CN1228123A - 对植物病原真菌有抑制活性的肽 - Google Patents

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Abstract

发现乳铁蛋白发现对植物病原体有抗真菌活性。制备了包含一个牛乳铁蛋白合成基因的基因构件，并用于产生转基因抗病植物。还描述了一种可以转化植物，使乳铁蛋白在植物体内得以表达从而使植物具有抗病性的方法。

Description

对植物病原真菌有抑制活性的肽
本发明涉及一种利用肽来防治植物病原体的方法，这种肽是由经过遗传改变的植物产生的，还涉及在该方法中有用的基因和植物。本发明尤其涉及乳铁蛋白(lactoferricin)和它在防治植物病原体中的作用。
大量的真菌和细菌都对重要经济作物有严重的危害。许多防治植物病害的方法得到应用并取得了不同程度的成功。一种方法就是向农作物上使用抗微生物的化学药剂。这种方法产生了许多本领域周知的问题。另外，近来使用的一种方法是利用生物防活生物(“biocontrol”)作为有害生物的天然竞争物或抑制物。但是，很难在大范围内应用生物防治，而且更难的是使那些活微生物在处理区保持较长时间的活力。最近，重组DNA技术提供了向植物细胞内插入能表达抗微生物化合物的克隆基因的机会。然而，这项技术也引起了人们的关注：即最终对众所周知、天然产生的抗菌物质产生微生物抗性。因此，需要继续鉴定由植物细胞通过某一基因的翻译而天然形成的抗微生物化合物。
特别令人感兴趣的是鉴定新肽和编码该肽的DNA序列，因为在本领域内已知肽具有抗病原体活性和抗微生物活性。例如，从动物、植物、昆虫和微生物资源中得到了许多所谓的裂解肽，包括哺乳动物保护素(defensin),cecropin,thionin，二甲双胍(mullitin)，昆虫保护素(defensin)等等。
具有抗病原体活性的另一类肽以水解酶为代表，如已知可抑制真菌生长的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶(Schlumbaum等，1986；Mauch等，1988)
已知牛奶蛋白乳铁素(lactoferrin)的酶水解产物同样具有抗微生物特性。乳铁素是一种结合铁的糖蛋白，存在于大多数哺乳动物的生物体液中，包括：奶、泪和粘液分泌物(Brock,J.,Arch.Dis.Child.55:417(1980)；Bullen,J.Rev.Infect.Dis.3:1127(1981))。认为乳铁素在体外可促进细胞生长，调节血细胞生成，防止微生物感染和免疫调节特性。但是，对于乳铁素在体内的功能却知之甚少。据报道胞外的乳铁素具有抗细菌和抗病毒活性。用牛的乳铁素进行研究发现，用猪胃蛋白酶消化而产生的一个酶水解物的抗微生物活性要比全蛋白对大肠杆菌溶菌产物的活性强。(Tomita，等，牛奶科学杂志(J.Dairy Sci.)74:4137-4142(1991))。
乳铁素在人体内也显示出抗真菌活性。Bellamy等，医学微生物免疫(Med.Microbiol.Immunolog.)182:97-105(1993)检验了白假丝酵母(Candida albicans)对乳铁素的抑制作用和失活作用的敏感性。其作用是致死的，可以导致菌落形成能力的迅速消失，暗示着乳铁素的活性肽对于寄主抵抗白假丝酵母有潜在作用。
最近将人的乳铁素cDNA在烟草悬浮细胞中表达，以测试乳铁素在植物中的抗菌活性。转基因愈伤组织产生一个48KD的单肽，明显小于全长的乳铁素蛋白。当用四种植物病原细菌测试菌落形成单位的减少以确定抗细菌活性时，从转基因烟草愈伤组织中得到的整个蛋白提取物较商业上得到的纯化的乳铁素具有更强的抗细菌活性。在转基因愈伤组织中从未测出全长的乳铁素，也指出乳铁素基因产物要经过翻译后加工。因为人的乳铁素基因在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中表达并产生大量的全长乳铁素，可以从理论上推断出由植物产生的全长乳铁素未经过适当的折叠，而未折叠的部分被降解掉了。在愈伤组织中表现抗菌活性的被截短的蛋白被鉴定为蛋白的氨基端或羧基端。
本发明提供了一种乳铁素的酶水解产物，该产物可在植物体内安全表达并产生抗病性。制备了包含一个乳铁蛋白合成基因的基因构件，并用于提供转基因抗病植物。还描述了一种可以转化植物，使乳铁蛋白在植物体内得以表达从而使植物具有抗病性的方法。
图1：质粒pCIB7703，含有处于遍在蛋白质启动子(位点15-1995)和nos终止子(位点2079-2339)调控下的乳铁蛋白B基因(位点1995-2079)，图2：质粒pCIB7704，与pCIB7703相似，具有ubi-SynPat-nos
选择盒(位点15-2845)。图3：质粒pCIB7705，含有一个存在于具NptⅡ质粒中的ubi-SynPat-nos-ubi-乳铁蛋白B-nos片段。图4：质粒pCIB7706，含有一个存在于具NptⅡ质粒中的ubi-乳铁蛋白B-nos片段。
本发明利用的乳铁蛋白，是具有抗病原体活性的乳铁素的酶水解产物，它对应于乳铁素的N-端区。乳铁素是产生于哺乳动物乳汁中的蛋白，尽管由于种类不同它们的精确氨基酸序列有某些差异，但在结构上和功能上具有同源性。用于本发明的优选乳铁蛋白包括乳铁蛋白B(牛乳铁蛋白)或乳铁蛋白H(人的乳铁蛋白)。现在发现乳铁蛋白可抑制许多农业上重要的病原体菌的生长，并能在植物体内表达，从而赋予植物抗病性。乳铁蛋白B(或牛乳铁蛋白)是一个25个氨基酸长的肽：Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe(SEQ ID NO:1)与全牛乳铁素序列的N-端有精确的同源性
乳铁蛋白H(或人乳铁蛋白)对应于人乳铁素的1-33个氨基酸，因此是一个33个氨基酸的肽，其序列如下：G R R R R S V Q W C A V S Q P E A T K C F Q W Q R N M R K V R G P(SEQ ID NO:2)当表达时，这些肽可能含有一个对应于起始密码子的N-端甲硫氨酸。
以蛋白质序列为基础，设计了一个乳铁蛋白基因用于植物体内表达。通过使用在玉米表达基因中最常使用的每个氨基酸的密码子，优化了在单子叶植物中表达时该合成基因密码子的使用。在Murray,Lotzer和Eberle，核酸研究(Nucl.Acids Res.)17,477-498,1989中描述了玉米密码子使用表。另一种方法，合成基因的密码子也可以通过不同的策略，如EP-A-359 472中描述的方法得到优化。
设计的乳铁蛋白B基因的植物优化序列包括以下编码序列：
5′-TTC-AAG-TGC-CGC-CGC-TGG-CAG-TGG-CGC-ATG-AAG-AAG-CTG-GGC-GCC-CCC-
    AGC-ATC-ACC-TGC-GTG-CGC-AGG-GCC-TTC-3′(SEQ ID NO:3)当在3′端加上终止密码子(TAA)时，序列如下：
5′-TTC-AAG-TGC-CGC-CGC-TGG-CAG-TGG-CGC-ATG-AAG-AAG-CTG-GGC-GCC-CCC-
    AGC-ATC-ACC-TGC-GTG-CGC-AGG-GCC-TTC-TAA-3′(SEQ ID NO:4)
乳铁蛋白H基因的植物优化序列如下：5′-GGC-CGC-CGC-CGC-CGC-AGC-GTG-CAG-TGG-TGC-GCC-GTG-AGC-CAG-CCC-GAG-
GCC-ACC-AAG-TGC-TTC-CAG-TGG-CAG-CGC-AAC-ATG-CGC-AAG-GTG-CGC-GGC-
CCC-3′(SEQ ID NO:5)
优选地，加入了一个甲硫氨酸起始密码子和一个终止密码子(TAG)。另外，来自Kozak共有序列中的ACC序列的加入，增加有效翻译的可能性。产生的甲硫氨酸-乳铁蛋白H基因序列如下，带下划线的是起始密码子和终止密码子：5′-ACC-ATG-GGC-CGC-CGC-CGC-CGC-AGC-GTG-CAG-TGG-TGC-GCC-GTG-AGC-CAG-
CCC-GAG-GCC-ACC-AAG-TGC-TTC-CAG-TGG-CAG-CGC-AAC-ATG-CGC-AAG-GTG-
CGC-GGC-CCC-TAG-3′(SEQ ID NO:6)
编码乳铁蛋白的结构编码序列在一种能够在植物细胞中起作用的启动子的调控下在植物细胞内表达，产生RNA序列并且产生在该转录的RNA上引起聚腺苷酸化的3’非翻译区。能够在植物体或植物细胞内起作用的启动子，即能够驱动相关结构基因如乳铁蛋白基因在植物细胞内表达的启动子，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的19S或35S启动子和CaMV双启动子；胭脂碱合酶启动子；与致病有关的(PR)蛋白启动子；核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。优选的是水稻肌动蛋白启动子(McElory等，Mol.Gen.Genet.231:150(1991))，遍在蛋白质启动子如玉米遍在蛋白质启动子(EP O342 926；Taylor等，Plant Cell Rep.12:49l(1993))和来自烟草、拟南芥(Arabidopsis)或玉米的Pr-1启动子。同样优选的还有35S启动子和增强的或双35S启动子，如Kay等，科学(Science)236:1299-1302(1987)所描述，以及克隆入pCGN2113的双35S启动子，保藏为ATCC40587。利用本领域公认的方法，启动子本身可能会通过修饰其强度以提高乳铁蛋白的表达。
可以将信号肽或转运肽同本发明的嵌合DNA构件中的乳铁蛋白编码序列相融合，以指导所表达的乳铁蛋白肽转运到目的作用位点。信号肽的例子包括内源的与植物致病性相关的蛋白相连的，如PR-1,PR-2等，例如，Payne等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)11:89-94(1988)。转运肽的例子包括叶绿体转运肽，如Von Heijine等，PlantMol.Biol.Rep.9:104-126(1991)；Mazur等，植物生理(Plant Physiol.)85:1110(1987)；Vorst等，基因(Gene)65:59(1988)所述，以及线粒体转运肽，如Boutry等，自然(Nature)328:340-342(1987)所述。这些相关文献的公开内容，在这里作为整体引入而加以参考。对于胞质的表达，要加上甲硫氨酸启始密码子。
本发明的嵌合DNA构件可能含有多拷贝的启动子或多拷贝的乳铁蛋白结构基因。另外，构件可以含有用于标记的编码序列和其它肽如信号肽和转运肽的编码序列，每个编码序列与其它功能性元件位于DNA分子适当的阅读框内。这些构件的制备为本领域的一般技术人员水平之内。
有用的标记包括提供对除草剂、抗生素或药物抗性的肽，例如：对潮霉素、卡那霉素、G418、庆大霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、phosphinothricin等的抗性。这些标记可以用于将被本发明的嵌合DNA构件转化的细胞从未被转化细胞中筛选出来。其它有用的标记是肽酶，这些肽酶通过一种可见的反应例如颜色反应容易地检测到，例如荧光素酶，β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。
转基因植物的获得可通过：(a)将根据本发明的重组DNA分子插入一种植物细胞的基因组中；(b)获得转化的植物细胞；以及(c)转基因植物的再生，其表达一定量的乳铁蛋白以减少病害。
重组DNA分子可以以许多本领域公认的方法导入植物细胞。本领域的技术人员会根据植物的种类，即：用于转化单子叶植物或双子叶植物，而选择不同的方法。转化植物细胞的适当方式包括：显微注射(Crossway等，生物技术(Bio Teckniques)4:320-334(1986))，电穿孔Riggs等，美国国家科学院院(Proc.Natl.Acad.sci.USA)83:5602-5606(1986)，土壤杆菌介导转化(Hinchec等，生物工程(Biotechnology)6:915-921(1988))，基因直接转运(Paszkowski等，EMBO J.3:2717-2722(1984))，以及使用Madison,Wisconsin的Agracetus公司和Wilmington,Delaware的Dupont公司的弹状粒子加速设备(例如，Sanford等，美国专利4,945,050；和Mc Cabe等，生物工程6:923-926(1988))。又例如：Weissinger等，遗传学年鉴(Annual Rev.Genet.)22:421-477(1988)；Sanford等，颗粒科学与科术(Particulate Science andTechnology)5:27-37(1987)(洋葱)；Christou等，植物生理87:671-674(1988)(大豆)；McCabe等，生物工程6:923-926(1988)(大豆)；Datta等，生物工程8:736-740(1990)(水稻)；Klein等，美国国家科学院院报，85:4305-4309(1988)(玉米)；Klein等，生物工程6:559-563(1988)(玉米)；Klein等，植物生理91:440-444(1988)(玉米)；Fromm等，生物工程8:833-839(1990)；以及Gordon-Kamm等，植物细胞(Plant Cell)2:603-618(1990)(玉米)。
在表达盒中使用的启动子的选择决定转基因植物中转基因在空间和时间上的表达方式。选择的启动子将在特定类型细胞(如：叶表皮细胞、叶肉细胞、根尖细胞)或特定组织器官(例如：根、叶、花)中表达，这种选择反映了转基因表达的目的位点。另外一种方法，所选择的启动子可以驱动受光诱导或其它时间调控的启动子控制的基因的表达。另一种方法是所选择的启动子受化学调控。这提供了仅在需要时用化学诱导剂处理后才诱导转基因的表达的可能性。
许多转录终止子可用于表达盒。它们负责转基因外的终止及其正确的聚腺苷酸化。适当的转录终止子和已知在植物中起作用的终止子包括CaMV35s终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、豌豆rbc S E9终止子，这些终止子既可以用于单子叶植物，也可以用于双子叶植物。
在转录单位内已发现许多序列可以提高基因表达，这些序列可与本发明的基因相连，从而提高在转基因植物中的表达。
不同的内含子序列已显示出可提高表达，尤其在单子叶植物中。例如：发现当玉米Adh1基因的内含子导入玉米细胞时在其同源启动子作用下，可显著提高野生型基因的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰转运酶基因形成的融合构件中特别有效并提高表达(Gallis等，基因发育(Genes Develop.)1:1183-1200(1987))。在同一试验系统中，玉米bronze 1基因的内含子同样具有提高表达的作用(Gallis等，出处同前)。内含子序列已被常规地整合到植物转化载体上，典型地位于非翻译前导区。
已知许多来源于病毒的非翻译前导区序列也可以提高表达，这一作用在双子叶植物细胞中尤其有效。特殊的是，来自烟草花叶病毒(TMV的“W-序列’)、玉米黄化斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示出可有效地提高表达(例如：Gallis等，核酸研究15:8693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物学15:65-79(1990))
