NL1033758C2 - ToTV-resistente planten. - Google Patents

Description

Titel: ToTV-resistente planten

5 TECHNISCH GEBIED VAN DE UITVINDING

De uitvinding heeft betrekking op virusresistente planten en de werkwijzen voor het produceren van dergelijke planten. Meer specifiek heeft de uitvinding betrekking op planten die resistent zijn tegen het tomatentorradovirus (ToTV), op werkwijzen voor het produceren van 10 dergelijke planten en op de aldus verkregen planten en delen van planten.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

De tomaat Solarium lycopersicum (formeel Lycopersicon 15 esculentum) is gevoelig voor een groot aantal virussoorten. Sommige van de meest voorkomende tomatenvirussen omvatten Tomato spotted wilt virus (TSWV (tomatenbronsvlekkenvirus); genus Tospovirus); Pepino mosaic virus (PepMV (pepinomozaïekvirus); genus Potexvirus), en Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV (tomatengeelkrulbladvirus); 20 genus Begomovirus). De schade die deze aandoeningen aan de plant toebrengen, varieert van verkleuring van de bladeren en necrotische letsels tot ernstig oogstverlies en sterfte van de plant.

De mogelijkheid om resistente planten de verschaffen is uitermate belangrijk voor professionele telers, en voor sommige van de 25 economisch meest schade verwekkende virussen werden er resistente plantvariëteiten geproduceerd. Soms duiken er echter nieuwe virussen op die aanzienlijke schade kunnen veroorzaken aan de oogst.

In 1996 werd een nieuw tomatenvirus gemeld dat sinds 1993 tomatenplanten had aangetast in de VS en Italië, het Tomato infectious 30 chlorosis virus (TICV (tomateninfectieuschlorosevirus); genus Crinivirus; Duffus et al., 1996) genaamd. Een ander nieuw 1033758 2 tomatenvirus van hetzelfde geslacht werd gemeld in 1998. Dit virus bleek in de VS sinds 1989 tomatenplanten te hebben geïnfecteerd en werd Tomato chlorosis virus (ToCV (tomatenchlorosisvirus); Wisler et al., 1998) genaamd. Deze twee nieuwe virussen werden verspreid door 5 de motluis; dit insect is een zeer doeltreffende ziekte-overbrenger.

Over het algemeen wordt aangenomen dat de geografische verspreiding van bekende virussen zal toenemen en dat er nieuwe virussen zullen verschijnen, gedeeltelijk als gevolg van de recombinatie van verschillende virussen waardoor nieuwe stammen of nieuwe 10 virussen worden gevormd. De ontwikkeling van resistente cultivars kan een belangrijke rol spelen in de succesvolle behandeling van deze ziektes.

Onlangs werd, op tomatenplanten uit Spanje, een nieuw virus ontdekt dat symptomen veroorzaakte die niet konden worden 15 toegewezen aan een bekend virus. De planten vertoonden necrotische letsels op de bladeren en bruine ringen op de vruchten in combinatie met een verminderde groei. In serologische tests (ELISA) werd de aanwezigheid aangetoond van het Pepino mosaic virus (PepMV)· Elektronenmicroscopisch onderzoek onthulde wel degelijk staafachtige 20 deeltjes, die kenmerkend zijn voor potexvirussen. Er werden echter ook bolvormige virale deeltjes gevonden in het geïnfecteerde weefsel. De uitvinders konden het nieuwe virus van het complex met PepMV scheiden. Het nieuwe virus werd voorlopig Tomatentorradovirus (ToTV) genaamd, werd gedeponeerd bij de Deutsche Sammlung von 25 Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH op 24 november 2004 onder het referentienummer ToTV-EOl (DSM 16999), en is de ziekteverwekker voor tomaten zoals "torrado" (Spanje), "marchitez" (Mexico) of "chocolate". Er wordt verondersteld dat het virus ook ziektesymptomen kan veroorzaken die gelijkaardig zijn aan de 30 symptomen die ontstaan bij tomaten van andere genera van solanum, 3 vooral bij Capsicum spp. (paprika) en Solanum melongena (aubergine).

Om dit ogenblik zijn er geen planten bekend die een specifieke resistentie bevatten voor dit nieuwe virus, terwijl er een grote behoefte bestaat aan het ontwikkelen van dergelijke resistente planten.

5

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinders hebben nu tomatenplanten ontdekt die resistent zijn tegen ToTV. Ze kwamen tot de vaststelling dat, na blootstelling van de planten aan het virus, de ziektesymptomen 10 wegbleven, en dat er geen virale deeltjes, of viraal RNA, bij deze planten konden worden waargenomen. Zoals hieronder weergegeven wordt deze respons omschreven als resistent. Dergelijke planten zijn van cruciaal belang voor de ontwikkeling van commercieel waardevolle soorten van gecultiveerde tomaten die resistent zijn tegen het nieuwe 15 virus. Door kruisexperimenten werd vastgesteld dat het gen dat verantwoordelijk was voor de resistentie tegen ToTV bij de resistente planten homozygoot aanwezig was en dat heterozygote planten ontvankelijk waren voor virale infectie. Men kwam dus tot de ontdekking dat ToTV resistentie wordt verleend door een recessief gen. 20 Planten die beide vormen van het allel bevatten, d.w.z. heterozygote planten, zijn echter even nuttig voor plantentelers doordat ze kunnen worden gebruikt als ouderplant bij kruisingen en sellings om homozygote afstammelingen te verkrijgen

In een eerste aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking 25 op een tomatenplant met in zijn genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV); genoemd virus werd gedeponeerd bij de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH op 24 november 2004 onder het referentienummer ToTV-EOl (DSM 16999). ToTV resistente 30 tomatenplanten waren tot op heden onbekend.

4

Na opeenvolgende experimenten kwamen de uitvinders tot de vaststelling dat de resistentie van deze ToTV resistente tomatenplanten nauw was verbonden met een aantal AFLP merkers. Zonder gebonden te willen zijn door theorie, en ondanks het feit dat de 5 locatie van de meeste van deze merkers op het genoom nog moeten worden achterhaald, neemt men aan dat het gen (de genen) dat verantwoordelijk is (zijn) voor de bepaalde eigenschap zich bevindt (bevinden) op chromosoom 4. Daarom bevindt, in een voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd eerste aspect, het allel dat een 10 gen omvat dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zich in een genomisch gebied dat is verbonden met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en/of P13/M38-F-311/313, bij voorkeur met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met 15 de grootste voorkeur met AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd eerste aspect bevindt genoemd allel zich op chromosoom 4, bij voorkeur in een genomisch gebied tussen AFLP merkers P14/M49-F-282 en P11/M35-F-20 216.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd eerste aspect is genoemd allel aanwezig in homozygote vorm, waardoor de plant het resistente fenotype expresseert.

In nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd 25 eerste aspect is genoemde tomatenplant een plant van de Solarium lycopersicum familie, bij voorkeur een gecultiveerde tomatenplant.

In nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd eerste aspect wordt genoemde weerstand geëxpresseerd als een weerstand tegen het uitbreken van een infectie met ToTV na 30 blootstelling van genoemde plant een ten minste de minimale 5 infectueuze dosering van het virus. Eenieder die is onderlegd in het vakgebied zal begrijpen dat de minimale effectieve dosis kan worden bepaald door routine-experimenten op ontvankelijke planten.

In nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd 5 eerste aspect werd genoemde plant geïdentificeerd in een resistentie-bioassay met betrekking tot infectie met ToTV, of waarin genoemde plant wordt geïdentificeerd door screening op de aanwezigheid van ten minste één moleculaire merker die is verbonden met genoemd allel van genoemd ToTV resistentie gen.

10 In nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemd eerste aspect wordt genoemde plant geproduceerd door een werkwijze omvattende screening op de aanwezigheid van ten minste één moleculaire merker die is verbonden met genoemd allel van genoemd ToTV resistentie gen.

15 In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een plant-deel dat is afgeleid van een plant van de onderhavige uitvinding. Voorbeelden van plant-delen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, enkelvoudige cellen en weefsels van pollen, zaadknoppen, bladeren, embryo’s, wortels, wortelpunten, helmknoppen, 20 bloemen, vruchten, stengelscheuten en zaden; evenals pollen, zaadknoppen, bladeren, embryo’s, wortels, wortelpunten, helmknoppen, bloemen, vruchten, stengelscheuten, enten, wortelstokken, zaden, protoplasten, calli, en dergelijke. Genoemd deel is bij voorkeur een vrucht of zaad. Andere voorkeursuitvoeringsvormen van plant-delen 25 omvatten delen voor vegetatieve propagatie waaronder dergelijke voorkeursdelen zoals microsporen, pollen, zaadknoppen, bladeren, embryo’s, wortels, wortelpunten, helmknoppen, bloemen, vruchten, stengelscheuten, stengels, scheuten, enten, wortelstokken, protoplasten, calli, en meristematisch weefsel en dergelijke.

6

In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het selecteren van een tomatenplant die resistent is tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals hierin gedefinieerd, waarbij genoemde werkwijze de volgende stappen omvat: 5 a) verschaffen van een inoculum van genoemd virus; b) blootstelling van een tomatenplant aan genoemd inoculum; c) voldoende incubatietijd voorzien; en d) selecteren van genoemde tomatenplant in geval er zich geen infectie voordoet bij genoemde plant na het verstrijken van genoemde 10 incubatietijd.

In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het selecteren van een tomatenplant met in zijn genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals hierin 15 gedefinieerd, waarbij genoemde werkwijze de stappen omvat van het screenen van het genomisch DNA van een tomatenplant op de aanwezigheid van een genomisch gebied dat is verbonden met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en/of P13/M38-F-311/313, bij voorkeur met AFLP 20 merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met de grootste voorkeur met AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/ 313.

In nog een ander aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor de productie van een tomatenplant 25 omvattende het selecteren van een plant met in zijn genoom ten minste één allel (van een gen) dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals hierin gedefinieerd door uitvoering van een werkwijze voor het selecteren van een tomatenplant volgens de onderhavige uitvinding en kruising van genoemde geselecteerde plant 7 met zichzelf of met een andere tomatenplant om zaad te produceren, en het zaad te laten groeien tot een tomatenplant.

In nog een ander aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het produceren van een tomatenplant 5 die resistent is tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals hierin gedefinieerd, waarbij genoemde werkwijze de volgende stappen omvat: a) selecteren van een plant met in zijn genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent tegen genoemd tomatentorradovirus (ToTV) door uitvoering van een werkwijze voor 10 het selecteren van een tomatenplant volgens de onderhavige uitvinding; b) kruising van genoemde geselecteerde plant met een andere tomatenplant om met zichzelf om zaad te produceren; c) genoemd zaad laten groeien tot een tomatenplant om 15 nakomelingen te produceren; d) eventueel herhalen van de kruisings- en groeistappen van de stappen b) en c), en e) selectie onder de nakomelingen van een plant waarbij genoemd allel aanwezig is in homozygote vorm.

