CN1496367A - 用于在植物中产生番茄黄叶卷缩病毒抗性的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用TYLCV的截短型复制相关蛋白(Rep)基因，在植物中提供对番茄黄叶卷缩双生病毒的基因工程抗性的材料和方法。根据本发明产生的抗病毒植物具有园艺上可接受的表型特征。本发明的方法包括将多核苷酸转入植物，其中当该多核苷酸在植物中表达时，该转化植物就会表现出对植物病毒感染的抗性。一个示例性实施方案中使用的多核苷酸包含来自TYLCV－Is的佛罗里达分离株的截短型Rep基因。本发明的方法可用来在植物如番茄和烟草中提供对TYLCV感染的抗性。本发明还涉及表达包含TYLCV截短型Rep基因的多核苷酸的转化的和转基因的植物和植物组织。

Description

用于在植物中产生番茄黄叶卷缩病毒抗性的材料和方法
本发明的产生与政府支持的研究项目相关，其USDA资助号为：99343628423，98341356784和99341358478。政府对本发明拥有某些权利。
相关申请的相互参照
本申请要求2002年5月7日申请的、系列号为60/289,315的美国临时申请的权利。
发明背景
由粉虱传播的双生病毒已经成为佛罗里达、加勒比海和大多拉丁美洲地区番茄生产的主要限制因素。这一病毒群目前正在西半球蔓延，并且在过去的15年中，在这一区域已鉴定的感染番茄的双生病毒的数目已经从3种增加到超过17种(Polston和Anderson，1997)。这种蔓延还在持续，并且几乎每个月都有关于新的流行报道。由粉虱传播的病毒单独出现，并与其他双生病毒或其他病毒混合感染。在许多国家由粉虱传播的双生病毒使番茄产量减少，也使总的作物产量普遍受损(Polston和Anderson，1997)。在佛罗里达，由于番茄斑点病毒(ToMoV)和番茄黄叶卷缩病毒(TYLCV)感染使番茄产量遭受严重损失(1990-91估计为12500万美元)，其中所述番茄斑点病毒在1989年首次出现，这些病毒感染都导致了作物损害和由于使用的杀虫剂增加带来的生产成本增加。
双生病毒科(Geminiviridae)可分为三个属，其中由粉虱传播的双生病毒属于双生病毒(Begomovirus)属。在双生病毒属中有单分基因组和双分基因组两个主分类。双生病毒的分类还不是很清楚，因为在序列分析完成之前病毒是按疾病症状来命名的。这些病毒中的许多病毒在同一宿主内引起相似的症状，这就导致在文献中差别很大的病毒具有相同或相关的名称。这对番茄黄叶卷缩病毒(TYLCV)来说尤其如此。有八种单独的双生病毒被称为TYLCV。最近出版了解决上述命名混淆的建议，但没有一条被所有的病毒学家接受，结果就是不同的病毒用许多不同的方式表示。使用Fauquet和Mayo(1999)建议的方案，可将这8种病毒根据其被第一次描述时所在的国家鉴定为：来自中国(TYLCV-Ch)、来自以色列(也是第一种被描述的病毒)(TYLCV-Is)、来自尼日利亚(TYLCV-Ng)、来自萨迪尼亚(TYLCV-Sar)、来自南沙特阿拉伯(TYLCV-SSA)、来自坦桑尼亚(TYLCV-Tz)、来自泰国(TYLCV-Th)和来自也门(TYLCV-Ye)。因此，虽然上述每一种病毒都被称为TYLCV，但每种病毒具有独特的序列，在基因组同源性小于90％。
称为番茄黄叶卷缩病毒以色列株(TYLCV-Is)的双生病毒曾导致多米尼加共和国的番茄生产遭受广泛损失(Polston和Anderson评论，1997)，1997年在佛罗里达也发现了这种病毒(Polston等人，1999)。在美国(佛罗里达、佐治亚、路易斯安那和密西西比)、加勒比(巴哈马群岛、古巴、多米尼加共和国、波多黎各和牙买加)、墨西哥、日本、欧洲和地中海(加那利群岛、埃及、以色列、塞浦路斯、意大利、西班牙、葡萄牙和摩洛哥)番茄的TYLCV-Is感染是一严重的问题。TYLCV-Is的发病率在增加，最近一次的经济损失就发生在1998年秋。在佛罗里达TYLCV-Is病毒广泛传播，很可能在未来几年中不断增长，并成为佛罗里达番茄生产的主要限制。目前市场上几乎没有TYLCV-Is感染抗性的番茄商业性栽培品种。将这种抗性归类为耐受性，因为被感染的植物并不显示症状或显示轻微症状，而且产量也相对地不受感染影响，但是仍能在病毒接种过的植物中检测到病毒，且这些接种植物可以作为易感染栽培品种或作物的接种物来源(Lapidot等人，2001)。
很难通过新鲜番茄的销售对双生病毒进行经济地控制，也不可能在番茄加工过程中进行实用的管理。目前，主要通过使用单一的杀虫剂吡虫啉(Bayer农业产品公司，堪萨斯城，MO)减少粉虱这一载体的数量来控制双生病毒。对这种杀虫剂的耐受性已有报道(Cahill等人，1996；Williams等人，1996)。在美国和其他地区吡虫啉失去效用只是时间早晚的问题。从1994到1997年佛罗里达的番茄种植者平均每英亩花费近250美元用于杀虫剂来控制ToMoV。而对于美国的种植者来说用于控制TYLCV-Is的花费会增加的更多。在加勒比国家双生病毒已使很多中小规模的番茄种植者由于生产成本增加和产量损失而破产。在以色列，已产生吡虫啉耐受性，只能在杀虫剂基础上增加其他排除措施来控制TYLCV-Is：将番茄种植在由能阻挡粉虱的遮蔽材料围绕的屋内，或田里的遮蔽隧道内。使用这些方法费用高而且往往并不是经济上或园艺上实用的选择。最经济且最实用的控制由粉虱传播的双生病毒的方法就是使用抗性栽培品种。目前尚无对西半球本土的双生病毒具有抗性的市售番茄栽培品种。如上文所述，在美国只有两种对TYLCV-IS具有耐受性的栽培品种适合生产。抗性来自野生的番茄属(Lycopersicon)，可能是L.peruvianum和L.pimpinellifolium。
有一些报道表明，编码双生病毒复制相关蛋白(Rep)的基因可用于病毒感染抗性。曾有一篇报道，将NTP结合基序突变的ToMoV Rep转入番茄植株证实干扰病毒复制(Stout等人，1997)。Hanson等人(1999)分析了BGYMV(大豆金黄花叶病毒)的Rep基因NTP结合基序发生突变的表型，证实NTP结合结构域在复制中是必需的。他们提出该基序的突变可在反式显性负干涉方案中用作对病原体来源的抗性(也被称为显性负突变)。Nicotianabenthamiana植物中对非洲木薯花叶双生病毒(ACMV)的抗性就是通过用ACMV Rep转化而产生的(Hong和Stanley，1996)。
有报道用来自萨迪尼亚的双生病毒TYLCV(TYLCV-Sar)的Rep基因可产生病毒抗性。但是，TYLCV-Sar是一种独特的病毒，与TYLCV-Is只有远源关系，基因组序列也有很大不同(＜80％同源性)。Noris等人(1996)发现用编码C末端截短(210个氨基酸)的蛋白质的TYLCV-Sar C1基因可在N.benthamiana植物中产生TYLCV-Sar抗性。但随着时间的推移这种抗性会被克服。Brunetti等人(1997)用同样的构建体转化番茄并发现这种抗性需要截短型Rep蛋白的大量累积，这种累积导致了“卷缩”表型，并且这种抗性并不扩大至其他不相关的双生病毒。在表达Rep基因反义RNA的Nicotiana benthamiana转基因植物中已观察到具有对TYLCV-Sar感染的抗性(Bendahmane和Gronenborn，1997)。根据本发明的方法转化的植物具有正常表型并且同样有望获得高产。
本发明克服了为产生病毒抗性番茄栽培品种的传统植物育种程序中花费高、耗时长以及可选择性小等缺陷。
发明概述
本发明涉及通过基因工程使植物产生番茄黄叶卷缩双生病毒如TYLCV-以色列株(TYLCV-Is)的抗性，同时该植物仍具有可接受表型特征的材料和方法。本发明给出了在番茄和烟草中产生TYLCV-Is抗性的示例性实施方案。具体地说，这种抗性是通过将TYLCV复制相关蛋白(Rep)基因的截短变体转化植物获得的。此处示例的是来自TYLCV-Is(佛罗里达分离株)的截短型Rep基因的用途。TYLCV-Is的全长Rep基因编码约357个氨基酸的病毒复制相关蛋白。在一个示例性实施方案中，本方法中使用的Rep基因3’末端截短，留下5’端508个核苷酸(nt)，后者包含82个核苷酸的基因间序列和编码142个氨基酸的Rep蛋白片段(N端)的426个核苷酸序列。在另一个实施方案中，使用本发明的截短型Rep基因的反义多核苷酸来提供感染抗性。本发明显示在番茄育种品系中应用基因工程开发TYLCV-Is抗性适用于佛罗里达产生番茄的杂种。
附图简述
图1表示含有截短型TYLCVRep基因的双元转化载体。