已知在植物中存在不同的使基因产物定向(targeting)的机制，并对控制这些机制作用的序列作了详细的表征。例如：基因产物向叶绿体的定向由不同的蛋白质氨基末端处所发现的信号序列调控，在进入叶绿体时被切掉从而产生成熟蛋白(例如：Comai等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),263:15104-15109(1988))。这些信号序列可以融入异源基因产物中，从而将异源基因产物导入叶绿体(van den Broeck等，自然313:358-363(1985))。编码适当的信号序列的DNA可以从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白，EPSP合酶，GS2蛋白和许多其它已知位于叶绿体内的蛋白的cDNA的5′端分离到。
其它基因产物位于其它细胞器如线粒体和过氧化物酶体中(例如：Unger等，植物分子生物学13:411-418(1989))。编码这些产物的cDNA同样可以被操作而用于异源基因产物向这些细胞器的定向。这种序列的例子有核编码的ATP酶和线粒体特有的天冬氨酸转氨酶异形体(isoforms)。向胞内蛋白质体的定向已由Regers等，美国国家科学院院报82:6512-6516(1985)描述。
另外，导致基因产物定向于其它的细胞区室的序列已被表征。负责向内质网、质外体定向以及从糊粉细胞向胞外的分泌是由氨基端序列负责的(Koehl & Ho，植物细胞2:357-368(1990))。另外，与羧基端序列相连的氨基端序列负责基因产物的液泡定向(Shinshi等，植物分子生物学14:357-368(1990))。
通过将上述适当的定向序列融入目的转基因序列中，就可能将转基因产物直接导入任何细胞器或细胞区室。例如：对定向于叶绿体而言，来自于RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合成酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列融入转基因的氨基端ATG框内。所选的信号序列应包括已知酶切位点，构建的融合应该考虑到需要切除的酶切位点后的每个氨基酸。在一些情况下，这种需要可以通过在酶切位点和转基因ATG之间加入一些氨基酸或在转基因序列内取代一些氨基酸来实现。所构建的用于导入叶绿体的融合子的叶绿体摄入效率可以通过应用Bartlett等，Edelmann等编《叶绿体分子生物学方法》(Methods inChloroplast Molecular Biology,Elsevier.1081-1091(1982))和Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)中描述的技术，通过检测其在体外转录的构件在体外翻译，随后在体外检测叶绿体摄入来检测。这些构建技术在本领域众所周知，同样可用于线粒体和过氧化物酶体中。转基因表达所需要的定向选择取决于作为给定途径起始点的前体在细胞内的定位。尽管有时在线粒体或过氧化物酶体，通常是在胞质或叶绿体内。转基因表达的产物一般不需要定向于内质网、质外体或液泡。
上述胞内定向机制不仅可用于与其同源启动子的连接，也可用于与异源启动子的连接，从而影响处于某一启动子转录调节下的特定的细胞定向，该启动子的表达方式不同于定向信号驱动的启动子的表达方式。
双子叶植物的转化技术在本领域已众所周知，包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及由原生质体或细胞直接摄取外源遗传材料。这可以通过PEG或电穿孔介导摄取，粒子轰击介导的输运，或显微注射实现。Paszkowski等，EMBO J 3:2717-2722(1984),Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199:169-177(1985),Reich等，生物工程4:1001-1004(1986)，和Klein等，自然327:70-73(1987)描述了这些技术的例子。在每种情况下，转化细胞通过使用本领域已知的标准技术再生为整个植株。
土壤杆菌介导的转化是双子叶植物转化的优选技术，因为它的转化效率高并可广泛应用于不同作物种类。通常用土壤杆菌转化的作物包括：烟草、番茄、向日葵、棉花、油籽油菜、马铃薯、大豆、苜蓿和杨树(E P 0 317 511(棉花)；EP 0 249 432(马铃薯，Calgene)；WO87/07299(Brassica,Calgene)；US4,795,855(杨树))。典型的土壤杆菌转化包括将携带外源目标DNA的双元载体(如pCIB 200或pCIB2001)转运至适当的土壤杆菌菌株中，该菌株取决于寄主土壤杆菌菌株携带的vir基因的互补是在共驻留Ti质粒上，或是在染色体上(如用于pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542(Uknes等，植物细胞5:159-169(1993))。重组双元载体向土壤杆菌的转运通过三亲株杂交步骤获得，利用了携带重组双元载体的大肠杆菌，这种大肠杆菌起辅助功能，携带一质粒如pRK2013并能将重组双元载体运至目的土壤杆菌菌株。另外，重组双元载体可以通过DNA转化转运至土壤杆菌(Hofgen & Willmitzer，核酸研究16:9877(1988))。
通过重组土壤杆菌对目的植物品种的转化通常包括土壤杆菌与该植物外植体的共同培养并按本领域已知的流程操作。转化组织在选择性培养基上再生，在双元质粒T-DNA边界之间携带抗生素或除草剂抗性标记。
大多数单子叶植物种类的转化现在也已成为常规操作。优选技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转入原生质体或利用粒子轰击技术直接将基因导入愈伤组织。转化可以用单种DNA或多种DNA(即共转化)进行，这两种方法都可适用于本发明。共转化可能具有以下优点：避免复杂载体的构建；产生目的基因与选择标记互不连锁的基因座的转基因植物，随后可将选择性标记切去，假如需要的话。然而，使用共转化的缺点在于分隔的DNA整合到基因组中的频率低于100％(Schocher等，生物工程4:1093-1096(1986))。
专利申请EP 0 292 435、EP 0 392 225和WO 93/07278描述了从玉米优良自交系中制备愈伤组织和原生质体的技术，利用PEG或电穿孔法转化原生质体，以及由转化的原生质体再生为玉米植株的技术。Gordon-Kam等，植物细胞2:603-618(1990)和Fromm等，生物工程8:833-839(1990)已经发表了利用粒子轰击法转化A188衍生的玉米系的技术。而且，专利申请WO93/07278和Koziel等，生物工程11:194-200(1993)也描述了利用粒子轰击法转化玉米优良自交系的技术。这项技术使用了从传粉后14-15天的玉米叶耳切下的1.5-2.5mm长的未发育成熟的玉米胚胎和PDS-1000He Biolistics的粒子轰击设备。
水稻的转化同样可以通过利用原生质体或粒子轰击直接转运基因技术来实现。原生质体介导的转化已被描述用于Japonica类型和Indica类型(Zhang等，Plant Cell Rep 7:379-384(1988)；Shimamoto等，自然338:274-277(1989)Datta等，生物工程8:736-740(1990))。这两种类型同样可常规地通过粒子轰击来转化(Chistou等，生物工程9:957-962(1991))。
专利申请EP 0 332 581描述了Pooideae原生质体的产生、转化和再生技术。这些技术可使Pooideae如Dactylis和小麦转化。而且，小麦转化已由Vasil等，生物工程10:667-674(1992)描述，使用粒子轰击C型长期可再生的愈伤组织的细胞；同样，Vasil等，生物工程11:1553-1558(1993)和Weeks等，植物生理102:1077-1084(1993)描述了使用粒子轰击未成熟胚胎和未成熟胚胎衍生的愈伤组织。然而，小麦转化的优选技术包括粒子轰击未成熟胚胎的转化，包括在基因输运前高蔗糖或高麦芽糖的步骤。在轰击前，任何数量的胚胎(长度0.75-1mm)被放置在含有3％的蔗糖(Murashige & Skoog,PhysiologiaPlantarum 15:473-497(1962))和3mg/l用于在暗处下诱导体细胞胚的2.4-D的MS培养基上。在轰击当天，胚胎从诱导培养基中取出并放置于渗压剂中(即：添加了所需浓度的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基，通常浓度为15％)。胚胎质壁分离(plasmolyze)2-3小时，然后被轰击。一般每个目标平板上有20个胚胎，但并不是绝对的。使用标准程序，将携带适当基因的质粒(如：pCIB 3064或pSG35)沉淀于微米大小的金粒上。每个胚胎平板用DuPont Biolistics’氦设备轰击，使用约1000psi的冲击压和80目标准筛。轰击后，胚胎再放回暗处修复约24小时(仍在渗压剂中)。24小时后，将胚胎从渗压剂中移出，放回诱导培养基上约一个月直至再生。大约一个月后形成胚胎愈伤组织的胚胎外植体被移至再生培养基上(Ms+1mg/L NAA,5mg/L GA)，还包括适当的选择剂(对于pCIB 3064:10mg/l basta，对于pSOG 35:3mg/l氨甲蝶呤)。大约一个月后形成的幼苗被转运到更大的叫作“GA7s”的无菌容器中，该容器含有50％强度的MS,2％蔗糖和同样浓度的选择剂。
当乳铁蛋白在植物体内表达时，可防治或抑制广谱的植物病原体，包括病毒、细菌和真菌植物病原体。适于通过在植物体内乳铁蛋白的表达来防治经济上重要的病害包括如下：玉米病原体真菌：玉蜀黍赤霉      Gibberella zeae黄曲霉          Aspergillus flavus寄生曲霉        A.parasiticus串珠镰孢        Fusarium moniliformeDiplodia maydis禾生刺盘孢      Colletotrichum graminicola顶头孢          Cephalosporium acremonium菜豆壳球孢      Macrophomina phaseolinaCercospora zeae-maydisExserohilum turcicumBipolaris maydis玉蜀黍球梗孢       Kabatiella zeae高粱柄锈菌         Puccinia sorghi多堆柄锈菌         Puccinia polysora丝轴黑粉菌         Sphacelotheca reiliana玉米黑粉菌         Ustilago maydis禾生刺盘孢         Colletotrichum graminicola炭色长蠕孢         Helminthosporium carbonumPeronosclerospora sorghiSclerophthora rayssiaePeronosclerospora sacchariPeronoscler philippinensisPeronosclerospora maydisPeronosclerospora sportaneaPeronosclerospora heteropogoni
  禾生指梗霉                      Sclerospora graminicola细菌：斯氏欧文氏细菌                  Erwinia stewartii
  密执安棍状杆菌内布拉斯加亚种    Corynebacterium nebraskense病毒：玉米矮生花叶病毒                Maize dwarf mosaic virus
  玉米粗缩病毒                    Maize rough dwarf(Maize rio cuano)virus
  玉米线条病毒                    Maize streak virus
  玉米黄萎矮生病毒                Maize chlorotic dwarf virus
  玉米黄萎斑驳病毒                Maize chlorotic mottie virus
  大麦黄萎病毒                    Barley yellow dwarf virus
  玉米致死病毒                    Corn lethal necrosis virus
  High Plains病毒
  玉米条病毒                      Maize stripe virus甜玉米病原体A．细菌病：
斯氏欧文氏细菌    Erwinia stewartii
燕麦假单胞菌      Pseudomonas avenae
菊欧文氏菌        Erwinia chrysanthemiB．真菌病：
Bipolaris maydis
Exserohilum turcicum
禾生刺盘孢
Phyllostictia maydis
玉蜀黍球梗孢
Cercospora zeae-maydis
指梗霉属
Pernosclerospora spp.
玉米黑粉菌
丝轴黑粉菌
高粱柄锈菌
多堆柄锈菌
Physopella zeae
串珠镰孢                    Fusarium moniliforme
腐霉属                      Pythium spp.
草酸青霉                    Penicillium oxalicum
镰孢霉属
Diplodia maydis
玉蜀黍赤霉C．病毒病：
甘蔗花叶病                  Sugarcane Mosaic
玉米矮生花叶病              Maize Dwarf Mosaic
玉米黄萎矮生病              Maize Chiorotic Dwarf
High plains病毒
玉米黄萎斑驳病              Maize Chiorotic Mottle
小麦条纹病                     Wheat Streak Mosaic
大麦黄矮病                     Barley Yellow Dwarf小麦病原：真菌病原：
禾柄锈菌(Puccina graminis fisp.tritici)
小麦隐匿柄锈菌                 Puccinia recondita f.sp.tritici
条形柄锈菌                     Puccinia striiformis
小麦网腥黑粉菌                 Tilletia tritici
麦矮化腥黑粉菌                 Tilletia controversa
印度腥黑粉菌                   Tilletia indica
Ustilago tritici
Urocystis tritici
禾顶囊壳                       Gaeumannomyces graminis
腐霉属                         Pythium spp.
大刀镰孢霉                     Fusarium culmorum
禾本科镰孢霉                   Fusarium graminaerum
燕麦镰孢霉                     Fusarium avenaceum
Drechslere tritici-repentis
丝核菌属                       Rhizoctonia spp.
禾生刺盘孢                     Colletotrichum graminicola
长蠕孢属                       Helminthosporium spp.