20 In een voorkeursuitvoeringsvorm van genoemde werkwijze wordt de selectie in stap e) uitgevoerd door screening van het DNA van genoemde nakomeling op de homozygote aanwezigheid van genoemd genomisch gebied dat is verbonden met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en/of 25 P13/M38-F-311/313, bij voorkeur met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met de meeste voorkeur met AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/ 313. Eventueel kan de selectie in stap e) worden uitgevoerd door een resistentie bioassay met gebruik van genoemd ToTV virus of elke geschikte 30 werkwijze zoals hierin beschreven.

8

In nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van genoemde werkwijze is de tomatenplant een plant van de Solarium lycopersicum familie, bij voorkeur een gecultiveerde tomatenplant.

In nog andere aspecten heeft de onderhavige uitvinding 5 betrekking op een tomatenplant die kan worden verkregen door een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding en op een plant-deel, bij voorkeur een vrucht of zaad, afkomstig van genoemde nieuwe en inventieve tomatenplant. Genoemd plant-deel is een alternatieve voorkeursuitvoeringsvorm omvattende plant-delen die geschikt zijn 10 voor vegetatieve propagatie.

BESCHRIJVING VAN DE VOORKEURSUITVOERINGSVORMEN

Zoals hierin gebruikt betekent de term “allel(en)” gelijk welke van een of meer alternatieve vormen van een gen, waarvan alle allelen 15 ten minste één eigenschap of kenmerk gemeenschappelijk hebben. In een diploïde cel of organisme bezetten de twee allelen van een bepaald gen overeenkomstige loei op een paar homologe chromosomen. Doordat de onderhavige uitvinding betrekking heeft op werkwijzen die de stappen omvatten voor het identificeren van genomische gebieden die 20 een of meer genen omvatten, maar ook regulatorische sequenties, is het in bepaalde gevallen meer nauwkeurig om te verwijzen naar “haplotype” (d.w.z. een allel van een chromosomaal segment) in plaats van “allel”; in die gevallen moet de term “allel” worden geïnterpreteerd als omvattende de term “haplotype”.

25 Een “gen” wordt hierin gedefinieerd als een overgeërfde eenheid bestaande uit een DNA sequentie die een specifieke locatie bezet op een chromosoom en die de genetische instructie bevat voor een specifiek kenmerk of eigenschap in een organisme.

Een “locus” wordt hierin gedefinieerd als de positie die een 30 bepaald gen bezet op een chromosoom van een bepaalde soort.

9

Zoals hierin gebruikt, betekent de term “heterozygoot” een genetische conditie die bestaat wanneer verschillende allelen overeenkomstige loei bezetten op homologe chromosomen.

Zoals hierin gebruikt, betekent de term “homozygoot” een 5 genetische conditie die bestaat wanneer identieke allelen overeenkomstige loei bezetten op homologe chromosomen.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term “moleculaire merker” naar een indicator die wordt gebruikt bij werkwijzen voor het visualiseren van verschillen in kenmerken van nucleïnezuursequenties. 10 Voorbeelden van dergelijke indicatoren zijn restrictiefragment lengtepolymorfisme (RFLP) merkers, geamplificeerd fragment lengtepolymorfisme (AFLP) merkers, enkelvoudige nucleotide polymorfismen (SNPs), microsatellietmerkers (bv. SSRs), sequentiegekenmerkte geamplificeerd gebied (SCAR) merkers, 15 gespleten geamplificeerde polymorfe sequentie (CAPS) merkers of isozyme merkers of combinaties van de hierin beschreven merkers die een specifieke genetische en chromosomale locatie vastleggen.

Zoals hierin gebruikt, betekent de term "tomaat" elke plant, lijn of populatie van Lycopersicon waaronder, maar niet beperkt tot, 20 Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon esculentum (br Solanum ly coper sicum), Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium, of Solanum lycopersicoides. Wilde 25 verwanten van de moderne tomaat werden geclassificeerd in het Lycopersicon geslacht, zoals L. pennellii, L. hirsutum, L. peruuianum, L. chilense, L. parviflorum, L. chmielewskii, L. cheesmanii, L.cerasiforme, en L. pimpinellifolium. De laatste jaren bestaat er een meningsverschil tussen tomaatonderzoekers en botanisten om de 30 namen van deze soorten al dan niet te herclassificeren. De nieuwe 10 voorgestelde wetenschappelijke naam voor de moderne tomaat is Solarium lycopersicum. Op een gelijkaardige manier kunnen de namen van de wilde soorten worden veranderd. L. pennellii wordt dan Solarium pennellii, L. hirsutum wordt dan S. habrochaites, L.

5 peruvianum kan worden gesplitst in S. 'Nperuvianum' en S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, en S. corneliomuelleri, L. parviflorum wordt dan S.neorickii, L. chmielewskii wordt dan S. chmielewskii, L. chilense wordt dan S. chilense, L. cheesmaniae wordt dan S. cheesmaniae of S. galapagense, en L. pimpinellifolium wordt dan S. 10 pimpinellifolium (Solanacea Genome Network (2005) Spooner en Knapp; http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum nomenclature.html).

Een plant volgens de onderhavige uitvinding bestaat in de natuur. Toch werd deze geïdentificeerd als een resultaat van een 15 technisch proces. De onderhavige uitvinding onthult twee belangrijke werkwijzen voor het identificeren van een dergelijke plant. In een eerste werkwijze wordt de plant geïdentificeerd door middel van een resistentie bioassay omvattende de blootstelling van een kandidaatplant aan een effectieve dosering tomaattorradovirus (ToTV) 20 (door mechanische inoculatie of blootstelling in het veld) zoals hierin gedefinieerd. Wanneer de kandidaatplant vrij van ziekte blijft, waarvan de symptomen bestaan uit necrotisch letsel eindigend in verbrand-achtige, volledige necrose van plantmateriaal, voornamelijk bladeren, en sterfte van de plant en/of concentrische ringen van 25 necrotische vlekken op de vruchten, zegt men dat genoemde plant resistent is. De plant die wordt geïdentificeerd door middel van deze werkwijze omvat twee allelen omvattende een gen dat resistent is tegen tomatentorradovirus (ToTV), en is dientengevolge homozygoot voor de eigenschap.

11

Een plant van de onderhavige uitvinding omvat ten minste één gen dat resistentie verleent tegen ToTV. De locus van het gen is verbonden met een aantal AFLP merkers zoals hierin gedefinieerd. De locatie van vele van deze AFLP merkers op de genomische map van 5 tomaat is echter nog niet bekend. Daarom is de positie van het gen in het genoom nog niet helemaal zeker. Doordat merker P14/M49-F-282 hypothetisch is gelokaliseerd op chromosoom 4, bestaat er een sterk vermoeden dat de locus is gelokaliseerd op chromosoom 4. Bij het vergelijken van de locatie van openlijk bekende merkers met die van 10 P14/M49-F-282, blijkt dat het gen is gelokaliseerd in een gebied waarvan de grenzen worden bepaald door CT264 (Tomaat EXPEN 2000 positie 86 cM) en merker TG163 Tomaat EXPEN 2000 positie 135 cM). Een plant van de onderhavige uitvinding kan worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een ToTV resistentie gen dat zich op chromosoom 15 4 op een positie bevindt tussen merkers CT264 and TG 163.

De planten van de onderhavige uitvinding bleken resistent te zijn tegen het virale middel dat de tomatenziekte veroorzaakt dat in Mexico bekend is onder de naam “marchitez”. Men veronderstelt dat dit virale middel hetzelfde is als het middel dat werd gedeponeerd onder 20 het aanwinstennummer DSM 16999 en de naam Tomatentorradovirus (ToTV) toegewezen kreeg. ToTV is de verwekker van een gelijkaardige tomatenziekte in Spanje, “torrado” genaamd. Men heeft vastgesteld dat de merkers, zoals hierin beschreven, die verband houden met weerstand tegen het ToTV virus dat werd gedeponeerd onder het 25 aanwinstennummer DSM16999 ook verband houden met weerstand tegen “marchitez”. Daarom zijn de planten, zoals hierin gedefinieerd, zowel resistent tegen “torrado” als tegen “marchitez”. De planten, zoals hierin beschreven, verlenen dus resistentie tegen: - alle virussen die ziekteverwekkers zijn en die ziektes 30 veroorzaken bij tomatenplanten met dezelfde of gelijkaardige 12 symptomen als deze veroorzaakt door het gedeponeerde virus ToTV DSM 16999; - alle plantenvirussen die tot dezelfde taxon behoren als die van ToTV (waarvan de taxonomische classificatie nog moet 5 worden bepaald), bij voorkeur de plantenvirussen van dezelfde familie, met een grotere voorkeur van hetzelfde geslacht, met een nog grotere voorkeur van dezelfde soort;

ToTV DSM 16999.

In een alternatieve werkwijze voor het identificeren van een 10 plant van de onderhavige uitvinding in de natuur, wordt de plant geïdentificeerd door screening op de aanwezigheid van ten minste één moleculaire merker die is verbonden met ten minste een allel van genoemd ToTV resistentie gen. De onderhavige uitvinding beschrijft nu diverse AFLP merkers die geschikt zijn voor gebruik in een dergelijke 15 screeningtest, doordat men heeft vastgesteld dat ze op verschillende manieren zijn verbonden met de aanwezigheid van het resistentie gen in tomatenplanten. Een geschikte moleculaire merker kan worden gekozen uit de groep bestaande uit AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en 20 P13/M38-F-311/313, bij voorkeur uit de groep bestaande uit AFLP

merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313, met de meeste voorkeur uit de groep bestaande uit AFLP merkers P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313. Het voorbeeld geeft een meer gedetailleerde beschrijving van de verbinding tussen deze merkers en 25 de resistentiekenmerken.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant, of een deel daarvan. Er zijn diverse mogelijkheden voor het identificeren van ToTV-resistente planten. In een eerste groep van uitvoeringsvormen van een dergelijke 30 werkwijze kunnen actieve/infectueuze of volledige-lengte infectueuze 13 klonen worden gebruikt, terwijl in een alternatieve uitvoeringsvorm alleen middelen voor virusdetectie worden gebruikt.

Een eerste stap van een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant door middel van een actief/infectueus virus 5 omvat het blootstellen van de plant of plant-deel, zoals een blad of stengelsegment, aan een infectueuze dosering van ToTV, waarbij het doel het verkrijgen van een infectie is. De blootstelling kan in vele gevallen het toedienen van fysiek contact inhouden. Een infectueuze dosering kan variëren tussen de verschillende planten en tussen de 10 geteste ToTV-isolaten. Theoretisch volstaat een hoeveelheid van ongeveer 1 tot 10 tot een hoeveelheid van 500-5000 virale deeltjes van genoemd virus of de nucleïnezuren daarvan. Infectie kan op deze manier worden verkregen door mechanische inoculatie van gezuiverde virusdeeltjes of virus nucleïnezuur op gezonde planten of, bijvoorbeeld, 15 door passieve inoculatie via blootstelling aan geïnfecteerde planten.