图2表示pKYLX71：35S2的表达框。TL表示T-DNA左边界，TR表示T-DNA右边界(参见An等人关于其起源的详细描述)。pKYLX71和pKYLX71：35S2(所使用的质粒)的多克隆位点是：HindIII*-BamHI-XhoI*-PstI-SacI*-XbaI*(*表示唯一位点)。pKYLX71：35S2中的启动子是一个经双重增强区改进的35S启动子。箭头指示了表达框和NPTII基因的转录方向。该质粒赋予大肠杆菌(E.coli)和根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)四环素和卡那霉素抗性。
图3A-3B表示pKYLX71：35S2中表达框的序列。用于构建35S2启动子的双重区被括弧和斜体标出(两个重复序列中的第一个)，转录起始位点、多克隆位点和rbcS-E93’区的主要3’末端用粗体字分开。表达框限于EcoRI和ClaI位点之间。
图4表示转化了截短型Rep基因的番茄植株(后部)显出TYLCV抗性。未转化的番茄(前部)显示出TYLCV病症。这个试验于2000年秋在Bradenton，FL的田里进行。所有被测植株在移到田里之前都暴露在带病毒的粉虱下。SEQ ID NO.8表示pKYLX71：35S2中表达框的序列。用于构建35S2启动子的双重区被括弧和斜体标出(两个重复序列中的第一个)，转录起始位点、多克隆位点和rbcS-E93’区的主要3’末端用粗体字分开。表达框限于EcoRI和ClaI位点之间。
图5A-5B表示从转基因2/5 Rep的烟草植株和未经转化的对照植株提取总RNA进行Northern印迹分析。图5A，泳道1表示未转化植株；泳道2表示未接种的2/5 Rep植株；泳道3和4表示接种TYLCV的C1T1植株。图5B表示用18SrRNA基因进行同样的印迹探测来确证各泳道的RNA加样量是等量的。
序列简述
SEQ ID NO.1是用于对本发明的Rep基因片段进行初次PCR扩增的寡核苷酸。
SEQ ID NO.2是用于对本发明的Rep基因片段进行初次PCR扩增的寡核苷酸。
SEQ ID NO.3表示本发明的截短型Rep蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4表示本发明的截短型TYLCV-Is Rep基因的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列且包括81个核苷酸的基因间区。
SEQ ID NO.5表示本发明SEQ ID NO.4的截短型TYLCV-Is Rep基因的反义核苷酸序列，其包括81个核苷酸的基因间区。
SEQ ID NO.6表示本发明的截短型TYLCV-Is(佛罗里达分离株)Rep基因的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列且包括82个核苷酸的基因间区。
SEQ ID NO.7表示本发明SEQ ID NO.6的截短型TYLCV-Is(佛罗里达分离株)Rep基因的反义核苷酸序列，其包括82个核苷酸的基因间区。
SEQ ID NO.8表示本发明的pKYLX71：35S2中表达框的核苷酸序列。
发明详述
本发明提供了一种在易感染TYLCV-Is(番茄黄叶卷缩病毒-以色列株)的番茄和其他作物中产生病毒抗性的方法。在示例性实施方案中，产生了对TYLCV-Is具有抗性的植株。根据本发明所产生的转基因植株显示正常表型特征，因此这种植物和其收获作物在商业上是可接受的。通过传统育种培养TYLCV-Is抗性是缓慢的(传统育种需要十多年而基因工程技术只需要3-5年)，传统育种通常取决于多个基因，并且经常由于抗性基因与不合需要的园艺学特征联系在一起而不甚理想。本发明极大简化了TYLCV-Is抗性植株的产生并将TYLCV-Is抗性基因导入合乎需要的番茄品系。
本发明涉及利用多核苷酸转化植物或植物组织使其产生对番茄黄叶卷缩病毒(TYLCV)感染抗性的方法，上述多核苷酸选自：i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因间区的全部或一部分和Rep基因5’编码序列的约400到500个核苷酸组成；ii)包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的多核苷酸；和iii)包含在严格条件下与TYLCV Rep基因片段或与TYLCV Rep基因片段反义序列杂交的序列的多核苷酸。本发明尤其选择对如下TYLCV的抗性：TYLCV-中国株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亚株、TYLCV-萨迪尼亚株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亚株、TYLCV-泰国株和TYLCV-也门株。可提供TYLCV感染抗性的植物包括番茄、烟草、补血草、碧冬茄、洋桔梗、粘果酸浆和其他易感染TYLCV的植物。
在一个示例性实施方案中，本发明提供了这样的植物，其利用编码TYLCV截短型复制相关(Rep)蛋白以及包含Rep基因间区的多核苷酸产生基因工程抗性。优选来自TYLCV-Is或TYLCV佛罗里达分离株的截短型Rep基因。在一个实施方案中，TYLCV-Is佛罗里达分离株的Rep基因编码具357个氨基酸的病毒复制相关蛋白，将其3’末端截短，留下5’端的508个核苷酸(SEQ ID NO.6)，后者包含82个Rep基因间区核苷酸和编码Rep蛋白142个氨基酸片段(SEQ ID NO.3)的426个核苷酸。示例的Rep基因片段是病毒Rep基因全长的一小部分(约40％)。在另一实施方案中，本发明用来产生感染抗性的是截短型Rep基因的反义多核苷酸。在一个实施方案中，反义多核苷酸的序列如SEQ ID NO.5或7所示。与截短型Rep基因序列或其反义序列杂交的多核苷酸序列或与截短型Rep基因序列或其反义序列具有50％或更高序列同一性的多核苷酸序列也同样包括在本发明的范围内。本发明的截短型Rep基因片段以及本发明截短型Rep基因片段的反义序列片段也在本发明的范围内，包括具有如SEQ ID NO.4-7所示中任一序列的多核苷酸片段以及杂交序列片段或具有序列同一性的序列片段，条件是当该片段在植物中表达时能赋予植物TYLCV抗性。产生多核苷酸序列片段的方法是本领域中众所周知的(见，例如Wei等人，1983)。
本发明的截短型Rep基因能够直接导入植物如番茄通过农杆菌介导的转化方法或通过由转化的育种品系的传统育种的基因转移方法导入，来保护植物免受TYLCV-Is感染。因此本发明也涉及新的对TYLCV如TYLCV-Is具高水平抗性的植物如番茄的育种品系。利用本发明的具有改进的Rep基因的新育种品系，育种者就能够培养有病毒抗性的番茄新栽培品种，而不会丢失其它想要的农艺学和园艺学性状。
在本发明的一个优选实施方案中，将根据本发明所述方法制备的病毒抗性转基因植物品系与具有相同病毒抗性但来自不同转化过程的转基因植物品系杂交，以产生较亲本品系病毒抗性高的杂交品种。上述杂交品种也在本发明的范围内。
由于本发明的方法赋予高水平抗性，因此应用由本发明培育的具有截短型Rep基因的新番茄栽培种能极大地减少由病毒感染引起的产量损失，而这种病毒感染最多能引起果实产量减少100％。此外，利用本发明的含有截短型Rep基因的栽培种可以明显降低为了控制粉虱这一TYLCV-Is和其他双生病毒载体而使用杀虫剂造成的依赖性，并随之可减少番茄生产成本和杀虫剂造成的环境污染。现在，控制TYLCV-Is主要依赖于单一的并转入整株植物的杀虫剂。一旦粉虱对这种杀虫剂产生抗性，就几乎不可能控制TYLCV-Is。所以本发明的应用可以通过增加产量、减少生产成本和环境污染而从整体上使番茄种植者和社会受益。
优选地，本发明的截短型Rep转基因具有在育种过程中起辅助作用的标记(辅助标记选择)。与Brunetti等人(1997)所得结果相反，使用本发明的Rep转基因到目前为止还未在已具有病毒抗性但尚未接种的转化植物中出现对表型的不利作用。抗性植株在接种后30-60天后未出现病毒复制迹象，这可通过核酸斑点杂交和PCR证实。本发明的截短型Rep基因可以通过转化或传统的育种技术轻易地导入新的园艺学背景，并将为生产提供更好的园艺学特性。此外在植物中使用本发明的截短型Rep基因不会像目前通用的抗性基因那样影响果实的大小。