Microdochium nivale
Pseudocercosporella herpotrichoides
禾谷白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)
禾指梗疫霉                     Sclerophthora macrospora
小麦壳针孢                     Septoria tritici
小麦颍枯壳针孢(小麦壳多壳孢菌) Septoria nodorum(Stagonospora nodorum)
Bipolaris sorokiniana
玫瑰镰孢霉                     Fusarium roseum
Cephalosporium gramineum
禾旋孢腔菌                      Cochliobolus sativus
麦角菌                          Claviceps purpurea细菌病原：
丁香假单胞菌致黑致病变种
丁香假单胞菌丁香致病变种
野油菜黄单胞菌小麦致病变种病毒病原：
大麦黄矮病毒                    Barley Yeliow Dwarf virus
土传小麦花叶病毒                Soilborne Wheat Mosaic virus
小麦梭线花叶病毒                Wheat Spindle Streak Mosaic virus小麦黄花叶病毒                  Wheat Yellw Mosaic virus大豆病原体1．真菌：
大雄疫霉菌var.sojae             Phytophthora megaspemia var.sojae
平头刺盘孢                      Colletotrichum truncatum
大豆壳针孢                      Septoria glycines
菊池尾孢                        Cercospora kikuchii
大豆尾孢                        Cercospora sojina
东北霜霉                        Peronospora manshurica
Microsphaera diffusa
立枯丝核菌                      Rhizoctonia solani
豆薯层锈菌                      Phakopsora pachyrhizi
山扁豆棒孢                      Corynespora cassicola
Calonectria crotalariae
腐皮镰孢霉
尖镰孢霉
菜豆壳球孢                      Macrophomina phaseolina
菜豆间座壳var.caulivoza & meridronalis
菜豆间座壳var.sojae
Phialophora gregata
腐霉属
核盘菌
齐整小核菌
根串珠霉2．细菌
丁香假单胞菌大豆致病变种
野油菜黄单胞菌pv.phaseoli3．病毒
大豆花叶病毒                  Soybean mosaic
豆荚斑驳病毒                  Bean pod mottle
花蕾黄化病毒                  Bud blight
花生斑驳病毒                  Peanut mottle
豇豆黄化斑驳病毒              Cowpea Chlorotic Mottle
黄花叶病毒                    Yellow Mosaic豌豆病原体1．种子和幼苗病害：
终极腐霉
立枯丝核菌2．细菌引起的病害：
丁香假单胞菌豌豆致病变种
丁香假单胞菌丁香致病变种3．真菌引起的叶部病害：
豌豆壳二孢                   Ascochyta pisi
豌豆球腔菌                   Mycosphaerella pinodes
豆类壳二孢                   Ascochyta pinodella
核盘菌
豌豆霜霉                     Peronospora pisi
豌豆白粉菌                Erysiphe pisi
豌豆刺盘孢                Colletotrichum pisi
链格孢                    Altemaria altemata
灰葡萄孢                  Botrytis cinerea4．真菌引起的根部病害：
尖镰孢霉f.sp.pisi
根腐丝囊霉f.sp.pisi
终极腐霉
腐皮镰孢霉f.sp.pisi
根串球霉5．病毒引起的病害：
豌豆耳突花叶病            Pea Enation Mosaic
菜豆(豌豆)卷叶病          Bean(Pea)Leaf Roll
豌豆种传花叶病            Pea Seedborne Mosaic
豌豆条斑病                Pea Streak
豌豆花叶病                Pea Mosaic
黄瓜花叶病                Cucumber Mosaic
黄瓜早枯病毒              Pea Early Browning Virus
红三叶草脉花叶病          Red Clover Vein Mosaic菜豆病原体Ⅰ．根部病害
根腐丝囊霉f.sp.phaseoli
终极腐霉
立枯丝核菌
腐皮镰孢霉f.sp.phaseoli
根串珠霉
齐整小核菌Ⅱ．气生部的真菌病害
豆刺盘孢                 Colletotrichum lindemuthianum
疣顶单胞锈菌             Uromyces appendiculatus
核盘菌
尖镰孢霉f.sp.phaseoli
Phoma exigua var.exigua
变灰尾孢
Chaetoseptoria wellmani
烟草疫霉
蓼白粉菌
终极腐霉和Pythium debaryanum
链格孢及其变种
灰褐柱丝霉
菜豆壳球孢
灰葡萄孢
立枯丝核菌Ⅲ．细菌引起的病害：
丁香假单胞菌菜豆致病变种
丁香假单胞菌丁香致病变种
菜豆黄单胞菌Ⅳ．线虫引起的病害：
北方根结线虫(Meloidogyne incognita)
滑刃线虫(Pratylenchus species)Ⅴ．病毒引起的病害：
菜豆普通花叶病               Bean Common Mosaic
菜豆金色花叶病               Bean Golden Mosaic
曲顶病                       Curly Top
菜豆曲矮花叶病               Bean Curly Dwarf Mosaic
菜豆豆荚斑驳病               Bean Pod Mottle
三叶草黄脉病                 Clover Yellow Vein
Red node
黄瓜花叶病
花生矮化病              Peanut Stunt甜菜病原体1．真菌：
菾菜生尾孢              Cercospora beticola      叶斑病
螺壳状丝囊霉            Aphanomyces cochlioides
立枯丝核菌                                 失水，根腐病
Erysiphe betae                                   白粉病
紫色丝核菌(紫卷担菌)Rhizoctonia violacea(Helicobasidium purpureum)
Ramularia beticola
腐霉属
菾菜茎点霉              Phoma betae
菾菜单胞锈菌            Uromyces betae
Peronospora farinosa
Alternaria tenuis
尖镰孢
大丽花轮枝孢
齐整小核菌
蓼白粉菌                                         白粉病
Polymyxa betae2．细菌：
丁香假单胞菌
胡萝卜软腐欧文氏菌                         欧文氏根腐病3．病毒：根际甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)甜菜温和性黄化病毒(BMYV)甜菜黄化病毒(BYV)甜菜曲顶病毒             Beet curly top virus甜菜花叶病毒             Beet mosaic virus
本发明提供的植物和种子，发芽和栽培后可表达乳铁蛋白。优选地，乳铁蛋白是由稳定整合在基因组的重组DNA表达的。转基因植物或种子或是单子叶的，或是双子叶的，并且优选地选自这样一组植物：玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、黑麦、燕麦、谷子、棉花、大豆、豌豆、菜豆、向日葵、禾草和油籽油菜。转基因种子可以装入袋中，袋上优选地带有用于防治植物病原体的说明标签。
上述构造的转基因种子和植物的遗传特性，可以通过有性繁殖或营养生长传给后代，从而能够在子代植物中维持并繁殖。一般所说的维持和繁殖可利用已知的适用于特定目的的农业方法如耕地、播种或收获。也可以使用特殊技术，如水栽法与温室技术。由于处于生长阶段的作物易受昆虫或感染的攻击和破坏以及杂草的竞争，为提高产量，采用了防治杂草、植物病害、昆虫、线虫以及其它的不利因素的措施，包括机械法如耕地、清除杂草和已感染的植物，以及使用农业化学药剂，如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、催熟剂和杀虫剂等。
根据本发明的转基因植物和种子的优良遗传特性可以进一步用于植物育种，旨在提高植物耐受害虫、除草剂或不利条件的特性；增强营养品质、提高产量或具有更好的结构从而减少倒伏或散生所造成的损失。不同的育种步骤的特征在于充分明确的人为干预，例如选择待杂交品系，指导亲本品系授粉或选择合适的子代植物。根据所需的特性，采用不同的育种方法。本领域众所周知的相关技术包括，但不仅限于杂交、自交、回交、多系育种，品种拟合、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术也包括通过机械、化学与生物化学的方法，使植物不育，从而产生不育的雄性和雌性植物。雄性不育植物与不同品系的花粉交叉授粉确保雄性的基因组不育而雌性可育植株一致性获得双亲品系的特性。因此，根据本发明的转基因植物和种子可用于改良植物品系的育种，例如提高常规方法的有效性，如用除草剂或杀虫剂处理，或由于遗传特性改变而免除所述的方法。另外，可获得抗逆性提高的新作物，由于其遗传“设备”的优化，从而比那些不能耐受相对不利的发育条件的作物产生质量更好的产品。
对于种子生产而言，发芽质量和发芽一致性是重要的产品特征，然而，对于农民收获并出售种子而言并不重要。由于很难将作物与其它作物和杂草种子隔离，为了防治种传病害，生产发芽良好的种子，在本领域中有经验的纯化种子的生长、调控和销售的种子生产者，已发展出了相当广泛且明确的种子生产技术。这样，农民可以普遍购买符合特定质量标准的有保证的种子，而不是使用从自己作物中收获的种子。用作种子的繁殖材料，一般用包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物的保护膜来处理。习惯上使用的保护膜包括化合物如克菌丹、萎锈灵、福美双((TMTD)、甲霜灵(Apron)和甲基嘧啶磷(Actellic)。如果需要的话，这些化合物进一步与载体、表面活性剂或提高使用效果的助剂一起应用本领域通常的制剂化技术形成制剂，以防止由细菌、真菌或动物害虫造成的破坏。保护膜可通过液体制剂浸湿繁殖材料来应用或用复合的干或湿制剂加以包被。其它使用方法，如直接处理花蕾或果实也是可能的。
本发明的更进一步的方面是提供新的农业方法，如上文例举的方法，其特征在于本发明使用转基因植物、转基因植物材料或转基因种子来防治植物病害。
为了从根据本发明的方法转化的植物培育下一代，可以使用下述方法：由下面实施例中描述产生的植物，如本领域所知，种在温室的盆中或土壤中，并允许开花。获得花粉并授粉于同株植物、子代植物或任何所需植物。类似地，转化的植物也可以用获自同株植物、子代植物或任何所需玉米的花粉来授粉。用这种方法获得的转化子代，可以通过导入的基因和/或伴随的DNA(基因型)或所赋予的表现型的存在与非转化子代区分开。转化的子代同样可以自交或与其它植物杂交，就象一般处理具有优良性状的植物一样。同样，如本领域所知，用这种方法产生的其它转化植物也可以自交或杂交，以产生所需性状的子代。
于是在第一实施方案中本发明提供1．一种重组DNA分子，其操作序列上含有：
(a)一种在植物细胞中起作用以产生RNA序列的启动子，如上述启动子，例如玉米遍在蛋白质启动子；
(b)一种编码乳铁蛋白如乳铁蛋白B或乳铁蛋白H生产的结构编码序列，例如SEQ ID NO:1或2的肽，任选地具有N端甲硫氨酸；优选的是一种植物优化编码序列，例如SEQ ID NO:3、4、5或6；以及
(c)一种在植物细胞中起作用导致向RNA序列3’端添加聚腺苷酸核苷酸的3’非翻译区，如上述的转录终止子，例如根瘤土壤杆菌(Agrobocterium tumifacrens)的胭脂碱合成酶转录终止子；并且如此处所述，还任选地包括一种或多种增强子或定向序列。
在第二实施方案中，本发明提供2．一种生产转基因抗病植物的方法，如上述植物，例如能够表达乳铁蛋白的玉米或小麦，包括以下步骤：
(a)将上述的一种重组DNA分子插入植物细胞基因组中，该重组DNA分子例如包括(ⅰ)在植物细胞中起作用以产生RNA序列的启动子；(ⅱ)用于编码乳铁蛋白生产的结构编码序列；和(ⅲ)在植物细胞中起作用导致在RNA序列3’端添加聚腺苷酸核苷酸的3’非翻译区；
(b)获得转化的植物细胞；以及
(c)从遗传转化的植物细胞再生以获得转化植物，该植物表达有效量的乳铁蛋白以减少病原体侵染引起的病害。
在第三实施方案中，本发明提供3．一种含有表达乳铁蛋白的细胞的植物(例如，玉米、小麦或甜菜)，例如，一种在基因组中稳定地整合有重组DNA的植物，重组DNA的操作序列上含有：
(a)一种在植物细胞中起作用以产生RNA序列的启动子；
(b)一种编码乳铁蛋白产生的结构编码序列；以及
(c)一种在植物细胞中起作用导致向RNA序列3’端添加聚腺苷酸核苷酸的3’非翻译区；
例如，其中该植物发育和形态正常。
在第四实施方案中，本发明提供4．一种当发芽和栽培后长成植物的种子，该植物含有表达乳铁蛋白的细胞，例如上述植物，例如其中的种子可以任选地加以包被(例如，用聚合物、杀真菌剂、杀虫剂、染料或其它种子包被)并/或包装于袋子或其它用于销售或运输的容器中。
在第五实施方案中，本发明提供5．乳铁蛋白防治植物病原体的应用，如植物细菌、真菌或病毒病原体，如上述；以及一种防治植物病原体的方法，如上所述，包括使病原体与表达乳铁蛋白的植物接触。
以下描述进一步解释了本发明的方法和组合物。然而，应该理解的是为本领域的一般技术人员所知的其它相当的方法也可以使用。
实施例实施例1：乳铁蛋白B对植物病原性真菌和其它微生物的抗菌活性。a．孢子萌发的抑制
使用Diplodia maydis和禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)的孢子来测定乳铁蛋白B的孢子萌发抑制活性。真菌菌株来自LoralCastor,CIBA-GEIGY,Illinois。乳铁蛋白B肽和乳铁素来自日本东京Morinaga牛奶工业有限公司。从生长于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,Difco)平板的产孢培养物上收集真菌孢子。D.maydis使用新鲜孢子或贮藏于-80℃25％甘油中。所用C.graminicola孢子是新鲜的。
测定时，取10ml融化的培养基(1.5％琼脂，包括8％的胡萝卜汁)冷却至50℃左右，加入10μl链霉素(250mg/ml)，再加入100μl D.maydis孢子(浓度106/ml)或100μl C.graminicola(浓度107/ml)。轻轻摇动溶液，混匀后倒入无菌培养皿中。培养基凝固后，在其上放一个直径1/4英寸的无菌滤盘，测试溶液用移液管移入滤盘。测试溶液为乳铁素(10μg)，乳铁蛋白B(10μg)，嘌呤硫素(purothionin)(阳性对照，0、5、10和20μg，购自Calbiochem)以及缓冲液(20mM Tris,pH7.5)。
室温下培养2-5天，除了含嘌呤硫素和乳铁蛋白B的滤盘周围以外，培养皿上清晰可见真菌的生长。抑菌圈的大小列于表1。在D.maydis实验中，含10μg乳铁蛋白B的滤盘显示抑菌圈为4.95mm，而20μg嘌呤硫素显示抑菌圈为4.5mm。在C.graminicola实验中，乳铁蛋白B产生的抑菌圈为1.7mm，而嘌呤硫素产生的抑菌圈为2.1mm。乳铁素不能抑制真菌的萌发和生长。