Eventueel kan infectie worden verkregen door bijvoorbeeld: - het laten groeien van een gezonde ent op een met ToTV geïnfecteerde wortelstok, of omgekeerd; - blootstelling van een gezonde plant aan transmissievectoren die 20 het virus bevatten (waaronder geïnfecteerde planten, bv. parasitaire planten zoals Cuscuta spp.); - het introduceren in een gezonde plant van een expressievector die een codeergebied bevat van het ToTV virus genoom; . het gebruik van agro-infectueuze klonen, zoals Agrobacterium 25 tumefaciens stammen bevattende een expressievector die een codeergebied bevat van het ToTV virus genoom;

In de context van de onderhavige uitvinding zijn de werkwijzen voor het blootstellen van een plant of plant-deel aan een infectueuze dosering van ToTV niet beperkt tot een specifieke werkwijze.

14

Zoals reeds vermeld kan infectie mechanische inoculatie omvatten van het virus op gezonde planten. Een deel van een ziek blad kan bijvoorbeeld rechtstreeks over een blad worden gewreven van een plant die moet worden geïnfecteerd. In een alternatieve werkwijze kan 5 bijvoorbeeld een inoculum worden bereid door het malen van virusbevattend plantenweefsel, bijvoorbeeld jonge bladeren die symptomen vertonen, met stamper en mortier, of met elk ander geschikt maalinstrument, in bijvoorbeeld een buffer die geschikt is voor inoculatie (bu. een 0,03 M fosfaatbuffer, pH 7,7) Na het malen, wordt 10 het verkregen homogenaat (het sap) bij voorkeur gefilterd, bv. door een kaasdoek. Het sap kan dan de inoculatie zijn, bijvoorbeeld door de bladeren voorzichtig in contact te brengen met een hoeveelheid van het sap. De bladeren worden bij voorkeur voorbehandeld om de lagere epidermis te beschadigen en het binnendringen van het virus te 15 bevorderen. Dit kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door de bladeren eerste te bepoederen met carborundum poeder. Een overmatige verwonding wordt bij voorkeur vermeden. Er wordt bij voorkeur een carborundum poeder gebruikt met microscopisch kleine hoekvormige deeltjes siliciumcarbide (400-500 mazen). Carborundum poeder kan ook 20 rechtstreeks aan het sap worden toegevoegd, waardoor de voorbehandeling kan worden overgeslagen. Het sap kan bijvoorbeeld worden aangebracht met de wijsvinger, een kussentje van in sap gedrenkt schuim of weefsel, of zelfs met de stamper die werd gebruikt voor het malen, een glazen spatel, een stijve borstel of een spuitpistool. 25 Na inoculatie worden de bladeren bij voorkeur onmiddellijk gewassen met water.

Een tweede stap van een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant omvat het identificeren van genoemde plant als een ToTV-resistente plant wanneer, na genoemde blootstelling, 30 ofwel i) ziektesymptomen in genoemde plant of plant-deel afwezig 15 blijven, met vertraging duidelijk worden of ten minste minder ernstig zijn, of zijn gelokaliseerd ten opzichte van een ontvankelijke en/of gevoelige controleplant, en/of ii) ToTV virus- of ToTV genomische sequenties niet aanwezig zijn in genoemde plant of plant-deel of de 5 aanwezigheid van ToTV virus ten minste kwantitatief verminderd is in de plant ten opzichte van een ontvankelijke controleplant. Zoals hierin gebruikt, betekent de term ‘gelokaliseerd’ beperkt tot het geïnoculeerde blad.

Het bepalen van de ontwikkeling van ToTV-geïnduceerde 10 ziektesymptomen bij geïnfecteerde planten kan worden uitgevoerd door kwantitatieve werkwijzen, bv. waarbij de periode die nodig is voor het ontwikkelen van waarneembare (bv. zichtbare) ziektesymptomen wordt genoteerd, of door kwalitatieve werkwijzen waarbij, nadat een bepaalde periode is verstreken, de plant wordt geïnspecteerd op van symptomen 15 en de aanwezigheid of de ernst van de symptomen wordt genoteerd.

Naast het bepalen van de ontwikkeling van ToTV-geïnduceerde ziektesymptomen of als een alternatief daarvoor, afhankelijk van het type ToTV-resistentie dat moet worden opgespoord, wordt de aanwezigheid van het virus in de plant of het plant-deel opgespoord. 20 Om de afwezigheid van het virus in de testplanten vast te stellen, kan in principe elke werkwijze worden gebruikt. Er kan bijvoorbeeld een werkwijze worden gebruikt waarin een ToTV-specifiek antilichaam, primer-set of probe volgens de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt. Eventueel kan een deel van de testplant in contact worden 25 gebracht met een ontvankelijke indicatorplant (bv. N. hesperis ‘67A’) om na te gaan of de virus al dan niet aanwezig is in de testplant. Eenieder die is onderlegd in het vakgebied zal begrijpen dat het bij dergelijke werkwijzen belangrijk is om het oppervlak van de testplant te desinfecteren, teneinde het verschil te kunnen maken tussen een 30 transmissievector, een tolerante testplant en een resistente testplant, 16 omdat alleen de aanwezigheid van het virus in de plantencellen moet worden vastgesteld.

Bij het uitvoeren van de tweede stap van een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant kunnen de volgende 5 resultaten worden verkregen. Als, na een succesvolle inoculatie (bv. na het in contact brengen van een plantenvirus onder omstandigheden die kunnen leiden tot infectie van een ontvankelijke en gevoelige controleplant): i) ziektesymptomen uitblijven; of virale deeltjes, of viraal RNA, 10 niet kan worden waargenomen: is de plant resistent; ii) ziektesymptomen later optreden of minder ernstig zijn; of systemische lage titers van virale deeltjes of viraal RNA kunnen worden waargenomen: is de plant gedeeltelijk resistent; iii) ziektesymptomen ernstig zijn, maar plaatselijk blijven, 15 beperkt tot het geïnoculeerde blad en zich niet systematisch verspreiden over het geïnoculeerde weefsel; of virale deeltjes of viraal RNA alleen plaatselijk kunnen worden waargenomen: is de plant overgevoelig; iv) als de ziektesymptomen uitblijven; en virale deeltjes, of viraal 20 RNA, wel kan worden waargenomen: is de plant tolerant.

v) als de plant ziektesymptomen ontwikkelt en hoge systemische virustiters heeft, dan is de plant ontvankelijk en gevoelig. Voorbeelden van dergelijke planten zijn de planten waarui het virus van de onderhavige uitvinding werd geïsoleerd. Deze planten kunnen dienst 25 doen als geschikte controleplanten voor de werkwijzen van de onderhavige uitvinding.

Voor de doelstelling van het produceren van resistente planten, en vanuit het oogpunt van fytosanitatie, zijn alleen de resultaten i), ii) en iii) interessant. Voor de doelstelling van het verkrijgen van planten 30 die geschikt zijn voor de productie van symptoomloze gewassen en 17 producten, kan resultaat iv) vanuit commercieel oogpunt ook bijzonder interessant zijn.

In een alternatieve uitvoeringsvorm van een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant worden alleen 5 virusdetectiemiddelen gebruikt. Een ToTV-resistente plant kan bijvoorbeeld in het veld worden geïdentificeerd door het observeren of identificeren van symptoomloze planten onder de symptomatische planten en de afwezigheid van het virus in genoemde plant te bepalen door een virusdetectiewerkwijze uit te voeren. Wanneer een dergelijke 10 werkwijze wordt uitgevoerd, verdient het de voorkeur een ToTV-selectief polynucleotide of een antilichaam te gebruiken. Een werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant vereist bij voorkeur het gebruik van het virus of virus-selectief polynucleotide of antilichaam.

15 De onderhavige uitvinding beschrijft nu een nog andere werkwijze voor het identificeren van een ToTV-resistente plant, door middel van het bepalen van de homozygote aanwezigheid van merkers die zijn verbonden met een vermoedelijk ToTV resistentie gen; voor deze merkers zijn er verschillende voorbeelden gegeven.

20 De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het produceren van een ToTV-resistente plant, of een deel daarvan. Nadat een ToTV-resistente plant werd geïdentificeerd, kan deze plant dienst doen als donorplant van genetisch materiaal dan moet worden overgebracht van genoemde donorplant naar een receptorplant om 25 genoemde receptorplant te voorzien van het genetisch materiaal. Overdracht van genetisch materiaal van een donorplant naar een receptorplant kan worden uitgevoerd door elke geschikte werkwijze bekend in het vakgebied. Het genetisch materiaal is in de meeste gevallen genomisch materiaal. Het is echter van groot belang dat ten 30 minste de resistentieverlenende delen van het genoom van de 18 donorplant worden overgedragen. In de afwezigheid van werkwijzen voor het bepalen welke delen van het genoom van de donorplant de ToTV-re siste ntie verlenen, kan de overdracht worden uitgevoerd door overdraging van volledige chromosomen. De ToTV-resistente plant doet 5 bij voorkeur dienst als mannelijke of vrouwelijke ouderplant bij kruising voor het produceren van resistente nakomelingen, waarbij de nakomeling genomisch materiaal van de resistente donor ontvangt en dienst doet als receptorplant. Hoewel een ontvankelijke ouderplant bij kruising in strikte zin niet noodzakelijk een receptorplant is, wordt een 10 dergelijke ontvankelijke ouderplant hierin ook opgenomen in de term receptorplant.

In een werkwijze voor het produceren van een ToTV-resistente plant kan ook protoplastfusie worden gebruikt voor de overdracht van resistentieverlenend genomisch materiaal van een donorplant naar een 15 receptorplant, d.w.z. door kruising van genoemde planten. Protoplastfusie is een geïnduceerde of spontane verbinding, zoals een somatische hybridisatie, tussen twee of meer protoplasten (cellen waarvan de celwanden werden verwijderd door een enzymatische behandeling) om een enkelvoudige bi- of multikernige cel te verkrijgen. 20 De gefuseerde cel die zelfs kan worden verkregen met plantensoorten die in de natuur niet kunnen worden gehybridiseerd, is weefsel dat werd gecultiveerd in een hybride plant die de gewenste combinatie van kenmerken vertoont. Meer specifiek kan een eerste protoplast worden verkregen uit een tomatenplant of andere plant die resistentie vertoont 25 tegen infectie door ToTV. Er kan bijvoorbeeld een protoplast worden gebruikt van een ToTV-resistente tomatenlijn. Een tweede protoplast kan worden verkregen uit een ontvankelijke tweede plantenlijn, eventueel van een andere plantensoort of variëteit, bij voorkeur van dezelfde plantensoort of variëteit, die commercieel wenselijke 30 eigenschappen bevat, zoals, maar niet beperkt tot, resistentie tegen 19 ziekte, resistentie tegen insecten, waardevolle vruchtkenmerken, enz. De protoplasten worden vervolgens gefuseerd door middel van traditionele werkwijzen voor protoplastfusie, die bekend zijn in het vakgebied voor het produceren van een kruising.

5 Als alternatief kan embryocultuur worden aangewend in de overdracht van resistentieleverend genomisch materiaal van een donorplant naar een receptorplant, d.w.z. voor het kruisen van genoemde planten. Embryocultuur kan worden gebruikt als werkwijze om embryo’s te isoleren van kruising waarbij planten geen 10 levensvatbare zaden produceren. In deze werkwijze wordt het bevruchte ovarium of onvolgroeide zaad van een plant op weefsel gecultiveerd om nieuwe planten te creëren (deze werkwijze wordt in detail beschreven in Pierik, 1999).

