CN1049454C - 生产转基因玉米的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产能稳定地表达可遗传的重组DNA的可繁殖的转基因玉米(谷类)植物的方法。其中所说的DNA优选包含一个编码一种种子贮存蛋白的重组基因，从而改善了玉米的氨基酸状况。

Description

生产转基因玉米的方法

本发明涉及可繁殖的转基因的玉米(Zea mays)种的植物(本文常称为玉米或谷类)，进一步说，本发明涉及通过颗粒轰击和随后的筛选技术来生产可繁殖的转基因植物。

植物的基因工程包括遗传物质(通常是指DNA或RNA形式)的分离和加工处理然后将这些遗传物质引入植物或植物细胞，它为农业和植物育种的现代化提供了可靠的保证。借助于遗传工程技术，可望实现提高作物的食用价值、更高产量和饲养价值，降低生产成本，增强作物抗虫害、抗旱能力和增强耐受力，并可生产药用成分、化学物质和生物分子以及其它优良品质。一旦某种基因被鉴定、克隆和加工处理，还必须以某种方式引入到一种有益的植物中，结果得到的植物既能繁殖，且还能将引入的基因遗传给子代。

目前已建立了许多方法，利用这些方法可将DNA转化各种植物和植物细胞。一般说来，这些植物都是双子叶的，但也有某种单子叶谷类转化成功的极道。然而，已证实某些植物种类至今还不能通过任何方法进行转化。因此，在本文的发现以前未能建立任何方法生产稳定转化的玉米(Zea mays)植物，在此植物中导入的重组DNA至少通过一个完整的生殖周期进行遗传。这些不成功的技术已在文献中有详细记载，并且最近有大量的评论文章对此进行讨论。(I.potrykus，Trends in Biotechnology，7,269，(1989)；K.Weising et al.，Ann.Rev.of Genetics，22,421，(1988)；F.Cockinget al.，Science，236，1259，(1987))。

已经尝试或提出了一些将DNA导入谷类细胞中的方法，包括电穿孔、微注射、微射弹轰击、脂质体融合、农杆菌介导的转移、宏观注射和暴露于裸露的DNA溶液中。

例如，J.Dewet et al.，Experimental Manipulation ofOvule Tissue，G.Chapman et al.，eds.，Longman，Inc.，New York(1985)P.197-269和Y.Ohta，PNAS USA，83,715(1986)都曾报道过将花粉粒与DNA溶液混合后将花粉撒到玉米须上，从而将DNA导入玉米中。在这些文章中，没有分子水平的数据来证实外源性DNA引入谷类细胞中。Arntzen等人在欧洲公开专利申请No.275,069中描述过将DNA与玉米花粉一起培育，然后给玉米穗授粉，并形成种子。已有报道，从这些种子长成的植物含有引入的DNA，但这不能说明导入的DNA可以通过一个完整的生殖周期进行遗传。

A.Graves等人(Plant Mol.Biol.，3，43(1986))报道了农杆菌介导的玉米幼苗的转化。所得证据是基于有时不可靠的分析。至今还没有关于用花粉和农杆菌介导的转移技术成功的进一步报道。

已有报道用微射弹轰击技术生产转化的玉米细胞，该技术是Sanford等人描述于Part.Sci.& Techn..5.27(1987).也见J.C.Sanford et al的欧洲公开专利申请No.331,855，该专利是基于在美国1988年2月29号申请的，申请号为07/161,807的专利。Klein等人在Plant Physiol.，91，440，(1989)也曾描述用微射弹轰击技术转化玉米细胞，但所用细胞不能够再生成为植物。因此，还未有公开方案描述过用轰击技术将DNA导入任何类型的具再生能力的玉米细胞培养物中。也没有报道过，通过轰击玉米愈伤组织，随后再生可育的玉米植株，且至少通过一个繁殖周期传递引入的基因而导致一种引入的基因稳定。D.McCabe等人在欧洲公开专利申请No.270,356中公开了用DNA轰击玉米花粉、花粉授到玉米须上且产生种子，据报道种子含有外源性DNA，但没有证据证明导入的DNA在一个完整的生殖周期中进行了传递，且这些人也没有进一步报道结果。

M.E.Fromm等人报道了用玉米原生质体的电穿孔而使DNA转化细胞(Nature，319，719(1986))，但这些转化细胞没有提供再生植物。C.Rhodes等人也报道过玉米原生质体的电穿孔(Science，240，204，(1988))。尽管能转化受体细胞，而且后一种情况，能再生植物，但植物本身是不育的。此外，Rhodes所用的生产细胞系的方法不具有重现性。

成功地生产可繁殖的转基因玉米植物的另一个障碍在于筛选出用上述方法所得到的极少数既具再生力(在原生质体或细胞培养物情况下)又能繁殖的转化体，由于用一种转化技术生产的转化体通常产量很低，因此进行某种筛选是必需的，但在筛选时通常要用到某些毒性因子，如某种除草剂或抗生素，而这些毒性因子对重组子的再生力或含重组子植物的繁殖力都可能有害。

另一方面，至少已知未转化的玉米原生质体、培养细胞和愈伤组织能再生形成成熟植物，且这些植物通常是可繁殖的。例如，R.D.Shillito等人(Bio/Technology，7,581，(1989))和L.M.Prioli等人(Bio/Technology，7,589，(1989))曾讨论过从细胞培养物中制备原生质体以及由此得到可繁殖的植物的方法。C.A.Rhodes等人(Bio/Technology，6，56，(1988))公开了试图用从胚胎形成的玉米细胞培养物中分离的原生质体再生出玉米植物的方法。

然而，本领域技术人员不可能确认哪一种玉米组织或培养物是外源性DNA的合适受体，例如含有接受外源性DNA且能稳定地整合外源DNA的大量有用的细胞，同时它们是幼植体的一个部分，例如，是能产生下一代植物的细胞谱系的一部分。

本领域面临进退两难的处境。一方面报道或建议了用某些转化技术产生了已转化的玉米细胞，并提出某些细胞和组织具有再生植物的能力因而他们是潜在的受体，一方面又未能找出一个将多种技术相结合的方法，能成功地生产已转化的玉米植物，该植物能使导入的DNA通过一个完整的生殖周期进行遗传。

本发明的目的是生产可繁殖的、稳定地转基因的玉米(Zea mays)植物和中子，它们能将导入的基因遗传给子代。本发明的目的还在于通过颗粒轰击技术和筛选过程生产稳定的转基因植物和种子，经过该过程至少一部分转化细胞获得高水平的存活力。本发明的再一个目的是生产除玉米之外的其它可繁殖的、稳定转基因的禾本科谷类植物。

下面引出了本文所引用的参考文献。Armstrong，CL，et al.(1985)Planta 164：207-214Callis，J，et al.(1987)Genes & Develop 1：1183-1200M.Bevan et al.(1983)Nuc Acids Res 11：36aChu，CC，et al.(1975)Sci Sin(Peking)18：659-668Cocking，F，et al.(1987)Science 236：1259-1262Dewet et al.(1985)Proc Natl Sci USA 82：7870-7873Freeling，JC，et al.(1976)Maydica XXI：97-112Graves，A，et al.(1986)Plant Mol Biol 7：43-50Green，C，et al.(1975)Crop Sci 15：417-421  Green，C，et al.(1982)Maize for BiologicalResearch，Plant Mol.Biol.Assoc.，pp 367-372Gritz，L，et al.(1983)Gene 25：179-188Guilley，H，et al.(1982)Cell 30：763-773Hallauer，AR，et al.(1988)Corn and CornImprovement，3rd ed.，Agronomy Society of America，pp 469-564Jefferson，R，et al.(1987)EMBO J 6：3901-3907Kamo，K et al.(1985)Bot Gaz 146：327：334Klein，T，et al.(1989)Plant Physiol 91：440-444Klein，T，et al.(1988a)Proc Natl Acad Sci USA 85：4305-9Klein，T，et al.(1988b)Bio/Technology 6：559-563Lu，C，et al.(1982)Theor appl.Genet 62：109-112McCabe，D，et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926Murashige，T，et al.(1962)Physiol Plant 15：473-497Neuffer，M，(1982)Maize for Biological Research，Plant Mol Biol Assoc，pp 19-30Phillips，R，et al.(1988)Corn and CornImprovement，3rd ed.，Agronomy society of America，pp 345-387Potrykus，I(1989)Trends in Biotechnology 7：269-273Rhodes，CA，et al.(1988)Science 240：204-7Sambrook，J，et al.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor  Laboratory PressSanford，J，et al.(1987)Part Sci & Techn 5：27-37Weising，K，et al.，(1988)Ann Rev of Genetics 22：421-478Yanishch-Perron，L，et al.(1985)Gene 33：109-119

本发明涉及可繁殖的转基因玉米(Zea mays)植物。该植物含有重组DNA，优选的是整合到染色体上的重组DNA，并能遗传给子代。

本发明还涉及从转基因玉米(Zea mays)植物、植物细胞，植物组成部分和种子得到的所有产品。

本发明还涉及稳定地含有重组DNA的转基因玉米种子和其遗传了重组DNA的子代。本发明还涉及转基因植物的繁殖和随后将重组DNA引入任何玉米(Zea mays)植物或种系。

本发明还涉及生产含有重组DNA的可繁殖转基因玉米(Zea mays)植物的方法，这个过程是基于微射弹轰击、筛选、植物再生、常规回交技术。

本发明还涉及生产除玉米外其它禾本科种的可繁殖转基因植物的方法。这些植物按传统方法，如电穿孔、农杆菌、注射以及先前的射弹轰击技术是不可能进行可靠转化的。

本发明还涉及从转化的胚胎形成的组织中获得的再生的可繁殖的成熟玉米植物，及由此植物产生的转基因种子和R₁代及其后代。

本发明的一个优选的实例是一种可繁殖的转基因玉米植物，该植物已用一个重组嵌合基因进行了稳定的转化，其中的基因表达为一种种子贮存蛋白，如10KD的玉米蛋白，以致于至少一种氨基酸的水平比它在亲本以及未转化的同系植株中有所提高。多拷贝的所说基因的表达或过量表达从本质上增加了某些氨基酸如赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等等的总体种子水平，本文使用的术语“基本上增加”意味着某种特定的氨基酸水平比未用上述种子贮存蛋白基因转化的相应植物或植物部分中存在的该种氨基酸含量高10-20％。

在优选实施例中，本发明通过用包裹有重组DNA的微射弹轰击脆性的胚胎形成的愈伤组织块，随后通过控制方法筛选转化了的愈伤组织系，而生产可繁殖的转基因植物。

图1A显示在实施例I中使用的质粒载体pHYGI1的结构图，图1B表示在线性化的pHYGI1中包含的HPT编码序列和有关的调节因子的相应部分。碱基对编号从指定的限制性酶的识别序列的5′核苷酸开始。ECORI位点开始于CaMV35S启动子的5′端。

图2A显示在实施例I中所用的质粒载体pBII221的结构图；图2B描绘了线性化的pBII221图，如，从HindIII切割位点到EcORI切割位点。

图3表示从PH1愈伤组织系和一个未转化的对照愈伤组织系分离的DNA的Southern印迹分析的实验结果，并图解表示实验中所用的pHYGI1探针。

图4表示从PH1和未转化的愈伤组织再生的RO植物中分离的叶DNA的Southern印迹分析实验结果，并图解表示了实验中所用的pHYGI1探针。

图5表示了从PH1 RO植物和未转化RO植物的R1子代中分离的叶DNA的Southern印迹分析实验结果，并图解表示了实验中所用的pHYGI1探针。

图6表示从PH2愈伤组织系和一个未转化对照愈伤组织系分离的DNA的Southern印迹分析实验结果，并图解表示实验中所用的pHYGI1探针。

图7A显示了在实施例II中所用的质粒载体pZ27Z10的结构图，图7B描绘了含有Z10编码序列和有关的调节因子的质粒pZ27Z10的线性图。

图8图解表示在嵌合对Z27-Z10基因内PCR引物的定位位点。

本发明涉及生产玉米种的可繁殖的转基因植物和种子，以及从这些转基因植物得到的植物、植物组织和种子，以及转基因植物的子代及产品，优选的是那些提高了食用或饲用价值的转基因玉米(Zea mays)植物。这里所说的转基因植物包括该种类中的所有植物，如：野生玉米，爆裂种玉米，甜玉米，硬质种玉米和马齿种玉米。

本文所用的“转基因”是指包括其基因型因重组DNA的存在而发生了改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，在遗传工程领域内将该重组DNA称为“异源DNA”、“外源性DNA”或“外来DNA”，所说的“DNA”经过遗传工程方法引入到一种基因型中，或者通过这样一个过程先引入到植物亲本的基因型中，然后经过有性杂交或无性繁殖遗传后代。这里所说的“基因型”是指细胞内遗传物质(以染色体形式或染色体以外产生的)的总和。所以，本文的术语“转基因”并不包括用常规的植物育种方法或自然发生现象，如随机杂交繁殖、病毒感染或自发突变等引起的玉米(Zea mays)基因型的改变。

所谓的“可遗传的”是指DNA至少能够通过植物的一个完整的生殖周期进行遗传。例如，通过配子将DNA从一个植物遗传给其子代植物。

本发明的转基因植物可以通过下列步骤产生：(i)建立一种可再生的细胞培养物，优选的是脆性的胚胎形成的愈伤组织，(ii)通过微射弹轰击技术转化所说的细胞培养物，(iii)鉴定或选择已转化细胞。(iv)从已转化的细胞中再生可繁殖的转基因植物。本发明所说的植物，有些可从转基因种子产生，这种种子是用常规杂交繁殖技术而建立的转基因优良种系和变种所得的可繁殖的转基因植物产生的，这种种子也可以是含有重组DNA的市售杂交种子。

