cDNA进行测序。蛋白质纯化：

从被烟草花叶病毒感染7天后的烟草叶中提取蛋白质。并通过一个用40μM NaOAc pH5.2平衡过的G-25柱脱盐(Woloshuk C.P.等，1991，The Plant Cell3.619-628)。脱盐的蛋白溶液在冰浴中停留过夜，然后20.000g离心50分钟。得到的上清液上样于一个用40mM NaOAc.pH5.2平衡过的S-Sepphrose(快流速.Pharmacia)柱(5×5cm)。用0-0.3M NaCl在上述缓冲液中的线性盐梯度洗脱吸附的蛋白。每隔2个流份进行免疫印迹分析，将含有Cluster-A的流份合并，并对50mM Tris.Hcl pH8.0透析。把这种溶液通过一个用0.1MZnCl₂：(pH＝5.4)微酸性溶液(50ml)活化的螯合Sepharose柱(HR10/2；Pharmacia)。使用前，此柱先用水(500ml)彻底洗过，然后再用上述Tris-缓冲液平衡。含有Cluster-A的混合液分几次上样每次含有3到4mg蛋白。把阻滞的蛋白峰混合，再进行螯合Sepharose层析。虽然用Cu²⁺

—离子活化螯合Sepharose柱后观察到较紧密的结合，但在这样的条件下纯化效果较差(资料未表示出)。最后一步纯化是通过一个用含有200mM NaCl的50mM K₂HPO₄ pH7.0缓冲液平衡过的Se perdex-75柱(HR10/30，Pharmacia)进行凝胶过滤。以每分钟0.5ml的流速进行凝胶过滤，每0.5ml收集一份。用SDS-PAA凝胶电泳和免疫印迹试验来分析这些流份。SDS-凝胶电泳，免疫印迹试验和序列测定：

按Laemmli介绍的方法(Laemmlil u.k.1970，Naterle227.680-685)，用12.5％SDS-PAA凝胶分离蛋白样品。根据Amersham(uk)提供的ECL Western印迹方法进行免疫印迹试验和测定。用烟草(PR-P2)同质的PR-4a、b的抗血清由MatthieuJoosten(Wageningen荷兰)惠赠。为进行免疫检测，把针对推定的cluster-A蛋白的抗血清稀释1∶2000倍。

为了测序、按Moos介绍的方法(Moos M等，1988 J.Biol.Chem.263，6005-6008)分离这种蛋白并按Matsudaira等介绍的方法把它电转印到PVDF膜上(Matsudaira等，1987.S.Biol.Chem.262，10035-10038)。通过考马斯亮兰R-250染色来观察蛋白带(Matsudaira等，1987，同上)。因为这种推定的Cluster-A蛋白是N-末端被封闭的，所以用Landon介绍的方法在PVDF膜上对它进行酸性水解(Landon M，1977.Methods of Enz.147.145-149)。在应用生物系统(AppliedBiosystems)477A蛋白测序仪上，以Edman降解法通过Eurosequence(Groningen，荷兰)对水解产物(由两个肽组成的)进行测序。酶活性试验：

按Molano等介绍的方法进行常规几丁质酶活性检测(1977，同上)。也用过象Wirfh和Wolf(Wirfh S.J和WoffG.A.1990.J.Microbiol Meth，12，197-205)介绍的兰色底物试验和Roberts及Selitcenni koff(Roberts W.K和Selitcenni koff c.p.1988.J.Gen.Miccobiol.134，169-176)所介绍的对硝基苯释放试验和Mccreath及Gooday(MeCreath K.J.Gooday G.W.1991.J.Miccobiol，Meth，14，229-237)所介绍的4-甲基伞形酮释放试验。按Selsteal和Marfinez(1980.Anal.Biochem.109，67-70)介绍的方法，在50mM KH₂PO₄缓冲液pH6.0中测定溶菌酶活性。几丁质酶活性测定：