Een werkwijze voor het produceren van een ToTV-resistente 15 plant omvat dus in één uitvoeringsvorm de stappen van het identificeren van een ToTV-resistente donorplant of een plant omvattende ten minste één allel van het resistentie gen (een carrièreplant) zoals hierin beschreven en kruising van genoemde ToTV-resistente donorplant of genoemde carrièreplant met een receptorplant. 20 Vervolgens kunnen, door verdere kruising en selfing, homozygote planten worden verkregen die resistent zijn tegen het virus.

Een werkwijze voor het produceren van een ToTV-resitente plant omvat verder de stap van het selecteren van een resistente plant uit nakomelingen door het uitvoeren van een werkwijze voor het 25 identificeren van een ToTV-resistente plant zoals eerder beschreven.

Genoemde receptorplant is bij voorkeur een tomatenplant van de soort Solarium lycopersicum, met een grotere voorkeur een S. lycopersicum plant die commercieel wenselijke eigenschappen bezit. De receptorplant kan een ToTV-ontvankelijke plant zijn, een ToTV-30 gevoelige plant of een ToTV-resistente plant. Zoals hoger beschreven 20 wordt de keuzen van plant bepaald door het gegeven dat de resistentie-eigenschap recessief is. Eenieder die is onderlegd in het vakgebied kent de diverse werkwijzen die beschikbaar zijn om dergelijke problemen op te lossen.

5 Een ander aspect van de onderhavige uitvinding is een ToTV- resistente plant, of een deel ervan, die kan worden verkregen door een werkwijze van de uitvinding.

Eén werkwijze voor het produceren van een ToTV-resistente plant kan de overdracht door introgressie omvatten van een 10 resistentieleverende nucleïnezuursequentie van een ToTV-resistente donorplant of plant met een resistentie gen in heterozygote vorm in een receptorplant door kruising van genoemde planten.

In één werkwijze, die wordt omschreven als stamboomteelt, kan een donorplant die resistentie vertoont tegen ToTV (homozygoot) 15 worden gekruist met een receptorplant die bij voorkeur commercieel wenselijke kenmerken vertoont, zoals, maar niet beperkt tot, weerstand tegen ziekte, weerstand tegen insecten, waardevolle vruchtkenmerken, enz. De resulterende plantenpopulatie (die de Fi hybriden voorstellen) wordt vervolgens onderworpen aan zelfbestuiving 20 en kan zaden voortbrengen (F2 zaden). De F2 planten die uit de F2 zaden zijn gegroeid worden vervolgens gescreend op resistentie tegen ToTV of op homozygote aanwezigheid van merkers die zijn verbonden met het resistentie gen. De nakomelingen kunnen dus op verscheidene manieren worden gescreend.

25

Productie van ToTV-resistente tomatenplanten door transgene werkwijzen

Volgens een ander aspect van de onderhavige uitvinding kan een nucleïnezuur (bij voorkeur DNA) sequentie omvattende ten minste één 30 van de merkers die zijn verbonden met het ToTV resistentie gen zoals 21 hierin gedefinieerd worden gebruikt voor de productie van een ToTV-resistente tomatenplant. Eens geïdentificeerd als geschikte donortomatenplant, kan de nucleïnezuursequentie die een gen omvat voor ToTV-resistentie naar een geschikte receptorplant worden 5 overgedragen door middel van elke beschikbare werkwijze. Genoemde nucleïnezuursequentie kan bijvoorbeeld worden overgedragen door kruising van een ToTV resistentie donortomatenplant met een ontvankelijke receptortomatenplant (d.w.z. door introgressie), door transformatie, door protoplastfusie, door een gedubbelde 10 haploïdetechniek of door embryocultuur of door gelijk welk ander systeem voor nucleïnezuuroverdracht, eventueel gevolgd door selectie van nakomelingen omvattende het heterozygote of homozygote gen en/of het gen dat ToTVresitentie vertoont. Voor transgene overdrachtswerkwijzen kan een nucleïnezuursequentie omvattende een 15 gen voor ToTVresitentie worden geïsoleerd uit genoemde donorplant door middel van werkwijzen die bekend zijn in het vakgebied en de aldus geïsoleerde nucleïnezuursequentie kan worden overgedragen naar de receptorplant door transgene werkwijzen, bijvoorbeeld door middel van een vector, in een gameet, of in elk ander geschikt 20 overdrachtselement, zoals een ballistisch deeltje dat is bekleed met genoemde nucleïnezuursequentie.

Transformatie van planten omvat over het algemeen de constructie van een expressievector die functioneert in plantencellen. In de onderhavige uitvinding omvat een dergelijke vector een 25 nucleïnezuursequentie die een gen omvat voor ToTV-resistentie, waarbij de vector een To TV resiste ntie leverend gen kan omvatten dat wordt gecontroleerd door of operationeel wordt verbonden met een regulatorisch element, zoals een promotor. De expressievector kan één of meer van dergelijke operationeel verbonden gen/regulatorische 30 elementcombinaties bevatten, met dien verstande dat ten minste één 22 van de genen die zich in de combinaties bevinden coderen voor ToTV-resistentie. De vector(en) kunnen in de vorm bestaan van een plasmide, en kunnen, alleen of in combinatie, worden gebruikt met andere plasmiden om transgene planten te verschaffen die resistent zijn tegen 5 Tb TV, door middel van transformatie werkwijzen die bekend zijn in het vakgebied, zoals het Agrobacterium transformatiesysteem.

Expressievectoren kunnen ten minste één merkergen omvatten dat operationeel is verbonden met regulatorisch element (zoals een promotor) waardoor getransformeerde cellen die de merker bevatten 10 worden teruggewonnen door negatieve selectie (door afremming van de groei van cellen die het selecteerbare merkergen niet bevatten), of door positieve selectie (door screening voor het product dat wordt gecodeerd door het merkergen). Vele vaak gebruikte selecteerbare merkergenen voor transformatie van planten zijn bekend in het vakgebied en 15 omvatten, bijvoorbeeld, genen die coderen voor enzymen die een selectief chemisch middel, dat een antibioticum of een herbicide kan zijn, metabolisch detoxificeren, of genen die een gewijzigde target coderen die ongevoelig is voor de inhibitor. Diverse positieve selectiewerkwijzen, zoals mannoseselectie, zijn bekend in het 20 vakgebied. Als alternatief kan merkerloze transformatie worden gebruikt om planten te verkrijgen zonder vermelde merkergenen, waarvan de technieken bekend zijn in het vakgebied.

Eén werkwijze voor het introduceren van een expressievector in een plant is gebaseerd op het natuurlijke transformatiesysteem van 25 Agrobacterium (zie bu. Horsch et al., 1985). A. tumefaciens en A. rhizogenes zijn plantpathogene grondbacteriën die plantencellen genetisch transformeren. De Ti en Ri plasmiden van A. tumefaciens en A. rhizogenes, respectievelijk, dragen genen die verantwoordelijk zijn voor de genetische transformatie van de plant (zie bu. Kado, 1991). 30 Werkwijzen voor het introduceren van expressievectoren in 23 plantenweefsel omvatten de rechtstreekse infectie of co-cultivatie van plantencellen met Agrobacterium tumefaciens (Horsch et al., 1985). Beschrijvingen van Agrobacterium vectorsystemen en werkwijzen voor Agrobacterium-gemedieerde genoverdracht worden gegeven door 5 Gruber en Crosby, 1993 en Moloney et al., 1989. Zie ook het Amerikaanse octrooischrift nr. 5.591.616. Algemene beschrijvingen van plantenexpressievectoren en reportergenen en transformatieprotocols en beschrijvingen van Agrobacterium vectorsystemen en werkwijzen voor Agrobacterium-gemedieerde genoverdracht vindt men in Gruber 10 and Crosby, 1993. Algemene werkwijzen voor het cultiveren van plantenweefsels zijn bijvoorbeeld beschreven door Miki et al., 1993 en door Phillips, et al., 1988. Een referentiehandboek voor moleculaire kloningstechnieken en geschikte expressievectoren werd geschreven door Sambrook and Russell (2001).

15 Een andere werkwijze voor het introduceren van een expressievector in een plant is gebaseerd op microprojectiel-gemedieerde transformatie waarbij DNA wordt gedragen op het oppervlak van microprojectielen. De expressievector wordt geïntroduceerd in plantenweefsels met een biolistisch apparaat dat de 20 microprojectielen versnelt tot een snelheid van 300 tot 600 m/s, een snelheid die volstaat om de celwanden en membranen van planten te penetreren (zie, Sanford et al., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al., 1988, 1992). Een andere werkwijze voor het introduceren van DNA in planten is via sonicatie van targetcellen (zie Zhang et al., 1991). Als 25 alternatief werd liposoom- of sferoplast fusie gebruikt om expressievectoren in planten te introduceren (zie bv. Deshayes et al., 1985 en Christou et al., 1987). Rechtstreekse opname van DNA in protoplasten door middel van CaCh precipitatie, polyvinylalcohol of poly-L-ornithine werd ook vermeld (zie bv. Hain et al. 1985 en Draper 30 et al., 1982). Elektroporatie van protoplasten en volledige cellen en 24 weefsels werd eveneens beschreven (D'Halluin et al., 1992 en Laursen et al., 1994).

Na transformatie van targetweefsels van tomaten maakt expressie van de hoger beschreven selecteerbare merkergenen de 5 voorkeursselectie mogelijk van getransformeerde cellen, weefsels en/of planten, door middel van regeneratie- en selectiewerkwijzen die nu welbekend zijn in het vakgebied. De merkers zoals hierin gedefinieerd kunnen ook voor dit doeleinde worden gebruikt.

10 Productie van 7b7V-resistente tomatenplanten door niet-transeene werkwijzen

In een alternatieve uitvoeringsvorm voor het produceren van een TbTV-resistente tomatenplant, kan protoplastfusie worden gebruikt voor de overdracht van nucleïnezuren van een donorplant naar een 15 receptorplant. Protoplastfusie is een geïnduceerde of spontane verbinding, zoals een somatische hybridisatie, tussen twee of meer protoplasten (cellen waarvan de celwanden werden verwijderd door een enzymatische behandeling) om een enkelvoudige bi- of multikernige cel te verkrijgen. De gefuseerde cel, die zelfs kan worden verkregen met 20 plantensoorten die in de natuur niet kunnen worden gehybridiseerd, is weefsel dat werd gecultiveerd in een hybride plant die de gewenste combinatie van kenmerken vertoont. Meer specifiek kan een eerste protoplast worden verkregen uit een tomatenplant of andere plant die resistentie vertoont tegen infectie door ToTV. Bijvoorbeeld, een 25 protoplast van gelijk welke resistente lijn zoals aangegeven in het Voorbeeld kan worden gebruikt. Een tweede protoplast kan worden verkregen uit een tweede tomaten- of andere plantvariëteit, bij voorkeur een tomatenlijn die commercieel wenselijke eigenschappen bevat, zoals, maar niet beperkt tot, resistentie tegen ziekte, resistentie 30 tegen insecten, waardevolle vruchtkenmerken, enz. De protoplasten 25 worden vervolgens gefuseerd door middel van traditionele werkwijzen voor protoplastfusie, die bekend zijn in het vakgebied.