在本系统中对斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)也进行了测试，表明乳铁蛋白B同样可抑制这种细菌的生长。表1．乳铁蛋白B对孢子萌发的抑制
                  抑菌圈真菌         缓冲液  嘌呤硫素    乳铁蛋白B
                   20μg      10μgD.maydis       0mm     4.5mm      4.95mmC.graminicola  0mm     2.1mm      1.7mmb．菌丝生长的抑制
用于评价抗真菌活性的另一种方法包括测定对菌丝生长的抑制。本方法中，在含4％胡萝卜汁的1.5％琼脂糖平板周边上用巴斯德吸管的粗端打一加样孔。加样孔孔底用一滴融化的琼脂糖溶液封上。所加的真菌取自主平板上的Bipolaris maydis，串珠镰孢(Fusariummonoliforme)，玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，并放在每个测试平板中央。加样孔(40μl)中的测试液是乳铁蛋白B(100μg)、乳铁素(100μg)以及缓冲液(20mM Tris,pH7.5)。在室温下培养至真菌从接种处长至加样孔，记录真菌生长的抑制情况。含乳铁蛋白B的加样孔附近所有的真菌生长受到抑制，而在乳铁素、缓冲液对照附近则没有抑制。结果如表2。表2：乳铁蛋白B对真菌生长的抑制
                 生长抑制(mm)真菌           缓冲液       乳铁蛋白B
                         (100μg)B.maydis          0               8串珠镰孢          0             9.7玉蜀黍赤霉        0             9.8瓜果腐霉          0            20.9立枯丝核菌        0             1.6C．液体培养中的最低抑制浓度
在液体抑制实验中测定了对乳铁蛋白B及其两个衍生物对大刀镰孢(Fusarium culmorum)和颖枯壳针孢(Septozia nodorum)的活性。肽为乳铁蛋白B(如上述，Met-乳铁蛋白B(具有N端甲硫氨酸的乳铁蛋白B)，和Gln-乳铁蛋白B(具有N端谷氨酰胺的乳铁蛋白B))。所有的肽都购自W.M.Keck生物工程资源中心，New Haven,CT。肽溶于双蒸无菌水中，浓度为1.5mg/ml。
如上所述真菌孢子从生长于马铃薯葡萄糖琼脂平板(PDA,Difco)的产孢培养物上收集，并在1/2强度PDA中稀释至15,000个孢子/ml。25μl系列稀释的肽加入到50μl的孢子中，孢子与肽都加入96孔板中。样品混合后，在590nm处测OD值(一种测量真菌生长的方法)。板在28℃下培养，在随后的2天内，间隔测590nm的OD值。可完全抑制生长的乳铁蛋白B肽的最低浓度表示为最低抑制浓度(MIC)。数据如表3。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)生长于YPD平板，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)BL882和大肠杆菌DH5α培养于L肉汤培养基中。少量P.pastoris细胞重新悬浮于YPD中，并计数细胞浓度，用YPD调至30,000个细胞/ml。在600nm处测量DH5α和BL882培养物的OD值。在L肉汤培养基内将细胞浓度调至30,000个细胞/ml，假设在600nm处OD=1时，DH5α为109细胞/ml,BL882为5×108细胞/ml。
在所有96孔板上，将20μl系列稀释的乳铁蛋白B肽加入到80μl细胞中。随后测定平板在590nm处的OD值，然后在28℃下培养平板。在随后的两天内有规律地测定590nm处的OD值。完全抑制真菌生长的乳铁蛋白B的最低浓度表示为最低抑制浓度(MIC)。如表3。表3：乳铁蛋白B的最低抑制浓度
    微生物                     肽
乳铁蛋白B  Met-乳铁蛋白B  Gln-乳铁蛋白B
大刀镰孢颖枯壳针孢禾生刺盘孢丁香假单胞菌BL882大肠杆菌DH5α巴斯德毕赤酵母     2010010020100300     2010010020100200     2010010020100300
实施例2：Gln-乳铁蛋白B肽在植物胞外液体中的稳定性
在植物体中使用调控序列来表达乳铁蛋白B肽，可将该肽定向于几个不同的亚细胞位点上(在下面实施例3-6详述)。对于胞外表达，乳铁蛋白B的编码序列融入玉米PR-1基因的前导序列中，从而导致将该肽分泌至胞外。实现此目的所使用的前导序列包括在成熟分泌的PR-1蛋白质起始处的谷氨酰胺残基，从而导致有一附加的N端谷氨酰胺残基的乳铁蛋白B的分泌(Gln-乳铁蛋白B)。在小麦、玉米和烟草的胞外洗液中测定人工合成的Gln-乳铁蛋白B肽的稳定性。
胞外洗液(ECF)是通过无菌、双蒸水浸润叶片组织，再通过离心该浸润组织收集得到的。对于小麦，使用UC703植物的叶片，对于玉米，使用6N615植物的叶片。这些叶片被切成小碎片，放置于20ml底部有棉花的注射器针管中。碎片用水冲洗以除去切口表面的细胞外渗液。随后加水并将推管插入针管中。注射器上下倒置于冷冻干燥管中，然后与冷冻干燥器相连。在温和的真空中30-40秒后，释放真空。再重复一次。叶片再放置于10ml注射器的管中，该注射器放在离心管中。在医用离心机中以1000-2000转/分旋转，收集胞外洗液，然后冷藏。
对于烟草(cultivar Xonthi.nc)，用10ml注射器向叶中注水，随后摘下烟叶，印干，卷起切成小圆柱，放入10ml注射器的针管中。注射器放置于离心管中，在医用离心机中以1000转/分旋转。收集管中的洗液并冷藏。
根据生产商说明(Novex),ECF的等分量样品在10％的Tricine凝胶上进行电泳。估计每一种植物ECF的相应蛋白浓度，用于估计从每种收集的液体中需要的ECF量以与随后温育中ECF的蛋白总量大致相当。这样，来自小麦的ECF 18.5μl，玉米的ECF 31μl和烟草的ECF 60μl分别与11.25μg的Gln-乳铁蛋白B肽温育，总体积为75μl，包括10mMTris pH7.5,50mM NaCl,2.5mM MgCl2和2.5mM CaCl2。该反应于37℃下温育，并在第0、15、30、60、90、120和180分钟时分别取出10μl样品。这些样品立即冷藏。
样品经热失活和烷基化后，用凝胶电泳法来分析是否含有Gln-乳铁蛋白B。在100℃温育10分钟后，冷却样品并在微量离心管中迅速离心。每个样品的烷基化是通过先在100℃N2气中用2μl 1mM DTT还原10分钟，然后加入碘乙酰胺(10mM,2μl)和1.4μl 1MTris(pH8.5)，使溶液变得更为碱性。用N2气冲洗管后，样品在暗处50℃下温育50分钟。对照肽样品(没有缓冲液或ECF的Gln-乳铁蛋白B肽)以同样的方式烷基化。样品冷冻保存至凝胶电泳分析。
向每个样品加入等量的2x Tricine/SDS样品缓冲液(Novex)，然后在100℃温育5分钟。根据生产商的说明，随后样品在10-20％Tricine/SDS凝胶(Novex)中进行电泳。为看见肽带，凝胶用考马斯亮兰(Pharmacia)染色和脱色。
Gln-乳铁蛋白B肽在小麦ECF中相当稳定。温育3小时后，还存在大量的肽，说明在小麦ECF中该肽的降解相当缓慢。在玉米ECF和烟草ECF中，温育3小时后Gln-乳铁蛋白B肽也仍然存在，尽管水平降低了。
这些结果指出Gln-乳铁蛋白B肽在这3种植物的ECF中仅缓慢降解。在这些条件下，在ECF中肽的降解需要3个小时以上。实施例3：在植物胞质内表达的乳铁蛋白B基因的构建
通过合成2个部分互补的寡核苷酸而获得在胞质内表达合成的乳铁蛋白B基因的编码和非编码DNA序列。寡核苷酸编码(在编码链上从5’-3’)一个BamHⅠ限制制酶末端，一个Kozak共有序列位点，包括甲硫氨酸起始密码子、编码乳铁蛋白B肽氨基酸序列的75个碱基对、一个终止密码子和一个NotⅠ限制性酶末端。寡核苷酸的核苷酸序列如下：Oligo1(SEQ ID NO:7):
5′-GATCCACCATGTTCAAGTGCCGCCGCTGGCAGTGGCGCATGAAGAAGCTGGGCGCCCCCAGC-
    ATCACCTGCGTGCGCAGGGCCTTCTAAGC-3′Oligo2(SEQ ID NO:8):
5′-GGCCGCTTAGAAGGCCCTGCGCACGCAGGTGATGCTGGGGGCGCCCAGCTTCTTCATGCGCC-
    ACTGCCAGCGGCGGCACTTGAACATGGTG-3′购买这些合成的寡核苷酸并在10％尿素/聚丙烯酰胺凝胶上电泳，切除含全长寡核苷酸的条带。寡核苷酸经洗脱、退火，用Oligo 1-1和Oligo2-1作PCR扩增。Oligo1-1(SEQ ID NO:9):
5′AGTAGGATCCACCATGTTCAAGTGCC-3′Oligo2-1(SEQ ID NO:10):
5′TACTGCGGCCGCTTAGAAGGCCCTGCGC-3′
PCR产物连接到pCRⅡ上，鉴定包括插入片段的克隆，并对插入片段测序，以证明未引入基因突变。含序列正确的BamHⅠ-NotⅠ插入片段克隆被克隆至经BamHⅠ和NotⅠ预处理的Bluescript中。将含遍在蛋白质启动子的一个2kb HindⅢ-BamHⅠ片段(Toki等，植物生理100:1503)克隆至该克隆的HindⅢ-BamHⅠ位点上。nos终止子连入NotⅠ-SacⅠ位点产生pCIB7703(如图1)，该质粒具有遍在蛋白质-乳铁蛋白B-nos基因盒。包含ubi-SynPAT-nos的DNA片段克隆至该质粒的HindⅢ位点。生成的质粒pCIB7704(如图2)，包含ubi-SynPAT-nos和ubi-lacto-nos基因盒。该质粒包含SynPAT基因用于植物筛选，并且可用于以在玉米遍在蛋白质启动子调控下的乳铁蛋白B基因转化植物。
质粒pCIB7704用KpnⅠ和SacⅠ酶切，释放出含ubi-SynPAT-nos-ubi-lacto-nos基因融合的片段。该片段克隆入Kpnl、SacⅠ酶切的pCIB 6848形成pCIB 7705(如图3)。质粒pCIB 7705包含用于细菌中筛选的NPTⅡ(卡那霉素抗性)和用于植物中筛选的SynPAT基因，并用于以在玉米遍在蛋白质启动子调控下的乳铁蛋白B基因转化植物。
从pCIB 7703上分离的KpnⅠ-SacⅠ片段，包含ubi-lacto-nos构件被克隆至质粒pCIB 6848，产生pCIB 7706(如图4)。从而将ubi-lacto-nos基因构建于含卡那霉素抗性基因的质粒中。实施例4：用于在植物中乳铁蛋白B的细胞外表达的合成基因的构建
为了在胞外表达乳铁蛋白B，在乳铁蛋白B基因5’端加上一前导序列。该前导序列来自于从玉米cDNA基因库(用大麦PR-1基因探针)克隆和测序(专利公开文本WO95/19443)的玉米PR1cDNA(PR-1mz)。用合成寡核苷酸和PCR扩增在两个步骤中构建该基因。Oligo3除一个沉默核苷酸改变外(为防止潜在的二级结构问题)，其序列与PR-1前导序列、乳铁蛋白B编码序列起始序列相同。Oligo4与乳铁蛋白B编码序列(此设计在详述中描述)和PR-1前导序列3’端互补。Oligo3-1与PR-1编码序列的5’端相同。
合成的寡核苷酸的核苷酸序列如下：Oligo3(SEQ ID NO:11):
5′-GATCCACCATGGCACCGAGGCTAGCGTGCCTCCTAGCTCTGGCCATGGCAGCCATCGTCGTGG-
    CGCCATGCACGGCCTTCAAGTGCCG-3′Oligo4(SEQ ID NO:12):
5′-GGCCGCTTAGAAGGCCCTGCGCACGCAGGTGATGCTGGGGGCGCCCAGCTTCTTCATGCGCCA-
    CTGCCAGCGGCGGCACTTGAAGGCC-3′Oligo3-1(SEQ ID NO:13):
5′AGTAGGATCCACCATGGCACCGAGGCTAG-3′Oligo5(SEQ ID NO:14):
5′AGTACCATCGTCGTGGCGCCATGCACGGCCCAGTTCAAG-3′
首先，玉米PR1前导序列以玉米PR-1 cDNA克隆为模板，用Oligo3-1和Oligo4进行PCR扩增。产生的PCR片段包含一个完整的BamHⅠ限制性酶切位点、PR-1前导序列、乳铁蛋白B和NotⅠ限制性酶切位点的一部分。在PCR反应中使用乳铁蛋白B模板，Oligo2-1(上面实施例3所述)和Oligo3作为引物。随后混合这两个PCR片段，在94℃下变性并在72℃下用Taq DNA聚合酶延伸5分钟。随后该反应用Oligo2-1和Oligo3-1进行PCR扩增10个循环。
将PCR片段克隆至PCRⅡ中。鉴定含插入片段的克隆，并对插入片段测序以确保未引入突变。分离出一个含插入片段并在前导序列中有一个突变(在第12个氨基酸GCC变成GAC)的质粒#10。在一次上述实验的重复实验中，分离出一个在乳铁蛋白B基因序列中有一个突变的质粒#11(第15个氨基酸GCC变成ACC)。这两个包含不同突变的质粒可用于产生正确的序列。BamHⅠ-NotⅠ插入片段被克隆至pBluescript作为BamHⅠ-NotⅠ插入片段。包含该突变的BstⅪ片段从包含#11插入片段的Bluescript质粒中切去，用相应的含#10插入片段的Bluescript质粒的BstⅪ片段来代替。将一个包含遍在蛋白质启动子(Toki等，植物生理100:1503)的2kb的HindⅢ-BamHⅠ片段克隆至该克隆的HindⅢ-BamHⅠ位点，将nos终止子连入NotⅠ-SacⅠ位点，生成的质粒称为p#10/11。
这个正确的质粒随后在PCR反应中作为模板，以Oligo 5和Oligo2-1作引物。Oligo5在乳铁蛋白B的第一个氨基酸的前面加上一个氨基酸，谷氨酰胺，从而在PR1前导序列和乳铁蛋白B序列的连接处产生了一个真正的前导序列切点。因此在植物细胞中去除PR1前导序列以期望产生带有N端增加一个谷氨酰胺的乳铁蛋白B。
将产生的PCR片段克隆至pCRⅡ并对克隆测序。将有正确序列(含有附加的谷氨酰胺)的BstⅪ-NotⅠ插入片段分离出来，随后克隆至用BstⅪ、NotⅠ酶解的质粒p#10/11以产生pCIB7707。从而将玉米PR1前导序列-乳铁蛋白B编码序列置于遍在蛋白质启动子和nos终止子(ubi-PR1-乳铁蛋白B-nos)的调控下。含有ubi-SynPAT-nos的DNA片段被克隆至该质粒的HindⅢ位点，从而生成含有SynPat和PR1-乳铁蛋白B基因盒的质粒pCIB7708。
该质粒用KpnⅠ和SacⅠ酶切以释放含有ubi-SynPAT-nos-ubi-PR1-lacto-nos基因融合的插入片段。该片段被克隆至用KpnⅠ、SacⅠ酶解的pCIB6848中生成pCIB7709。该质粒含有用于细菌中筛选的NPTⅡ(卡那霉素抗性)基因和用于植物中筛选的SynPAT基因，可用于以受玉米遍在蛋白质启动子调控的乳铁蛋白B基因转化植物。
包含ubi-lacto-nos基因盒的从pCIB7707分离的KpnⅠ-SacⅠ片段被克隆至质粒pCIB6848，生成pCIB7710。从而将ubi-lacto-nos基因构建于包含卡那霉素抗性基因的质粒中。实施例5：用于植物中乳铁蛋白B在体液泡内表达的基因的构建：
为了乳铁蛋白B的液泡表达，将用于液泡定向的一个序列加在上面实施例4描述的PR1前导序列-乳铁蛋白B基因盒的3’端(在植物乳铁蛋白B细胞外表达的合成基因的构建)。这个增加的18个碱基对序列编码一个C端Val-Phe-Ala-Glu-Ala-Ile液泡定向序列(Dombrowski等，植物细胞5,587-596,1913)，其后是一个终止密码子。另外，为方便克隆，在合成基因的5’和3’端引入限制酶末端。
本合成基因的构建使用了两个寡核苷酸。上面实施例4已描述了Oligo3-1的序列。Oligo6的序列包括乳铁蛋白B编码序列3’端的互补链、液泡定向序列的密码子、终止密码子和NotⅠ限制酶切位点。其序列如下：
Oligo6(SEQ ID NO:15):
5′-AGTAGCGGCCGC-TTA-GATGGCCTCGGCGAACAC-GAAGGCCCTGCGCACGCA-3′
如实施例4所述，Oligo3-1和Oligo6用于在质粒pCIB7707中PR1前导序列-乳铁蛋白B基因构件的PCR扩增。PCR片段克隆至pCRⅡ，并选择带有插入片段序列的克隆。将插入序列测序，带有正确序列的克隆用于切割BamHⅠ-NotⅠ片段。该片段被克隆入Bluescript中，包含遍在蛋白质启动子的一个2kb HindⅢ-BamⅠ片段(Toki等，植物生理100:1503)被克隆至该克隆的HindⅢ-BanHⅠ位点，并在NotⅠ-SacⅠ位点连上nos终止子。如是生成质粒pCIB7712。从而将玉米PR1前导序列-乳铁蛋白B-液泡定向序列置于遍在蛋白质启动子和nos终止子(ubi-PR1-lactoB-vac-nos)的调控下。包含ubi-SynPAT-nos的DNA片段连入该质粒的HindⅢ位点，生成质粒pCIB7713。