离心10ml培养物收集诱导表达cA-3蛋白的细菌和对照菌，并把沉淀悬浮在1ml TBS(20mM Tris-HCl.pH7.5，150mMNaCl)缓冲液中。超声破碎后，悬液于-20℃保存。几丁质酶活性检测前加入1％Triton x-100。按如下方法获得TMV感染或健康的烟草叶子总蛋白提取物：在5ml TBS中匀浆简单离心匀浆物去掉不溶物，于-20℃保存。用水(nanopure)真空渗透叶子来获得细胞外蛋白，把渗透的叶子放进一个注射器里，用台式离心机3000rpm离心5分钟。含有细胞外蛋白的无色洗涤物于-20℃保存。在含有50μl彻底洗过的3H-标记几丁质悬液、50μl细菌或植物提取液及100μl 50mM磷酸钾pH6.4的200ml反应混合液中测定几丁质水解活性，30℃保温30分钟后加入0.5ml10％的三氯乙酸，离心混合液去掉沉淀物，取出0.5ml上清液，用玻璃毛过滤。在液闪计数仪中测定流入的放射活性。RNA和DNA印迹分析：

在提取缓冲液(1M Tris-HCl、0.1M LiCl、10mM EDTA1％SDS，pH9.0)中通过匀浆冰冻叶—组织，从受刺激或未受刺激的烟草叶—组织中提取总RNA。用酚—氯仿萃取匀浆物，用2MLiCl沉淀RNA。乙醛酸化(glyoxylateien)后，在1.5％琼脂糖凝胶中电泳RNA，并印迹到尼龙膜上(Genesvceen.NewenglandNaclear or Hybond-N，Amersham)。按已介绍的方法(Cornelissen等，1987，Nvcl，Acids Res，15 6799-6811)，分离烟草基因组DNA，进行酶解、电泳以及印迹试验。在5xSSc、2％SDS.50％甲酰胺、100μg/ml鲱鱼精DNA中，42℃下与^{32}P-标记的Cluster-A cDNA插入片段进行烟草核酸杂交(1xSDS，在50℃下进行)，并进行放射自显影。农杆菌菌株MOG101的获得：

从章鱼氨酸Ti-质粒pTiB6衍生构建了一种带给根瘤农杆菌毒性功能的辅助质粒，MOG101。MOG101是带有非致癌基因Ti-质粒的根瘤农杆菌菌株，这种非致癌Ti-质粒中整个Ti-区被来自转座子Tn1831的细菌壮观霉素标记基因所取代，(Hooykaas等，1980.plasmiol 4.64-75)。

Ti-质粒pTiB6含有两个邻近的T-区：TL(T-左侧区)和TR(T-右侧区)。为了得到缺乏TL-和TR区的衍生质粒，我们构建了中介载体pMOG579。质粒pMOG621是一个pBR322的衍生体，它含有两个定位在T-区外面左右侧的Ti-质粒片段(图2)。在质粒pMOG579中，这两个片段内一个带有壮观霉素抗性标记基因的转座子Tn1831中的2.5kbBamHI-HindIII片段分隔开(以黑色表示)(图2)。这一质粒被引入根瘤农杆菌株LBA1010中(C58-C9(pTiB6)＝一个清除的C58菌株)，其中用HB1018(pRKZO13作辅助质粒已通过E.Coli三亲交配引入了pTiB6质粒(Koekman等(1982)，Plasmiol(7.119-132)。筛选出抗利福平(20mg/L)和壮观霉素(250mg/L)的转移结合子。pMOG579和pTiB6之间的双重重组导致失去羧苄青霉素抗性(pBR322标记物)并缺失整个T-区。从铺到羧苄青霉素(100mg/L)板上的5000个壮观霉素抗性的转移结合子复制物，发现有2个是敏感的。Southern分析表明：双重杂交偶然地缺失了整个T-区(未表示出来)。产生的菌株称作MOG101。这种菌株和它的构建同GV2260菌株是类似的(Deblaere等1985，Nacl.Acid，Res.13，4777-4788)。MOG101在Hood E.Gelviu.SB.Melchers L.S和Hoe-Kema A.1993.Transgene Research2.208-218中有更详细的介绍，并经请求可从MOGE International N.N.自由得到。

序列表(1).一般信息：(i)申请人：

(A)名称：MDGEN International N.V.