Als alternatief kan een embryocultuur worden aangewend in de overdracht van een resistentie gen van een donorplant naar een 5 receptorplant. Embryocultuur kan worden gebruikt als werkwijze om embryo’s te isoleren van kruising waarbij planten geen levensvatbare zaden produceren. In deze werkwijze wordt het bevruchte ovarium of onvolgroeide zaad van een plant op weefsel gecultiveerd om nieuwe planten te creëren (Pierik, 1999).

10 De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het produceren van een 7b 7V resistente tomatenplant omvattende de stappen van het uitvoeren van een werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van een allel dat is geassocieerd met de weerstand tegen ToTV in een donortomatenplant volgens de uitvinding 15 zoals hoger beschreven, en het overdragen van een nucleïnezuur omvattende genoemd allel, dat op deze wijze werd opgespoord, van genoemde donorplant naar een TbTV-ontvankelijke ontvangende tomatenplant. De overdracht van genoemde nucleïnezuursequentie kan worden uitgevoerd door elk van de werkwijzen die hierin eerder werden 20 beschreven.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van een dergelijke werkwijze omvat de overdracht door introgressie van genoemde nucleïnezuursequentie van een 7b7V-resistente donorplant naar een TbTV-ontvankelijke ontvangende tomatenplant door kruising van de 25 planten. Deze overdracht kan dus worden uitgevoerd door traditionele teelttechnieken. De ToTV resistentie genen worden bij voorkeur geïntrogresseerd in commerciële tomatenvariëteiten door middel van merker-geassisteerde (MAS) teelt. Merker-geassisteerde teelt of merker-geassisteerde selectie omvat het gebruik van een of meer van 30 de moleculaire merkers voor de identificatie en selectie van de 26 nakomelingen die een of meer van de genen omvatten die coderen voor de gewenste eigenschap. In de onderhavige instantie is een der gelijke identificatie en selectie bij voorkeur gebaseerd op de selectie van merkers die worden geassocieerd met het resistentie gen zoals hierin 5 gedefinieerd.

ToTV-resistente tomatenplanten en zaden

Een ToTV-resistente plant, of een deel ervan, die kan worden verkregen door een werkwijze van de uitvinding, vormt ook een aspect 10 van de onderhavige uitvinding.

De ToTV-resistente tomatenplanten van de onderhavige uitvinding kunnen van elk genetisch type zijn, zoals door inteelt voortgebracht, hybride, haploïd, dihaploïd, parthenocarp of transgeen. Verder kunnen de planten van de onderhavige uitvinding heterozygoot 15 of homozygoot zijn voor de resistentie-eigenschap, bij voorkeur homozygoot. Hoewel het allel dat in de onderhavige uitvinding werd geïdentificeerd kan worden overgedragen naar gelijk welke plant teneinde een ToTV-resistente plant te verschaffen, zijn de werkwijzen en planten van de uitvinding bij voorkeur verwant met planten van de 20 Solanaceae familie, met een grotere voorkeur tomaat.

Door inteelt verkregen ToTV-resistente tomatenplantlijnen kunnen worden ontwikkeld door middel van de technieken van terugkerende selectie en terugkruising, selling en/of dihaploïden of elke andere techniek die wordt gebruikt om ouderlijnen te maken. In een 25 werkwijze voor het selecteren en terugkruisen kan ToTV-resistentie worden geïntrogresseerd in een target receptorplant (die de terugkerende ouder wordt genoemd) door kruising van de terugkerende ouder met een eerste donorplant (die verschillend is van de terugkerende ouder en hierin wordt omschreven als “niet-terugkerende 30 ouder”)· De terugkerende ouder is een plant die niet resistent is of een 27 laag gehalte aan resistentie heeft tegen ToTV en die commercieel wenselijke eigenschappen bevat, zoals, maar niet beperkt tot, resistentie tegen ziekte, resistentie tegen insecten, waardevolle vruchtkenmerken, enz. De niet-terugkerende ouder vertoont ToTV-5 resistentie en omvat een nucleïnezuursequentie die codeert voor ToTV-resistentie. De niet-terugkerende ouder kan elke plantvariëteit zijn of inteeltlijn die kan worden gekruist met de terugkerende ouder. Het nageslacht dat het gevolg is van een kruising tussen de terugkerende ouder en de niet-terugkerende ouder wordt teruggekruist naar de 10 terugkerende ouder. De resulterende plantenpopulatie wordt vervolgens gescreend. De populatie kan op verscheidene manieren worden gescreend. De populatie kan bijvoorbeeld worden gescreend door middel van resistentie bioassays of veldscreen zoals hierin eerder beschreven. Fi hybride planten die een TbTV-resistent fenotype 15 vertonen omvattende de vereiste nucleïnezuursequentie die codeert voor ToTV-resistentie, en commercieel wenselijke eigenschappen bezitten, worden vervolgens geselecteerd en geselfed en geselecteerd over een aantal generaties (tot 5, 6, 7 of 8 generaties) zodat de tomatenplant steeds verder door inteelt kan worden gekweekt. Deze 20 werkwijze van voortgezette selfing en selectie kan worden uitgevoerd over twee tot vijf generaties. Het resultaat van een dergelijke teelt en selectie is de productie van lijnen die genetisch homogeen zijn aan de genen die worden geassocieerd met ToTV-resistentie, evenals andere genen die worden geassocieerd met commercieel interessante 25 kenmerken. In plaats van fenotypische pathologiescreens te gebruiken van bioassays, kan MAS worden uitgevoerd met een of meer van de eerder beschreven moleculaire merkers, hybridisatieprobes of polynucleotiden om het nageslacht te identificeren dat een nucleïnezuursequentie omvat dat codeert voor TbTV-resistentie. Als 30 alternatief kan MAS worden gebruikt om de resultaten van de 28 kwantitatieve bioassays te bevestigen. Nadat de juiste selectie is gemaakt, wordt de werkwijze herhaald. De werkwijze voor het terugkruisen van de terugkerende ouder en selecteren voor ToTV-resistentie wordt herhaald over ongeveer vijf of meer generaties. Het 5 nageslacht dat via deze werkwijze wordt voortgebracht is heterozygoot voor een of meer genen die coderen voor To7V-resistentie. De laatste terugkruisingsgeneratie wordt vervolgend geselfed teneinde een homozygoot zuiver teeltnageslacht te verkrijgen voor To TV-re siste ntie.

De ToTV-resistente door inteelt verkregen tomatenlijnen die 10 hierin zijn beschreven kunnen worden gebruikt in bijkomende kruisingen om ToTV-resistente hybride planten te verkrijgen. Een eerste To7V-resistente door inteelt verkregen tomatenplant van de uitvinding kan worden gekruist met een tweede door inteelt verkregen tomatenplant die commercieel wenselijke eigenschappen bezit, zoals 15 maar niet beperkt tot, weerstand tegen ziekte, weerstand tegen insecten, wenselijke vruchtkenmerken, enz. Deze tweede door inteelt verkregen tomatenlijn kan al dan niet ToTV-resistent zijn, maar heeft bij voorkeur ten minste één allel voor ToTV-resitentie verbonden met de merkers die hierin zijn gedefinieerd zodat ten minste 50% van het 20 nageslacht het ToTV-resistente fenotype expresseert. Met een grotere voorkeur is de tweede door inteelt verkregen tomatenlijn ook ToTV-resistent, zodat het resistente fenotype wordt behouden, ondanks de kruisingen. Op deze manier kan de eerste ToTV-resistente tomatenplant van de uitvinding die door inteelt werd verkregen worden 25 gebruikt om een bijkomende erfelijke eigenschap aan te introgressie te onderwerpen in de tweede tomatenplantlijn die door inteelt werd verkregen.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van zaden die kunnen 30 groeien in ToTV-resistente tomatenplanten. In een bepaalde 29 uitvoeringsvorm omvat deze werkwijze de stappen van het verschaffen van een ToTV-resistente tomatenplant van de uitvinding, het kruisen van genoemde ToTV-resistente plant met een andere ToTV-resistente tomatenplant, en het verzamelen van zaden die het resultaat zijn van 5 genoemde kruising, die op hun beurt zullen worden geplant en ToTV-resistente hybride tomatenplanten produceren.

In een andere uitvoeringsvorm omvat de werkwijze de stappen van het verschaffen van een To7V-resistente tomatenplant van de uitvinding, het kruisen van genoemde ToTV-resistente plant met een 10 Solanum lycopersicum plant, het verzamelen van zaden die resulteren uit genoemde kruising, regenereren van genoemde zaden in planten, selecteren van To7V-resistente planten door een van de hierin beschreven werkwijzen, zelf-kruising van de geselecteerde planten over een voldoende aantal generaties om planten te verkrijgen die eèn allel 15 bevatten dat To7V-resistentie verleent aan de planten, terugkruising van de aldus geproduceerde planten met S. lycopersicum planten met de wenselijke fenotypische eigenschappen over voldoende generaties om S. lycopersicum planten te verkrijgen die To TV-resistent zijn en de gewenste fenotypische eigenschappen bezitten, en het verzamelen van 20 zaden die door de planten werden geproduceerd als gevolg van de laatste terugkruising die, indien geplant, tomatenplanten produceren die ToTV-resistent zijn.

Bij wijze van voorbeeld, en niet als beperking, worden Voorbeelden gegeven van de onderhavige uitvinding.

25

VOORBEELD

Identificatie van merkers die zijn verbonden met het ToTV-resistentie gen bii tomaten

Het doel van dit experiment was het identificeren van AFLP 30 merkers die verband houden met ToTV resistentie bij tomaten, door 30 middel van een Bulk Segregant analyse (BSA; Michelmore, R. W., I. Paran en R.V. Kesseli, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9828-9832).

ToTV-resistentie bleek een monogene recessieve overgeërfde 5 eigenschap te zijn. De analyse werd uitgevoerd op 150 planten van een F2 gecultiveerde tomatenkruising waarvan de F3 planten werden gefenotypeerd. Voor het bepalen van een betrouwbaar fenotype, werd de fenotypering op F3 planten verscheidene keren herhaald voor een ondergroep van F2 planten. Op basis van de resultaten die werden 10 verkregen door herhaalde fenotypering werden 18 afzonderlijke planten aangegeven als betrouwbaar resistent en werden negen planten aangegeven als betrouwbaar ontvankelijk. Deze planten werden gebruikt voor het BSA. De fenotypische informatie van deze afzonderlijke planten is opgenomen in tabel 1.