I、植物种系和组织培养物

已经知道，特别适用于生产本文所说的可繁殖的转基因玉米植物的细胞是那些经过如下文进一步详细描述的筛选方式之前后都具有再生能力的愈伤组织细胞。通常，这些细胞来自含有未高度分化细胞的分生组织。一般说在禾本科谷物类中，尤其在玉米中这样的组织包括存在于幼叶基部，未成熟的玉米雄穗，未成熟的胚胎和胚芽鞘节中的组织。优选的是用未成熟的胚胎，从这些组织和植物类型中制备愈伤组织并维持它生长的方法在本领域中是已知的，详细的操作可参见文献C.f.phillips et al.，(1988)，它已作为本文的参考文献。

所用的特异性愈伤组织必须能再生成可繁殖的植物。各个愈伤组织的特异性再生能力对进行成功地进行轰击和筛选是很重要的，因为在筛选过程中和筛选之后，再生能力显著减弱。因此，选用尽可能有高度再生能力的培养物开始试验是很重要的。已发现育龄在3个月以上，最长育龄为36个月的愈伤组织有足够高的再生力，因而可优选使用。通过将样品转移至再生培养基上且监测嫩芽、根和幼苗的形成可决定一种特定培养物的再生能力。每个佩特里培养皿中出现的幼苗的相对数目或每克组织的鲜重可作为再生能力的粗略估计。总之，每克愈伤组织至少产生一个植株的培养物是优选的。

如果利用大量不同的植物组织开始培养玉米愈伤组织，优选的有用的培养物是来自未成熟的玉米胚胎。当这种胚胎长至1-3mm长时从穗粒上摘下来得到。通常在授粉后大约9-14天胚胎就能长到上述所需长度。在无菌条件下，将胚的茎轴以下(胚鳞以上)部分置于常规固体培养基中。几天至几星期后，从胚鳞上长出愈伤组织。在愈伤组织已充分生长之后，就可评估胚鳞上长出的增殖细胞的脆性度和完全长好的胚胎的存在。所谓的“脆性度”是指不引起细胞损伤情况下，组织易于分散。然后将具有这种形态学的组织转至新鲜培养基中，按照常规方式每隔二周进行继代培养。为减少继代培养期间细胞成团和/或增大细胞表面面积，应将细胞过筛。

愈伤组织起始生长的培养基优选的是固体的。在优选实施例中，典型的初始和维持培养基是按照Armstrong等人(1985)描述的chu.et al.的N_b盐(1975)或是Murashige等人(1962)的MS盐。在该基本培养基中补充了蔗糖和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。已发现补充L脯氨酸和酪蛋白水解产物可以改善愈伤组织培养物的起始生长频率、形态学和生长。虽然在较弱的光线下进行培养也是可以采用的，但通常还是在黑暗中进行维持培养。对于维持和增殖细胞所必须的合成激素2，4-D的水平，通常须达到约0.3-3.0mg/ml。

虽然用脆性的胚胎形成的愈伤组织可成功地完成转化和再生。但这并不意味着其它可转化的再生性细胞、组织或器官不能用于生产本发明的可繁殖的转基因植物。对用于转化的细胞唯一确切的要求是在转化后，且经过随后使用的选择和筛选过程后，它们必须能再生出含有重组DNA的植物。

例如，可以用在液体悬浮培养基中生长的细胞。为建立这些培养物，生长4-6个月后，将II愈伤组织转至液体生长培养基中。生长再生性悬浮细胞培养物的方法和参考文献如下：C.E.Green et al，在Maize for Biological Research.Plant Molec.Biol. Assoc.(1982).P367-372，R，Phillips et al.，Corn and Corn Improvement Agronomy Soc.Amer.，(3d ed.，1988)P.345-387，和I.Vasil，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol.I，Laboratory Procedures and Their Applications，AcademicPress(1984)P.152-158。典型情况下，用于悬浮培养物的液体生长培养基与固体的愈伤组织诱导培养基具有相似的配方。可将ABA(脱落酸)(10^-7M)加至液体生长培养基中以增加再生力和增强培养物的存活力，优选的愈伤组织在引入液体培养基之前最好不要筛分。

在液体培养基中继代培养的培养物可适当地维持主动生长和再生特性。在最佳实施例中，用新鲜生长培养基按1∶8-9稀释，每隔一周进行继代培养。

II、转化所用的DNA

这里所用的术语“重组DNA”指的是由任何来源所衍生或分离的DNA，随后将DNA经化学改变，然后引入到玉米(Zea mays)中。从一种来源衍生得到的重组DNA的一个实例是鉴定为是一个生物体内一种有用片段的一个DNA序列，且然后通过化学方法合成为基本上纯化的形式。从一种来源分离的重组DNA的一个实例是一个有用的DNA序，该序列是通过化学方法，如利用限制性内切核酸酶，从所说来源上切去或移走的，因而可利用遗传工程对它进一步操作，如：扩增以用于本发明。

所以，“重组DNA”包括完全合成的DNA，半合成DNA，从生物来源分离出的DNA以及从引入的RNA衍生的DNA。一般说来，重组DNA并不是最初就存在于作为外来DNA受体的玉米基因型中，但在本发明的范围内，是从一个确定的玉米基因型中分离的一个基因，然后将该基因的多拷贝引入相同的基因型中，例如可以增加给定基因产品如一种贮存蛋白的产量。

重组DNA可包括但不只限于此，来自植物基因，非植物基因，如，来自细菌、酵母、动物或病毒的基因；经修饰的基因，基因的某一部分、嵌合基因的DNA。也包括来自相同或不同玉米(Zea mays)基因型的基因。

用于转化的重组DNA可以是环状或线性的，可以是单链或双链。通常，重组DNA是嵌合DNA形式，如，质粒DNA，它们含有侧面为调节序列的编码区，这种调节序列能启动存在于得到的谷类植物中的重组DNA的表达，例如，重组DNA本身包含或由一个在玉米中具活性的启动子组成，或者该DNA可以利用作为转化靶的玉米基因中已经存在的启动子。

构建能转化特定植物的重组的DNA的成分和方法已为本领域技术人员所熟知，利用相同的构建成分和方法，可产生本发明中使用的DNA。重组DNA的特定成分在本发明中不是主要的，本发明也不依赖于所用特定重组DNA的成分。K.Weising等人(Ann.Rev.Genetics，22,421，(1988))描述了合适的DNA成分、选择性标记基因、报道基因(reproter gene)、增强子、内含子等，并提供了有关成分的参考文献。J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2d ed.，1989)提供了合适的构建方法。通常，重组DNA相对较小，如，小于30kb，以便尽可能地减少由于DNA增大而易于受到的物理、化学或酶降解的破坏。

本发明所用的合适的重组DNA包括能提供或者增强所得转基因谷类植物某一优良特性的所有DNA、它能编码表达蛋白质和反意义RNA转录以促进提高作物的食用价值、高产量、抗虫害能力、抗病力、抗降草剂能力等等，例如，重组DNA能编码一种DHDP合成酶，如含有dapA基因，以提高赖氨酸产量；能编码对昆虫具抗性的苏芸金杆菌(Bt)，σ-内毒素或一种蛋白酶抑制剂，以及编码对草甘磷杀虫剂具抗性的细菌EPSP合成酶；编码具杀真菌剂特性的几丁质酶或葡聚糖内-1，3-β-葡萄糖苷酶。

在改善作物食用或饲用价值方面最重要的是基因编码的蛋白质含有高含量必需氨基酸，例如，为保证鸡、饲谷、豆类家禽的足够营养和良好生长，通常要补充合成的蛋氨酸或某种蛋氨酸类似物。产生能供应较高水平蛋氨酸的谷物种系可以减少补充蛋氨酸的需要，通过将编码高蛋氨酸蛋白的能高效表达的基因引入到玉米基因组中就可获得这种高蛋氨酸谷物种系。

编码高蛋氨酸蛋白的基因包括：(1)编码一种玉米的15KD玉米蛋白(11％蛋氨酸)的基因(Pedersen et al.，J.Biol.Chem.，261，6279(1986))；2.)编码巴西坚果贮存蛋白(18％蛋氨酸)的基因，(Altenbach et al.，Plant Mol Biol.8；239，(1987))；3)编码一种玉米的10KD玉米蛋白(22.5％蛋氨酸)的基因，(Kirihara et al.，Gene，7,359，(1988))。其中优选的是10KD玉米旦白基因，因为它是玉米的内源性基因，其蛋白产物在穗粒中正常积累产品中蛋氨酸的含量比15KD玉米蛋白高2倍。为了在种子中获得蛋氨酸的高水平表达，其编码序列最好与具来自高水平表达的种子特异性基因的调节序列进行融合。或者，将完整的内源性10KD玉米旦白基因的另外拷贝引入到谷类基因组中，也能提高谷物种子中蛋氨酸的含量。

赖氨酸是人类和单胃动物食物中的一种必需氨基酸，是大多数主要农作物，尤其是玉米中三种最有限的氨基酸之一。所以，以谷类为基础的食物必须补充合成赖氨酸或含赖氨酸的油籽蛋白食物。而且，因为多数油籽食物本身的赖氨酸源不充足，因此比较饲用混合料中赖氨酸时常发现谷物中，其它成分含量太高，而所要求的营养成分较少，所以，提高谷类或油籽作物或两者中赖氨酸含量的方法将会大大提高其营养价值和显著降低饲料使用者如猪和家禽饲养者的费用。

提高谷类赖氨酸含量的一种方法是反向调节生物合成途径，使得游离的赖氨酸积累。大肠杆菌的dapA基因编码二氢甲基吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)，它是一种调节酶，在植物中该酶活性强烈地受赖氨酸的反馈抑制。该细菌酶对赖氨酸抑制作用的敏感性约低200倍。将dapA基因引入植物细胞并表达，就可使植物本身的DHDPS被完全抑制后游离赖氨酸的合成持续进行。

保护谷物免遭害虫的侵袭，对维持谷类作物的产量和有效的控制生产玉米作物成本尤为重要。在美国，玉米的主要昆虫害虫包括鳞翅目类的多种害虫，如欧洲玉米螟、地老虎、蚯蚓以及鞘翅目种类，如Diabrotica种。保护玉米免受害虫侵袭对生产者来说是较昂贵的，需要以合适的方式应用有毒的化学杀虫剂。因为传统的育种和选择方法还不能产生一种新的能基本上对多数害虫有抗性的玉米种系，根据本发明在玉米作物中引入和遗传对害虫具抗性的基因或序列，将降低生产成本，减少毒性化学杀虫剂的应用，且可更有效地控制害虫。

本发明的基本部分在于将某种昆虫抗性基因引入玉米细胞中，通过有丝分裂复制该基因。从而使基因进入整个玉米植株中，并且通过有丝分裂和减数分裂过程最终遗传给子代。

苏云金杆菌(或简称“Bt”)包括将近20个已知的能产生内毒素多肽的亚种，该多肽被多数种类的昆虫吸收后产生毒性。最近，由H.Hofte et al.，Microhiol.Rev.，53，242，(1989)；和H.R.Whitely et al.，Ann.Rev.Microbiol.，40,549，(1986)综述了这种内毒素蛋白(Bt蛋白)及相应基因(Bt基因)的生物学和分子生物学性质。编码各种Bt旦白的基因已被克隆和序列分析。研究表明其中Bt多肽的一个片段对大量鳞翅目类害虫有毒性是必需的，且该片段包含于Bt多肽分子的起始端的50％序列中。因此，一个被截短的Bt基因所编码的截短的Bt多肽在多数情况下仍保留它对大量鳞翅目类害虫的毒性。已证明，在美国HD73和HD1Bt多肽对玉米植物的重要的鳞翅目类害虫，如欧洲玉米螟，地老虎，蚯蚓的幼虫有毒性。编码HD1和HD73Bt多肽的基因的克隆和序列分析已分别由M.Geiser et al.，Gene，48,109，(1986)；和M.J.Adang et al.，Gene，36,289，(1985)进行，且可以用标准方法从来自培养收集物的HD1和HD73品系中克隆(如芽孢杆菌遗传保藏中心，Columbus，Ohio或USDA Bt保藏收集处Peoria，Illinois)。

利用过去曾用于克隆Bt基因的方法将编码新的、以前未曾定性过的Bt毒素的DNA克隆到宿主芽孢杆菌生物体中。方法包括在能在合适寄主中复制的一个合适质粒或噬菌体载体中建立一个从芽孢杆菌属生物体分离的DNA的文库，以及利用抗Bt旦白的抗体或从一个同源Bt基因序列中分离的DNA以鉴定含有克隆的Bt序列的转化体。利用已克隆DNA的缺失分析，可以初步决定Bt编码序列的大致定位位点。测定Bt编码序列的精确定位位置可以用许多标准方法，包括测定已克隆DNA片段的序列；确定在编码Bt蛋白的序列中存在的大开放阅续框架，以及通过比较由该DNA序列和Bt蛋白的部分氨基酸序列中得到的氨基酸顺序来证实编码Bt蛋白的DNA序列的性质。

用于本发明中的一个嵌合Bt基因包括一个5′DNA序列，该序列含有玉米植物中的定位于Bt序列下游的转录(启动子)和转译的启始部分的DNA。嵌合Bt基因也包括一个3′DNA序列，它包括一段来自能在谷物中表达的一个基因的3′非编码区序列。最重要的是，嵌合Bt基因包括一段编码由苏芸金杆菌产生的毒性Bt多肽或该多肽的毒性部分或具有基本上与该多肽同源的氨基酸序列的多肽的DNA序列。该Bt编码序列包括：(1)编码具杀虫活性的旦白(该活性旦白与具有抗谷物害虫活性的Bt内毒素有同源性)的DNA序列，如HD73或HD1 Bt序列；(ii)为Bt内毒素多肽中杀虫活性片段编码的序列；如，从羧基和/或氨基末端截短的具杀虫活性的HD73或HD1多肽；(iii)一段截短过的Bt序列。该序列在框架中与一个序列(该序列为能提供某些其它优点的多肽编码)融合。这些额外的优点有：(a)能选择的基因，例如提供抗生素或除莠剂抗性的基因；(b)产物(如，荧光素酶或β一葡萄糖苷酸酶)易于检测或测定的报告基因；(c)为具有某些额外用途的多肽序列(如旦白酶抑制剂)编码的DNA序列，这些用途是稳定Bt蛋白质免于降解或增强Bt蛋白质抗昆虫效果。(d)协助指导Bt蛋白到达谷物细胞内外某一特定区域的序列，如：一个信号序列。