(B)街道：Einsteinweg97

(C)城市：LEIDEN

(D)州：Zuid-Holland

(E)国家：荷兰

(F)邮政编码(ZIP)：NL-2333CB

(G)电话：31.71.258282

(H)传真：31.71.221471

(A)名称：Rijksuniversiteit te Leiden

(B)街道：stationsueg46

(C)城市：LEIDEN

(D)州：Zuid-Holland

(E)国家：荷兰

(F)邮政编码(ZIP)：NL-2312AV(ii)发明的题目：植物几丁质酶，编码它的DNA和含有它们的植物(iii)序列数：14(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：patentin Recease#1.0，Version#1.25

(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1253个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：同mRNA互补的DNA(iii)假拟：非(vi)原始来源：

(A)生物体：烟草N.tabacum

(B)品系：Samsun NN.

(D)发育阶段：TMV-诱导的(vii)直接来源：

(B)克隆：Cluster-A(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：14…1126

(D)其他信息：/部分(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：CGAGTTTTTT TTT TTT TCT ATT ATT TTC TCA TGT TTC CTT CTC CGG CAA 49

Phe Ser Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gln

1 5 10CTA GTT TGC ACA AAT AGC CAA AAT GTT ATT AAG GGA GGG TAC TGG TTT 97Leu Val Cys Thr Asn Ser Gln Asn Val Ile Lys Gly Gly Tyr Trp Phe

15 20 25AAG AAC AGT GGA TTA GCA TTA AAC AAC ATA GAC TCA ACA CTT TTC ACT 145Lys Asn Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr

30 35 40CAT CTA TTT TGT GCA TTT GCT GAT CTT AAT CCA CAA TCA AAT CAG TTA 193His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Ser Asn Gln Leu45 50 55 60ATC ATT TCG CCA GAA AAT CAA GAT TCA TTC AGC CAA TTT ACA AGT ACA 241Ile Ile Ser Pro Glu Asn Gln Asp Ser Phe Ser Gln Phe Thr Ser Thr

65 70 75GTT CAA AGG AAA AAT CCT TCA GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA 289Val Gln Arg Lys Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly

80 85 90GGA AGA GCT GAT ACA ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT 337Gly Arg Ala Asp Thr Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn

95 100 105TCA AGA AAA AGT TTT ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA TTT 385Ser Arg Lys Ser Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Phe

110 115 120GGA TTT CAT GGC CTT GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT ACA 433Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr125 130 135 140GAT ATG ACA AAC TTA GGG ATC CTT TTG AAT GAG TGG CGC ACC GCT ATC 481Asp Met Thr Asn Leu Gly Ile Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile

145 150 155AAC ATG GAG GCG AGA AAT TCC GGC AGG GCG GCA CTG CTT CTC ACG GCG 529Asn Met Glu Ala Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala

160 165 170GCG GTT TCC TAC TCA CCC CGA GTC AAT GGA TTG AAC TAC CCA GTT GAA 577Ala Val Ser Tyr Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu

175 180 185TCG GTG GCA AGA AAC TTA AAC TGG ATT AAC CTT ATG GCA TAT GAC TTC 625Ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe

190 195 200TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA 673Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu205 210 215 220TTT GAT CCT GTG AAC CAT ATT AGT GGA AGC GAT GGA ATT AAT GCA TGG 721Phe Asp Pro Val Asn His Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp

225 230 235ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA AAA AAA TTG GTA CTT GGA ATT CCA TTT 769Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe

240 245 250TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTG GTT AAC CCG AAT ATC CAC GAT CTT AGA 817Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu Val Asn Pro Asn Ile His Asp Leu Arg

255 260 265GCA CCT GCC GCC GGA AAA TCA AAT GTA GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG 865Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser

270 275 280ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGA GAT TAT ATA GTG CAG AGT CGC GCC ACA 913Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Gln Ser Arg Ala Thr285 290 295 300ACT GTG TAT AAT GCT ACT ATT GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGA AGT 961Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser

305 310 315AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT ACT CAA AGT GTT AGA AAT AAG GTT AAT 1009Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp Thr Gln Ser Val Arg ASn Lys Val Asn

320 325 330TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG CTA GGT TAC TTT GCA TGG CAC GTT GCA 1057Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala

335 340 345GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT TCT CGT ACA GCT TCA CAA ACA TGG GGA 1105Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr Trp Gly