PCIB7713用KpnⅠ和SacⅠ酶切释放含ubi-SynPAT-nos-ubi-PR1-lacto-vac-nos基因融合的插入片段。该片段克隆至KpnⅠ、SacⅠ酶解的pCIB6848而生成pCIB7714。该质粒包括用于细菌中筛选的NPTⅡ(卡那霉素抗性)基因和用于植物中筛选的SynPAT基因，并用于以玉米遍在蛋白质启动子调控下的乳铁蛋白B基因转化植物。
将从pCIB7712上分离的含ubi-lacto-nos盒的KpnⅠ-SacⅠ片段克隆至质粒pCIB6848，生成pCIB771015。从而将ubi-lacto-nos基因构件置于含卡那霉素抗性基因的质粒中。实施例6：用于在植物中乳铁蛋白B的质体内表达的基因的构建
为使乳铁蛋白B在质体中表达，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(ssu)基因的叶绿体定向序列被克隆并置于乳铁蛋白B基因序列的5’端。该转运肽序列指导小亚基蛋白定向至叶绿体，在那儿转运肽序列被切除，释放成熟蛋白。设计的转运肽-乳铁蛋白B基因构件包含(5’到3’)一个BamHⅠ限制性酶切位点、一个Kozak共有序列(包括甲硫氨酸启始密码子)、融入乳铁蛋白B编码序列的叶绿体定向序列、一个终止密码子和一个NotⅠ限制性酶切位点。乳铁蛋白B基因构件是由来自拟南芥(Arabidopsis)(ats 1A；Wong等，植物分子生物学20,81-93,1992)和来自玉米(Matsuoka等，生物化学杂志102,673-676,1987)的ssu基因构建的。这些ssu基因的转运肽的编码序列(Wong等，植物分子生物学20,81-93,1992)是从基因组DNA、cDNA或cDNA基因文库中利用PCR扩增而克隆的。根据Wong等(植物分子生物学20,81-93,1992)的设计，用来自拟南芥和玉米的ssu基因构建了三个转运肽序列(TP1、TP2和TP3)。这样，TP1只包含转运肽编码序列(长至酶切位点)，而TP2和TP3包含转运肽的全序列以及成熟ssu蛋白的部分编码序列，并具有双酶切位点。TP2在双酶切位点外还有2个附加氨基酸密码子。TP3正好在双酶切位点上终止。a．拟南芥叶绿体定向序列-乳铁蛋白B基因构件
第一个转运肽序列用寡核苷酸ATP-5’和ATP1-3’扩增来克隆。这些寡核苷酸序列如下：
ATP-5′(SEQ ID NO:16):
5′AGTAGGATCCACCATGGCTTCCTCTATGCTC-3′
ATP1-3′(SEQ ID NO:17):
5′GCAGTTAACTCTTCCGCCGTT-3′ATP-5’寡核苷酸包括有利于克隆的BamHⅠ限制性酶切位点、一个起始密码子5’端的Kozak共有序列和ats1A基因编码序列的前18个核苷酸。用基因组DNA作为模板。扩增产物克隆至pCR-Script(SK+)并对克隆测序以证明插入序列包含165个碱基对的ats1A转运肽编码序列，从+1延伸到+165bp。一个具有正确序列的克隆称为pATP1。
转运肽序列与乳铁蛋白B的融合是使用4个引物通过PCR来实现的：ATP-LF5’(SEQ ID NO:18):5′GTAGGATCCACCATGGCT-3′从ATP1扩增产物的5’端开始；ATP-LF3’：与上述实施例3中描述的Oligo2-1相同；2个桥连引物跨接ats1A/乳铁蛋白B融合子并且含有ATP13’端的18个核苷酸，其后伴随着乳铁蛋白B编码序列5’端的18个核苷酸。5’桥连引物的序列是：ATP1-LFB5’(SEQ ID NO:19):5′-GGCGGAAGAGTTAACTGCTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′3’桥连引物序列(5’桥连引物序列的互补链)是：ATP1-LFB3’(SEQ ID NO:20):5′-CCAGCGGCGGCACTTGAAGCAGTTAACTCTTCCGCC-3′
对于每一个转运融合子构件，需要进行两次扩增。第一次扩增包括两组反应。反应1产生特定的带有短乳铁蛋白B序列延伸的ATP1 PCR片段。该反应包括引物ATP-LF5’,ATP1-LFB3’和质粒pATP1DNA。反应2产生带有短5’ATP1序列的乳铁蛋白B的PCR片段。该反应包括以克隆的乳铁蛋白B为模板的引物ATP-LF3’或ATP1-LFB5’。第二次扩增将反应1和2的产物等体积混合，在94℃下变性1分钟，在Taq DNA聚合酶和核苷酸存在下72℃退火5分钟，形成“全长”模板。随后加入引物ATP-LF5’、ATP-LF3’进行PCR扩增，从而产生ATP1-乳铁蛋白B的基因融合子。PCR产物被克隆至PCRⅡ载体上。
分离克隆并测序。具有正确序列的质粒用BamHⅠ和NotⅠ酶解并将插入片段克隆至经BamHⅠ、NotⅠ预酶解的Bluescript中。一个含有遍在蛋白质启动子的2kb HindⅢ-BamHⅠ片段(Toki等，植物生理100:1503)被克隆至该克隆的HindⅢ-BamHⅠ位点，并在NotⅠ-SacⅠ位点连上nos终止子。生成的质粒在乳铁蛋白B编码序列上游含有ATP1叶绿体定向序列。该基因构件位于遍在蛋白质启动子和nos终止子之间。
含有ubi-SynPAT-nos基因构件的DNA片段被克隆至这些质粒的HindⅢ位点，产生pCIB 7721。生成的质粒用KpnⅠ和SacⅠ酶切以释放出含有ubi-SynPAT-nos-ubi-ATP1/2/3-lacto-nos基因融合子的插入片段。将这些片段克隆至经KpnⅠ、SacⅠ酶切的pCIB6848中，形成pCIB7722。该质粒含有用于细菌中筛选的NPTⅡ(卡那霉素抗性)基因和用于植物中筛选的SynPAT基因，且可用于以玉米遍在蛋白质启动子调控下的乳铁蛋白B基因转化植物。
将来自pCIB7720的含有ubi-ATP1-lacto-nos基因融合子的KpnⅠ-SacⅠ片段克隆至质粒pCIB6848，形成pCIB7723。从而将ubi-ATP1-lacto-nos基因融合子置于含卡那霉素抗性基因的质粒中。
以与ATP1相似的方式，用寡核苷酸ATP-5’和ATP2-3’，利用基因组DNA或Oligo dT作引物，反转录的RNA为模板将第二个转运肽编码序列ATP2克隆。OligoATP2-3’序列(SEQ ID NO:21):5′-CTGCATGCAGTTGACGCGACCACCGGAATCGGTAAGGTCAGG-3′
克隆PCR产物，带有插入片段的克隆经测序以证实其含有从+1到+261bp的ats 1A转运肽编码序列的261bp。一个具有正确序列的克隆被称为质粒pATP2。
第三个转运肽编码序列ATP3以与ATP2相似的方法克隆，使用寡核苷酸ATP-5’和ATP3-3’。OligoATP3-3’序列(SEQ ID NO:22):
5′-GCAGTTGACGCGACCACCGGAATCGGTAAGGTCAGG-3′
克隆PCR产物，具有正确序列的克隆称为pATP3，它含有从+1到+255的ats1A转运肽编码序列的225bp。
这些转运肽序列如上面ATP1所述，都与乳铁蛋白B基因序列融合。
5’桥连引物组的序列是：
    ATP2-LFB5′(SEQ ID NO:23):
    5′-CGCGTCAACTGCATGCAGTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′
    ATP3-LFB5′(SEQ ID NO:24):
    5′-GGTGGTCGCGTCAACTGCTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′3’桥连引物组的序列(5’桥连引物的互补链)是：
    ATP2-LFB3′(SEQ ID NO:25):
    5′-CCAGCGGCGGCACTTGAACTGCATGCAGTTGACGCG-3′
    ATP3-LFB 3’(SEQ ID NO:26):
    5′-CCAGCGGCGGCACTTGAAGCAGTTGACGCGACCACC-3′
产生的PCR融合产物被克隆。具有正确序列的克隆含有ATP2-乳铁蛋白B和ATP3-乳铁蛋白B基因融合子。这些片段被克隆至Bluescript，并如上述加入遍在蛋白质启动子和nos终止子形成pCIB7730和pCIB7740。ATP1/2/3-乳铁蛋白B基因构件位于遍在蛋白质启动子和nos终止子之间。根据上述pCIB7740的方法，产生了具有遍在蛋白质-SynPat-nos片段新构件的质粒pCIB7731和pCIB7741。b．玉米叶绿体定向序列-乳铁蛋白B基因构件：
以与产生拟南芥ssu转运肽-乳铁蛋白B基因构件相同的方式，利用玉米ssu基因的转运肽序列合成了另外的转运肽-乳铁蛋白B融合构件(Matsuoka等，生物化学杂志102,673-676,1987)。唯一的区别在于形成转运肽和寡核苷酸序列所用的模板DNA的来源不同。
用于玉米ssu转运肽序列PCR扩增的模板DNA是玉米基因组DNA,cDNA或cDNA文库。寡核苷酸序列(5’到3’)如下：MTP-5′(SEQ ID NO:27):5′-AGTAGGATCCACCATGGCGCCCACCGTGATG-3′MTP1-3′(SEQ ID NO:28):5′-GCACCGGATTCTTCCGCCGTT-3′MTP2-3′(SEQ ID NO:29):5′-CTGCATGCACCGTATGCGACCACCGTCCGTCGACAGCGGCGG-3′MTP3-3′(SEQ ID NO:30):5′-GCACCGTATGCGACCACCGTCCGTCGACAGCGGCGG-3′MTP-LF5′(SEQ ID NO:31):5′-GTAGGATCCACCATGGCG-3′MTP-LF3′(SEQ ID NO:32):5′-GCGGCCGCTTAGAAGGC-3′MTP1-LFB5′(SEQ ID NO:33):5′-GGCGGAAGAATCCGGTGCTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′MTP2-LFB5′(SEQ ID NO:34):5′-CGCATACGGTGCATGCAGTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′MTP3-LFB5′(SEQ ID NO:35):5′-GGTGGTCGCATACGGTGCTTCAAGTGCCGCCGCTGG-3′MTF1-LFB3′(SEQ ID NO:36):5′-CCAGCGGCGGCACTTGAAGCACCGGATTCTTCCGCC-3′MTF2-LFB3′(SEQ ID NO:37):5′-CCAGCGGCGGCACTTGAACTGCATGCACCGTATGCG-3′MTF3-LFB3′(SEQ ID NO:38):5′-CCAGCGGCGGCACTTGAAGCACCGTATGCGACCACC-3′
形成的质粒含有与乳铁蛋白B编码序列融合的玉米转运肽序列(MTP1,2和3)。实施例7：在玉米原生质体中乳铁蛋白B基因的表达
已知允许瞬时表达的原生质体用于包含乳铁蛋白B的质粒的瞬时表达。如Shillitto等(美国专利5,350,689：玉米植物和自原生质体或原生质体衍生的细胞再生的玉米植物(Zea mays plants and transgenicZea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast derivedcells).1989)所述，从悬浮培养的细胞中分离原生质体，并以20×106/毫升的浓度，再悬浮于0.5M甘露醇/15mM MgCl2溶液中。用于转化的质粒DNA是：pUbi-bar，含有遍在蛋白质启动子、第一外显子和内含子，bar基因和nos终止子；pUbi-GUS，包括遍在蛋白质启动子、第一外显子和内含子、GUS基因和nos终止子；以及pCIB7703。
质粒DNA用聚乙二醇(PEG)沉降法导入原生质体(Kramer等，Planta 190,454-458,1993)，方法如下：在45℃水浴中轻轻摇动试管使原生质体热激4分钟。将含1000万个原生质体的500微升等分样品移至无菌管中，随后向每管加入：25-50μg每种质粒和450微升40％PEG。PEG的制备是将PEG8000(Sigma Chemical Co.StLouis,MO)溶于0.4M甘露醇和0.1M Ca(NO3)2·4H2O的中，pH调至8.0。试管放置20分钟，偶尔轻轻晃动，每隔5分钟用1ml、2ml、5ml的W6溶液稀释(5mM KCl,61mM CaCl2·H2O,154mMNaCl,51mM葡萄糖，0.1％2-(N-吗啉代)乙基磺酸，pH6.0)。最后稀释后，原生质体在60-100g离心10分钟，倒去大部分上清液，仅在原生质体上留大约0.5ml的液体。轻轻振荡使原生质体重新悬浮于残留液体中。DNA导入后，原生质体以2百万/ml浓度重新悬浮于FW培养基中，并在暗处室温培养18小时，以分析RNA和蛋白质表达。
根据生产商的说明(Tropix)，从所有转化体的等分样品中制备蛋白质提取物，随后进行GUS活性测定。结果显示，用pCIB7703和ubi-GUS联合转化的细胞具有很高的GUS活性(10×106数目/分钟/1×106原生质体)，其活性与用ubi-bar和ubi-GUS转化的细胞的GUS活性(10×106数目/分钟/1×106原生质体)相当。这显示乳铁蛋白B基因构件的表达对在瞬时表达细胞内GUS基因的表达没有影响，就是说无明显细胞毒性。以ubi-bar和pICB7703转化的细胞仅显示本底水平的GUS活性(5000数目/分钟/1×106原生质体)。
制备RNA样品用于反转录-PCR(RT-PCR)分析，以评价乳铁蛋白B mRNA的存在。为了达到这个目的，从转染原生质体上分离出总RNA和poly(A)RNA。使用商品试剂盒(Stratagene)并根据每个厂商的说明进行RT-PCR。为检测ubi-乳铁蛋白B-nos cDNA，使用与nos终止子聚腺苷酸化信号和遍在蛋白质启动子中第一个外显子的5’侧序列互补的PCR引物。因为在这个外显子和乳铁蛋白B编码序列/nos终止子之间的pCIB7703构件上有一内含子，所以产生的PCR条带根据其大小可证明是来自RNA。
对于RT-PCR反应，根据厂商说明，1μl总RNA在50μl反应体积中进行反转录。其中1μl用于PCR扩增，利用引物176(SEQ IDNO:39:5’-TTCCCCAACCTCGTGTTGTTC-3’)和179(SEQ ID NO:40:5’-CCAAATGTTTGAACGATCGCG-3’)，或引物177(SEQ ID NO:41:5’-CACAACCAGATCTCCCCCAAA-3’)和180(SEQ ID NO:42:5’-AAATTCGCGGCCGCTTAGAAG-3’)。反应条件为：94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟，共43个循环。样品在琼脂糖凝胶上按大小进行分离。引物176和179产生了大约220个碱基对的PCR片段，与设想采用来自于由质粒PCIB7703转化的细胞的cDNA为模板DNA的结果一致。一条来自质粒的PCR条带长1.3Kb。
为了Northern分析，RNA样品在琼脂糖凝胶上按大小分离，并转印到尼龙膜上。然后，印迹与含乳铁蛋白B基因构件序列的放射性探针杂交。
用于免疫印迹的蛋白质提取物通过在合适的缓冲液中制作原生质体悬浮液来制备。悬液微离心5分钟，将上清液和蛋白质颗粒悬于Laemmli样品缓冲液中，进行Laemmli SDS凝胶电泳。因为连接乳铁蛋白B肽和蛋白质的二硫键可能会带来问题，所以在电泳前需要用DTT或2-ME来还原，然后用碘乙酰胺封闭抑制提取物中蛋白质的SH基。电泳过的凝胶电转移到硝酸纤维素膜上，用一种抗乳铁蛋白B抗血清进行Western分析。
用于质谱分析的蛋白提取物的制备是通过剧烈晃动缓冲液中的原生质体悬液，微离心10分钟，两次，每次收集上清液。适当稀释后，使用分析肽的标准流程，用MALDI-MS(Voyager,PerceptiveBiosystems)分析。如果样品需进一步纯化，提取物可在C18柱中分步分离。用MALDI-MS分析分离物中是否存在乳铁蛋白B肽。
蛋白提取物同样可制备用于抗真菌活性的评价。在这种情况下，原生质体在pH7.5、含1.5％的PVPP、5mM DTT和10μM AEBSF(盐酸4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟)的20mM Tris缓冲液中匀浆。如上述实施例1所述的方法，以体外抑制真菌法测定提取物的抗真菌活性。
包含其它乳铁蛋白B基因的基因构件的瞬时表达分析使用本实施例中描述的方法进行。实施例8：植物转化、筛选和再生a．对质粒和选择性标记的描述