本发明还涉及以下的多核苷酸分子：i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因间区的全部或一部分和Rep基因5’编码序列的约400到500个核苷酸组成；ii)包含所述TYLC VRep基因片段的反义序列的多核苷酸；和iii)包含在严格条件下与TYLCV Rep基因片段或与TYLCV Rep基因片段反义序列杂交的序列的多核苷酸，这样当多核苷酸整合到植物基因组中时，植物会产生对病毒的抗性，同时又不会对植物表型特征产生负面影响。与截短型Rep基因序列或其反义序列杂交的多核苷酸序列或与截短型Rep基因序列或其反义序列具有50％或更高序列同一性的多核苷酸序列也同样包括在本发明的范围内。同样包括在本发明范围内的还有本发明的截短型Rep基因片段和本发明的截短型Rep基因片段反义序列的片段，包括具有任一SEQ ID NO.4-7序列的多核苷酸片段及其杂交序列的片段或具有序列同一性的序列片段，只要上述片段在植物中表达就会使植物产生TYLCV抗性。
此外，由于基因编码冗余，本发明的多核苷酸可以有许多不同的序列编码同一个截短型Rep多肽。制备其它编码相同的或基本上相同的截短型Rep多肽的多核苷酸序列在本领域技术人员的技术范围内。这些变体或替换的多核苷酸序列也包括在本发明的范围内。这里所指的“基本上相同的”序列是指编码一个出现氨基酸替换、缺失、添加或插入的截短型Rep蛋白的序列，但这些变化却不会在本质上改变将上述多核苷酸导入植物基因组时使植物产生病毒感染抗性的能力。本发明的多核苷酸编码保守的替换蛋白，其中一类(非极性，不带电荷极性，碱性和酸性)中的一种氨基酸被同一类中的另一种氨基酸取代都落在本发明的范围内，只要这种替换在本质上并不会改变本发明中的产生抗性的能力。本发明的范围还包括比示例的多核苷酸更长或更短的多核苷酸，只要这种更长或更短的多核苷酸也能使植物产生病毒抗性，同时并不会对植物的表型特征产生负面冲击。
本发明也涉及到含有本发明的截短型Rep基因的能在合适的宿主植物中表达的重组多核苷酸载体。合适的载体选自本领域中公知的载体，包括质粒、噬菌体DNA、或质粒和噬菌体DNA的重组体、酵母质粒及衍生物和片段。本发明的多核苷酸可以插入到一个载体的多克隆位点，如商业上购买的pUC载体和pGEM载体，本发明的多核苷酸具有可切割的限制性末端，从而使其适合插入任何所希望的植物表达或整合载体。其它植物表达载体也可用于本发明。另外，可以将调控序列如启动子可操作地连接到本发明的多核苷酸编码序列上。例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S或35S2启动子就可以运用在本发明中。植物启动子，如Ap3启动子、热休克80启动子、苜蓿组蛋白H3.2基因启动子(Kelemen等人，2002)、E8启动子等都可以运用在本发明中。其他合适的启动子包括章鱼碱合酶启动子和胭脂碱合酶启动子。该启动子可以是组成型的、组织特异型的或诱导型启动子。
表达载体也可任选地包含选择性标记基因。在一个实施方案中，标记基因表达时可产生抗生素或除草剂抗性。抗生素抗性标记包括如当表达时提供G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素等抗性的多核苷酸。除草剂抗性标记包括例当表达时可提供草甘膦和磺酰脲类等抗性的多核苷酸。在一个实施方案中，将一种编码新霉素磷酸转移酶II型的多核苷酸整合到本发明的表达载体中。这种酶赋与对抗生素卡那霉素的抗性。用含有抗生素或除草剂抗性标记基因的本发明载体转化了的细胞可通过该细胞在抗生素或除草剂中的生长而得以鉴定。
载体也可包括将3’非翻译终止片段可操作地连接到截短型Rep基因编码序列的3’末端。3’终止片段可提供用于在mRNA的3’末端添加多聚腺苷酸信号。任何适用于植物的3’终止片段都在本发明的范围内。
本发明也涉及用含有本发明的截短型Rep基因的多核苷酸感染、转化或转染的细胞。优选地，截短型Rep基因来自TYLCV-Is且含有编码如SEQID NO.3所示氨基酸序列多肽的核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，多核苷酸包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，将多核苷酸整合入一个合适的载体，并且将该重组载体转化能够将上述多核苷酸导入植物细胞的细菌或其他宿主。能够用本发明的多核苷酸感染、转化或转染的合适的宿主细胞包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiliS)。其他合适的宿主包括农杆菌(Agrobacterium)细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞。含有本发明多核苷酸的农杆菌可以根据本领域公知的常规方法转化入植物细胞。在农杆菌转化中本发明的多核苷酸载体也可包括T-DNA序列。将多核苷酸导入植物细胞还可以通过基因枪靶向法(Carrer，1995)、电穿孔法、直接基因注射法或其他本领域所公知的方法。还可以利用非标记的转化技术将本发明的多核苷酸转化植物(Zuo等人，2002)。
本发明也涉及含有本发明的截短型Rep基因并表现出对植物TYLCV双生病毒如TYLCV-Is感染抗性的转基因植物、植物组织(包括植物种子)。在一个实施方案中，本发明的转基因植物包含含有本发明截短型Rep基因的多核苷酸。在一个示例性实施方案中截短型Rep基因来自TYLCV-Is并且含有编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列多肽的核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，多核苷酸含有如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，植物包含含有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的反义序列的多核苷酸。本发明的转基因植物和植物组织可以从下列植物中制备，如番茄(Lycopersicon esqulentum)、烟草(烟草类)、补血草(波状补血草(Limonium sinuatum))、碧冬茄(Petunia hybrida)、洋桔梗(Eustoma grandiflora)、粘果酸浆(Physalis ixocarpa)、辣椒、大豆和其他会受或容易受TYLCV-Is感染的植物。本发明也涉及上述转基因植物的后代。
这里所用到的术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合体，并且除非特别限定，也包括与天然存在的核苷酸具有相似功能的天然核酸的已知类似物。上述多核苷酸序列包括可被转录成RNA的DNA链序列和可被翻译成蛋白质的RNA序列。本发明中所述的核酸或多核苷酸的互补序列也在本发明的范围内。多核苷酸序列包括编码本发明中Rep蛋白的全长序列，也包括来自全长序列的较短序列。可以理解一个特定的多核苷酸序列包括天然序列的简并密码子或可导入特异宿主细胞时提供优选的密码子序列。示例性序列的等位基因变异也包括在本发明中。
本发明的多核苷酸和蛋白质也可以被定义为与实施例中的多核苷酸和蛋白质具有较大同一性和/或相似性范围。序列同一性一般大于60％，优选地大于75％，更优选地大于80％，甚至更优选地大于90％，也可以大于95％。与本发明的实施例中序列相比较，序列的同一性和/或相似性可为49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％。除非特别强调，这里所述的两种序列的同一性和/或相似性百分比可以通过Karlin和Altschul(1990)的算法确定，以及经Karlin和Altschul(1993)的算法修正。这种算法被添加到Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST的搜索是通过NBLAST程序进行的，记分＝100，字长＝12，可得到所需百分序列同一性的序列。为比较缺口排列的目的，可以使用Altschul等人(1997)描述的Gapped BLAST程序。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的缺省参数。参见NCBI/NIH网点。