350 355 360GTG TCA TCT CAA GAG ATG AAG TGATGGATTA CGTAATTGTG TGTGTCAAGT 1156Val Ser Ser Gln Glu Met Lys365 370ATACTACTTA TAATAAGGCA ACAGATATGT GAACTATGAC ATAAATAAAT AAACAATAAA 1216TTGTGGTCTC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1253(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：371氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：Phe Ser Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gln Leu Val Cys Thr1 5 10 15Asn Ser Gln Asn Val Ile Lys Gly Gly Tyr Trp Phe Lys Asn Ser Gly

20 25 30Leu Ala Leu Aan Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys

35 40 45Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Ser Asn Gln Leu Ile Ile Ser Pro

50 55 60Glu Asn Gln Asp Ser Phe Ser Gln Phe Thr Ser Thr Val Gln Arg Lys65 70 75 80Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly Gly Arg Ala Asp

85 90 95Thr Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn Ser Arg Lys Ser

100 105 110Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Phe Gly Phe His Gly

115 120 125Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Asp Met Thr Asn

130 135 140Leu Gly Ile Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile Asn Met Glu Ala145 150 155 160Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Tyr

165 170 175Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val Ala Arg

180 185 190Asn Leu Asn Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn

195 200 205Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val

210 215 220Asn His Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly225 230 235 240Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala

245 250 255Trp Arg Leu Val Asn Pro Asn Ile His Asp Leu Arg Ala Pro Ala Ala

260 265 270Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn

275 280 285Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Gln Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn

290 295 300Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp Ile Ser305 310 315 320Tyr Asp Asp Thr Gln Ser Val Arg Asn Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly

325 330 335Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gln Asn

340 345 350Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr Trp Gly Val Ser Ser Gln

355 360 365Glu Met Lys

370(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(ix)特征：

(A)名称/关键词：misc-特征

(B)位置：1…29

(D)其他信息：/功能＝“pcn引物”(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：

GTTTCCTTCT CCATGGAACT AGTTTGCAC(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：非(vi)原始来源：

(A)生物体：烟草N.tabacum

(B)品系：Samsun NN.

(D)发育阶段：TMV-诱导的

(F)组织类型：叶(ix)特征：

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：15

(D)其他信息：/标记＝x

/注释＝“残基是Val或Ile”(ix)特征：

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：10

(D)其他信息：/标记＝x

/注释＝“可能为Gly”(ix)特征：

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：14

(D)其他信息：/标记＝x

/注释＝“未知残基”(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：Pro Val Asn His Xaa ser Gly ser Asp Xaa Ile Asn Ala Xaa Ile Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(A)生物体：烟草N.tabacum

(D)发育阶段：TMV-诱导的

(F)组织类型：叶(xi)SEQ ID NO：5的序列描述Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp1 5 10 15(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：26个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(A)生物体：烟草N.tabacum

(D)发育阶段：TMV-诱导的

(F)组织类型：叶(ix)特征：

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：12

(D)其他信息：/标记＝x

/注释＝“Val和lle都存在”(xi)SEQ ID NO：6的序列描述Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Xaa Ser Gly Ser Asp1 5 10 15Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val

20 25(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：3155个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假拟：非(vi)原始来源：

(A)生物体：烟草N.tabacum

(B)品系：Samsun NN(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：454…907(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：1859…2497(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：2847…2884(ix)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)位置：908…1858(ix)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)位置：2498…2846(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：join(454…907，1859…2497，2847…2884)(xi)SEQ ID NO：7的序列描述GAGCTCTGTT AATAATTTTG ACGTAACTAG TCATCAGGTC GCAGTTCAAG TCATCAGGTA 60GCAGTTCAAG TCATGAAAAT AGTCTCTTGC AGGTAAGGTT GCGTACAACA GATCCTTGTG 120GTCCGGCCCT TTCCGAACTT CGCTTGTAGC TGGAGCTTAG TCACCGGAAT ACCCGTTGTT 180CCGTTAATAA CAAGAACACA TACAAGACGA TTTGCTAACA AAAATATATA TATAAACCAA 240AAGTGTAACG ATGATAAAAT TGCACAATTC TGAAGGATAT ACAGGAAAAT TTTGACCTTT 300TCTCTATTTA GAAATATTGA GAGATTCAAC CACTTTCTAA TGGAGTAGTA AATGTATCGC 360AAACTAAAAG CCGCCGGTAG ACAGTAAACT CAAATCTTCA AACTTATTTA AACTCGAAGT 420CACAAATTAA ATAAGCTATC AACCTTCAAT TTA ATG GCT AAT TCT GTC ACT CTT 474