乳铁蛋白B基因构件是在遍在蛋白质启动子和nos终止子的调控之下。对于玉米的转化，选择性标记被克隆至含有合成phosphinothricin乙酰转移酶基因(命名为SynPAT)的质粒中，并受玉米遍在蛋白质启动子和nos终止子(ubi-SynPAT-nos)的调控。SynPAT是一株链霉菌(Thompson等，EMBO 6:2519-2523,1987)bar基因的人工合成版本，已被优化用于在植物体内表达(美国专利5,276,208:Phosphinothricin抗性基因及其应用(Phosphinothricin-resistance geneand its use))。含ubi-SynPAT-nos盒(pUBIAc)的质粒来自德国法兰克福的Hoechst Aktiengesellschaft。包含ubi-乳铁蛋白B-nos和ubi-SynPAT-nos基因盒的质粒用于转化玉米。SynPAT基因盒的存在允许使用除草剂BASTA来筛选转化植物。
为转化小麦，含ubi-lacto-nos基因盒的质粒和含有bar选择性标记基因并受遍在蛋白质启动子和nos终止子调控的一个质粒(pUBA或pUBA/kan)进行共轰击(cobombarded)(Toki等，1992，植物生理100:1503-1506)。bar基因盒的存在允许使用除草剂BASTA来筛选转化植物。pUBA质粒含有ubi-bar-nos和氨苄青霉素抗性基因用于在大肠杆菌中的筛选。pUBA/kan含有一个卡那霉素抗性基因而不是氨苄青霉素抗性基因以用于在大肠杆菌中筛选。
从大肠杆菌中分离到潮霉素基因(Gritz和Davis，基因25,179-188,1983)，在其末端连上BglⅡ接头，随后将该片段克隆至载体pCIB710的BamHⅠ位点形成pCIB712。两个寡核苷酸(5’-AGTAGGATCCATGAAAAAGCCTGAACTC-3’(SEQ ID NO:43)和5’-TACTGGATCCCTATTCCTTTGCCCTC-3’(SEQID NO:44)用于来自pCIB712基因的PCR扩增。PCR片段用BamHⅠ酶解并克隆至pPEH3的BamHⅠ位点。含有插入序列的克隆被测序，具有正确序列和正确方向的基因称为pCIB7613。该质粒含有在遍在蛋白质启动子和nos终止子的调控下的潮霉素抗性基因。随后用该质粒轰击植物，转化植物以潮霉素为筛选剂来筛选。
乙酰羟酸合酶(AHAS)基因克隆自一个由磺酰脲(Beacon)抗性玉米组织衍生的Lambda-Zap基因组文库，用作拟南芥基因探针(K.Sathasivarn等，核酸研究18,2188)。利用PCR扩增，使用带有适当单碱基改变的寡核苷酸，在该基因1862位点引入了一个G到A的转换。该核苷酸的改变导致了丝氨酸变为天冬酰胺。将该基因克隆至一个载体上而形成质粒pCIB4247。在pCIB4247中用两个对于玉米AHAS基因的起始和终止有特异性的寡核苷酸(5’-TATCTCTCTCTATAAGGATCCATGGTCACC-3’(SEQ IDNO:45)和(5’-TACTGGATCCTCAGTACACAGTCCTGCC-3’(SEQ ID NO:46))进行PCR扩增，形成的片段克隆至pCRⅡ。插入序列被测序以保证未发生突变，含正确插入序列的质粒用于分离具有AHAS序列的BamHⅠ片段。该片段被克隆至pPEH3的BamHⅠ位点，形成pCIB7612。该质粒包含一个在玉米遍在蛋白质启动子和nos终止子调控下的突变的玉米AHAS基因。该基因转化入植物后赋予imidazolinone(灭草喹/Scepter)抗性。
从拟南芥和玉米中分离到原卟啉原氧化酶(protox)的cDNA，并从拟南芥中分离到protox基因启动子。来自拟南芥和玉米的protoxcDNA通过与一株protox缺陷的大肠杆菌互补而被克隆。筛选突变的拟南芥和玉米protox基因以增强对抑制protox的除草剂的抗性。该抗除草剂的拟南芥protox cDNA被克隆至一质粒上的双35S启动子和tml终止子之间。
以拟南芥protox cDNA 5’端的片段作探针，从基因组文库中分离出拟南芥protox启动子。含有该启动子的质粒用NcoⅠ和BamHⅠ酶解，使启动子与载体相连，但除去其下游序列。将含抗除草剂的protoxcDNA和tml终止子的NcoⅠ-BamHⅠ片段克隆到该质粒。这样就形成了一个质粒，它含有拟南芥protox启动子的约600个核苷酸、抗除草剂的Arab protox基因的编码序列和tml终止子。用该质粒转化的植物可在含该除草剂的培养基上筛选。b．将乳铁蛋白B基因构件转化入玉米
用于玉米转化的方法已由Koziel等描述(生物工程11,194-200,1993)，该法使用微粒轰击进入未成熟胚细胞内。将玉米近交系CGA00526的未成熟胚在受粉后大约10天无菌分离，并盾片侧朝上放置到改进的杜氏(Duncans)“D”培养基上(Duncan等，Planta165,322-332,1985)。此培养基中补充了灭草平(5mg/l)代替麦草畏。大约2周后，从胚中分离出愈伤组织，并放到以2,4-二氯苯氧乙酸(5mg/l)代替灭草平的培养基上，随后以10-14天的间隔传代培养。在转化前4-6小时，将1-4个月龄的愈伤组织移入含12％的蔗糖为渗压剂的新鲜培养液中。
将质粒DNA或分离的片段DNA根据DuPont Biolistic手册所述沉淀至金粒上。每个组织板用DuPont Biolistics氦设备轰击2次。使用600-1100psi的断裂压和80-100μm标准筛。轰击后，组织于黑暗中放置12-24小时。随后，将组织转移回到改进的杜氏“D”培养基中，并在暗处培养，培养基中添加了最低浓度为20mg/l的选择剂BASTA。除了完全去掉谷氨酰胺和天冬酰胺外，将改进的杜氏“D”培养基的氨基酸添加物换成改进的克氏(Koa’s)氨基酸添加物(K.W.Kao和M.R.Michayluk,Planta 126,105-110,1975)。以不少于14天的间隔转移一次，共69-80天，将组织转入含最低浓度20mg/l的BASTA的新鲜培养基中。在传代培养期间将非胚胎愈伤组织除去。
经过黑暗中的筛选期之后，将组织移入以MS为基础的培养基中(Murashige和Skoog，植物生理(Physiol Plant)15,473-439,1962)，此培养基含有以下激素来诱导萌芽和体细胞胚的发育：ancimidol(0.25mg/L)，激动素(0.5mg/L)，萘乙酸(napthaline aceticacid)(1mg/L)，BASTA(最低浓度5mg/l)。将组织以16小时光照方式在该培养基中培养10-14天，然后在以MS为基础的培养基中传代培养，该培养基中含BASTA(3mg/l)但无植物激素以使胚发育。胚发育后，转入3/4强度的MS培养基中使根发育。将生根的植物转入土壤，并在温室中生长。C．将乳铁蛋白B基因构件转化入小麦：
使用粒子轰击法转化未成熟胚和由未成熟胚衍生的愈伤组织已由Vasil等(生物工程11:1553-1558,1993)和Weeks等(植物生理102:1077-1084,1993)描述。将春或冬小麦的未成熟胚在授粉后2周左右无菌分离，并在以MS为基础的培养基(Muroshige和Skoog,1962Physiol.Plant 15:473-439)盾片侧向上培养，培养基中加入2,4-D(二氯苯氧乙酸)、谷氨酰胺和天冬酰胺诱导愈伤组织6-10天。在转化前4-6小时，以胚胎发生反应筛选胚胎并移入含15％麦芽糖为渗压剂的新鲜培养基中。用于转化的构件包括含ubi-bar-nos盒(pUBA或pUBA/Kan)的质粒，可用BASTA对转化组织进行筛选。另外还可以使用赋予其它除草剂(例如：磺酰脲类，imidazolinone)或抗生素(例如：潮霉素)抗性的基因构件。此构件与上述实施例2-6所描述的一个含有乳铁蛋白B基因的构件共转化，这些构件包括pCIB7706、pCIB7710、pCIB7715、pCIB7723、pCIB7733和pCIB7743。质粒DNA按照DuPont Biolistic手册所述沉降至金粒上。将每个胚胎板用DuPont PDS 1000氦装置来轰击，裂解压1100psi，采用80目标准筛。24小时后，将胚胎从渗压剂中移出并放回到诱导培养基中。大约一个月后，具有发育的胚胎发生的愈伤组织的胚胎外植体转至含1mg/lBASTA的再生培养基中(MS+1mg/l萘乙酸和5mg/l赤霉素)培养2周，然后转至无激素的含3mg/l BASTA的再生培养基中培养2-6周，直至形成幼芽。带有幼芽的胚胎转至1/2强度，含0.5mg/l NAA和3mg/l BASTA的MS培养基上直至根发育，此时，将幼苗转至土中并长成成株。收获植物组织用于分析(如实施例10所述)且植物自交以产生自交种子。d．将乳铁蛋白B基因构件转化入甜菜
如Hall等自然生物工程(Nature Biotechnolosy).Vol.4,1133-1138,1996所述，将保卫细胞从甜菜叶片无叶脉处分离。叶片用搅拌器(23000转/分，60秒)在50ml Ficoll介质(100g/L Ficoll,735mg/LCaCl2·2H2O和1g/l PVP40)中于冰浴中匀浆。随后用于尼龙筛(300μm)过滤，用500ml冷水冲洗匀浆物并转至含3.8％(w/v)CaCl2·2H2O的10ml CPW9M中。叶表皮用离心法回收，并用细胞壁降解酶(0.5％纤维素酶和3％离析酶，Yakult Honsha，日本)降解16小时，产生单个细胞。用55μm筛过滤后，悬浮液与等体积的含15％蔗糖的Percoll混合。在试管内，在原生质体悬浮液上加入1mlCPW15S，再加入0.5ml 9％麦芽糖/1mM CaCl2。在55g旋转10分钟后，从上层液收集保卫细胞并以同样方式再分离一次。
将保卫细胞重新悬浮于0.75ml 9％麦芽糖/1mM CaCl2(麦芽糖溶液)中，加入DNA(50微克每一百万个细胞)，随后加入0.75ml 40％PEG6000。室温条件下30分钟后，每5分钟加入2ml等分F培养基，共加样4等分。用麦芽糖溶液冲洗原生质体，然后用藻酸钙包埋。将原生质体在改进的K8P培养基中培养，1周后以200μg/L的双丙氨酰膦筛选。11天后，小型藻酸盐部分包埋于琼脂糖中，培养在含250μg双丙氨酰膦/L的PG1B培养基中。形成的愈伤组织转移到含双丙氨酰膦的新鲜培养基平板上培养两周。然后，在25℃，以光照/无光(16小时/8小时)条件下，不加选择地培养。每2周进行一次传代培养，4周后小植物再生。将小植物生根并栽到土壤中。实施例9：表达乳铁蛋白B的转基因植物的分析
通过筛选过程(实施例8)而存活的经转化的植物组织用于分析乳铁蛋白B基因构件(PCR)、该转基因衍生的RNA(Northern印迹杂交法，RT-PCR)和该转基因衍生的蛋白质(Western)。a．PCR分析：
根据试剂盒说明，用IsoQuick核酸提取盒(ORCA研究公司)从转化的植物组织中提取DNA。根据标准流程进行PCR分析。用于乳铁蛋白B基因构件扩增的引物是根据已知转基因构件的序列而设计的。b．Northern分析：
用Northern印迹杂交法分析转化的植物中RNA的存在。对于Northern印迹分析，从叶组织中提取RNA。将冰冻的组织研磨后，加入提取缓冲液(0.1M LiCl,100mM Tris pH8,10mM EDTA,1％SDS)，随后加入等体积的水饱和的苯酚和氯仿。RNA用乙酸钠/乙醇从水相中沉淀，并在含甲醛的琼脂糖凝胶上按大小进行分离。凝胶印迹到GeneScreen Plus尼龙膜上，将此膜与乳铁蛋白B基因衍生的探针杂交。杂交过夜后，在高度严格条件(65℃)下冲洗印迹，并在X-射线胶片上曝光。c．RT-PCT分析
RNA样本如上述实施例7所述，同样用RT-PCT分析乳铁蛋BRNA的存在。d．Western分析
测定转化植物中乳铁蛋白B或该转基因编码的乳铁蛋白B衍生的蛋白质。对于Western分析，将新鲜叶片在液氮中迅速冷冻并研磨成细粉。然后样品在-20℃下在丙酮中用冷的10％三氯乙酸处理1小时，离心，用冷丙酮冲洗，晾干。干样品用0.05M硫酸(3ml/g鲜重)在冰上温育1小时。提取液用0.01N氢氧化钠中和并晾干。根据生产商的说明，样品在10-20％Tricine SDS凝胶上(Novex)上电泳。在湿孔内以200mA的恒定电流转移3小时，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用丽春红染色，以观察膜结合蛋白质。
转移到硝酸纤维素膜上的蛋白质用免疫亲合纯化的山羊抗乳铁蛋白B抗体进行检测，随后用第二级碱性磷酸酶联三体抗体检测。加入硝基四唑蓝/溴-氯-碘磷酸底物溶液后检测抗乳铁蛋白B反应条带。e．质谱分析
从转化植物制备的蛋白质提取物，如上述实施例7所述，也用MALDI-MS分析了乳铁蛋白B肽的存在。f．乳铁蛋白B转基因植物提取物的抗菌活性的评价：
从乳铁蛋白B转基因植物中通过在pH7.5，含10％PVPP,5mMDTT和10mM AEBSF(盐酸4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟)的20mM Tris缓冲液中的组织匀浆来制备。蛋白提取物用已建立的方法如硫酸铵沉淀、HPLC层析和使用抗乳铁蛋白B抗血清免疫纯化法来进一步纯化。在每个提取物中确定蛋白质浓度，等分样品用于抗真菌测定。
上述实施例1描述的三种测定都用于评价在粗蛋白提取物和部分纯化蛋白提取物中的抗菌活性。用于测定抗菌活性的微生物包括实施例1所列的微生物，以及其它玉米和小麦重要的真菌病原体以及乳铁蛋白B敏感的细菌实验室株系，例如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(W.Bellamy等，应用细菌学杂志(J.Appl.Bacteriol)73,472-479,1992).实施例10：乳铁蛋白B转基因植物抗病性提高的检测a．转基因玉米类植物的测定1．南方玉米叶枯病(SCLB)测定
SCLB由Bipolaris maydis引起，以前叫异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)和玉米长蠕孢(Helminthospcium maydis)。B.maydis在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上培养，不断地在近紫外光照射下诱导产孢。在1％Tween-20中用玻璃棒轻轻刮平板来收获孢子。收集孢子溶液，用无菌双蒸水将孢子浓度调至500-1000个孢子/ml。转基因植物和野生型对照植物生长于温室中至3-5周龄。使用气雾剂喷雾器向顶端充分伸展的3片叶的每一片上喷洒孢子悬浮液细雾。随后，将植物置于一个封闭高温的培养箱中培养过夜(16-20小时)。将植物从保温箱中移至生长箱内，接种大约1周后，计数形成的病斑，并测量10-15个代表性病斑的大小以比较对照植物和转基因植物。接种后14天内，每隔3-4天，同样也用肉眼观察植物病害发展情况。
来自T1系B10表达甲硫氨酸-乳铁蛋白B mRNA的植物表现出抗病性增强，因为其病害症状弱于转基因对照和野生型对照植物的病害症状。2．炭疽叶枯病
禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)是炭疽叶枯病的病原菌，可引起被侵染的叶子坏死。为进行病害测定，从类似上述B.maydis的产孢琼脂平板上收集孢子。3-5周龄植物的叶片喷上孢子悬浮液，孢子浓度大约为106孢子/ml。与用B.maydis侵染植物类似，接种植物在保温箱内培养过夜后移入生长箱。2周内，每隔3-4天测定叶片坏死面积的百分率，并与转基因和非转基因植物对照比较。3．玉米圆斑病(Carbonum leaf spot)测定：
炭色长蠕孢(Helminthosporium carbonum)是玉米圆斑病的病原菌。为测定病害，如B.maydis的方法所述，从产孢培养基上收集孢子。以浓度为2.5-10×104的孢子悬浮液对3-5周龄的玉米叶片喷雾，植物在保温箱中培养过夜。随后，植物在生长箱中生长约14天。如炭疽叶枯病中的描述，随后发生病害。
表达Met-乳铁蛋白B RNA的T1系B10b植物显示出抗病性增强。与转基因对照和野生型对照相比，在表达植物中圆斑病菌接种后的病症减轻。4．镰孢霉根病的测定：
串珠镰孢(Fusarium moniliforme)在玉米耳叶引起镰孢霉耳霉病。如B.maydis的方法所述，在PDA平板上培养串珠镰孢并收集孢子。将打孔的滤纸折叠，置于小袋中，把表面消毒的玉米种子置于折叠的滤纸中，根从打孔处伸出至袋底。在袋底中装12ml串珠镰孢孢子悬浮液。于25-30℃的生长箱中培养。7-14天后，测定由于真菌侵染而导致的根生长的抑制和根坏死，并比较转基因植物和非转基因对照植物。5．腐霉菌根病测定：
瓜果腐霉(Pythium aphinadermatum)是玉米茎腐和根腐的病原之一。为测定病害，与镰刀菌测定类似，采用小袋的方式。用游动孢子或菌丝体制备接种物。为了形成游动孢子，菌丝体与高羊茅(fescue)草的叶片接触，在连续荧光灯下培养，收集形成的游动孢子。另外一种方法，从腐霉PDA培养基上取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖培养基上，培养2-3周。从培养基上收集菌丝并用搅拌器在无菌双蒸水中将其打散。