本发明还包括与实施例中序列具有充分同源性的多核苷酸分子，使得两者可在标准的严格条件和标准方法(Maniatis，T.等人，1982)下与序列杂交。这里所指的杂交的严格条件是指其中杂交在低于熔解温度(Tm)20-25℃过夜进行，DNA杂交液为6×SSPE，5×Denhardt’s溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml变性DNA。熔解温度如下列公式所述(Beltz，G.A.等人，1983)：
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/碱基对中双链体的长度。
洗涤一般如下进行：
(1)室温下1×SSPE，0.1％SDS，15分钟，洗两次(低严格条件洗涤)。
(2)Tm-20℃，0.2×SSPE，0.1％SDS，15分钟，洗一次(中度严格条件洗涤)
因此，尤其认为在严格条件下与如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示序列杂交的多核苷酸序列也包括在本发明范围内。
所有在这里参考和引用的专利、专利申请、临时申请和出版物都全文引用作为参考，包括所有的附图和表格及至与本说明书的明确讲授不一致之处。
下面举例说明实施本发明的步骤。这些实施例不能作为限定。除非特别指出所有的百分数均为重量百分数，所有的溶液混合物组分均以体积表示。
实施例1-转化番茄植株的产生
制备来自TYLCV-Is的截短型Rep基因多核苷酸(SEQ ID NO.4)。用引物EH312和EH313从病毒中经PCR扩增得到截短型Rep基因并用本领域公知的标准方法克隆。引物对EH312和EH313的核苷酸序列如下：
EH312：5′CCAAGCTTAGCCATTAGGTGTCCAAG3′HindIII(SEQ ID NO.1)
EH313：5′CTCTCGAGGATTTACTGCCTGAATTG3′Xho I(SEQ ID NO.2)
将截短型Rep基因的cDNA克隆插入具有增强型35S启动子和rbcS-E9终止信号的双元载体pKYLX71：35S2的多克隆位点(见图2)。然后通过标准的农杆菌介导的转化将Rep基因片段插入番茄(Lycopersiconesculentum Mill.)基因组。用农杆菌介导转化番茄按标准方法进行(Armitage等人，1988；McCormick等人，1986)。转基因植株经NPT II选择筛选，并用PCR扩增确证转基因的存在。
实施例2-番茄植株中的TYLCV-Is抗性
收获转化植株的种子后播种，用粉虱对T1子代的幼苗接种TYLCV-Is。收获时(接种后12周)，子代30个品系中的8个有超过41％的植株无病毒症状，而作为对照的未转化植株100％出现严重的病症(表1)。该结果说明该示例性508个核苷酸的截短型Rep基因在转基因番茄植株中赋予了高水平的TYLCV-Is(佛罗里达分离株)抗性。而且几乎在所有植株中转化植株表型正常。
TYLCV截短型Rep植株的T2子代先是暴露在带病毒的粉虱下，然后于2000年秋到2001年春种植在Bradenton，FL.的田里。在温室实验中观察到的TYLCV抗性在田里的这种较苛刻条件下同样很明显(表2，图4)。
实施例3-烟草植株中的TYLCV-Is抗性
为了检测截短型TYLCV Rep基因在其他植物：烟草中是否有效，与在番茄中所做的一样又用相同的载体构建体(图1)将“Xanthi”转入。7个转化截短型Rep基因的烟草品系表现出对TYLCV的免疫性。这就证实了由截短型Rep基因在不同宿主和独立的转化过程中引起的抗性。没有发现对另两种双生病毒：卷心菜叶片卷缩病毒和番茄斑点病毒(ToMoV)的抗性。这种由截短型Rep基因引起的抗性机制似乎是由于基因沉默。这一结论基于用TYLCV攻击TYLCV抗性植株时，对转化的烟草做Northern杂交分析显示截短型Rep基因转录本的抑制。
实施例4-番茄中Rep和C4构建体的检测
对八个含有TYLCV Rep基因、TYLCV-Is C4基因(一个定位在Rep基因内但具有不同阅读框的基因)或已改变的或截短形式的Rep基因的构建体在植物中作了评价。用饲养在TYLCV感染的番茄植株上的粉虱接种T1子代。在八个构建体中有三个未观察到病症，也未检测到TYLCV-Is(通过杂交和PCR检测)(明显的免疫性)(表1)。所有植株表型正常。选择T1子代植株的后代接种TYLCV，并在田里作出评价。如期望的那样，T2代植株表现出抗性分离(表2)。田中植株可观察到两种抗性-免疫性和恢复性。所有抗性植株表型正常。在生长季节共对植株作了3次TYLCV-Is检测。
C4和ΔC4构建体：评价了两种含有C4基因的构建体，其中C4基因在Rep基因内约220nt处起始，以正义(C4)或反义(ΔC4)定向，且不含有基因间区(IR)。它们在T1子代中不产生抗性(表1)。
C1，ΔC1，NC1和NΔC1构建体：含有基因间区或整个Rep基因的正义(C1)或反义( ΔC1)定向的构建体并不能在T1子代中产生免疫性。虽然仍在收集非增强型启动子品系的数据，但初步的数据暗示这与启动子无关(增强型启动子C1和ΔC1对非增强型启动子NC1和NΔC1)。在转化了NC1和NΔC1的T1和T2子代植株中出现了恢复，说明启动子有一些影响。
2/5 TYLCV Rep和AS 2/5 TYLCV Rep构建体：使用含有TYLCV-Is IR和2/5 TYLCV Rep基因，起始于Rep5’末端以正义(2/5 TYLCV Rep构建体；SEQ ID NO.6)或反义(AS 2/5 TYLCV Rep构建体；SEQ ID NO.7)定向的构建体得到了最好的抗性(见表1，2，3和4)。用2/5 TYLCV Rep构建体观察到最高的免疫性出现率。这种抗性表现为免疫性并且从T1到T3子代都能观察到高出现率。在T2子代中也观察到较低的恢复率，但在T3子代中恢复率更低(T3子代数据未显示)。
实施例5-建立源自TYLCV Rep的免疫性
即使在生长季节进行了3次检测(接种后的4，8和12周)，许多转化了2/5 TYLCV Rep构建体的T1和T2子代植株在接种TYLCV后并未表现出病症和病毒DNA(通过核酸杂交和PCR检测)。
为了确定是否由于病毒水平太低而用实验室分析检测不出又进行了研究。来自易感植株的插条(接穗)嫁接到检测不到病毒DNA的接种过的转化植株上。嫁接建立4周后接穗未表现病症也检测不到病毒DNA。这与将易感接穗嫁接到接种过的未转化植株形成对比。此时嫁接2-3周后，接穗表现出病症。这明显表明了在接种植株中没有病毒存在，抗性机制阻碍了病毒的复制。
实施例6-烟草的转化
将2/5 TYLCV Rep构建体转化烟草(Nicotiana tabacum)(Freitas-Astua，J.，2001)。测定T1子代植株的转基因拷贝数、转录本产生、TYLCV抗性和对两种非相关的二重双生病毒：番茄斑点病毒(ToMoV)和卷心菜叶片卷缩病毒(CabLCV)抗性。可以检测到植株对TYLCV是有免疫力的，证据就是在接种后通过ELISA、PCR和核酸杂交检测不到病毒。这种抗性与转基因的拷贝数无关。用TYLCV攻击后产生转录本，但转录本产物量明显减少(图5A和5B)。转化植物不具有对ToMoV或CabLCV的抗性。
可以理解上述描述的实施例和实施方案只是出于阐述的目的，建议本领域的熟练技术人员对其稍作其他多种改良或变化，这些也应包括在本申请的主题和范围内。
表1.用八种不同的TYLCV基因构建体转化番茄植株的T1子代，评价对TYLCV感染的抗性
转基因   产生种子的T0代植株数     评估的T1代植株数1     测试的品系数   具转基因的品系数   具转基因且具免疫性的品系数     免疫性出现率(％)     免疫性的平均出现率(％)
2/5 TYLCVRep   50     455     35   302   22     7-91     45.6
AS-2/5TYLCVRep 22 263 22 17 14 8-50 17.1
ΔC4   18     197     18   12   0     0     0
C4   1     12     1   0   0     0     0
C1   2     28     2   1   0     0     0
NC1   8     95     8   0   0     0     0
NΔC1   5     67     5   0   0     0     0
总数   123     1,292     106
1排除评价期间死亡的植株。
2斜体的数据表示非最终数据，还在研究中。
表2.用不同的TYLCV基因构建体转化番茄植株的T2子代，评价对TYLCV感染的抗性