15

Merker identificatie en verificatie Merker nomenclatuur

Codes waardoor de AFLP primercombinatie over het algemeen wordt aangeduid, bv. P14/M49-F-282, waarbij P en M de gebruikelijke Psil en 20 MseI primer sequenties of universele primers zijn (Vos et al., 1995; Bai et al., 2003) gevolgd door 2 of 3 extra selectieve bases zoals aangegeven door een tweecijferige extensiecode. De tweecijferige extensiecodes zijn als volgt: 11: AA; 13: AG; 14: AT; 15: CA; 21: GG; 25: TG; 35: ACA; 38: ACT; 49: CAG; 51: CCA; 61: CTG. 282 is bij benadering de grootte in 25 basisparen van het resulterende polymorfe fragment (opgegeven grootte ± 2 basisparen). De grootte wordt gewoonlijk afgerond, maar kan ook in decimalen worden weergegeven. Dit fragment werd versterkt bij de onderzochte planten. Primer en adaptersequenties worden in detail beschreven door Bai et al. 2003.

30 31

Merker TG163 (Expen 2000; SOL Genomics Network; http://www.sgn.cornell.edu/index.pl) bestaat uit een voorwaartse : Voorwaartse sequentie:

TCTGGGATCATATATGGGATCTTAGAATGCTGAAGTTTCCAGTCCT 5 TGATCTCCCTGGACATACTCACTGGTAATACTCTGTGGCAATAA TGAAGCTGCTTGCCATCTCTTTAATTAGTTGAGTTTTTGATATAAG ATTATTGTCTGGTCCTTCAATGTGTGTCTCACTATGCTGCCTAC AACTTAATGACTGCTAACTTTTTTTGTTAGGGTTTAGGGTTAGAAG TTTCTTTCTGGATTACCATTTCCTTATTGAGTAAATGCAGTTGA 10 TGTTTGTTCGCAGGACATGGACTGTCAAGTGCAATCCCGAACATGA AGACTTAATTCTGGTTCTTTCTCTTCATTTCCTTTATCTGTTTG TCTACCCTATGTATCTGGAAAACATACTTGTGCACACTCTCACTGA GCC

15 Omgekeerde sequentie:

CTTAGAAGCTTCCGCATGAAAATGAACTGCAAACGTCATACTAGAT AAAATTAAAGAGACCTCTTGCAAAATTCTACATTCCACCTCAGC AGCGTTAACTCCATCATGAACACATCAAGAATACAGATTTGGAGGG GGATATACTGGAGTGATACAAACATTAATAAAAGAGATGAGTAG 20 TGTGGCAAAGGGATAATGAGCTCAAAAGATGGATCACGAGTTCAT ACTTACTTCGAGTTGTACTGATTTATTTTCTTGGAAGATGAGGCT TG ATTG ATTCTACAAC C AC CTGTTAGGAAAAAAAATGCTAAATTAA AACATGAAAACACGTGGTGCCAATTCTCAACTTAAAATAAGACA ACTCTATTAGACTATTCATCATGTATTAGAAATAATAGCAAATTGC 25 CAAGAATACATGCACACTCATGGGAACATTTTCTATGTTATCCT GAAATTGGCTCAGAAGTCCAACACAAGAAAAGACACAGATG

Biologisch materiaal

Bladmateriaal van een totaal van 300 F2 planten was 30 beschikbaar voor evaluatie. Hiervan werd een totaal van 150 planten 32 gefenotypeerd op basis van het fenotype van de F3 planten die werden afgeleid uit deze F2 planten. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit bladmateriaal van deze 150 gefenotypeerde planten (Tabel 1) en Pstl/Msel sjablonen voor AFLP vergelijking werden uit deze DNA 5 stalen gegenereerd. Vervolgens werd op alle planten een testvergelijking uitgevoerd met gebruik van de primercombinatie P14/M50.

BSA en verificatie op afzonderlijke planten 10 Het BSA werd gestart door screening van 96 primercombinaties op één massa bevattende tien (10) afzonderlijke planten die resistent zijn tegen ToTV en één massa bevattende negen (9) afzonderlijke planten die ontvankelijk zijn voor ToTV (Tabel 2). Deze screening resulteerde in de identificatie van drie (3) 15 kandidaatmerkers (P11/M54-F-233/235 (bi-allelisch), P14/M49-F-282 en P15/M49-F-330) die vervolgens werden geverifieerd op 32 planten, bestaande uit een totaal van achttien (18) verkrijgbare ToTV resistente planten, negen (9) ToTV ontvankelijke planten en vijf (5) planten waarvan het fenotype niet ondubbelzinnig kon worden bepaald (Tabel 20 3). Op basis van deze screening bleek P14/M49-F-282 de meest nauw verbonden merker met het ToTV resistentie gen.

Er werd een tweede BSA uitgevoerd waarbij 96 primercombinaties werden gescreend op de R-massa en S-massa (nu bestaande uit respectievelijk negen en acht planten). Deze screening 25 resulteerde in de identificatie van twee kandidaatmerkers (P21/M61-F-583 en P25/M51-F-131) die samen met één merker van de vorige BSA screening (P15/M49-F-330) werden geverifieerd op de 32 hoger vermelde planten (Tabel 3). Geen van de additionele gescreende merkers bleek nauwer verbonden dan de best verbonden merker 30 P14/M49-F-282, die werd geïdentificeerd in de eerste ronde van BSA.

33

Doordat merker P14/M49-F-282 de meest nauw verbonden merker bleek te zijn, werd besloten om deze merkers te screenen op alle 150 gefenotypeerde planten. De resultaten worden voorgesteld in Tabel 5. In totaal werden 17 recombinanten geïdentificeerd (Tabel 4). De 5 fenotypes werden onderverdeeld in drie klassen: - resistent (A) = De algemene infectieverhouding bedraagt minder dan 25% - segregerend (H) = De algemene infectieverhouding ligt tussen 25% en 75% 10 - ontvankelijk (B) = De algemene infectieverhouding is groter dan 75%

Op basis van deze classificatie in combinatie met de genotypes van merker P14/M49-F-282, werden in totaal 28 15 recombinanten geïdentificeerd, dat overeenkomt met een afstand tussen de merker en het ToTV-resistentie gen van ruwweg 9,5 cM. Dit komt overeen met de berekende grootte van het venster (9cM), waarin het ToTV resistentie gen is gelokaliseerd tussen merker P14/M49-F-282 en P11/M35-F-216 (Tabel 3) Deze berekening is gebaseerd op de lijnen 20 die werden gebruikt voor BSA en waarvan wordt aangenomen dat ze het meest betrouwbaar zijn gefenotypeerd.

De merker P14/M49-F-282, die het dichtst verbonden bleek te zijn van alle geteste merkers, bevond zich toch nog op een vrij grote afstand van de locusmerkers die, waar gewenst, nauwer waren 25 verbonden. Daarom werd een derde BSA screening uitgevoerd, waarbij 72 primercombinaties werden gescreend, waardoor het totale aantal gescreende primercombinaties op 263 werd gebracht. Bij deze derde screening werden negen kandidaatmerkers (in zes primercombinaties) geïdentificeerd, die werden geverifieerd op acht resistente en acht 30 ontvankelijke planten (Tabel 3). Twee merkers (P11/M35-F-216 en de 34 bi-allele merker P13/M38-F-311/313) bleken het dichtst verbonden. Het dient vermeld dat de positie van merker P11/M35-216 op dit ogenblik hypothetisch is, doordat de positie is gebaseerd op een enkele recombinant. De twee merkers P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313 5 werden vervolgens gescreend op een grotere reeks planten waarvan de fenotypische informatie bekend was, waaronder 17 recombinanten en 28 resistente en ontvankelijke planten (Tabel 5).

Screening van twee kandidaat verbonden merkers op kiemplasmalijnen. 10 De twee merkers P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313 werden geïdentificeerd als het dicht verbonden met de ToTV resistentie. Het dient vermeld dat de afstand tussen gen en merker moeilijk te bepalen is, doordat de interpretatie van het fenotype een grote invloed heeft op de berekende afstand. Deze merkers werden 15 gescreend op een kiemplasmareeks van 83 planten. Op basis van deze screening, bleek merker P11/M35-F-216 een predictieve waarde te hebben van 90,4% en bleek merker P13/M38-F-311/ 313 een predictieve waarde te hebben van 96,4% (Tabel 6).

20 Positionering van ToTV-resistentie op het tomatengenoom

Experimenteel bewijs in combinatie met de eigen genoommappen van tomatenmerkers toonde aan dat merker P14/M49-F-282 was gelokaliseerd op chromosoom 4. Daarom wordt verwacht dat de genetische basis van ToTV-resistentie is gelokaliseerd op 25 chromosoom 4.

Besluit

Door screening van in totaal 263 Pstl/Msel PCs op twee massa’s resistente en ontvankelijke planten en vervolgens het 30 uitvoeren van verificatiestappen, bleken in totaal vier merkers (één bi- 35 allele) te zijn verbonden met ToTV resistentie. De afstand tussen de merkers en het ToTV resistentie gen is moeilijk te bepalen, maar op basis van de getranslateerde fenotypes en genotypes van merker P14/M49-F-282 wordt de afstand geschat op 9,5 cM. Dit komt overeen 5 met de berekende grootte van het venster, 9 cM, waarin het ToTV resistentie gen is gelokaliseerd. Deze berekening is gebaseerd op de lijnen die als meest betrouwbaar gefenotypeerd worden beschouwd.

Merkers P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313 (bi-allele) werden geverifieerd op 83 kiemplasma planten. Op basis van deze 10 screening hebben de merkers een predictieve waarde van respectievelijk 90,4% en 96,4%. De aanwezigheid van afwijkende lijnen kan worden verklaard door de allele variatie aan de ToTV locus of recombinatie.

Het ToTV resistentie gen is hoogstwaarschijnlijk 15 gelokaliseerd op chromosoom 4 zoals aangetoond door de aanwezigheid van merker P14/M49-F-282 op dat chromosoom.

Op basis van het relatief hoge aantal kandidaat verbonden merkers die werden geïdentificeerd door middel van 263 PCs, is het waarschijnlijk dat het ToTV resistentie gen een introgressie is van een 20 toevoeging van wilde tomaten.

36 ___ttmaimeni 1_ Experiment 2 _ _ _ _ — --..