为了在玉米中使Bt蛋白得到最大合成量，还可以将Bt基因的DNA序列作适当调整，使之与谷物中能高效表达的基因更为相似。因为用于许多Bt基因，包括HD73和HD1基因的密码子与芽胞杆菌种中使用的更为相似，而与在玉米中表达的基因的密码子不同。因此，用在玉米植物中更高频率利用的密码子替代那些在芽孢杆菌中很少利用的密码子可提高玉米细胞Bt基因的表达(见E.Murray et al.，Nucl.Acids Res.，17,477，1989)。这种密码子的替代要求所进行的碱基替换不改变所得Bt多肽的氨基酸序列。Bt多肽应在序列上与细菌基因或其片段相似。含有比初始细菌基因具有更高比例的优选的玉米中使用的密码子的完整的Bt编码序列，或其一部分，可以用经典的化学合成方法进行合成，然后用经典方法引入或装配到Bt基因中。例如用定位诱变、DNA聚合和连接等等方法。

除了作为转录单位的重组DNA序列或其部分外，有用的重组DNA可以是未被转录的，如具有调节或结构的功能。也可以将DNA引入后，作为遗传工具产生突变子和/或有助于鉴定、遗传标记、或者分离玉米DNA片段。有关的其它例子可参见前文已引用的Weising的文章。

通常引入到植物细胞中的重组DNA进一步包含一个选择性标记或一个报道基因，或者两者都有，以有利于转化细胞的鉴定和筛选。除此之外，可选择性标记可以携带于DNA的某个公开的片，并用于共转录过程。在选择性标记和报道基因两侧都可以存在适当的调节序列以促使它们在植物中的表达。有用的选择性标记是本领域内熟知的，例如抗菌素和除莠剂抗性基因。

选择性标记基因的特异性例子在前文引用的Weising等人的文章中已有描述。一个优选的选择性标记基因是潮霉素磷酸转移酶(HPT)编码序列，它可以从大肠杆菌中得到并对抗生素潮霉素B有抗性。其它的选择性标记包括转座子Tn5(AphII)的氨基苷磷酸转移酶基因，该基因的编码产物对卡那霉素，新霉素和G418抗菌素具抗性，以及编码对草甘磷，2，2-二氯丙酸，氨甲蝶呤，咪噻啉酮除草剂，磺酰脲类除草剂，溴苯腈，phosphinothricin和其他除草剂化合物具抗性或忍耐性产物的那些基因。授予所得转化植物对这些植物毒素复合物有抗性或耐受性的选择性标记基因也具有商业用途。编码给予植物毒素抗性的酶类的选择性标记基因已列表于下表1中。

                     表1

                选择性标记基因抗性基因或酶          具有的抗性       参考文献新霉素磷酸转移酶      G418，新霉素，   P.J.southern et al.，(neo)                 卡那霉素         J.Mol.Appl.Gen.，1,327

                                   (1982)潮霉素磷酸转移酶      潮霉素B          Y.Shimizu et al.，Mol.(hpt或hyg)                             Cell Biol.，6，1074(1986)二氢叶酸还原酶        氨甲蝶呤         W.W，Kwok et al.，PNAS(dhfr)                                 USA，4552(1986)phosphinothricin    Phosphinothricin   M.DeBlock et al.，EMBO转乙酰酶(bar)                          J.，6，2513(1987)2，2-二氯丙酸       2，2-二氯丙酸      V.Buchanan-Wollaston脱卤酶              (茅草枯)           et al.，J，Cell.Biochem.，

                                   Supp，13D，330(1989)乙酰羟酸合成酶      磺酰脲类、咪唑     P.C.Anderson et al.(U.

                啉酮，和三唑嘧     S.Patent No.4,761,373)；

                啶除草剂           G.W.Haughn et al.，Mol.

                                   Gen.Genet.，211，266(1988)5-烯醇丙酮酸        草甘磷             L.Comai et al.，Nature，-shikimatel-                           317，741(1985)磷酸合成酶(aroA)卤芳基腈水解酶      溴苯腈             D.M.Stalker et al.，pub-

                                   lished PCT appln.WO87/04

                                   181乙酰辅助酶A         Sethoxydim         W.B.Parker et al.，Plant羧化酶              haloxyfop          Physiol.，92，1220(1990)二氢蝶酸酯          氨磺酰除草剂       F.Guerineau et al.，Plant合成酶(Sull)                           Molec.Biol.，15,127(1990)32KD光系统II        三嗪类除草剂       J.Hirschberg et al.，型多肽(psbA)                           Science，222，1346(1983)氨茴酸盐合成酶      5-甲基色氨酸       K.Hibberd et al.，(U.S.

                                   Patent No，4,581,847)二氢甲基吡啶二羧酸  氨乙基半胱         K.Glassman et al.，Publi

                     shed合成酶(dapA)    氨酸     PCT application No.WO89/

                            11789

报告基因用于鉴定潜在的转化细胞和估测调节序列的功能，编码易于检测的标记旦白的报道基因是本领域熟知的，总的说来，一个报告基因是一种在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因。且该基因编码一种蛋白质，它们表达可通过一些易于检测的特性如：表现型改变或酶活性而证实。Weising et al.(见上文)提供了这样基因的实例。优选的基因包括来自E.coli的Tn9的氯霉素乙酰转移移酶(cat)基因。E.coli的UidA位点的β-葡萄糖苷酸酶基团，以及来自荧火虫(photinus phralis)的荧光素酶基因。在DNA已引入到受体细胞中后一个合适的时间测定报告基因的表达。优选的这种分析是利用E.coliβ-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(R.Jefferson et al.，EMBO J，，16,3901，(1987))。一转化和表达该基因的玉米细胞置于含有底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸(X-GLUC)的细胞外介质中时染上兰色。

本文利用的调节序列包括任何组成型、诱导型、组织或器官特异的，或发育阶段特异的启动子，这些启动子能在特定的植物细胞中表达。合适的这样的启动子在前文提及的Weising等人的文章中已有报道，下面列出了适用于本发明的部分启动子代表：根瘤农杆菌的T-DNA的调节序列，包括mannopine合成酶，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶；玉米的乙醇脱氢酶启动子；光诱导启动子，如不同种的二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶的小亚单位基因；大的叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；花椰菜花叶病病毒(CaMV)的35S和19S启动子；发育调节的启动子，如玉米的腊质，玉米旦白或青铜色启动子；以及既可诱导或又是组成的合成的或其它天然启动子，包括那些其表达具器官特异性或在植物的特异发育阶段表达的启动子。

如内含子、增强子、多聚腺苷化序列等其它成分也是重组DNA的一部分。这些成分对于DNA的功能是或不是必要的，但它们能够影响转录，mRNA的稳定性或其它类似因素而改善DNA的表达。这些成分包含于DNA中，以期望在植物中获得转化DNA的理想特性。例如，玉米AdhIS第一内含子位于一个特定重组DNA结构的启动子与编码序列之间。已知当这个内含子存在于一个DNA结构中时，可以提高玉米细胞中某种旦白的产量(J.Calllis et al，Genes and Develop.，1，1183，(1987))。但是，某种选择性标记满意地进行充分表达常常不需要内含子存在(T.Klein et al.，Plant physiol.，91，440(1989))。玉米中Shrunken-1第一内含子就是这样一个合适的例子。这些其它成分必须与DNA结构中的剩余部分相亲和。

III、DNA的传递过程

通过微粒轰击过程将重组DNA引入能再生的玉米细胞培养物，优选的是愈伤组织培养物。Sanford等人已对合适的微粒轰击仪器作了一般性描述(1987)。该文作为本文参考文献。Klein等人曾报道利用一种装置轰击玉米非再生性悬浮培养细胞的方案(1998a，1988b，1989)。但没有报道轰击愈伤组织培养物或能再生的玉米细胞的方法。

在微射弹轰击过程，也称为生物“导弹发射”过程中，重组DNA转移到愈伤组织中是由微小的生物惰性物质颗粒传递的。当惰性颗粒外面包裹了DNA并将该颗粒加速到合适的发射速度后，一个或多个带DNA的微粒就能穿入一个或多个细胞中，在该细胞中DNA从颗粒上释放并在细胞中表达。一些受体细胞稳定地保留引入的DNA并进行表达。

这种称为微射弹的微粒，通常是具有高密度的物质，如钨和金。用所需的DNA包裹这些颗粒。然后将这些微射弹置于一个大射弹表面，该大射弹能将来自合适能源的动力传递给微射弹。在大射弹和微射弹被加速到恰当的速度后，将它们与一个阻力装置相连，该装置阻止大射弹继续它的运行路线，但允许DNA包裹的微射弹继续运行并撞击受体愈伤组织细胞。合适的这样的仪器可以利用各种动力如黑色火药或用电弧光放电产生的冲击波(P.Christou et al.，Plant Physiol.，87,671(1988))。目前，优选利用的是一种以黑色火药作为动力的装置，且由Sanford et al.(1987)对该装置进行描述，且作出进一步解释，此文作为本文参考文献。

Klein等人(1988a，b)提供了使用这种黑色火药动力仪器的方法，包括两个主要步骤。第一，在一种水溶液中以特定顺序将微射弹与DNA，CaCl₂和亚精胺混和。按照规定变化各种成分的浓度。优选的操作方法完全按照Klein等人(1988b)提供的方法，不同的是将规定的合适DNA浓度加倍。第二，DNA包裹的微射弹，大射弹和受体细胞置于仪器中恰当位置，并将动力供给大射弹。这个步骤中可变化的部分包括受体细胞与发射管末端的距离以及样品室里的真空度。将受体组织定位于终止平板盘下面2-15cm处，优选的是5cm处

本发明中用于产生转基因植物的愈伤组织培养体通常应该是处于转移期间的中期，然后经过一个“迟缓期”，在该期间组织转移至新的培养基中。而且也可在达到稳定期(相当于一个延长期间)前不必转到新鲜培养基中进行继代培养。所用的组织为30-80mg的片状组织，优选的是40-60mg。将组织团块放在佩特里培养皿上或其它表面，并按所需的任何方式排列，可以看到(i)培养皿中心的空间将收到最高浓度的金属-NDA颗粒，且位于该区的组织在轰击过程中几乎受到毁坏；(ii)到达组织的颗粒数随着组织与轰击中心的距离增加而减少，以至远离培养皿中心的组织很少被击中。为了防止组织飞溅或喷出，在培养皿上放一个筛网，优选的是一个金属筛网。另外一种使组织受轰击的放置方法是将组织以一薄层方式散置于滤纸。组织可以受到DNA包裹的金属颗粒的一次或多次轰击。

IV、筛选过程

一旦愈伤组织受到重组DNA轰击后，DNA就穿入到一些细胞中，鉴定和筛选出那些既含有重组DNA，又具充分再生能力的细胞是必要的。有两种一般性方法可用于达到上述目的。第一种方法，可通过各种标准方法筛选存在重组DNA的被转化的愈伤组织或由其再生出的植物。这些方法包括检测报道基因的表达、或者估测重组基因的表型效果(如果有的话)。另一种方法，较优选的是：当一种选择性标记基因与重组DNA一起或作为重组DNA的一部分传递后，就可用一种选择性试剂检测该选择性标记基因的表达，从而鉴别已转化的愈伤组织细胞。

筛选假定的转化子是转化过程成功的关键性部分。因而必须选择筛选条件，以便使转化细胞生长和累积，同时抑制非转化细胞的生长。在一个群体中单个细胞的存活常常高度依赖于细胞的存活力。这个事实使得情况显得复杂。同样，筛选的条件不必太严格，以防止愈伤组织细胞的再生能力和所得植物的繁殖能力受阻。因此，必须估计筛选因子对细胞活力和形态学方面的影响。这可以由对给定的选择性因子和事先已被转化的组织进行实验得出一条生长抑制曲线而完成。这也将建立一个抑制生长的浓度范围。

当应用了某种选择性标记基因后，或者是在非选择性培养基上，使受到轰击的愈伤组织重新恢复生长，或者更好的是将愈伤组织直接转至含选择性因子的培养基上。

筛选步骤包括暴露于一种毒性因子中，并且使该试剂的浓度依次变化和利用多轮筛选。对于每一种特定因子来说，其特有的浓度和筛选周期的长短是需要变化的。目前优选的一种筛选过程包括利用在一个相对较低的毒性试剂浓度时进行最初一轮筛选，然后在较高浓度时进行以后几轮筛选。这就使得选择性因子通过一个较长的时间期间缓慢地产生毒性响应。优选的是因子的起始浓度为由生长抑制曲线所决定的生长受抑制时的浓度的5-40％。这种效应可以使得转化细胞更好地生长和分化，同时使未转化细胞受到抑制，但在某种程度上并没使未转化细胞的生长受阻。一旦极少数单个转化细胞经过充分时间的分化后，组织可以移至含有较高浓度毒性因子的掊养基中，以从本质上杀死所有未转化细胞。这种向较高浓度毒性因子的转移电减少了非转化细胞适应这种因子的可能性。优选的较高浓度范围是在30-100％生长抑制的范围内。第一个筛选周期的长度约为1-4周，优选的是2周左右，后面的筛选周期可以从1周到12周，优选的是2-10周左右。假定的玉米转化子通常可鉴定为非增殖细胞背景中出现的组织的增殖部分。该愈伤组织也可以在整个筛选过程期间的不同时间，培养于非选择性培养基中。