构建体   测试的品系数   测试的植株数1   具免疫性的品系数 免疫性出现率   免疫性平均出现率     恢复的品系数   恢复的出现率   恢复的平均出现率
2/5TYLCVRep 13 347 13 26.6-80.0 53.8     5   3.3-31.8 13.7
AS-2/5TYLCVRep 5 135 5 10.0-55.1 22.3     4 16.640.0 29.2
C1ΔC1T2   2   50   2 66.9-72.2   69.6     1   13.3   13.3
ΔC4   NT
C4   NT
C1   NT
NC1   1   22   0 -   -     1   36.3   36.3
NΔC1   2   29   0 -   -     2   31.8，100   65.9
总数
1排除评价期间死亡的植株。
                表3.评价转化2/5 TYLCV Rep构建体的T2子代植株对TYLCV感染的抗性
品系号     测试植株数1   品系的免疫性出现率(％)   具转基因的植株数   具转基因的植株的免疫性出现率(％)(％)     ％恢复     ％逃逸2
2-5     29   75.9   18   100     0     18.0
2-9     30   80.0   23   100     0     0
21-2     443   41.0     -
21-4     30   80.0   24   100     0     0
21-8     29   55.1   12   92     0     33.3
21-10     20   390     -
23-2     44   27.0     -
23-5     12   31.8   5   100     0     29.0
23-7     36   32.0     -
25-4     22   57.0     -
25-5     30   40.0   12   83.3     0     6.6
25-11     28   39.2   12   58.3     0     10.7
25-15     12   27.0     -
32-6     39   40.0     -
32-12     18   29.0     -
37-6     40   40.0     -
37-11     38   78.0     -
37-12     30   33.3   13   76.9     23.0     6.6
37-13     31   52.0     -
45-10     25   80.0   19   100     0     4.0
51-4     30   26.6   10   80     20.0     0
62-5     29   48.2   13   100     0     3.4
70-12     23   82.6   13   69     0     13.0
89-5     22   27.2   5   100     0     4.5
1排除评价期间死亡的植株。
2％逃逸-没有病毒也未检测到转基因的植株(这些用与TYLCV基因外部的结合转化载体的引物28和94重新评价)。
3斜体的数据表示非最终数据，还在研究中。
            表4.评价转化AS-2/5 TYLCVRep构建体的T2子代植株对TYLCV感染的抗性
 品系号   测试植株数1     品系的免疫性出现率(％)   具转基因的植株数   具转基因的植株的免疫性出现率(％)     ％恢复     ％逃逸2
 66-2   30     10.0   8   12.5     37.5     0
 66-7   29     55.1   15   73.3     0     0
 66-11   30     20.0   18   22.2     66.6     3.3
 84-1   22     18.1   8   37.5     50.0     10.0
 84-8   24     8.3   6   0.0     66.6     0
1排除评价期间死亡的植株。
2％逃逸-没有病毒也未检测到转基因的植株(这些用与TYLCV基因外部的结合转化载体的引物28和94重新评价)。
3斜体的数据表示非最终数据，还在研究中。
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序列表
                               序列表
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     欧内斯特·希伯特
<120>用于在植物中产生番茄黄卷缩病毒抗性的材料和方法
<130>POL-100XC1 PCT
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>番茄黄叶卷缩病毒
<400>1
ccaagcttag ccattaggtg tccaag                                    26
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>番茄黄叶卷缩病毒
<400>2
ctctcgaggg atttactgcc tgaattg                                   27
<210>3
<211>142
<212>PRT
<213>番茄黄叶卷缩病毒
<400> 3
Met Pro Arg Leu Phe Lys Ile Tyr Ala Lys Asn Tyr Phe Leu Thr Tyr
1               5                   10                  15
Pro Asn Cys Ser Leu Ser Lys Glu Glu Ala Leu Ser Gln Leu Lys Lys
            20                  25                  30
Leu Glu Thr Pro Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Lys Val Cys Lys Glu Leu
        35                  40                  45
His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Val Leu Ile Gln Phe Glu Gly
    50                  55                  60
Lys Tyr Gln Cys Lys Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser Pro Asn
65                  70                   75                  80
Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Ala Ala Lys Ser Ser Thr
                85                  90                  95
Asp Val Lys Thr Tyr Val Glu Lys Asp Gly Asn Phe Ile Asp Phe Gly
            100                 105                 110
Val Ser Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln Ser Ala
        115                 120                 125
Asn Asp Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Asn Ser Gly Ser Lys Ser
    130                 135                 140
<210>4
<211>506
<212>DNA
<213>番茄黄叶卷缩病毒