Met Ala Asn Ser Val Thr Leu

1 5TTC GCC ATT ATT TTC TCA TGT TTC CTC CTC CAG CAA CTA GTT TGC ACA 522Phe Ala Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Gln Gln Leu Val Cys Thr

10 15 20AAT AGC CAA AAT GTT AAG GGA GGA TAC TGG TTT AAG GAC AGT GGA TTA 570Asn Ser Gln Asn Val Lys Gly Gly Tyr Trp Phe Lys Asp Ser Gly Leu

25 30 35GCA TTA AAC AAC ATA GAT TCA ACA CTT TTC ACT CAT CTA TTT TGT GCA 618Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys Ala40 45 50 55TTT GCC GAT CTT AAT CCT CAA TTA AAT CAG TTA ATT ATT TCG CCG GAA 666Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Leu Asn Gln Leu Ile Ile Ser Pro Glu

60 65 70AAT CAA GAT TCA TTC AGG CAA TTT ACA AGT ACA GTT CAA AGG AAA AAT 714Asn Gln Asp Ser Phe Arg Gln Phe Thr Ser Thr Val Gln Arg Lys Asn

75 80 85CCT TCG GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA GGA AGA GCT AAT TCA 762Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly Gly Arg Ala Asn Ser

90 95 100ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT TCA AGA AAA AGT TTT 810Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn Ser Arg Lys Ser Phe

105 110 115ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA TTA GGA TTT CAT GGC CTT 858Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Leu Gly Phe His Gly Leu120 125 130 135GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT GCA GAC ATG ACA AAC TTA G 907Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Ala Asp Met Thr Asn Leu

140 145 150GTATTATTGA CAAACATATA TTTTCTTCAT TTGTTTTACA CATATGGATG GCCCTTACAT 967GAATTTATTT TTGGACAAAT ATAGCTAGTT GTGAATTTAG GAGAGGCAAT CGGGCGGGTC 1027GTGTCGGATA TGGGATGGAT TGAAAATGGA TAATGAAAAA ATGGATAAAG TATCCGACCC 1087GATTCATATT TAATACGGAT AATAAACCGG TCCATGACTT CTTGAATATG ATCCCTTTTG 1147GGAGAATTTC TATTTTCCCA AACTTACCCC CAATTTGAAG CTTTATAAAT GCAAAAGTTA 1207AACTCATTAG TTATCCATTG ATTATCCATT TTCCAAATGG ATAATATGAT TCTTATTTAT 1267ATTTGACCCG TTTTTAAAAA GTTCATTATC CAACCCATTT TTAGTGGATA ATATGGGTGG 1327TTAATTCTTT TCTTTTAACC ATTTTGCCAT CACTAGTTGT GATATTTGAA CTCTCATCTG 1387TCTGTTCAGA TATTATATTG AATTATGTGA CAACAGTATT TGAAATTAGA AATTATTATA 1447CACATAATAT ATTTTTATTT ACTTAATTAT CATATCTCTG ACTGCAATAC TAGGTTCTTG 1507ATACTAGACA CATTATATGT AACTTTTGCA AATTATGGGT CTATGATATT TTCGAAAATA 1567ATAACAATTT TTTCACTCTC CTCACAGTTA TATATAATCT CGAAAGGGGA AAGATCCCTC 1627AGAGAATCAC TCGATTATAT TGACAAGTTC AAAAAACTGA TCATAATATG ATGGCGATTG 1687CAAGCAGGCC CCCATCATCT CATAACAACT GATAGGTTTC GTTAAACCTG CTCATTATAT 1747CCATATGTCT ACTATGATAC CATACAATAT GAATTGTGTA ATCACTCCAT CTAGCTAACA 1807ATTTAAACTG TTGAAGAGTA CACTTTTATT TACTTACCTG TTAATTAAAC A GG ACC 1863