一旦愈伤组织部分被鉴定为一个假定的转化子，即可用表型和/或基因型分析证实转化。如果用某种选择因子，表型分析的一个例子就是测定在该选择性因子的各个浓度时，假定转化子的鲜重比对照组织鲜重的增加量。其它可以进行的分析决定于重组DNA的功能。例如，如果该DNA编码一种酶或蛋白质，就可进行对这种酶或蛋白质特异性的酶学或免疫学分析。可以用合适的生物或化学分析检测其它基因产物。其它类似技术在本领域内是已知的，这里不再重复。用常规技术，如Southern印迹分析或聚合酶链反应(PCR)等可证明该基因存在。

V、植物的再生和种子产生

然后将已证明被转化的细胞系再生成植物，并且测定所得植物的繁殖力。通过基因型和/或表型分析把结果为阳性的转化细胞系放到能促进组织分化和植物再生的培养基中。可按本领域中众所周知的标准方法进行植物的再生。该方法通常包括降低使愈伤组织增殖终止的植物生长素的浓度，促进体细胞胚胎发育或其它组织的分化。Green等人描述了这种再生过程的一个例子(1982)。这种植物可在生长室或温室中生长成熟，并象Neuffer描述的那样进行合适的有性杂交(1982)。

对于本发明来说很重要的再生过程，可以通过任何常规方法进行。如果某种选择性标记已转化到细胞中，那么可将选择性因子混入再生培养基中，以进一步证明再生的幼苗是被转化过的。由于再生技术是广知的，而且也不是本发明的关键所在，所以任何完成再生和生产可繁殖植物的技术都可以应用。

VI、R1子代分析

从转化的愈伤组织再生的植物称为RO代或RO植物。通过RO代植物经各种有性杂交所产生的种子称为R1子代或R1代。当R1种子发芽后，所得植物也称为R1代。

为了证实重组DNA通过一个完整的生殖周期得以成功地传递和遗传，应该对R1代进行分析证明确实有转化DNA存在。该分析可用任何方法进行，如用上文提到的分析证实受轰击愈伤组织中转化的方法，但用于本分析试验时，以植物或植物部分替代愈伤组织。

对于不同的转化细胞系，重组可以表现出不同的遗传类型。例如，重组DNA可以按孟德尔法则遗传给子代。这种遗传类型包括重组DNA通过雄性和雌性配子进行传递，并稳定地整合或掺入到玉米核DNA上。另外一种遗传类型是母性遗传，重组DNA主要或全部地通过雌性配子进行传递。某一特定转化子的遗传类型可以通过分析经各种有性杂交的子代来确定。

VII、在其他玉米变种中建立重组DNA

为了将引入的重组DNA整合到所需种系或变种中，将可繁殖的转基因植物用于常规的玉米育种方案中。集中改良谷物的方法和参考文献已由Hallauer提供(1988)，此文作为本文参考文献。常规的育种过程应用的是一种转换方法(回交)。简言之，转换是通过初始的转基因繁殖植物与优良的近交系杂交完成的。从杂交获得的子代就可区分出那些植物带有重组DNA，那些不带有重组DNA。带有该DNA的植物再与优良近交系杂交，所得子代可再一次分离。重复这一回交过程，直至初始优良近交系转化成带有重组DNA，并具有最初亲本的所有重要特性种系为止。通常，该过程需要6-8代才能完成。一般，对于每一个优良系使用一个回交程序，使该优良系转化成从遗传工程性质上修饰的优良系。

一般说来，如果重组DNA能够掺入到许多不同杂合体中，所产生的转化玉米的商业价值是非常大的。一个农民一般生植几个在成熟期，耐受力和其它农艺特性方面不同的杂交品种。农民也必须根据他或她的地理位置来选择种植某种杂种。因为由于在某些特性如成熟期，抗病和抗昆虫能力等方面的不同，适应于某一地区的杂种通常不一定适应另一个地区。为此，重组DNA掺合到许多亲本种系中，以产生许多含有所需的异源DNA的杂合体是必需的。

谷物育种技术和把基因从一个种系或变种转至另一种系或变种所需要的技术是本领域内技术人员熟知的。因此，通过这些育种方法能将重组DNA引入到任何其它种系或变种中。

VIII、转基因植物的应用

希望本发明生产的转基因植物在商业和研究方面有广泛的用途。创立的转基因植物应用于传统的农业中，具有优良特性有益于生产者(如对害虫和除莠剂的抗性或增加产量等农艺特性)，有益于利用该植物的穗粒的消费者(如：改善人类食物或动物饲料中的营养成分)或有益于粮食加工者(如改善加工特性)。在这些应用中，植物生长成熟后其穗粒可用于人类食物或动物饲料。而且，植物的其它部分，包括茎、谷壳、无性繁殖部分等都有使用价值。如用作动物的青贮饲料或用作装饰目的。通常，提取到的谷物和其它农作物中的化学成分(如油或淀粉)可食用和工业上使用。创立的转基因植物可以使这些成分的含量增多或改变。

还发现转基因植物可用于制造商品旦白质或其它分子。从植物部分，种子等处提取或纯化出所需的分子。从植物分离出的细胞和组织可以在体外培养，生长或发酵生产这些分子。

转基因植物也可用于商业性的育种过程，或者与相关的谷物种类杂交或繁殖。由重组DNA编码所获得的改良性状可以通过例如原生质体融合技术从谷类细胞转至其他种类的细胞。

转基因植物在研究或育种方面有广泛的用途，包括通过插入诱变产生新的突变植物，以便鉴别通过传统突变和选择产生的有益突变种。将为用于产生遗传变异的可转移因子编码的重组DNA序列引入植物就是这样一个例子。也可以利用本发明方法产生具有独特“植物外形特征序列”或其它标记序列的植物，利用这些序列鉴定特定的种系或变种。

下面的非限制性实施例是对本发明的具体说明，提供这些实施例可更好地解释生产本发明的能稳定地表达重组DNA并将该重组DNA遗传给子代的可繁殖玉米植物的总过程。除了其它特别注明以外，所有部分分数和百分数都是重量比。必须认识到的是一种特异性转化现象发生的可能性是用于转化过程的许多物质的功能。因此，当出现按本文描述的转化过程没能产生转化产物这种个别情况时，重复这种转化过程是必要的。

实施例1

来自于愈伤组织系AB11的可育的转基因玉米植株。

I、建立和维持保留植物再生能力的玉米细胞培养物。

从用近交系B73植物的花粉(Iowa State University)给近交系A188植物(University of Minnesota，Crop Improvement Asso-ciation)授粉而产生的未成熟的杂交胚胎开始培养得到脆性的，胚胎形成的玉米愈伤组织培养物，当该胚胎长度达到1.5到2.0mm时收集幼穗。将每个穗在50％v/v市售漂白液(2.63％w/v次氯酸钠)中于室温下进行表面灭菌20分钟。然后用无菌的蒸馏的去离子水洗涤幼穗。无菌操作分离未成熟胚胎，并将其置于营养起始/维持培养基上，使根/茎轴显露于培养基中。起始/维持培养基(下文称″F培养基″)由含有2％(w/v)蔗糖的N₆基本培养基(chu 1975)，每升1.5mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，6mM脯氨酸，和0.25％Gelrite(kelco，Inc.，San Diego)组成。将pH调至5.8，然后进行高压蒸汽灭菌。除另有说明外，所有组织培养操作过程都在无菌条件下进行。

将未成熟胚胎在26℃下避光培养。估测起源未成熟胚胎的小盾片的细胞繁殖物的脆性度以及分化好的(well-defined)体细胞胚胎的存在。在该未成熟胚胎起始培养后，将具有这种形态学特征的组织转移到新鲜培养基中培养10到14天。然后将这种组织在一种常规主要成分培养基上每14到21天进行继代培养。从已经生长到大约1克大小的片状组织上取下60到80毫克量的组织，并将其转移到新鲜培养基中。传代培养经常要进行细心地观察监护以保证只保留正确形态的组织。体细胞胚胎的存在可以保证在合适条件下培养物长成植株。本实施例中所使用的命名为AB11的细胞培养物就是这样的一种培养物，并且在轰击之前已经培养了大约一年。

II.质粒

运用标准重组DNA技术在载体pBS⁺(Stratagene，Inc.，San Diego，CA)，一种3.2Kb环状质粒中构建质粒pHYGI1。将含有玉米AdhIS第一内含子的553bp Bcl-BamHI片段(Callis et al.1987)插入到CaMV35S启动子和pCHN1-1(一种根据实施例5构建的质粒)的潮霉素编码顺序之间。pHYGI1的结构如图1所示。pHYGI1的样本已于1990年3月16日保藏于典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA，根据布达佩期条约可以获得该样本，保藏号为40774。

pBII221含有大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶编码序列，该序列在5′端侧面区为CaMV35S启动子而在3′端侧面为noS多腺苷酸化序列。将玉米AdhIs第一内含子插入到35S启动子和pBI221的编码顺序之间而构建这种质粒(Jefferson et al.1987)。pBII221的结构图如图2所示。

通过微射弹轰击将质粒引入胚胎形成的愈伤组织培养物AB11。

III、DNA传递过程

在微射弹轰击之前将胚胎形成的玉米愈伤组织系AB11进行继代培养7到12天。将制备的AB11愈伤组织按下述方法进行轰击。把每簇大约湿重50mg的5簇愈伤组织交叉排列在一个无菌的60×15mm佩特里平板中心部位(Falcon1007)。将平板存放在一个有湿纸巾的密闭的容器中，进行轰击处理。制备12个平板进行这种处理。

严格按照Klein et al.(1988b)所述的方法将质粒覆盖在M-10钨颗粒(Biolistics)上，不同之处是，(i)使用两倍所说量的DNA，(ii)DNA沉淀到该颗粒上是在0℃下进行，和(iii)在整个轰击过程中将含有DNA包裹的钨颗粒的试管置于冰上。

所有试管含有25μl的50mg/ml在水中的M-10钨，2.5MCaCl₂2.5μl和100mM亚精胺10μl以及总量为5μl的1mg/ml质粒DNA。如果同时使用两种质粒，每种质粒的用量为2.5μl。一个试管只含有质粒pBII221；而另一个试管含有T.E.缓冲液(见下面的表2)。

将全部试管于冰上培养10分钟，在Eppendrof离心机中于室温下离心5秒钟沉淀颗粒，去掉25μl的上清液。将试管置于冰上进行轰击处理。对每个样品的轰击不超过5次。

从Biolistics公司(Ithaca，NY)获得大射弹和终止平板。按照厂家所述方法对它们进行灭菌。由Biolistics公司提供微射弹轰击仪器。

将样本平板盘置于微射弹轰击仪的终止平板盘底下5cm处，而终止平板处于最接近于该园筒的槽中。将如上述制备的愈伤组织平板培养物放在样本平板托盘中部，并去掉佩特里培养皿盖。将一种网眼为3×3mm，由电镀钢制成的7×7厘米方形的电镀硬钢丝筛网置于敞开的平板上以便在轰击中保留该组织。每次轰击时按照Biolistics公司所述方法对钨/DNA制备物进行超声处理，并吸取2.5μl的悬浮液置于大射弹顶部。按照制造商所述方法操作该仪器。所进行的轰击试验概括于表2中。

表22XpBII221制备物          用于确定瞬时表达频率7×pHYGI1/pBII221(1∶1)  作为一种可能性阳性处理以进行转化3×T.E.^a                阴性对照处理^a10mM Tris·HCl，       PH8.0，1mM EDTA

将用pBII221轰击的两个愈伤组织培养平板以平板对平板的方法转移到F培养基(不含潮霉素)中，并将愈伤组织于26℃下避光培养。2天之后，再将这种愈伤组织以平板对平板的方法转移到35×10mm大小的，含有2ml的GUS测试缓冲液(1mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸)(Research Organics)，100mM磷酸钠PH7.0，各5mM的铁氰酸钾和亚铁氰酸钾，10mMEDTA，和0.06％Tritonx-100的佩特里培养皿中(Falcon 1008)。把平板在37℃下培养3天，之后计算兰色细胞数，得出两个平板中观察到的瞬时GUS-表达细胞的总数，分别为313和355，这表明其他被轰击平板中也出现了DNA传递过程。由于GUS测试是损伤性的，因而在计数之后弃去GUS测定试验中所使用的组织培养物平板。

IV.选择性过程

当培养基冷却到45℃时，在倒入平板培养皿之前，加入适量体积的过滤消毒的溶于水中的100mg/ml潮霉素B，使潮霉素B(Calbiochem)掺入到培养基中。

在全部样品被轰击处理之后，立即用pHYGI1/pBII221对所有平板中的愈伤组织进行处理，并且将两个T.E.平板培养皿以平板对平板方式转移到含有15mg/l潮霉素B的F培养基中，(每个平板10片愈伤组织)。这被称之为1轮选择平板。将T.E.处理平板中的愈伤组织转移到不含有潮霉素的F培养基中。将这种组织每2-3周继代培养到非选择性培养基上，被称之为非选择性对照愈伤组织。

选择14天之后，在选择性和非选择性培养基中出现的组织基本相同。将七个pHYGI1/pBII221平板和1个T.E.处理的平板中的全部愈伤组织从1轮选择平板中转移到含有60mg/l潮霉素的2轮选择平板中。2轮选择平板每个平板中含有10个30mg的愈伤组织片，从而扩大了平板的总数。

2轮选择平板培养21天之后，将全部材料转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择平板上。轰击后79天，检查3轮选择平板系列中的愈伤组织的存活部分。其中一部分是从用pHYGI1/pBII221处理的平板上坏死组织背景中增生产生的。这部分被命名为PH3，并且将其转移到不含有潮霉素的F培养基中。