_ RMftawi I Rtt*cai<y»2 ~ Repücaaon3 | Rgtfica&on* I Reptetioos Q*ratt \ W»1

Plant w i inteueaol l<cta> 9 pt tested 9 rtecteo c< Wal · g tested «inlecied pt ]k*at tpiiasiedi finfeoeopt jtoaf pHesied ainteqed pl ltoUQg tested ttinteoeöi in % fan BS/

1 7 9 1 7 | 9 \ I I I I I T I

2 S Γ 9 ~ €__9______.________ 3 __3__9__6__9_______1 _

4 0 T 9 o 9 o__8 0__9__O__9___0Λ | 0,0 R

5 0 | 9 ~ 2__9__________

_0__a__9 9__9__5__9__0__9__4__6__61.0 183 S

_10__6__9__5__9 __________ 12__5__9__β__9__________ 10__1__9__0__9___________

19 0 [ 9 ~~ 0__I__0__9__0__9 0 \ 9 0J> DO R

20 __S 7___2 7 _____ ______ I ~~____

21 __9__9____'_9__|__7___9__7__9__6__9__04.4 14.9 S

22 __S__0 6__9__1 ~_______ 26__1__9___0__9__I________ 28 __2__9__1__9____________ 29 __1__6__4__7_____________ 30 __3__9__S__9____________ 31 __6__Q 7__9_______________ 32 __0__9__9__9______________ 33 __7__9 0__9___________ 34 __2__9__O__9______*_____ 35 __5__9__4__9__________ 36 __9__9__8__9__________ 37 __1__9__3___9___________ 39 S____8 9____S__4__JJ__4 9__7__9__65.8 23,6 no

40 __0__8___0__9__O__9__0__9__0__9__0,0 0.0 R

45 __0__9__9__9__6__9__5__9__S__9__9ΛΛ 18,3 5

46 __0__0__O__9__O__9__0__9__0__B__0.0 0.0 R

47 __6__9__7__8__4__9__4__9__8__9__96.9 22.8 00 49 __o__g__o__9__o__o__g___g__g__9__o λ oo r 50 __3__9__3__9__________

52 __0__9___0__9__O__9__0__9__0__9__0.0 Q.D R

53 __0__9__0__9 6__9__9__9__6__9__I2J 14.9 S

$4__2__9__0___9__________ 87__2__9__2__9__________ sa__§__9__a__β____ ~_____ S9__6__0__6__9__________I_____ 63 __0__9__6__β___________ 64 __3__9__5__9__________ 65 __5__9___8__9__________ 66 __1__9___0__0____________ 69 __1__9___0__9__________ το__g__9__o__β__o__9__g__9__g__9__0.0 00 r 71__0__9__0__9__________ 75 __1__9__0__9__________ 76 __6__9___6__O_____________

70 __0_ 9__6__9__8__9__6__B__5___O__70.5 14.6 S

70__0__9__0__9__6 9 4 0_ 5 9 66.9 19.9 _no__ 01__6__9__5__9___________ 62 __g__g__o__9__g__9__o__9__g__o__0.0 0.0 r

63 __9__9__β__9__7__9__7__9__4__9__77.6 20.8 S

84__o__a___g___9__g___9__1__g___g__0__2.3 so no 65__o__g__g__β__________ 87__g__g__4__9___________ 89 7__9 7 9 7 8__4__9__5__9__96.1 1S.7 no 90 __0__8__1__9__*___________ 92__5__9__7__9_____________ 94 __7__9__6__9___[_________ 9»__o__g__g__o__g__e___o__g__g__b__o.o oo r 95 __o__β__o__g__________ 102__o__g__o__g___________ 105 __6__9__5__O__._.________ 106 __1__9__O__9__________ 112 0__B__O 9 ________ ____ 115__3__9__9__9_____________ 119 __7___9__Θ__9__7__9__2__9__3__5__66.3 29 no

120 __0__9__0__9__O__9__0__9__O__9__0Λ__O_ R

121 __O__9___O__8___________ 122 __3__9___7__9____________ 123 __o__9__g__g______________ 125 ____o 9___1 9__2__________ 126 __8__9___6__8__7__9__4__6__3__O__63.6 22.1 no 12fl___8__9 6__9__9__9__3__9__5__9 68.9 265 no 120__5__9__3__9______________ 130 __O__8__O__9 _____________ 131 5__9__7__9____________ 132 __O__9__1__9__________

133 __O 4__g__8 O 9__O 9 O__9__0.0 O R

134 I 1 19 I O loll 11 \ 1 I 1 1

Tabel 1 Overzicht van de F2 planten en de fenotypes voor ToTV resistentie

Opmerking: de fenotypes zijn gebaseerd op de F3 planten afgeleid uit deze F2 planten 37

135 I 9 I 9 | 8 I 9 I 1 I 9 I 9 I ~ 9 |_S 1 3 i 66.7 \ U5 S \ I I

136 · 0__9__0__9 ~ 0 I 9 0__9__0__J__Ο Λ 0 R____ 136__0__9__1__9_____I _______ 139 __δ__9__7__9 i ~______I___ 140 __2__9__5__9__________T ______ 14?__B__9__6__9__________.______ 143__3__9 6___9 _________________________ 145 __0__9__3__fl___________________ 146 4__9__4__9______„_____________ 147 B__9__3__9__________________ 150 3__9__2__9_____________ 152 __5 9__5__9____________________ 153 __3__9__3__9_______________ <54__I__9__β__9____ __________ <55__3__9__2___9______________;_____ <57 6__9__7__9_____________ 160 __0__9__2__9____________________ 161 __0__9__1__9 ______________ <63__1__9__0__9_________________ 164 __4___7__S 9_________________ 165 0__9__1__9_________________ 166 __3__9__4__9_____,__________ 170 3__9__4__9________________ 171 __0__9__0__9__0__9_____9__0___9__0.0 0J R____ 172 __8___g__5____9__9__8___9__7___9__64.1 143 S___ 173 __B___9__6 9_____________________ 174 __4___9__4___9_________________ 176 2__9__5__9__________________ 177 __5__9__4__9__________________ 179__o__j__o__9__g__9__o a__g__g__o.o o.o R____ 1B1__6__9__4__9 ________________ 162 __8__J__7__9__6__9___7__9__7__9__77.B 7.9 no ___ 183__2 9 6 9 ______ __________ 185__1___8__3__9_______________ 188 __0__9__0__9__0__9__0___9 0__9__0.0 0.0 _ R____ 189 __6__9__7__9________________ 19>__o___g__o__9__g__9 0 9__g__9 no go R____ 191__4__9__5 9________________ 1B2__B___g__B__9__5__9__S__B__5__9__68-9 183 no____ 197 0 9 1 B ________ _____ ___ _________,_________ 196__6__9__7__9________________ 200 __8__9__5__9_____________________ 201 __5__9__3__9_____,____________ 203 7___g__5__g __________ 205 S__J}__4__9 _________ 206 __o___9__g__g__g__g__g___9__g___9 0 0 go r ____ 207 __g___9 0 9 ________ ._______________ 209__7__9__3__9 __ 211__4___0__4__9__ .

. 212__0___9 0__g__0__9__1___5__0___8__2.5 6.9 no___ 213 6___9__6__« _ 215__3__7__1__8 _______ 217__0__J__0__9 _________ 219 _ 6___Q 4 0 ________ • 221__6__9__5__9________________ I»__9___9__4__9__9__9__5__9__7 9__75.6 2S.3 00_____ 226 __1__9__2__9__________________ 227 7____B__3__9_____________ 259__5___J9__7__9 ____ 262__o___g__o__g___o__9__o__g__g__9__o.o 0.0 r ____ 275 __5__9___6 9_____________________ 276 __4__9__7__9 _____ 2B3__0___9__g__g_________________ 284__6___9__4___9______________________ 300__0__S__2__9_______*____\ j _________________________ _________ ______iBRtshtontBrw

Su«c»p<lM· control lln» (» FI from which tha F3 was dertwdl: _____________________9 Suscpflbl» Bom

62 ] 12 I 14 I 7 | 7 7___7____7 9__7 7__85.6 14.0 I I I

62__12___14__8___14__7__7__8__9 6 9_________ 62__7___9__34__35__8__J»__6__9__9___9_______ 62 I S ~ 9 I a~ I s i 9 I 9 I 6 \ 9~ 1 1~ 1~ 1 I 1 I i

Tabel 1 vervolg 38

Gebruikte F2 planten in de massa gebruikt voor BSA

Susceptible groep Ontvankelijke groep ~ÖÖ4 ÖÖ8 019 032 040 045 046 053 049 078 070 083 082 135 095 172 136 178* 149*

*Planten alleen gebruikt in het eerste BSA

39 •o > p> η ϊ * ? 5 " « Η- t 9 α ιβ Η __

A # A Τ3 J.J Ό H

S' A - « SS $ ί

Hl gis i 1 I I

5 H ui o 3 co lo «5 II -τι e tb "τι -τι A Hj ώ J 6 6 ώ ώ

'Z V _* ^ m*> afc Cft flS

2 Φ σ> o o* n5 o Π P Λ Η λ Λ Λ Λ

Cb Ο ζ 5 ζ ζ ζ ζ (t v 6» v v v y f , a „ 1·„ „ s I, , legende A = homozygous PI (ontvankelijk) B = Honozygous P2 (resistent) H = Heterozygote score D " Tussen A en H C = Tussen B en H Π — Score onbekend R = Plant resistent S = Plant ontvankelijk '

Getranslateerd fenotype KG A = Alg. * geïnfecteerd ) 75 H = 25 ( Alg. % geïnfecteerd (, 75 ' ' '

Tabel 3 Overzicht van merkers die werden geïdentieficeerd door middel van BSA en die vervolgens werden gescreend op 32 F2 planten.

De merkers zijn geordend in de meest voor de hand liggende volgorde. De vraag is of merker P11/M35-F-216 juist is gepositioneerd.

40

MM

ft Qi * Η· 5 • b in

m M

Ml * E ff ff S 2 2. α ί* ff H. 3

g (D S

ff g t S S

€ Λ Λ £ δ o <fl :

Ree T026 5.6 El K3 Legende:

Ree TÖ37 22.2 Q Έμ""' a = Hgmozygoot PI (ontvankelijk)

Ree T054 11.1 ra E9 b = Homozygoot P2 (resistent)

Ree T075 5.6 9 η h = Heterozygote score

Ree :T084 2.3 5.0 1 Q D = Tussen A en H

„ec W 22 2 Q .13- C = Tussen B en H

Ree T090 5.9 ra El _ ... ,

Ree T125 5 6 I M ü = Sc°re onbfekend

Ree T132 5.6 ra ^9

Ree T134 5 6 Η R R = Plant resistent

Ree T137 5.G ra Ifl S = Plant ontvankelijk

Ree Ti36 5.6 fl H~

Ree T145 16.7 ra El Getranslateerd fenotype KG

Ree T153 33.3 S El A = Alg. % geïnfecteerd ^ 75 _ec toiI ^ ® |§_.·3...... B = Alg. % geïnfecteerd ^25

Ree T212 fs 8.9 ¾ | H = 25 < Alg. % geïnfecteerd < 75

Opmerking:

Recombinanten zijn geïdentificeerd door De Ruiter zaden

Tabel 4 Recombinanten geselecteerd door De Ruiter Zaden op basis van merken P14/M49-F-282 N

I ? 41

I £ I

* ?! ί hellm f I si 111 11 I * *!.*$» * 3- s S MUi g g Ϊ a a a fjggj ram rra BBS ·ΜΒ| tui es.t S3 u u jijAi . - WOJ SI I I U U UM be T1J2 if, ~βϋ·' TOOJ 61.1 .85 _ u uuir tuj o.o 0.oH~ * " Imiuyaoas PI (ontvankelijk) TOW oe 06 I Ë B 6« T134 56 "B~~Βνΐ^^^^Β~ B “ Honokjgaas P2 (realstent) T00> 1 u ΊΓ UBB TU5 BET ηiH Ρ>··^^η Ho Drt«i<awut» score

T600 61 ία 1E B B nan tus a oBIB^^B d o v~._I fen H

T010 ti l S u U umt) Roc T137 3 6 “ mem » en H

T012 61.1 [g u ,.. U UH Roc Tija 3.6 B" C ” “™β TÓ1Ó 56 n U ~ UUmE T113 72.2 fpn u (^ΠΒ~ ® = Score onbekend