Gly ThrCTT TTG AAT GAG TGG CGC ACC GCT ATC AAC ACG GAG GCG AGA AAT TCC 1911Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile Asn Thr Glu Ala Arg Asn Ser

155 160 165GGT AGG GCG GCA CTA CTT CTC ACG GCG GCG GTT TCC AAC TCA CCC CGA 1959Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Asn Ser Pro Arg170 175 180 185GTC AAT GGG TTG AAC TAC CCA GTT GAA TCA TTG GCA AGA AAC TTA GAC 2007Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Asp

190 195 200TGG ATT AAC CTT ATG GCC TAT GAT TTC TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA 2055Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro

205 210 215TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA TTT GAT CCT GTG AAC CAT GTT 2103Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Val

220 225 230AGT GGA AGT GAT GGA ATT AAT GCA TGG ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA 2151Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr

235 240 245AAA AAA TTG GTG CTT GGA ATT CCA TTT TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTA 2199Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu250 255 260 265GTT AAC GCG AAT ATT CAC GGT CTT AGA GCA CCT GCT GCC GGA AAA TCA 2247Val Asn Ala Asn Ile His Gly Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser

270 275 280AAT GTT GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGG 2295Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg

285 290 295GAT TAT ATA GTG GAG AGT CGC GCC ACG ACT GTG TAT AAC GCT ACC ATT 2343Asp Tyr Ile Val Glu Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile

300 305 310GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGT AGT AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT 2391Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp

315 320 325ACT CAA ACT GTT AGA AAT AAG GTT AAT TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG 2439Thr Gln Thr Val Arg Asn Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu330 335 340 345CTT GGT TAT TTT GCA TGG CAC GTT GCA GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT 2487Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu

350 355 360TCT CGT ACA G GTTAGACGTA GTTTTTCTTT GTTTTTTTTT TTAATTCTGG 2537Ser Arg ThrTATTTATATT TTTGTATGGA TAACACGTAA TTTTGTCGAA TACATAATTG TCAAAATACA 2597TCATTTTTAT TGGTGCATGT TTTCTCATGA ATTCTTAGGA AAGCATGACT ATGCTATTTG 2657GTCGATAGTC TTGTGAAATT TTATACATAA TCAATGCTTT TAAGGTCGGA ATTATTAGAC 2717AATTGTCTTT CTCAATTAAT TATTATTATT ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT 2777ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT ATTATTATTA TTTACATTTC CCCCACTTGT 2837GTCTTGCAG CT TCA CAA ACA TGG GGA GTG TCA TTT CAA GAG ATG AAG 2884

Ala Ser Gln Thr Trp Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Lys

365 370 375TGATGGATTA CGTAATTGTG TTTGTCAAGT ATCCTACTTA TAATAAGGTG ACAGATATGT 2944GAACTATGAC ATAAATAAAA TAAATATAAA TCGGGTTCCC CAATTTTATT TTTCTACGAA 3004TAATATATTT CTTCCCCCTT TGGAGTACAT TAGGTTTATT ATTGTTATTA TTGTTGTTGT 3064TGTTGTTTGT ACTAATAATA TATTTCTTCG TTCCAAAATA GTTGATGCTT TTTGTTTTTC 3124GATATTATTT TCTCGTTTTC AATTAATTAA A 3155(2)SEQID NO：8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：377个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：8的序列描述：Met Ala Asn Ser Val Thr Leu Phe Ala Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu

1 5 10 15Leu Gln Gln Leu Val Cys Thr Asn Ser Gln Asn Val Lys Gly Gly Tyr

20 25 30Trp Phe Lys Asp Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu

35 40 45Phe Thr His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Leu Asn

50 55 60Gln Leu Ile Ile Ser Pro Glu Asn Gln Asp Ser Phe Arg Gln Phe Thr65 70 75 80Ser Thr Val Gln Arg Lys Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile

85 90 95Ala Gly Gly Arg Ala Asn Ser Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln

100 105 110Pro Asn Ser Arg Lys Ser Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg

115 120 125Gln Leu Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser

130 135 140Ala Ala Asp Met Thr Asn Leu Gly Thr Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr145 150 155 160Ala Ile Asn Thr Glu Ala Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu

165 170 175Thr Ala Ala Val Ser Asn Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro

180 185 190Val Glu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Asp Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr

195 200 205Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala

210 215 220Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Val Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn225 230 235 240Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile

245 250 255Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu Val Asn Ala Asn Ile His Gly

260 265 270Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser ASn Val Gly Ala Val Asp Asp

275 280 285Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Glu Ser Arg

290 295 300Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser305 310 315 320Gly Ser Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp Thr Gln Thr Val Arg Asn Lys

325 330 335Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His

340 345 350Val Ala Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr

355 360 365Trp Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Lys

370 375(2)SEQID NO：9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(xi)SEQ ID NO：9的序列描述：

AAT ACGACTC ACT AT AG(2)SEQID NO：10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(xi)SEQ ID NO：10的序列描述：

TCTCCGGCAA CTAGTTTGCAC(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(xi)SEQ ID NO：11的序列描述：GTCATAGTTC ACATATCTGT TGCC(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(xi)SEQ ID NO：12的序列描述：TTTAAACTCG AAGTCACAAA TTAAA(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是

(xi)SEQ ID NO：13的序列描述：TTTAAACTCG GATCCACAAA TTAAA(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：是(xi)SEQ ID NO：14的序列描述：AATTGTCTAG AC

Claims

1.一种与其他植物蛋白分离的植物蛋白，所述植物蛋白具有内切几丁质酶活性、抗真菌活性，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量大约为40～43KDa。

2.权利要求1的与其他植物蛋白分离的植物蛋白，它可从TMV感染诱导的烟草植物叶子中得到。

3.权利要求1的分离蛋白，其含有SEQIDNO：1或7所示的氨基酸序列或其具有几丁质酶活性的片段。

4.权利要求1到3任一项中的蛋白，其中有一个或多个氨基酸被取代、缺失或加入而不消除几丁质酶活性。

5.一种含有权利要求1到4任一项的蛋白作为活性成分的抗真菌组合物。

6.权利要求5的抗真菌组合物，它还含有β-1，3-葡聚糖酶和/或几丁质酶。

7.权利要求5的抗真菌组合物，它除含有所述蛋白外还含有与所述蛋白对真菌有协同作用的蛋白。

8.一种分离的DNA序列，它含有编码权利要求1蛋白的开放读码框架。

9.一种含有编码SEQIDNO：1或7中氨基酸序列的开放读码框架的分离DNA序列，和在严格条件下与其杂交的DNA序列。

10.一种植物可表达的重组DNA序列，它含有编码权利要求1的蛋白或所述蛋白之前体的DNA序列，所述DNA序列被有效地连接到在植物中以上述蛋白形式表达上述DNA序列所必须的调控元件上。

11.权利要求10的植物可表达的重组DNA序列，其中所述DNA序列编码一种具有SEQIDNO：1或7所示的氨基酸序列的蛋白前体。

12.权利要求10的植物可表达的重组DNA序列，它含有SEQIDNO：1或7中所示的DNA序列。

13.一种含有权利要求10的DNA序列的克隆载体。

14.一种含有权利要求13的克隆载体的细菌菌株。

15.一种含有权利要求13的载体的农杆菌菌株。

16.一种植物基因组，其中已插入了权利要求10的植物可表达重组DNA序列。

17.一种有权利要求16的重组植物基因组的植物细胞或这种细胞的原生质体。

18.一种植物或它的部分材料，如鳞基、花、果、叶、花粉、根或根培养物、种子、茎、块茎或微块茎等，其含有一个或多个权利要求20的细胞。

19.一种植物或它的部分材料，如鳞茎、花、果、叶、花粉、根或根的培养物、种子、主茎、块茎或微块茎等，其中基本上所有细胞都含一种权利要求16的重组植物DNA基因组。

20.权利要求19的植物或其部分材料，这种植物或其部分材料对真菌感染的易感性较低。

21.一种对真菌易感性降低了的植物变种的育种方法，其特征在于至少一个亲代品系含有权利要求16的重组DNA基因组。

22.一种抑制真菌生长和/或发芽的方法，其中将真菌或使真菌与有效量的权利要求1的几丁质酶接触。