在不含潮霉素的F培养基上培养19天后，将PH3转移到含有60mg/l潮霉素的F-培养基中。发现PH3能够在60mg/l潮霉素存在下通过多次继代培养而维持生长。

V.已转化愈伤组织的证实

为证明PH3愈伤组织已获得潮霉素抗性基因，按照与实施例5相同的方法从PH3愈伤组织和未选择的对照愈伤组织中分离基因组DNA，并且进行Southern吸印试验分析。将分离的DNA(10μg)用BamHI(NEB)进行消化，并在0.8％W/V琼脂糖凝胶上于TAE缓冲液(40mMTris-乙酸盐，PH7.6，1mMEDTA)中以15V电压电泳16小时。把该DNA转移到一种Nytran膜上((Schleicher and Schuell)。转移、杂交和冲洗条件按厂家的建议执行。

用一种带有α-³²P-dCTP(ICN Radiochemicals)的寡聚标记药盒(Pharmacia)按照厂家说明进行随机的引物标记而制备一种³²P标记的探针。所用的模板DNA是含有全部HPT编码顺序的pHYGI1的1055bp BamHI片段。

在一个x-OMATIC盒中使膜在Kodak x-OMAT AR胶片上曝光进行加强扫描。在所希望的1.05Kb位置处发现一条对应于PH3愈伤组织的谱带，表明存在有HPT编码顺序。对应于对照愈伤组织的膜上没有标记的谱带。

为了证明潮霉素基因已整合到高分子量DNA中，按照上述的方法将来自PH3愈伤组织和对照愈伤组织的未消化DNA进行电泳，吸印分析和杂交。只有未消化的PH3DNA以相等于未切割DNA的泳动度表现出与探针发生杂交。没有发现对照愈伤组织的DNA发生杂交反应。这些结果表明HPT编码顺序并不作为完整的pHYGI1或作为一种小的非染色体质粒存在于PH3愈伤组织中。这些结果与潮霉素基因结合到大分子量DNA中是相一致的。

VI、植物再生和种子的产生

将部分PH3愈伤组织直接从含有60mg/l潮霉素的平板中转移到含有MS基础盐(Murashige et al.1962)和加补有硫胺·HCl0.5mg/l，2，4-D0.75mg/l，蔗糖50g/l，天冬酰胺150mg/l，以及Gelrite2.5g/l(Kelco Inc.，San Diego)的RM5培养基中。

在RM5培养基上培养14天之后，将大部分PH3和未选择的对照愈伤组织转移到R5培养基中(RM5培养基，只是去掉了2，4-D)。在26℃下将这种平板避光培养7天，并将其转到以14小时光照和10小时黑暗的光照方式在26℃进行14天。此时，将形成的小植物转移到一个含有100mlR5培养基的夸脱罐装瓶(Ball)中。将植物从罐头瓶中转移到蛭石中生长7到8天，然后将它们移植到土壤中，使之生长到成熟。从PH3中生长出总共45棵植物而对照愈伤组织中生长出总共10棵。

通过标准技术用近交Zea mays系MBS501(Mike Brayton Seeds)，FR4326(illinois Foundation Research)和专利所有的近交系LM1112对成熟PH3植物进行控制授粉。在授粉45天采集种子，并使之进一步干燥1-2周。

VII、R1子代分析

通过PCR分析检测R1植物中HPT和GUS基因顺序的存在。用一种酶分析试验测定HPT活性而测定该HPT基因的表达。表3概括了数据结果。这些数据表明了重组DNA通过父代和母代亲本进行遗传和表达，且符合孟德尔遗传规律。Southern印迹表明HPT编码顺序整合到来源于愈伤组织的高分子量DNA，且与这些遗传数据结合在一起说明前面所说的DNA顺序是从染色体结构上整合的。R1后代中GUS基因顺序的存在表明了一种未选择基因的共同转化和遗传。

      表

PH3的R1后代分析

    转化体

亲本：MBS501×PH3.4

                   PCR分析PH3.4植株  酶HPT分析   HPT    GUS4.1        -         -      -4.2        +         +      +4.3        +         +      +4.4        -         -      -4.5        +         +      +4.6        +         +      +4.7        +         +      +4.8        -         -      -4.9        -         -      -

亲本：LM1112×PH3.18  18.1    -    -    -18.2    +    +    +18.3    -    -    -18.4    -    -    -18.5    +    +    +18.6    +    +    +18.7    +    +    +18.8    +    +    +18.9    +    +    +18.10   +    +    +

亲本：PH3.2×FR4326

               PCR分析

   酶植株   HPT分析   HPT   GUS2.1    -         -      -2.2    -         -      -2.3    +         +      +2.4    -         -      -2.5    +         +      +2.6    -         -      -2.7    +         +      +2.8    +         +      ND2.9    -         +      ND

      对照

亲本：TE 3.1×oh433.1    -    -    ND3.2    -    -    ND3.3    -    -    ND3.4    -    -    ND3.5    -    -    ND3.6    -    -    ND3.7    -    -    -3.8    -    -    -3.9    -    -    -3.10   -    -    -3.11   -    ND   ND3.12   -    ND   ND3.13   -    ND   ND3.14   -    ND   ND3.15   -    ND   ND3.16   -    ND   ND3.17   -    ND   ND3.18   -    ND   ND3.19   -    ND   ND3.20   -    ND   ND3.21   -    ND   ND

3.22    -    ND    ND

3.23    -    ND    ND

3.24    -    ND    ND

根据下列方法进行HPT酶分析：S.K.Datta et al.，Bio/Tech-nology，8,736(1990)，M.Staebell et al.，Anal.Biochem.，185,319(1990)，和E.Cabanes-Bastos，Gene，77169(1989)。

从生长7-10天的幼苗上切下根的样本(0.2g)，并将其迅速冷冻在液氮(N₂)中。用一种随意使用的研棒和管(Kontes)将样本加氧化铝和400μlEB(50mM Tris-HCl，10％V/V甘油，0.1mMPMSF，PH7.0)一起研磨30-60秒，然后在一种Eppendorf微量离心机中离心10分钟。将上清液转移到一种Centricon 30滤器装置上，并将其在一种Beckman GPR离心机中用固定角度转头以5000rpm的转速于4℃下离心30分钟脱盐。用1ml的EB冲洗每个过滤装置，再以5000RPM的转速离心60分钟。然后回收保留物，并将其存放于-70℃下。按照上述方法将转基因的和未选择的对照愈伤组织样本(0.2g)进行研磨，使用其上清液做为正负对照。

使用Bradford，Anal.Biochem.，72,248(1976)的方法用一种BioRad药盒对蛋白进行定量。根提取物中的蛋白浓度范围是0.2-2μg/ml。

将根提取物(4μg总蛋白)加入到一种含有20mM Tris-马来酸盐(maleate)，13mMMgCl₂，120mMNH₄Cl，0.5mMDTT，50μMATP，0.61μg/μl潮霉素B，25μg/μl牛血清白蛋白，和12μCiγ³²P-ATP的反应混合物中。反应体积是33μl。将反应混合物于37℃下培养30分钟。

将1μl的反应混合物点样到一种聚乙烯亚胺纤维素薄层色谱分析平板上(Sigma Chem.Co.)。将平板在50mM PH5.4的甲酸中显影，空气干燥，并曝光于Kodak XAR-5胶片上。在这些条件下反应产物，磷酸潮霉素迁移到接近于溶剂的前面。

从植物组织中取下0.1g样本并冷冻于液氮当中以进行PCR测定。然后将样本与120粒度金刚沙在200μl0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，20mM EDTA，1％ Sarkosyl PH8.5中于4℃下进行研磨。接着进行苯酚/氯仿提取，以及乙醇和异丙醇沉淀，将样本悬浮于T.E.中，通过聚合酶链反应进行分析(K.B.Muullis，美国专利No.4,683,202)。

在100μl体积中含有50mMKCl，10mM Tris-Hcl PH8.4，3mMMgCl₂，100μg/ml明胶，各0.25μM的几种合适引物，0.2mM的每种三磷酸脱氧核苷(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，2.5单位的Taq DNA聚合酶(Cetus)和10μl的DNA制备物的反应液中进行PCR。混合物上盖一层矿物油，加热至94℃3分钟，并以55℃下反应1分钟。72℃下1分钟，94℃下1分钟的周期扩增35次。然后将混合物在50℃下培养2分钟，再在72℃下培养5分钟。取10μl的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，并且通过用溴化乙锭染色后进行观察。

为了分析HPT基因的存在，使用了一种互补于35S启动子的PCR引物，和一种互补于HPT编码顺序的PCR引物。因此，为了产生大小合适的PCR产物，HPT模板DNA必须含有邻近的35S启动子区域，AdhI内含子，和5′蛋白编码顺序区域。

为了分析GUS基因的存在，使用了与位于GUS蛋白编码区中顺序互补的PCR引物。如模板DNA含有两个引物之间的完整编码区，则可以推断出一种797bp PCR产物。实施例II

来自含有为一种种子蛋白编码的重组DNA的愈伤组织系AR63S的可育转基因植株

在玉米粒的内胚乳中产生10·KD-玉米贮藏蛋白，这种蛋白是称为“种子贮藏蛋白”这一类蛋白质中有代表性的一种。这种蛋白质含有极高量的蛋氨酸(22.5％)，且该蛋白是由Zps10/(22)基因编码的(M.S.Benner et al.，Tbeor，Appl.Genet.，78,761(1989))；这种基因本文称之为Z10。因此，提高Z10基因的表达可增加玉米中蛋氨酸含量。通过使用实施例1的方法稍加修改可以产生含有一种嵌合Z10基因的可繁殖的转基因玉米。实施例II还说明了运用一种不同于实施例I中所用的愈伤组织系引入重组DNA。

I、组织培养系

通过实施例I中所述的起始和维持方法，从优良近交系A188和B73杂交所产生的未成熟胚胎中制备本实施例中所用的命名为AB63S的胚胎形成的玉米愈伤组织系。在轰击之前愈伤组织系已经开始培养了大约7个月。轰击前11周时将该组织挤压通过一种1.9mm的筛进行过筛，并置于N6维持培养基上。生长1-2周之后从所得到的组织中选择脆性的胚胎形成愈伤组织，并将其转移到新鲜的培养基上使之生长1.5-3周，再次过筛。这种易碎愈伤组织的过筛和再获得的循环过程总共进行3次，然后对该组织轰击。

II、质粒

本实施例中使用了实施例1中所述的质粒pHYGI1和pBII221。另外，在DNA/钨制剂中包含了质粒pZ27Z10。通过标准的重组DNA技术运用载体pUC118(J.Vieira et al.，Methods Enzymol.1533(1987))，一种3.2kb的环状质粒，来构建质粒pZ27Z10。pZ27Z10含有来源于本文中称之为Z27的一种玉米27KD-玉米蛋白基因(D.E.Geraghty，Ph.D.Thesis，University of Minnesota(1987))的，直接毗连于编码区的5′转录调节区和来源于一种本发明称之为Z10的玉米10KD-玉米蛋白基因(Kirihara et al.，Gene，7,359(1988))的3′非编码顺序。本文将Z27调节顺序和Z10编码及3′顺序的结合体称之为嵌合Z27-Z10基因。来源于与35S启动子毗邻的CaMV基因组区的多聚A信号定位于pZ27Z10中3′端到Z10基因顺序之间。图7表示这种质粒的结构图。

一个质粒pZ27Z10的样品已经寄存于美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，根据布达佩斯条约以保藏号ATCC 40938可以获得。

III、DNA传递过程

在进行微射弹轰击之前将从玉米胚胎形成的愈伤组织系AB63S中得到的组织进行继代培养3周。将该组织过1.9mm的筛以制备用于轰击的组织。把过筛的组织置于无菌的5.5cm Whatman 1号过滤盘上，每盘放置约500mg组织的一个薄层。制备总共6个组织盘。在进行微射弹轰击之前将这些含有组织的过滤盘转移到空的佩特里平板中。通过把平板在一个层流的流动罩中敞开放置20分钟使该组织稍微脱水。为了防止组织进一步脱水，将平板存放在一个高湿度的盒子中直到用于进行轰击。

用于进行轰击的DNA由质粒pHYGI1，pZ27 Z10和pBII221的1∶1∶1混合物(重量比)组成。按照如实施例1中所述的方法将DNA沉积到钨颗粒上。

除了使用Biolistic^TMPDS1000(Dupont)仪器和组织上不放置筛网外，其他按照实施例1中所述的方法进行轰击。按照下述方法对6个含有愈伤组织的过滤盘进行处理：对2个滤盘各自用DNA/钨制剂进行轰击两次(可能的阳性处理2X)；将三个滤盘各自用DNA/钨制备物进行轰击1次(可能的阳性处理1X)，对1个滤盘用一种钨/水悬浮液轰击一次，其中钨的用量与DNA/钨轰击时的用量相同(负对照处理)。

IV、已转化的愈伤组织的筛选

轰击之后，将从2XDNA处理后得到的含有愈伤组织的滤盘转移到1轮选择平板上：含有15mg/l潮霉素的F培养基。将1XDNA处理的两个滤盘和负对照处理的滤盘也转移到1轮选择培养基中。把1XDNA处理的第三个滤盘转移到不含潮霉素的F培养基上，用作未选择的对照愈伤组织。由于这种未选择的对照愈伤组织有可能是阳性，因此为了进行比较只将其保留进行前两轮的选择；接着使用维持于不含潮霉素的F培养基中的未经轰击的AB63S愈伤组织作为未选择的对照愈伤组织。

五天之后将愈伤组织以小块为单位(大约25mg)从滤盘中转移到新鲜的1轮选择培养基上。平板密度为每平板10个愈伤组织块。此时愈伤组织重量已经增加了大约2倍。将未选择的对照愈伤组织以同样的方式转移到不含潮霉素的F培养基中。轰击后19天，把所有的组织从1轮选择培养基中转移到2轮选择培养基中(含有60mg/l潮霉素的F培养基)，这次转移的平板密度为每平板14个愈伤组织块。由于以前的转移在14天内这些愈伤组织的体积已经增加了大约3倍。23天之后，将所有的愈伤组织从2轮选择培养基中转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择培养基中。