TO 19 0 0 0 0 I Q B ^BBHj Π40 38. 9 Sfl U U U flB

:ÏS NiirjD Q ÏS iö* i ü l im ; - *jT* "**** TÖ22 64 7 B- U _. UUBS Rk f M5 '167; BIDjjnBl s = ΡΐΛη,: ontvankelijk

Roc JTD26 5.6 IjJ JIS . OBBT. T146 :44 4 gag u IM(W

:2g “? H u ... u UB. fïïi 6Ï-I Sh; U UJ·. Cetr.inwIntrerd fenotype te njis m.s Sr ii u 0|ff T119 00 SB fl 9 λ m ai<· » ~..f—. _. «\ __ :T030 «44 H U U uB T130 27.6 9 0 " n ÏlÜ~ I ? 75 :toj< 722 Hf u u uB ria 55.0 SB u 0 uB B ***; % ’eïe£‘*cteeed<25

IT033 54,4 ^ Tis? 33 3 ^ Q Q9· ® 8 2S ^Alq. % geïnfecteerd \ 7S

ITP* 50.0 T155 ?7Ó M U “ u ui onerkiiM·

.T03G 1000 Η BB^^BI T157 72 2 figg U U Ufl η·7,·Αΐη»»ι.... ,i4n — »----—*rrnw,A

Ree T037 22.2 T160 11 i B U U ül BnuwiininiHiii Ujn qeldBatlfifieert .Td39 C$,9 asMlB^^B·· Γ161 $ c H‘ u " U UH door De Bolter waden ’two 0.0 tic 'H[ u u H| 'TWS BO.O TIM 56.3 M U U U9 , . rw« 0.0 6.0 .Η-Γ^^ΗΗΗΒ^Β TICS 5.6 ^^B u on HT’ 7047 58.9 22.0 M U|..;TÏEu|BB TIM J8.9 TO U U U ^B"

'T049 01 0.0 Bf BBIBB· T170 38.9 §m U . TrU^B

0.||JMB| TI72 84.1 u\m nHIH

:T0$3 02.2 T17J B ΜΓπΓϋ·

Rtc 'TDS4 Ml B-imJBBBr T174 4J.4.....W5*' yl' |U uBB

.1057 22.2 H U U 0 fflt Tl TC 38.9 1¾ ül' lu U BB

;Τ05β 72.2 ® U U ÜH tWe ΤΛΤ7 S00 ®Β

T0C 05 8 14 9 H' U " U UB T179 ' 00 q'qH

30|53 77 0 S U U ΤΙβΟ 16 T H j toto O'0 tioe ' 0.0 l^j nL BBB^St jjec.jWS $,( fl: ^3BBBL. tiab _o.p ooH Ife BH».

iTOTO M.t Q HBflefi' fw? ~ 6fl 9 ii 1 S"BI T BBifij.....

IT079 . 60,9 10.9 |B ,Β^ΒΒΒ T134 66.7 ' ' JT|

T08I 61.1 W UI· 1U· U9 T197 5.6 " g U O BR

T062 0.0 B .BBB TI9S 72.2 SS U U U «Η

το» niBlB^^H Tjoo cm KJ u u uB

Ree TOM 2.3 $.0 T201 ej.e |3 u ~ u UflES

T08S 00 '·ΤBI^^BB-' T203 €6.7 « U O UH

Roc T037 22.2 B B_9flB 1205 SO.6 U U U BW

r ^ ' IS M~ M~“Lm9^B" ^ 0 0 00 66 7 ^ ΐ Γ^ΒΠ ΤίβΟ 55 6 Mfl' 3""ΐ^Β·

Tl 19 (Al 290 ffl ' U "" 1222 75 e U U UB

T12C 531 22.18^ T276 U "

T126 68 9 26.6B UI IU UB 3283 0.0 B

T129 *4.4 M JuJIug^B Τ2Θ4 55 6 fl U ** U Hl τι» oo B DBBB noo 143 Q u u u||

Tabel 5 Gegevens gegenereerd door middel van de drie best verbonden merkers. Merker P14/M49-F-282 werd gescreend op 150 fenotypelijnen en de merkers P11/M35-F-216 en de bi-allele P13/M38-F-311/313 werden gescreend op een ondergroep.

42 2 2 2 *ό tj *ό g g ^ ω ω 3 ^ ^ § ό é c5 yi3r<pcD «i j φ co jn 3 71 71 71 3 Tl τι 5 ίί Ü ro 2· co <J « ^ GS <5 S -* ω

Plant f 1 ? ? Plant # § # # I ” Q g o o ξ o

CO <JÏ CO CO CO ; CO

T06PF35 A » hmosygous PI (ontvankelijk) T579 1192_ μ|||| T06HM26 B e Beozygans PI (resistent) T793 1673 ίΙίΐΜΐ T06HN32 ®= feterawt« «ore

__. " Krsstli SB BHBS .......... D -== Tossen A en H

T71_80_ T06HN91 C« Tussen B en B

T70_73_ gij hgfej T06HNG3 ° ~ Score onbekend J06HT72A;

Tabel 6 Gegevens gegenereerd door screening van twee kandidaat verbonden merkers met ToTV resistentie op 83 kiemplasmalijnen.

1033758

Claims (23)

1. Tomatenplant met in zijn genoom ten minste één allel van 5 een gen dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV); genoemd virus werd gedeponeerd bij de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH op 24 november 2004 onder het referentienummer ToTV-EOl (DSM 16999).

2. Plant volgens conclusie 1, waarbij genoemde plant een plant is van het geslacht Solanaceae, met een grotere voorkeur een tomatenplant.

3. Plant volgens conclusie 1, waarbij genoemde plant een plant 15 is van de Solarium lycopersicum familie.

4. Plant volgens conclusie 3, waarbij genoemd allel is gelokaliseerd in een genomisch gebied verbonden met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131,

5. Plant volgens een van conclusies 1-4, waarbij genoemd allel is gelokaliseerd op chromosoom 4, bij voorkeur in een genomisch gebied tussen AFLP merkers P14/M49-F-282 en P11/M35-F-216.

6. Plant volgens een van de conclusies 1-5, waarbij genoemd 30 allel aanwezig is in homozygote vorm. 1033758

7. Plant volgens een van de conclusies 1-6, waarbij genoemde resistentie is geëxpresseerd als resistentie tegen het uitbreken van een infectie. 5

8. Plant volgens een van de conclusies 1-7, waarbij genoemde plant is geïdentificeerd in een resistentie bioassay met betrekking tot infectie met het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1, eventueel gevolgd door een werkwijze voor de screening op 10 de aanwezigheid van ten minste één moleculaire merker die is verbonden met genoemd allel van genoemd ToTV resistentie gen.

9. Plant volgens een van de conclusies 1-8, waarbij genoemde plant is geproduceerd door een werkwijze voor het screenen op de 15 aanwezigheid van ten minste één moleculaire merker die is verbonden met genoemd allel van genoemd ToTV resistentie gen, eventueel gevolgd door een resistentie bioassay met betrekking tot infectie met het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1.

10. Plant volgens conclusie 9, waarbij genoemde moleculaire merker is gekozen uit de groep bestaande uit AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en P13/M38-F-311/313, bij voorkeur uit de groep bestaande uit AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/313, 25 met de meeste uit de groep bestaande uit AFLP merkers P11/M35-F-216 en P13/M38-F-311/ 313.

11. Plant-deel afgeleid uit een plant volgens een van de conclusies 1-10. 30

12. Plant-deel volgens conclusie 10, waarbij genoemd deel een vrucht of zaad is.

13. Werkwijze voor het selecteren van een plant die resistent is 5 tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1, waarbij genoemde werkwijze de volgende stappen omvat: a) verschaffen van een inoculum van genoemd virus; b) blootstelling van een plant aan genoemd inoculum; c) voldoende incubatietijd voorzien; en 10 d) selecteren van genoemde plant in geval er zich geen infectie voordoet bij genoemde plant na het verstrijken van genoemde incubatietijd.

14. Werkwijze voor het selecteren van een plant met in zijn 15 genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1, waarbij genoemde werkwijze de stappen omvat van het screenen van het genomisch DNA van een plant op de aanwezigheid van een genomisch gebied dat is verbonden met AFLP merkers P14/M49-F-282, 20 P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en/of P13/M38-F-311/313, bij voorkeur met AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met de grootste voorkeur met AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/ 313.

15. Werkwijze voor het produceren van een plant omvattende het selecteren van een plant met in zijn genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent aan het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1 door uitvoering van de werkwijze van conclusie 13 of 14 en kruising van genoemde plant met zichzelf of met een andere plant teneinde zaad te produceren, en het groeien van genoemd zaad tot een plant.

16. Werkwijze voor het produceren van een plant die resistent is 5 tegen het tomatentorradovirus (ToTV) zoals gedefinieerd in conclusie 1, waarbij genoemde werkwijze de volgende stappen omvat: a) selecteren van een plant met in zijn genoom ten minste één allel van een gen dat resistentie verleent tegen genoemd tomatentorradovirus (ToTV) door uitvoering van een werkwijze van 10 conclusie 13 of 14; b) kruising van genoemde geselecteerde plant met een andere plant of met zichzelf om zaad te produceren; c) genoemd zaad laten groeien tot een plant om nakomelingen te produceren; 15 d) eventueel herhalen van de kruisings- en groeistappen van de stappen b) en c), en e) selectie onder de nakomelingen van een plant waarbij genoemd allel aanwezig is in homozygote vorm.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, waarbij genoemde selectiestap e) wordt uitgevoerd door screening van het DNA van genoemd nageslacht op de homozygote aanwezigheid van genoemd genomisch gebied verbonden aan AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, en/of 25 P13/M38-F-311/313, bij voorkeur aan AFLP merkers P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met de meeste voorkeur aan AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/ 313.

18. Werkwijze volgens conclusie 16, waarbij genoemde selectiestap e) wordt uitgevoerd door een resistentie bioassay door middel van genoemd virus.

19. Werkwijze volgens een van de conclusies 13-18, waarbij genoemde plant een plant is van het Solanaceae geslacht, met een grotere voorkeur een tomatenplant, met een nog grotere voorkeur een plant van de Solarium lycopersicum soort.

20. Plant verkrijgbaar door de werkwijze volgens een van de conclusies 13-20.

20 P15/M49-F-330, en/of P13/M38-F-311/313, bij voorkeur met AFLP merkers P14/M4S-F-282, P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313, met de meeste voorkeur met AFLP merkers P11/M35-F-216 en/of P13/M38-F-311/313.

21. Plant volgens conclusie 20, waarbij genoemde plant een plant is van het Solanaceae geslacht, met een grotere voorkeur een 15 tomatenplant, met een nog grotere voorkeur een plant van de Solarium lycopersicum soort.

22. Plant-deel afgeleid van een plant volgens conclusie 21.

23. Plant-deel volgens conclusie 22, waarbij genoemd deel een vrucht of zaad is. 25 30 1033758