如上所述，玉米种子置于滤纸折叠处，接种物(游动孢子或分散的菌丝，以适当的浓度)加入袋底。如镰刀菌所述，培养1-2周后，测定根长和根坏死情况，并比较转基因和非转基因对照植物。6．斯氏细菌枯萎病：
斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)引起玉米斯氏枯萎病。为测定病害，细菌在营养培养基中生长至高密度，并稀释至大约107个细菌/ml。以蘸有细菌悬浮液的针刺入玉米叶片使玉米叶片被侵染。接种后第1、2和3周测病斑。7．叶盘测定：
上述整株植物病害的测定都可用放在湿培养皿中的叶盘来测定。b．转基因小麦类植物的测定：1．假单胞菌病害的测定：
丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.SyringaeVan Hall)引起小麦细菌叶枯病。为测定病害，记录可见病害症状，细菌(菌株BL882)在L-肉汤琼脂平板上培养过夜。用牙签从平板上刮取一小条细胞，再悬浮于10mM MgCl2溶液中。测定在600nm处悬浮液的吸收值以确定悬浮液中细菌的浓度。经测定每0.1的OD600值相当于1×108 cfu/ml。培养物稀释至1×107细菌/ml，吸取少量于1ml塑料巴斯德吸管中。约50μl细菌注入3周龄的小麦叶片中。接种面积轻轻用黑记号笔(felt-tip)作标记。植物置于塑料盒中，其内部湿度由普通花园喷壶浇大量水来调节。盒子紧闭并置于18-20℃Percival箱中，每天光照16小时。5天后，通过计算接种区域内产生的边缘有一薄层褪绿的深色死斑的病斑面积百分率评价病害严重度。
为了更精确地定量病害发生的程度，叶子用1×105 cfu/ml的BL882菌株浸润来对称地接种，该菌株含有一个带有卡那霉素抗性基因的质粒。在浸润当天和随后几天，测定注射的感染区的细菌滴度。测定方法：合并来自在覆盖1cm空间的叶片浸润区打孔的叶子，在10mMMgCl2中研磨，提取物的稀释液涂于加入50μl/ml卡那霉素的LB平板上(BL882分离物已用卡那霉素抗性基因转化)。培养3天后，来自叶片的单个细菌生长形成易于计数的菌落。以这种方式，可以定量测定在转化植物中细菌的生长率，并与对照非转化植物比较。2．小麦颍枯壳针孢的测定：
小麦颍枯壳针孢(Septoria nodorum)引起小麦叶片的叶斑病和小麦叶耳的颍斑病。为测定病害，从产孢平板或液体培养基上收集孢子，并以适当的浓度喷到2周龄植物的叶片上。接种的植物置于高温度雾箱中2-3天，随后移入生长箱。随后3周内测定叶片病害面积的百分率并注意分生孢子器是否存在。3．小麦壳针孢的测定：
小麦壳针孢(Septoria tritici)引起小麦叶斑病。为测定病害，从产孢平板或液体培养基上分离孢子，以适当的浓度喷于1-2周龄小麦类植物的叶片上。接种植物置于高湿度雾箱中3天，然后移入生长箱中。接种后2-3周测定叶片病害面积的百分率并注意分生孢子器是否存在。4．叶盘测定：
上述整株植物病害测定也可以在温培养皿中的叶盘上进行。5．镰孢霉的盆栽(pouch)测定：
这种测定与上述玉米的串珠镰孢和瓜果腐霉测定相似。大刀镰孢(F.culorum)的孢子从类似于B.maydis的平板上收集。打孔的滤纸折叠，置于袋中，表面消毒的小麦种子置于折叠处，长出的根穿过打孔处至袋底。12ml在休氏(Hewitt’s)培养基(一种允许小麦种子萌芽和生长的营养培养基)培养的大刀镰孢的孢子悬浮液置于袋底，在10-15℃生长箱中培养约1周，然后在15-18℃下继续培养。大约4天后记录根长和根褐病的发病情况。6．叶白粉病的测定：
禾白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)引起小麦叶片的白粉病。该菌是专性寄生菌，因此接种物需保存在小麦叶片上。用于病害测定的植物先培养至12-14龄，从叶片上切下2.5cm片段，置于含50mg/ml苯并咪唑的琼脂平板上。从被感染的叶片上收集的孢子以适当的浓度接种琼脂平板上的叶片。随后，平板在17℃，弱光条件下培养。接种后10天左右观测叶片上的病症。例11：人乳铁蛋白(Lacto H)
从人乳铁素中也分离到抗细菌和抗真菌的肽称为乳铁蛋白H。该肽相当于成熟蛋白的1-33个氨基酸。合成了一个编码乳铁蛋白H肽的基因(SEQ ID NO:2)，其密码子经优化以利于在玉米中表达(SEQ ID NO:5):
 G   R   R   R   R   S   V   Q   W   C   A
GGC-CGC-CGC-CGC-CGC-AGC-GTG-CAG-TGG-TGC-GCC-
 V   S   Q   P   E   A   T   K   C   F   Q
GTG-AGC-CAG-CCC-GAG-GCC-ACC-AAG-TGC-TTC-CAG-
 W   Q   R   N   M   R   K   V   R   G   P
TGG-CAG-CGC-AAC-ATG-CGC-AAG-GTG-CGC-GGC-CCC
为了使该基因序列转录和翻译，加上了一个甲硫氨酸起始密码子和一个终止密码子。另外，将取自Kozak共有序列的ACC序列加在序列起始端，从而提高有效翻译的可能性。这样形成了下面的Met-乳铁蛋白H基因序列，起始密码子和终止密码子有下划线。
5′-ACCATGGGCCGCCGCCGCCGCAGCGTGCAGTGGTGCGCCGTGAGCCAGCCCGAGGCCACCAAG-
    TGCTTCCAGTGGCAGCGCAACATGCGCAAGGTGCGCGGCCCCTAG-3′(SEQ ID NO:6)
用类似于前述实施例关于表达乳铁蛋白B的方法，在适当启动子的调控下，在植物细胞内表达本基因序列。
                      序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人：
(A)姓名：NOVATIS AG
(B)街道：Scharzwaldallee 215
(C)城市：Basel
(E)国家：瑞士
(F)邮政编码(ZIP):4058
(G)电话：+4161 324 11 11
(H)传真：+4161 322 75 32(ⅱ)发明名称：对植物病原真菌有抑制活性的肽(ⅲ)序列数目：46(ⅳ)计算机可读信息：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patent In Release#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅴ)片段类型：N-端(ⅵ)初始来源：
(A)生物：牛乳铁蛋白(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro1           5                       10                  15Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe
        20                  25(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：33个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅴ)片段类型：N-端(ⅵ)初始来源：
(A)生物：人乳铁蛋白(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述：Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu1               5                   10                  15Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly
        20                  25                  30Pro(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：75个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)  (ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：植物优化的牛乳铁蛋白基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述：TTCAAGTGCC GCCGCTGGCA GTGGCGCATG AAGAAGCTGG GCGCCCCCAG CATCACCTGC         60GTGCGCAGGG CCTTC                                                          75(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：78个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：植物优化的牛乳铁蛋白基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：TTCAAGTGCC GCCGCTGGCA GTGGCGCATG AAGAAGCTGG GCGCCCCCAG CATCACCTGC        60GTGCGCAGGG CCTTCTAA                                                      78(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：99个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：链
(D)拓扑类型：线性  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：植物优化的人乳铁蛋白基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述：GGCCGCCGCC GCCGCAGCGT GCAGTGGTGC GCCGTGAGCC AGCCCGAGGC CACCAAGTGC           60TTCCAGTGGC AGCGCAACAT GCGCAAGGTG CGCGGCCCC                                   99(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：108个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：植物优化的人乳铁蛋白基因(ⅹⅰ)SEQ IDNO:6的序列描述：ACCATGGGCC GCCGCCGCCG CAGCGTGCAG TGGTGCGCCG TGAGCCAGCC CGAGGCCCACC          60AAGTGCTTCC AGTGGCAGCG CAACATGCGC AAGGTGCGCG GCCCCTAG                       108(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：91个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo1(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述：GATCCACCCT GTTCAAGTGC CGCCGCTGC AGTGGCGCAT GAAGAAGCTG GGGCGCCCCCA                  60GCATCACCTG CGTGCGCAGG GCCTTCTAAG C                                                 91(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：91个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo2(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述：GGCCGCTTAG AAGGCCCTGC GCACGCAGGT GATGCTGGGG GCGCCCAGCT TCTTCATGCG                 60CCACTGCCAG CGGCGGCATC TGAACATGGT G                                                91(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo1-1(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述：AGTAGGATCC ACCATGTTCA AGTGCC                             26(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo2-1(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述：TACTGCGGCC GCTTAGAAGG CCCTGCGC                          28(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：88个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo3(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述：GATCCACCAT GGCACCGAGG CTAGCGTGCC TCCTAGCTCT GGCCATGGCA GCCATCGTCG                60TGGCGCCATG CACGGCCTTC AAGTGCCG                                                   88(2)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：88个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo4(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述：GGCCGCTTAG AAGGCCCTGC GCACGCAGGT GATGCTTGGGG GCGCCAGCT TCTTCATGCG               60CCACTGCCAG CGGCGGCACT TGAAGGCC                                                  88(2)SEQ ID NO:13的信息：  (ⅰ)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo3-1(ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述：AGTAGGATCC ACCATGGCAC CGAGGCTAG                          29(2)SEQ ID NO:14的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo5(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述：AGTACCATCG TCGTGGCGCC ATGCACGGCC CAGTTCAAG               39(2)SEQ ID NO:15的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：51个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：Oligo 6(ⅹⅰ)SEQ ID NO:15的序列描述：AGTAGCGGCC GCTTAGATGG CCTCGGCGAA CACGAAGGCC CTGCGCACGC A                    51(2)SEQ ID NO:16的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP-5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:16的序列描述：AGTAGGATCC ACCATGGCTT CCTCTATGCT C