轰击后59天，发现在坏死愈伤组织块周围有五个活的增殖部分。这五个部分被认为是从2轮选择中的同一个愈伤组织块中生长出的，因为它们在前面转移过程中的连续平板中表现为互相邻近的关系。这些组织产生于2XDNA处理组，被命名为愈伤组织系Met1。

把愈伤组织系Met1转移到含有60mg/l潮霉素的F培养基和不含有潮霉素的培养基中。培养22天之后，在两类培养基中没有发现组织的生长或形状有什么区别。愈伤组织系Met1能快速地生长而且似乎不受培养基中潮霉素存在的抑制。每种培养基中的Met1愈伤组织表现为高度脆性和胚胎形成性质，并且与不含有潮霉素的F培养基中生长的对照AB63S愈伤组织看上去没有区别。

V、已转化愈伤组织的确定

用Met1愈伤组织和对照A63S愈伤组织进行抑制研究。在开始抑制研究之前，将Met1愈伤组织在不含潮霉素的培养基中生长21天。将Met1愈伤组织和对照AB63S愈伤组织转移到含有0，15，60，100和200mg/l潮霉素的F培养基平板上。对应于每个潮霉素浓度制备每种愈伤组织系的三个平板；每个平板含有5或6片大约每片50mg的愈伤组织(每平板中总愈伤组织大约为300mg)。

培养28天后，测量每个平板上的愈伤组织的重量。通过用从每个潮霉素浓度的平板中所得愈伤组织的平均重量除以0mg/l潮霉素平板中所得愈伤组织的平均重量，求得生长抑制百分率。结果表明Met1愈伤组织的生长在15，60和100mg/l的潮霉素浓度下完全没有被抑制。在含有200mg/l潮霉素的培养基中Met1愈伤组织的生长有大约20％被抑制。相对而言，AB63S愈伤组织的生长在所有浓度的潮霉素存在时都被抑制；在200mg/l潮霉素存在时，AB63S愈伤组织的生长有90％被抑制。这些结果证实愈伤组织系Met1对生长培养基中存在的潮霉素表现出抗性。

运用Southern印迹分析来证明Met1愈伤组织DNA中存在有潮霉素抗性基因，并确定该愈伤组织是否也具有嵌合Z27-Z10基因。为了检查HPT编码顺序，用限制性内切酶BamHI，HindIII和BstEII对从Met1愈伤组织和从对照愈伤组织中分离出的DNA样本进行消化。将消化的DNA样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳并按实施例1中所述方法使之吸印到一种Nytran膜上。在吸印之前对溴化乙锭染色的凝胶进行光学检查发现BamH1消化显示是完全性，而HindIII和BstEII都没有在有效的程度上切割DNA样本。用一种来自HPT编码顺序的生物素标记的1.05kb BamHI片段对印迹进行探测。进行杂交反应、洗涤和检测的条件按照本实验中所用的一种BRL:Photogene^TM药盒的说明使用。

杂交反应之后，含有用BamHI消化的Met1DNA的泳道上可观察到在所期望的1.05kb大小处和大约2.7，4.5以及6.5kb处有带标记的谱带。这些结果表明HPT编码顺序存在于愈伤组织系Met1的DNA中。在2.7，4.5和6.5kb处的谱带表明或者是限制性酶消化不完全，或者是存在有HPT顺序的多个重排的拷贝。对于HindIII和BstEII消化来说，在两个泳道上未消化DNA的位置处可以观察到杂交反应信号。这一结果说明HPT编码顺序已被整合到Met1基因组中的高分子量DNA中去。在任何含有对照愈伤组织DNA的消化物的泳道上没有发现杂交反应信号。

为了检测嵌合Z27-Z10基因，使用从Met1愈伤组织和对照愈伤组织中分离的DNA样本进行Southern吸印分析。用限制性酶BamHI和EcoRI对DNA样本进行消化。BamHI消化可以产生一个2.76kb的片段，该片段含有来源于转化反应中所用的PZ27Z10构建物的Z10编码顺序和3′非编码顺序。在7.26kb PZ27Z10质粒中有一个单一EcoRI位点。使用Photogene药盒(BRL)中所述的条件，用一种含有完整Z10编码顺序的生物素标记的探针与制备的印迹进行杂交。

对于BamHI消化产物来说，内源性Z10顺序在含有Met1和对照愈伤组织DNA的泳道上在9kb和大约15kb处表现出杂交信号。在Met1样本中于大约3.5kb处可以观察到另外一条谱带，但在对照DNA样本中则没有。在Met1DNA中于所希望的2.76kb大小处没有发现强烈的杂交反应信号。在Met1DNA的BamHI消化物中缺少一条2.76kb的标记谱带表明或者是该DNA的消化不完全，或者是所引入DNA的重排。

对于用EcoRI进行消化，在Met1和对照愈伤组织DNAs中，内源性Z10顺序在大约12kb和16kb处显示出杂交反应信号。在Met1样本中大约14kb处可以观察到一条另外的谱带但在对照愈伤组织DNA样本中没有。这些结果表明新的Z10顺序存在于Met1愈伤组织的DNA中而不存在于对愈伤组织DNA样本中。

这些结果可以通过用BamHI，NcoI和NsiI消化Met1和对照愈伤组织DNAS进行第二次Southern印迹分析而得到证实。来源于Met1和对照愈伤组织的未消化DNA的样本也包括在内。用一种³²P-标记的Z10编码顺序探针探测该滤盘。在全部的消化物中，Met1愈伤组织DNA中可以观察到新的Z10杂交反应信号，而在负对照愈伤组织DNA样本中则不存在。这些结果表明在Met1愈伤组织中存在新的Z10编码顺序，在含有未消化DNA的泳道上，在来源于Met1和对照愈伤组织的未消化DNA的位置处观察到杂交反应信号。这些结果表明，引入的Z10顺序已整合到Met1愈伤组织的染色体DNA中。

VI、植株再生和转基因种子的产生

按照实施例1中所述的方法将来源于Met1系和来源于对照系AB63S的愈伤组织置于RM5培养基中。在26℃下避光培养14天之后，如实施例1中所述将愈伤组织转移到R5培养基中。该愈伤组织在26℃下避光培养7天，然后转移到如实施例1中所述条件下的光照处。光照14天之后，将小植物转移到含有100mlR5培养基的Magenta盒中(Sigma Chemical Co.)。在这种培养基中培养7-14天后，再把小植物转移到蛭石生长7天，然后转移到土壤中使之生长至成熟。从Met1愈伤组织中再生出总共49个植株(命名为Met1-1到Met1-49)，而从对照AB63S愈伤组织中再生出总共25个植株。

对从叶组织中制备的DNA样本进行PCR分析以证明从Met1愈伤组织中再生的植物已经保留了引入的DNA。为此，使用一组6个寡聚脱氧核苷酸。这些寡聚核苷酸的顺序、它们在图8所示嵌合Z27-Z10基因结构中的定位以及相对位置概括为下述的表4

表4

I、嵌合Z27-Z10基因中寡聚核苷酸名称/位置

1、  Z27-5′    nt    132-156

2、  Z27-MID    nt    628-651

3、  Z27-3′    nt    1081-1104

4、  Z10-5′    nt    1182-12065、Z10-MID  nt  1420-14446、Z10-3′  nt  1548-1571

II、从寡聚核苷酸对中得到的扩增片段的大小

A.内源性或嵌合基因对

(1)+(3)    972   BP

(2)+(3)    476   BP

(4)+(6)    389   BP

(4)+(5)    262   BP

B、特异性嵌合基因对

(1)+(6)    1439  BP

(1)+(5)    1312  BP

(2)+(6)    943   BP

(2)+(5)    816   BP

设计一套寡聚核苷酸(或引物)，以便于使用由一个Z27寡聚核苷酸(Z275′或Z27mid)和一个Z10寡聚核苷酸(Z10mid或Z103′)组成的一个寡聚核苷酸对可以只使来源于嵌合Z27-Z10基因的片段扩增，而不使来源于内源性玉米Z27或Z10基因的片段扩增。在使用这些Z27-Z10-特异性寡聚核苷酸对进行的PCR反应中出现所希望大小的扩增片段，可以确定在某一特定愈伤组织或植物DNA样本中有嵌合Z27-Z10基因的存在。

当用对照AB63S愈伤组织DNA，Met1愈伤组织DNA或pZ27Z10质粒进行PCR反应时，使用一对Z27寡聚核苷酸(Z275′或Z27mid和Z273′)或一对Z10寡聚核苷酸(Z105′和Z10mid或Z103′)可以分别引起代表Z27调节顺序或Z10编码顺序的片段扩增。这些反应做为来源于某一特定愈伤组织或植物DNA样本的内源性玉米基因顺序扩增的阳性对照。

按照下述方法从两种Met1RO植物(命名为Met1-1和Met1-2)和从一种对照AB63SRO植物中制备叶DNA。使用与HPT编码顺序，嵌合Z27-Z10基因，Z27调节顺序和Z10编码顺序特异性的寡聚核苷酸对，用这些DNA样本进行PCR反应。PCR反应产物的凝胶分析表明在使用Met1-1DNA和Met1-2DNA的所有反应中可以获得所希望大小的扩增反应产物。对照AB63SDNA表现出HPT编码顺序和嵌合Z27-Z10基因阴性，但对于内源性Z27调节顺序和Z10编码顺序表现为阳性。这些结果表明所检查的Met1Ro植物中已经保留了引入的HPTDNA和嵌合Z27-Z10DNA。

为了确证诊断的Z27-Z10PCR反应产物中含有Z27调节顺序和Z10编码顺序，对PCR反应产物进行Southern印迹分析。从两个载有相同样本的琼脂糖凝胶中制备Southern印迹滤纸。该样本含有从上述Z27调节顺序，Z10编码顺序和嵌合Z27-Z10基因顺序的扩增反应中产生的PCR反应产物。用Z10编码顺序探针与一个印迹杂交而另一个印迹与一种Z27调节顺序探针进行杂交。结果表明Z10编码顺序探针可以与从Z10编码顺序PCR反应和嵌合Z27-Z10基因PCR反应中产生的扩增片段进行杂交，但不与从Z27调节顺序的PCR反应中得到的扩增片段进行杂交。相类似的是，Z27探针可以与从Z27调节顺序PCR反应和嵌合Z27-Z10基因PCR反应中得到扩增片段进行杂交，但不与从Z10编码顺序PCR反应中得到的扩增片段进行杂交。这些结果表明PCR反应中扩增的片段含有所希望的基因顺序，并且诊断的嵌合Z27-Z10基因的PCR扩增反应产物含有Z27调节顺序和Z10编码顺序。

用近交玉米系A188，B73，A654和H99对成熟的Met1Ro植物进行控制授粉。另外，进行几次自我和同属植物授粉。使用Met1Ro植物即作为雄性花粉供体又作为雌性花粉受体，进行总130次授粉。在授粉后45天采集成熟种子，并使之进一步干燥1-2周。

VII、R1子代分析

通过对来自三组R1子代的R1植物组织DNA的PCR分析，估测HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因的存在。

分析的第一组R1子代由来源于RO植物Met1-7的4个未成熟穗状雄花种子组成。可以通过对从Met1-7的穗状雄花发展成的须毛进行开放授粉获得这些穗状雄花种子。大约授粉后18天，从植物上取下穗状雄花种子并进行表面消毒。切下每个种子的胚乳并置于干冰上冷冻，存放于-70℃下直到用于进行DNA分离。

将每个种子的胚胎转移到R5培养基中并使之繁殖。10天之后，将幼苗转移到蛭石上生长7天，然后再转移到土壤中，使之生长至成熟。使用对HPT编码顺序，嵌合Z27-Z10基因和玉米Adh-1基因有特异性的寡聚核苷酸系列对从每个胚乳中分离的DNA进行PCR分析。发现4个胚乳DNA样本中有3个对全部上述基因顺序表现阳性。第四个胚乳DNA样本对HPT编码顺序和嵌合Z27-Z10基因顺序表现阴性但对内源性Adh-1顺序表现阳性。这些结果表明HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因已经被遗传到Met1-7的R1子代中。

用从杂交A654×Met1-1中得到的24个种子进行类似的分析。授粉24天后，将种子从穗上取下并进行表面消毒。按照上述方法分离和处理胚乳和胚胎。对这种胚乳DNA样本的PCR分析表明24个子代中有9个已经接受HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因。剩余的15个子代不携带有任何引入的基因顺序。分析的第三级R1子代由RO植物Met1-6自我授粉产生的28个R1植物组成的。从28个两周龄幼苗的叶组织中制备DNA样本。

对叶DNA样本的PCR分析表明24个R1子代携带有HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因。剩余的4个R1子代不携带任何引入的基因顺序。上述描述的分析结果概括在表5中，并且表明大部分的Met1植物的R1子代遗传有引入的DNA。

                      表5

       Met1植物交配子代中的引入的HPT序列

             和嵌合Z10基因的遗传

             异型杂交        自体授粉

          (A654×Met1-1)     (Met1-6)基因型        子代数           子代数HPT+/Z27Z10+      9/24             24/28HPT+/Z27Z10^-     0/24             0/28HPT^-/Z27z10+     0/24             0/28HPT^-/Z27Z10^-    15/24            4/28远亲杂种群体中Z27Z20+/HPT+植株数与Z27Z10-/HPT-植株数之比例符合单基因位点的1∶1分离比率。此外，自体授粉产生的植物群体中Z27Z10+/HPT+植株数与Z27Z10-/HPT-植株数之比例符合单基因位点3∶1分离比率。这些数据还表明了引入的HPT序列和Z27-Z10序列之间的连锁。