<400>4
gccattaggt gtcgaggtat tagtaagaca ccgatacacc gattgccata gagctttgag     60
ggacaccgat tcatttcaac atgcctcgtt tatttaaaat atatgccaag aattatttcc     120
taacatatcc caattgttct ctctctaaag aggaagcact ttcccaatta aaaaacatag     180
aaaccccaac aaataaaaaa tacatcaaag tttgcagaga attccacgag aatggggaac     240
cacatctcca tgtgcttatc caattcgaag gcaaatacca atgtaagaac caacggttct     300
tcgacctggt atccccaaac aggtcagcac atttccatcc aaacattcag gcagctaaga     360
gctcaacaga tgtcaagacc tacgtggaga aagacggaga cttcattgat tttggagttt     420
tccaaatcga tggcagatca gctagaggag gtcagcaatc tgccaacgac gcatacgccg     480
gagcactcaa ttcaggcagt aaatcc                                                       506
<210>5
<211>506
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>番茄黄叶卷缩病毒的反义序列
<400>5
ggatttactg cctgaattga gtgctccggc gtatgcgtcg ttggcagatt gctgacctcc     60
tctagctgat ctgccatcga tttggaaaac tccaaaatca atgaagtctc cgtctttctc     120
cacgtaggtc ttgacatctg ttgagctctt agctgcctga atgtttggat ggaaatgtgc     180
tgacctgttt ggggatacca ggtcgaagaa ccgttggttc ttacattggt atttgccttc     240
gaattggata agcacatgga gatgtggttc cccattctcg tggaattctc tgcaaacttt     300
gatgtatttt ttatttgttg gggtttctag gttttttaat tgggaaagtg cttcctcttt     360
agagagagaa caattgggat atgttaggaa ataattcttg gcatatattt taaataaacg     420
aggcatgttg aaatgaatcg gtgtccctca aagctctatg gcaatcggtg  tatcggtgtc    480
ttactaatac ctcgacacct aatggc                                          506
<210>6
<211>508
<212>DNA
<213>番茄黄叶卷缩病毒
<400>6
tagccattag gtgtcgaggt attagtaaga caccgataca ccgattgcca tagagctttg     60
agggacaccg attcatttca acatgcctcg tttatttaaa atatatgcca agaattattt     120
cctaacatat cccaattgtt ctctctctaa agaggaagca ctttcccaat taaaaaacat     180
agaaacccca acaaataaaa aatacatcaa agtttgcaga gaattccacg agaatgggga     240
accacatctc catgtgctta tccaattcga aggcaaatac caatgtaaga accaacggtt     300
cttcgacctg gtatccccaa acaggtcagc acatttccat ccaaacattc aggcagctaa     360
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cggagcactc aattcaggca gtaaatcc                                                    508
<210>7
<211>691
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>番茄黄叶卷缩病毒的反义序列
<400>7
agagcgaccc actcttcaag ttcatctgga acttgattaa aagaagaaga aagaaatgga     60
gaaacataaa cttctaaagg aggactaaaa atcctatcta aatttgaatt taaattatga     120
aattgtaaaa tatagtcctt tggggccttt tcttttaata tattgagggc ctcggattta     180
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gtcttgacat ctgttgagct cttagctgcc tgaatgtttg gatggaaatg tgctgacctg     360
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tacctggaca cctaatggct atttctctag a                                    691
<210>8
<211>1998
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达载体
<400>8
gaattcgccc ggggatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctatatctct     60
acgatctagt caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg     120
agaagattag ccttttcaat ttcagaaaga atcctaaccc acagatggtt agagacgctt     180
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caaaggccat ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg     480
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gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat     720
gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca     780
aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt     840
caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacgcttgtc tacctccaaa     900
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tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag     1020
tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg     1080
aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg     1140
aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg     1200
acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa     1260
gttcatttca tttggagagg acacgctgaa atcaccagtc tctctctaag cttggatcct     1320
cgagctgcag gagctcgaat tgatcctcta gagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca     1380
acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca ttgcgcacac accagaatcc tactgagttc     1440
gagtattatg gcattgggaa aactgttttt cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac     1500
tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt     1560
aatgaatgat atggtccttt tgttcattct caaattaata ttatttgttt tttctcttat     1620
ttgttgtgtg ttgaatttga aattataaga gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa     1680
tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt     1740
gtaccattat gcttattcac taggcaacaa atatattttc agacctagaa aagctgcaaa     1800
tgttactgaa tacaagtatg tcctcttgtg ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt     1860
aattttccag aatccttgtc agattctaat cattgcttta taattatagt tatactcatg     1920
gatttgtagt tgagtatgaa aatatttttt aatgcatttt atgacttgcc aattgattga     1980
caacatgcat caatcgat                                                   1998

Claims (68)

1.一种在植物或植物组织中提供对番茄黄叶卷缩病毒(TYLCV)感染抗性的方法，该方法包括用选自以下的多核苷酸转化所述植物或植物组织：
i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因间区的全部或一部分和Rep基因5’编码序列的约400到500个核苷酸组成，或所述多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段；
ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列，或包含所述反义多核苷酸的可提供感染抗性的片段的多核苷酸；以及
iii)包含在严格条件下与所述的TYLCV Rep基因片段或与所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列杂交的序列，或包含所述杂交多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is的佛罗里达分离株。
4.根据权利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
5.根据权利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
6.根据权利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
7.根据权利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
8.根据权利要求1的方法，其中所述番茄黄叶卷缩病毒选自：TYLCV-中国株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亚株、TYLCV-萨迪尼亚株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亚株、TYLCV-泰国株和TYLCV-也门株。
9.根据权利要求8的方法，其中所述番茄黄叶卷缩病毒是TYLCV-以色列株。
10.根据权利要求1的方法，其中所述植物或植物组织选自：番茄、烟草、补血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸浆。
11.根据权利要求10的方法，其中所述植物或植物组织是番茄。
12.根据权利要求10的方法，其中所述植物或植物组织是烟草。
13.根据权利要求1的方法，其中用所述多核苷酸通过农杆菌感染法、基因枪靶向法、电穿孔法或直接基因注射法转化所述植物或植物组织。
14.根据权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至所述Rep基因序列的调控序列。
15.根据权利要求14的方法，其中所述调控序列包含启动子。
16.根据权利要求15的方法，其中所述启动子选自：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。
17.根据权利要求15的方法，其中所述启动子选自：CaMV 35S启动子、CaMV 35S2启动子、章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、Ap3启动子、热休克80启动子、苜蓿组蛋白H 3.2基因启动子和E8启动子。
18.根据权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含选择性标记基因。
19.根据权利要求10的方法，其中所述选择性标记基因在表达时提供抗生素抗性。
20.根据权利要求19的方法，其中所述抗生素抗性选自G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素抗性。
21.根据权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含3’非翻译终止序列。
22.具有增强的对番茄黄叶卷缩病毒(TYLCV)感染抗性的转基因的或转化的植物或植物组织，其中所述植物或植物组织包含选自以下的多核苷酸：
i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因间区的全部或一部分和Rep基因5’编码序列的约400到500个核苷酸组成，或所述多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段；
ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列，或包含所述反义多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸；以及
iii)包含在严格条件下与所述的TYLCV Rep基因片段或与所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列杂交的序列，或包含所述杂交多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
23.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is。
24.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is的佛罗里达分离株。
25.根据权利要求22的植物或植物组织，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