                                                                       31(2)SEQ ID NO:17的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP1-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:17的序列描述：GCAGTTAACT CTTCCGCCGT T                                       21(2)SEQ ID NO:18的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP-LF 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:18的序列描述：GTAGGATCCA CCATGGCT                                          18(2)SEQ ID NO:19的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP-LFB 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:19的序列描述：GGCGGAAGAG TTAACTGCTT CAAGTGCCGC CGCTGG
                                                                36(2)SEQ ID NO:20的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP-LFB 3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:20的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAAGC AGTTAACTC TCCGCC                              36(2)SEQ ID NO:21的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP2-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:21的序列描述：CTGCATGCAG TTGACGCGAC CACCGGAATC GGTAAGGTCA GG
                                                              42(2)SEQ ID NO:22的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP3-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:22的序列描述：GCAGTTGACG CGACCACCGG AATCGGTAAG GTCAGG                          36(2)SEQ ID NO:23的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP2-LFB 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:23的序列描述：CGCGTCAACT GCATGCAGTT CAAGTGCCGC CGCTGG                        36(2)SEQ ID NO:24的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP3-LFB 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:24的序列描述：GGTGGTCGCG TCAACTGCTT CAAGTGCCGC CGCTGG                        36(2)SEQ ID NO:25的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)  (ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP2-LFB 3′(ⅹⅰ)SEQ ID NO:25的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAACT GCATGCAGTT GACGCG                     36(2)SEQ ID NO:26的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：ATP3-LFB 3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:26的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAAGC AGTTGACGCG ACCACC
                                                       36(2)SEQ ID NO:27的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非
(ⅵ)初始来源：
  (A)生物：MTP-5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:27的序列描述：AGTAGGATCC ACCATGGCGC CCACCGTGAT G                                31(2)SEQ ID NO:28的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非
(ⅵ)初始来源：
  (A)生物：MTP1-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:28的序列描述：GCACCGGATT CTTCCGCCGT T                                           21(2)SEQ ID NO:29的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：42个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非  (ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP2-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:29的序列描述：CTGCATGCAC CGTATGCGAC CACCGTCCGT CGACAGCGGC GG                  42(2)SEQ ID NO：30的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP3-3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:30的序列描述：GCACCGTATG CGACCACCGT CCGTCGACAG CGGCGG                        36(2)SEQ ID NO:31的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅱ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP-LF5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:31的序列描述：GTAGGATCCA CCATGGCG                                   18(2)SEQ ID NO:32的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP-LF3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:32的序列描述：GCGGCCGCTT AGAAGGC                                    17(2)SEQ ID NO:33的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP1-LFB5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:33的序列描述：GGCGGAAGAA TCCGGTGCTT CAAGTGGCGC CGCTGG
                                                          36(2)SEQ ID NO:34的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP2-LFB 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:34的序列描述：CGCATACGGT GCATGCAGTT CAAGTGCCGC CGCTGG                       36(2)SEQ ID NO:35的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTP3-LFB 5’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:35的序列描述：GGTGGTCGCA TACGGTGCTT CAAGTGCCGC CGCTGG
                                                              36(2)SEQ ID NO:36的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：36个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非
(ⅵ)初始来源：
  (A)生物：MTF-LFB 3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:36的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAAGC ACCGGATTCT TCCGCC
                                                               36(2)SEQ ID NO:37的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTF2-LFB 3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:37的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAACT GCATGCACCG TATGCG                            36(2)SEQ ID NO:38的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：MTF3-LFB 3’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:38的序列描述：CCAGCGGCGG CACTTGAAGC ACCGTATGCG ACCACC
                                                         36(2)SEQ ID NO:39的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：引物176(ⅹⅰ)SEQ ID NO:39的序列描述：TTCCCCAACC TCGTGTTGTT C                                      21  (2)SEQ ID NO:40的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非
(ⅵ)初始来源：
  (A)生物：引物179(ⅹⅰ)SEQ ID NO:40的序列描述：CCAAATGTTT GAACGATCGC G                                 21(2)SEQ ID NO:41的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅵ)初始来源：
(A)生物：引物177(ⅹⅰ)SEQ ID NO:41的序列描述：CACAACCAGA TCTCCCCCAA A                                21(2)SEQ ID NO:42的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非
(ⅵ)初始来源：
  (A)生物：引物180(ⅹⅰ)SEQ ID NO:42的序列描述：AAATTCGCGG CCGCTTAGAA G                   21(2)SEQ ID NO:43的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅹⅰ)SEQ ID NO:43的序列描述：AGTAGGATCC ATGAAAAAGC CTGAACTC
                                     28(2)SEQ ID NO:44的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑类型：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：非
(ⅲ)反义：非(ⅹⅰ)SEQ ID NO:44的序列描述：TACTGGATCC CTATTCCTTT GCCCTC
                                       26(2)SEQ ID NO:45的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅹⅰ)SEQ ID NO:45的序列描述：TATCTCTCTC TATAAGGATC CATGGTCACC           30(2)SEQ ID NO:46的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：非(ⅲ)反义：非(ⅹⅰ)SEQ ID NO:46的序列描述：TACTGGATCC TCAGTACACA GTCCTGCC            28

Claims (16)

1．一种重组DNA分子，在其操作序列中含有：
(a)一种在植物细胞中起作用以导致RNA序列产生的启动子；
(b)一种编码乳铁蛋白的产生的结构编码序列；以及
(c)一种在植物细胞中起作用以导致在RNA序列3’端添加聚腺苷酸核苷酸的3’非翻译区。
2．权利要求1的DNA分子，其中的启动子是遍在蛋白质启动子，且3’非翻译区是来自根瘤土壤杆菌的胭脂碱合酶转录终止子。
3．权利要求1或2的DNA分子，其中的乳铁蛋白是乳铁蛋白B。
4．一种生产转基因抗病植物的方法，包括以下步骤：
(a)将权利要求1的重组DNA插入到植物细胞基因组中；
(b)获得转化的植物细胞；以及
(c)从转化的植物细胞再生为转基因植物，该转基因植物表达有效量的乳铁蛋白以减少病害危害。
5．权利要求4的方法，其中所述的植物选自玉米、小麦和甜菜。
6．权利要求4或5的方法，其中的乳铁蛋白是乳铁蛋白B。
7．一种含有可表达乳铁蛋白的细胞的植物。
8．一种根据权利要求7的植物，其基因组上具有稳定地整合的权利要求1的重组DNA。
9．一种根据权利要求7或8的植物，选自玉米、小麦或甜菜。
10．当发芽并栽培后将长成权利要求7、8或9的植物的种子。
11．根据权利要求10的种子，其被包装或包被。
12．一种根据权利要求7-11的植物或种子，其中乳铁蛋白是乳铁蛋白B。
13．乳铁蛋白在防治植物病原体中的应用。
14．一种防治植物病原体的方法，包括将所述病原体与根据权利要求7的植物接触。
15．一种农业方法，其中用根据权利要求7的转基因植物或其子代防治植物病原体。
16．一种含有根据权利要求10的种子的商品包装。
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