实施例III

由含有为杀虫剂蛋白质编码的重组

DNA的愈伤组织系AB12产生的能繁

殖的转基因植物

由各种苏云金芽孢杆菌基因编码的蛋白质在许多农药的应用中非常有用。生产常有特异性异源Bt基因的转基因玉米作物可以提高植物对特异性害虫的抗性。可根据实施例I的方法，按照下文所述，作几点小改变制备含有一个重组Bt基因的能繁殖的转基因植物。

在实施例I中的愈伤组织系AB11开始制备的同时，制备另一种愈伤组织系AB12是由带有相同基因型的植物单独杂交(A188×B73)产生的。这个实施例表现了能繁殖的转基因植物从除AB11和AB63S以外的第三个愈伤组织系再生，同时证明了能繁殖的转基因植物的产生不只是单一愈伤组织系的唯一特性。

这里使用了实施例I中所述的质粒pHYGI1同时也利用了pMS533，这种质粒含有在阅读框架中与新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因融合的杀虫剂苏云金杆菌内毒素(Bt)基因。CaMV和兰伊红合成酶启动子的DNA片段定位于融合基因的5′位置上。融合基因3′位置是来源于番茄蛋白酶抑制剂I基因和兰伊红合成酶基因的多聚腺苷区域的DNA片段。

除了在钨/DNA制剂中使用的DNA含有质粒pHYGI1和pMS533外，与实施例I中相同方法，轰击愈伤组织。一个试管只含有5μlTE(10mM Tris-HCl PH8.0，1mM EDTA)。

进行如下的轰击试验：11×pHYGI1/pMS533(潜在的正处理)和3×TE制剂(对照处理)。

轰击后，从pHYGI1/pMS533处理得到的愈伤组织放在1轮选择性平板上，其中F培养基含有15mg/l的潮霉素(每个平板含有十片愈伤组织)。同样方法制备两个用TE制剂轰击的平板(选择对照愈伤组织)。其中一个用TE制剂轰击的平板放在没有潮霉素的F培养基上。这个愈伤组织在整个实验中保留作为对照组织的来源(非选择对照愈伤组织)。

18天后，将愈伤组织从1轮选择性平板中转移到2轮选择性平板上，2轮平板含有60mg/l潮霉素(每个平板上有10个30mg的愈伤组织片)。二十一天后，在2轮选择性平板上选择愈伤组织显现出完全被抑制。将所有的愈伤组织从2轮选择性平板转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择性平板上。

在3轮选择平板上培养42天后，从坏死的组织周围增殖出六个扇形部分，都是从pHYGI1/pMS533处理的材料中产生的。将愈伤组织系转移到F培养基。

二十四天后，命名为CB2的一个愈伤组织系基本上成熟。然后将每个愈伤组织系的部分转移至(i)含有15mg/l潮霉素的F培养基，或(ii)含有60mg/l潮霉素的F培养基。对照愈伤组织放在含有15mg/l潮霉素的F培养基基上。

六个愈伤组织系中只有一种CB₂能够在60mg/l潮霉素的存在下通过多次继代培养而持续生长。从该愈伤组织的部分中分离出DNA并用Southern印迹分析证实Bt基因的存在。

用限制酶BamHI和XhoI共同消化DNA。BamHI在Bt编码序列的5′位末端切割。xhoI在编码区域的3′末端切割。由pMS533的1.8kbBamHI/xhoI限制性片段制备一种³²P标记的探针。杂交和放射自显影后可观察到，预料中的1.8kb谱带。来自未转化的愈伤组织的DNA中未观察到谱带。

如上文所述从CB₂再生植物，进行控制授粉产生R1子代。对R1植物进行PCR分析以检验HPT和Bt基因序列的存在，用实施例I中的酶分析方法检验HPT基因表达。

用实施例I中描述的方法对从R1幼苗根组织中分离出的DNA进行PCR分析。为了检验每个DNA样品适用于PCR分析，用对本地玉米10KD玉米蛋白基因具有特异性的引物进行PCR分析。用于Bt基因PCR分析的引物，一个与35S启动子互补，一个与Bt编码序列互补。用于HPT的PCR分析的引物与实施例I中的相同。分析结果列于表6。结果表明引入的HPT和Bt基因通过雄性和雌性亲本传递并且观察的频率与孟德尔遗传规律相一致。该结果符合HPT和Bt基因插入染色体DNA的结果。还发现HPT和Bt基因连锁遗传，表明两种基因一起紧挨着插入到相同染色体中。

                表6

           CB2的R1子代分析A.转基因                       对照CB2.8×FR4326            AB12.7×FR4326分析                        分析

 10Kd  HPT  BT   HPT        10Kd  HPT  BT   HPT植株 PCR   PCR  PCR  酶    植株 PCR   PCR  PCR  酶1    +     +    +    +       1    +    -    -    -2    +     +    +    +       2    +    -    -    -3    +     -    -    -4    +     +    +    +5    +     +    +    +6    +     -    -    -7    +     +    +    +8    +     -    -    -9    +     +    +    +10   +     -    -    --  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -B.转基因                       对照CB2.11×LB101              AB12.4×LB101分析                        分析

 10Kd  HPT  BT   HPT        10Kd  HPT  BT   HPT植株 PCR   PCR  PCR  酶    植株 PCR   PCR  PCR  酶1    +     -    -    -      1    +    -    -    -2    +     +    +    +      2    +    -    -    -3    +     -    -    -4    +     +    +    +5    +    -  -    -6    +    +  +    +7    +    -  -    -8    +    -  -    -9    +    -  -    -10   +    -  -    +-  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -C.转基因                对照CB2.7×LM1112      AB12.5×LM1112分析                 分析

 10Kd  HPT  BT          10Kd  HPT  BT植株 PCR   PCR  PCR    植株 PCR   PCR  PCR1    +     -    -       1    +    -    -2    +     +    +       2    +    -    -3    +     -    -4    +     -    -5    +     +    +6    +     +    +7    +     +    +8    +     +    +9    +     -    -10    +   -   --  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -D.转基因                对照FR4326×CB2.9      FR4326×AB12.1分析                 分析

 10Kd  HPT  BT          10Kd  HPT  BT植株 PCR   PCR  PCR    植株 PCR   PCR  PCR1    +     -    -        1    +    -    -2    +     +    +        2    +    -    -3    +     +    +4    +     +    +5    +     +    +6    +     -    -7    +     +    +8    +     +    +9    +     -    -10   +     -    --  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -E.转基因                  对照A188×CB2.1          A188×AB12.2

分析                 分析

10Kd  HPT  BT             10Kd  HPT  BT植株PCR   PCR  PCR       植株 PCR   PCR  PCR1    +    +    +           1    +    -    -2    +    +    +           2    +    -    -3    +    +    +4    +    -    -5    +    +    +6    +    -    -7.   +    +    +8    +    +    +9    +    -    -10   +    -    --  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -F.转基因                  对照LM1112×CB2.2         LM112×AB12.6

分析                  分析

 10Kd  HPT  BT           10Kd  HPT  BT植株 PCR   PCR  PCR    植株  PCR   PCR  PCR1    +    -  -    1    +    -    -2    +    -  -    2    +    -    -3    +    -  -4    +    -  -5    +    -  -6    +    -  -7    +    -  -8    +    +  +-  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -

实施例IV

由通过两个完整有性生殖周期传递重组DNA的愈伤组织系AB12产生的能繁殖的转基因植物

I.植物系和组织培养

使用愈伤组织系AB12，该愈伤组织描述于实施例III。

II、质粒

使用实施例I所述的质粒pBII221和pHYGI1。

III、DNA传递过程。

如实施例I中方法轰击愈伤组织，不同的是所用钨/DNA制剂中的DNA不相同。所有试管含有25μl50mg/ml M-10钨(在水中)，25μl 2.5MCaCl₂，10μl 100mM亚精氨，以及总质粒含量为5μl 1mg/ml。一个试管只含质粒pBII221；两个试管只含有质粒pHYGI1；一个试管只含5μlTE缓冲液不含质粒。

进行下列轰击实验：2XpBII221制剂(瞬时表达)；7XpHYGI1制剂(潜在的正处理)；3XTE制剂(负对照处理)。

所有的轰击进行完后，由pBII221处理过的愈伤组织以一个平板对一个平板方式转移到F培养基上(每个平板上有5个50mg的片)。两天以后，象实施例I那样将愈伤组织放入GUS分析缓冲液。计算瞬时表达细胞数，发现686个和845个GUS阳性细胞，意味着在轰击平板中出现了颗粒传递过程。

IV、选择已转化愈伤组织

轰击后，将pHYGI1处理的愈伤组织放入1轮选择性平板上，其中的F培养基含有15mg/l潮霉素(愈伤组织以每个平板十个25mg片放置)。以TE制剂轰击的两个平板做同样处理(选择对照愈伤组织)。其中一个用TE制剂轰击的愈伤组织平板放置在不含潮霉素的F培养基上，这个愈伤组织作为整个实验中对照组织的来源(非选择性对照愈伤组织)。

十三天后，1轮选择性平板上的愈伤组织与非选择性愈伤组织没有区别，将所有的愈伤组织由1轮选择性平板转移到含有60mg/l潮霉素的2轮平板上。平板数大约扩大五倍。

二十三后，2轮选择性平板上的愈伤组织的重量基本上得到增大。但此时也显现出趋于坏死。将所有的愈伤组织从2轮平板上转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择性平板上。

轰击后第五十八天，可观察到从坏死组织周围增生出三个活的扇形部分。所有三个系都是由pHYGI1处理得到的，命名为24C、56A和55A。

在维持培养基上培养十五天后，可观察到愈伤组织系生长，24C系很好生长而55A和56A系则生长较慢。所有三个系都转移至含有60mg/l潮霉素的F培养基上。由维持培养基中得到的非选择性对照愈伤组织也放到含有60mg/l潮霉素的F培养基上。

在含有60mg/l潮霉素的培养基上培养十九天后，24C系的生长完全未被抑制，通过对照显示出24C系的重量大约增加百分之八十。56A系完全坏死，55A系非常濒于坏死。24C系和55A系和对照组织再次转移至含有60mg/l潮霉素的F培养基上。

在含有60mg/l潮霉素培养基上培养二十三天后，24C系的生长仍完全未被抑制，而55A系完全坏死，正如第二次暴露在含60mg/l潮霉素的F培养基上阴性对照愈伤组织相同。

V、已转化愈伤组织的形态

对来自24C系的用BamHI消化的DNA进行了Southern印迹分析，并如实施例I的方法用HPT探针探测。如图6所示，24C系在预期的1.05kb处发现了一条谱带，证明24C系含有HPT编码序列。由对照组织得到的DNA中没有发现谱带。将24C愈伤组织名称改为PH2。

为了证明潮霉素基因整合到高分子量DNA上，从PH2愈伤组织和对照愈伤组织中分离出的DNA进行下面的处理：(i)无限制性酶，(ii)BamHI，如前所述，或(iii)PstI，它仅在HPT编码序列内切割一次质粒pHYGI1。按前述方法，将样品吸印，并用HPT编码序列探测。

未消化的PH2DNA显示仅在未切割DNA位置处与探针杂交。证明潮霉素基因整合到高分子量DNA上。如前所述，可观察到预期的用BamHI消化的PH2DNA的1.05kb谱带。对于用PstI消化的PH2DNA，如果潮霉素基因存在于完整的pHYGI1质粒上，则预期有一条5.9kb的谱带。如果基因整合到基因组DNA中，则预期有两条或更多条不同大小的谱带(大小取决于寄主DNA中PstI的侧面位点)。观察到的两条谱带具有的近分子量为6.0kb和3.0kb。这些数值与潮霉素基因整合到高分子量DNA中相一致。在以上任何处理中没有发现对照愈伤组织的DNA发生杂交。

这些结果证明在PH2愈伤组织中没有作为完整的pHYGI1或作为一个小的非染色体质粒形式的HPT编码序列存在。它们与潮霉素基因整合到高分子量DNA中相一致。进一步的Southern印迹分析表明HPT编码序列与35S启动子序列相邻接。

VI、植物的再生和种子的产生

如实施例I所述，将PH2系，同非选择性的对照愈伤组织一起放到RM5培养基上再生植物。十六天后，如实施例I的方法将愈伤组织转移至R5培养基上。在R5培养基上培养二十五天后，将植物幼苗转移至R5培养基上生长二十天。此时，将幼植物转移至蛭石中生长一周再移植入土壤中至生育能力成熟，然后用近交系B73进行控制授粉。

VII、R1子代分析

A、PH2作为花粉供体

对根须和褪色的叶进行分析来检测B73XPH2.6交配得到的10个R1子代植物中的HPT表达。鉴定一个阳性植物，如实施例I所述，用HPT探针进行Southern印迹分析，证实该阳性植物中HPT基因的存在。

为进行根须的生物检定，在125ml锥形瓶中，在加入0.1％Alconox的1∶1稀释的商品漂白粉水溶液中灭菌二十分钟，将种子灭菌，用无菌水漂洗三次。在150rpm转速下，将种子在含有50mg/ml Captan的无菌水中吸胀过夜。

吸胀作用后，从瓶中倾去溶液，将种子转移至含有三张水饱和的发芽纸的气流箱中(Flow Laboratories)。第四张水饱和的发芽纸放在种子的上部。使种子发芽4天。

种子发芽后，从每个幼苗上切去大约1cm长的主根根尖，且培养在含有MS盐，20g/l蔗糖，50mg/l潮霉素，0.25％Gelrite的培养基上，在26℃的黑暗中培养4天。