26.根据权利要求22的植物或植物组织，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
27.根据权利要求22的植物或植物组织，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
28.根据权利要求22的植物或植物组织，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
29.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述番茄黄叶卷缩病毒选自：TYLCV-中国株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亚株、TYLCV-萨迪尼亚株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亚株、TYLCV-泰国株和TYLCV-也门株。
30.根据权利要求29的植物或植物组织，其中所述番茄黄叶卷缩病毒是TYLCV-以色列株。
31.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述植物或植物组织选自：番茄、烟草、补血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸浆。
32.根据权利要求31的方法，其中所述植物或植物组织是番茄。
33.根据权利要求31的方法，其中所述植物或植物组织是烟草。
34.根据权利要求22的植物或植物组织，其中用所述的多核苷酸通过农杆菌感染法、基因枪靶向法、电穿孔法或直接基因注射法转化所述植物或植物组织。
35.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至所述Rep基因序列的调控序列。
36.根据权利要求35的植物或植物组织，其中所述调控序列包含启动子。
37.根据权利要求36的植物或植物组织，其中所述启动子选自：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。
38.根据权利要求36的植物或植物组织，其中所述启动子选自：CaMV35S启动子、CaMV 35S2启动子、章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、Ap3启动子、热休克80启动子、苜蓿组蛋白H3.2基因启动子和E8启动子。
39.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述多核苷酸包含选择性标记基因。
40.根据权利要求39的植物或植物组织，其中所述选择性标记基因当表达时提供抗生素抗性。
41.根据权利要求40的植物或植物组织，其中所述抗生素抗性选自：G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素抗性。
42.根据权利要求22的植物或植物组织，其中所述多核苷酸包含3’非翻译终止序列。
43.权利要求22的植物或植物组织的后代。
44.选自如下的多核苷酸：
i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因间区的全部或一部分和Rep基因5’编码序列的约400到500个核苷酸组成，或所述多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段；
ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列，或包含所述反义多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸；以及
iii)包含在严格条件下与所述的TYLCV Rep基因片段或与所述的TYLCV Rep基因片段的反义序列杂交的序列，或包含所述杂交多核苷酸的可提供对所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
45.根据权利要求44的方法，其中所述TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is。
46.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述TYLCV Rep基因片段来自TYLCV-Is的佛罗里达分离株。
47.根据权利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
48.根据权利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SBQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
49.根据权利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
50.根据权利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反义序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能够提供感染抗性的片段。
51.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述番茄黄叶卷缩病毒选自：TYLCV-中国株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亚株、TYLCV-萨迪尼亚株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亚株、TYLCV-泰国株和TYLCV-也门株。
52.根据权利要求51的多核苷酸，其中所述番茄黄叶卷缩病毒是TYLCV-以色列株。
53.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述植物或植物组织选自：番茄、烟草、补血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸浆。
54.根据权利要求53的多核苷酸，其中所述植物或植物组织是番茄。
55.根据权利要求53的多核苷酸，其中所述植物或植物组织是烟草。
56.根据权利要求44的多核苷酸，其中用所述多核苷酸通过农杆菌感染法、基因枪靶向法、电穿孔法或直接基因注射法转化所述植物或植物组织。
57.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至所述Rep基因序列的调控序列。
58.根据权利要求57的多核苷酸，其中所述调控序列包含启动子。
59.根据权利要求58的多核苷酸，其中所述启动子选自：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。
60.根据权利要求58的多核苷酸，其中所述启动子选自：CaMV 35S启动子、CaMV 35S2启动子、章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、Ap3启动子、热休克80启动子、苜蓿组蛋白H3.2基因启动子和E8启动子。
61.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选择性标记基因。
62.根据权利要求61的多核苷酸，其中所述选择性标记基因在表达时提供抗生素抗性。
63.根据权利要求62的多核苷酸，其中所述抗生素抗性选自：G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素抗性。
64.根据权利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3’非翻译终止序列。
65.一种表达载体，其包含权利要求44的多核苷酸。
66.根据权利要求65的表达载体，其中所述表达载体适于在植物中表达所述多核苷酸。
67.植物细胞，在其基因组中包含权利要求44的多核苷酸。
68.植物种子，在其基因组中包含权利要求44的多核苷酸。
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