根据存在或缺乏丰富的根毛或根枝对根进行评价。如果有根毛和根枝则认为根是转基因的(具潮霉素抗性)，如果有少量的根枝，则认为它是未转化的(对潮霉素敏感的)。

将根顶端部分切去后，PH2穗和对照穗的幼苗转移至潮湿的蛭石中，在黑暗中生长5天。此时对褪色的叶进行生物检定，从胚芽鞘顶端切割下1mm，表面灭菌10秒钟，放置在含有0mg/l(对照)或100mg/l潮霉素和MS基础盐，20g/l蔗糖，2.5g/l Gelrite的培养基上，在26℃的黑暗中培养18小时。每个平板含有每个茎干的二个重复部分，然后以光照14小时，黑暗10小时的光照方式，在26℃将平板培养48小时，且以0(全为棕色)到6(全为绿色)的比例评估叶组织中的绿色百分率。如果比率为0，则将这些苗认为是非转化的(潮霉素敏感)，如果比例为3或更大，则认为是已转化的(对潮霉素抗性)。

B、PH2作为花粉授体

通过对根系进行分析，测试由命名为PH2.23的一个PH2植物与B73杂交得到的80个R1子代植株的HPT的表达，且经测试有26个为阳性。通过在气流箱中将幼苗直接暴露于含潮霉素的培养基中进一步确证所有26个子代中HPT基因的表达。用PCR分析其中两株具抗性的植株，且证实HPT序列的存在。

VIII、R2子代分析

以PH2作为花粉亲本的转基因R1植物生长成熟且用于给FR4326植物授粉。

交配得到的R2种子发芽，并通过PCR检测HPT序列的存在。用实施例I所述的HPT酶分析测定HPT基因的表达。

所检测的十九个子代中有三个含有HPT基因序列并能表达出HPT酶活性，其余的子代既不含有HPT序列也没有酶活性。这个结果证明在两代连续的繁殖过程中，由花粉传递经过遗传工程的DNA且得到表达。表明该基因是稳定的。实施例V

本实验利用实施例III中描述的易碎的、胚胎形成的玉米愈伤组织培养体AB12。

利用标准重组DNA技术，用载体pBS⁺(Stratagene，Inc.，San Diego，CA)，一个3.2kb环形质粒，构建质粒pCHN1-1和pLUC-1。pCHN1-1含有来自E.Coli(Gritz et al.1983)的3′末端侧面为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(Chilton and Barnes 1983)的兰伊红合酶(nos)多聚腺苷化序列的潮霉素B磷酸转移酶(HPT)编码序列。用花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S启动子(Guilley et al.1982)启动表达，该启动子定位于HPT编码序列的上游。在此实施例中还使用了质粒pBII221和pHYGI1。

pLUC-1含有火蝇荧光素酶编码序列(Dewet et al.1987)，该序列5′端侧面为CaMV35S启动子，3′侧面为兰伊红合酶多聚腺苷化序列。这个质粒单独地作为阴性对照DNA。通过微射弹轰击将质粒引入AB12。如实施例I所述制备二十六个平板。一个试管中只含有质粒pBII221；两个试管既含有质粒pHYGI1又含有质粒pBII221；两个试管既含有质粒pCHN1-1又含有质粒pBII221；一个试管中仅含有pLUC-1。进行轰击试验概括于表7。

              表72XpBII221制剂          测定瞬时表达频率10XpHYGI1/pBII221      作为转化的潜在阳性处理10XpCHN1-1/pBII221     作为转化的潜在阳性处理4XpLUC-1               阴性对照处理

用pBII221轰击的两个愈伤组织平板用来分析瞬时GUS表达。计算蓝细胞数目，得出两个平板中有291和477个瞬时GUS表达细胞，说明在其他被轰击的平板上也出现了DNA传递过程。

所用的样品轰击后，立即将所有平板中愈伤组织用pHYGI1/pBII221，pCHN1-1/pBII221处理，用pLUC-1处理的其中三个平板中一个平板对一个平板的方式转移至1轮选择性平板上，其中的F培养基含有15mg/l潮霉素B(每个平板上有五片愈伤组织)。将用pLUC-1处理的第四个平板中的愈伤组织转移到没有潮霉素的F培养基上。将该组织每隔2-3个周在非选择性培养基上进行继代培养并作为非选择对照愈伤组织。

选择两个星期后，在选择性和非选择性培养基上出现的组织基本相同。对选择性培养基上的pHYGI1/pBII221和pCHN1-1/pBII221处理的各取八个平板中的愈伤组织和两个对照平板中的愈伤组织从1轮选择性平板上转移到含60mg/l潮霉素的2轮选择性平板上。每个2轮选择性平板含十片30mg的愈伤组织，结果扩大了平板总数。在选择性培养基上保留的组织，用pHYGI1/pBII221和pCHN1-1/pBII221处理过的组织的平板各取两个及一个对照愈伤组织的平板，在37℃放入GUS分析缓冲液中以测定轰击后两周是否可观察到蓝色细胞簇。在分析缓冲液中放置六天后出现大量GUS表达，结果概括于表8。

                表8处  理            重复样品          观察结果pLUC-1                              无蓝色细胞pHYGI1/pBII221    平板1             11个单细胞，1个四细胞束

              平板2             5个单细胞pCHN1-1/pBII221   平板1             1个单细胞，2个二细胞束

              平板2             5个单细胞，1个二细胞束

                                2个8-10细胞束

在2轮选择性平板上培养二十一天后，将样品的所有存活部分转移到含60mg/l潮霉素的3轮选择性平板上。保留2轮选择性平板，其中只含有明显坏死的组织。定期观察2轮选择性平板和3轮选择性平板上的存活的增殖部分。

转移至3轮选择性平板上三十五天后，检查2轮和3轮选择性平板组上存活的愈伤组织部分。两个这样的存活部分从用pHYCI1/pBII221处理的平板上的坏死组织增生出来。从3轮平板组上生出的存活部分命名为3AA，从2轮平板组上生出的存活部分命名为pH1。然后将两个系转移至无潮霉素的F培养基上。

在没有潮霉素的培养基上培养十九天后，3AA系生长极少而pH1系快速生长。将两个系再次转移至F培养基上培养九天。然后再将它们转移至含15mg/l潮霉素的F培养基上培养十四天。此时可观察到3AA系质地很不好而且生长缓慢，而pH1系则含15mg/l潮霉素的F培养基上生长很快，将pH1系继代培养到无潮霉素的F培养基上。

在F培养基上培养十天后，对pH1系开始进行抑制试验。将pH1的愈伤组织转移至含有1，10，30，100和250mg/l潮霉素B的F培养基上。每个浓度制备5个愈伤组织平板，每个平板含有十片大约50mg的愈伤组织。相对于每个潮霉素浓度制备一个未选择的对照组织的平板。

已发现pH1系在0，10，30，100和250mg/l潮霉素浓度时，继代培养九次都能够持续生长。

在各个时间点，从2轮和3轮选择性平板上重新获得其他的增殖部分。它们在有潮霉素存在时，多轮培养如2或3次继代培养时不能生长。

为了证明pH1愈伤组织获得了潮霉素抗性基因，从pH1和所有未选择的对照愈伤组织中分离DNA制备pH1愈伤组织的Southern印迹，方法如下：在液氮中冷冻2g愈伤组织，将它研磨成细粉状；将细粉转移到含有6ml萃取缓冲液的30ml Oak Ridge试管中(7M尿素，250mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％肌氨酸)。向其中加入7ml1∶1的苯酚∶氯仿，振荡试管在37℃温育十五分钟。样品在4℃下以8K转速离心十分钟。用miracloth(Calbiochem 475855)将上清液吸移到任意一个含有1ml4.4M醋酸铵，pH5.2的15ml的试管中，向其中加入6ml异丙醇，振荡试管，在-20℃保温十五分钟。然后在贝克曼TJ-6离心器上以4℃和最大转速离心五分钟沉淀DNA，去掉上清液，在室温下将沉淀溶于500μlTE-10(10mM Tris-HClPH8.0，10mM EDTA PH8.0)溶液中15分钟。将样品转移至1.5ml Eppendorf试管中，向其中加入100μl4.4M醋酸胺，PH5.2和700μl异丙醇。在-20℃下保温十五分钟，在Eppendorf微离心器中(12,000rpm)沉淀DNA五分钟。用70％乙醇洗涤沉淀，干燥，重新悬浮于TE-1(10mM Tris-HCl PH8.0 1mMEDTA)溶液中。

10μg分离的DNA用BamHI(NEB)消化并如实施例I所述用HPT探针分析。如图3所示，在预期的1.05kb位置上发现PH1愈伤组织有一条谱带，表明存在HPT编码序列。而对照愈伤组织则没有谱带。

为了证实潮霉素基因整合到高分子量DNA中，对从PH1愈伤组织和对照愈伤组织分离出的NDA做以下处理：(i)没有限制性酶，(ii)BamHI，如前所述，或(iii)PstI，它在HPT编码序列内只切割一次质粒pHYGI1。如前所述，吸印样品并用HPT编码序列探测。

未消化的PH1DNA仅在未切割的DNA位置处与探针杂交，证明潮霉素基因插入到高分子量DNA中。如上文看到的，用BamHI消化的PH1DNA有预期的1.05kb的谱带。对于用PstI消化的PH1DNA，如果潮霉素基因存在于完整pHYGI1质粒上，则可预期有一条5.9kb谱带。如果基因掺入高分子量DNA中，则可预期有两条或更多条不同大小的谱带(大小决定于寄主DNA中PstI侧面位点)。可观察到三条分子量大小约为：12，5.1和4.9kb的谱带。这个结果证实了潮霉素基因掺入到高分子量DNA中。4.9kb谱带的强度大约是其它两条谱带的二倍，表明或者是部分消化或者可能存在HPT基因重复衔接。从任何以上的处理中，对照愈伤组织的DNA没有发生杂交作用。

这些结果证明，HPT编码序列没有作为完整的pHYGI1或作为一个小的非染色体质粒存在于PH1愈伤组织中。这些结果与潮霉素基因已掺入高分子量DNA中相一致。而且Southern印迹分析证明HPT编码序列与35S启动子序列相邻接。

将在抑制性研究中使用的所有潮霉素浓度的培养基上得到的愈伤组织转移至RM5培养基上，如实施例I那样使植物再生。从PH1共产生出65株植物，由对照愈伤组织共产生30株植物。

为证明整合的DNA已保留在RO组织中，如前面所描述的将从3个随机挑选的PH1的RO植物中得到的用BamHI消化的叶DNA进行Southern印迹分析，如实施例I所述用HPT探针对印迹进行探测。由图4可见，三株植物都发现了一条1.05kb谱带，表明存着有HPT编码序列。从对照植物的DNA中没观察到谱带。采用标准技术用近交Zea mays系A188，B73，和Oh43对成熟的PH1植物进行控制授粉。授粉后四十五天收获种子，再使其干燥一至两周。

通过根系和褪色的叶的生物检定和Southern印迹分析估测R1子代中潮霉素抗性特征的存在，从再生的PH1和对照植物中各选择两个穗进行分析。对所有穗都用近交系A188作花粉供体，结果列于下文的图5和表9。

                     表9

               PH1的R1植株分析PH1植株  根分析  叶分析  印迹  CONT  根分析  叶分析  印迹

                          PLANT3.1        +       ND     +    4.1     -       ND     ND3.2        -       ND     -    4.2     -       ND     ND3.3        -       ND     -    4.3     -       ND     ND3.4        -       ND     -    4.4     -       ND     ND3.5        -       ND     -    4.5     -       ND     ND3.6        +       ND     +    4.6     -       ND     ND3.7        -       ND     -    4.7     -       ND     ND

                           2.1     -       ND     -10.1       +       +      +    1.1     -       -      -10.2       +       +      +    1.2     -       -      ND10.3       -       -      ND   1.3     -       -      ND10.4       -       -      -    1.4     -       -      ND10.5       -       -      -    1.5     -       -      ND10.6       -       -      -    1.6     -       -      ND10.7       -       -      -    1.7     -       -      ND10.8       ND      +      +    1.8     -       -      ND关键词：+＝转基因     -＝非转基因     ND＝没有试验

用从一个PH1母本中产生的两个R2子代，确证HPT基因的存在。

用Oh43花粉对PH1.3.1植物(见表9)授粉。使交配产生的九粒种子发芽，从四株子代植物的叶中得到DNA，用HPT编码序列探针进行Southern印迹分析。被检验的四株植物中的两株含有高拷贝数的HPT序列。尽管在两株植物中存在HPT基因，但在褪色叶的分析中没有检测到基因的表达。

植物PH1.10.8(表9)用B74授粉或自体授粉，检测交配子代中的五十个的根和叶中HPT的表达，没有检测到基因表达。同样用8个子代的DNA进行的Southern印迹分析也没有检测到HPT基因的存在。在自我交配的子代中9个子代的叶分析中，也没有证明该基因存在。由自交配的4个子代DNA的Southern印迹分析也没有证明HPT基因存在。

只有转基因植物(R0和R1)用作为母本时，重组DNA才能遗传给子代，意味着PH1的重组DNA是母系遗传。

上文中所提到的所有出版物和专利文件作为本文的参考文献。通过各种特异性的和优选的实施例和技术对本发明进行了描述。然而应该明白在保留本发明的精神和范围的情况下可有许多变化和修改。

Claims (4)

1.生产可稳定地表达可遗传重组DNA的可繁殖转基因玉米的方法，包括下列步骤：

(i)建立一种来自玉米植物的能再生的细胞培养物准备用于转化；

(ii)用重组DNA包裹的微射弹轰击所说培养物的细胞以转化所说培养物的细胞；

(iii)鉴别或选择转化的细胞；

(iv)从转化细胞再生一种能稳定表达可遗传的所说重组DNA的可繁殖转基因玉米植物。

2.根据权利要求1所说的方法，其中的细胞培养物，是指一种脆性的胚胎形成的愈伤组织培养物。

3.根据权利要求2所说的方法，其中受轰击的愈伤组织培养物是以组织块形式存在，每个组织块约为30-80mg。

4.根据权利要求3所说的方法，其中的愈伤组织是在固体培养基上开始培养的。

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