JP2009538618A - ToTV抵抗性植物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、ウィルス抵抗性植物及びそのような植物を生産する方法に関する。特に、該方法は、トマトトラドウィルス(Tomato torrado virus)(ToTV)に抵抗性である植物、そのような植物を生産する方法、並びに、このようにして得られた植物及び植物部分に関する。
トマト ソラヌム リコペルシクム(Solanum lycopersicum)(以前はリコペルシコン エスクレントゥム(Lycopersicon esculentum))は、多くのウィルス種に対して感受性である。最も有名なトマトウィルスのいくつかは、トマト黄化えそウィルス(TSWV;トスポウィルス属);ペピーノモザイクウィルス(PepMV;ポテクスウィルス属)、及びトマト黄化葉巻ウィルス(TYLCV;ベゴモウィルス属)を包含する。これらの病気が植物に対して与える被害は、葉の変色及び壊死病斑から、ひどい作物損失及び植物の死に及ぶ。
a)該ウィルスの接種原を用意すること、
b)該接種原へとトマト植物を曝露すること、
c)十分なインキュベーション時間を許すこと、そして、
d)該インキュベーション時間の経過後に該トマト植物において感染が確立しないときに、該植物を選抜すること、
の段階を含む。
a)該トマトトラドウィルス(ToTV)に対する抵抗性を与える遺伝子の少なくとも1の対立遺伝子をゲノム内に有する植物を、本発明に従うトマト植物を選抜する方法を実施することにより選抜すること、
b)該選抜された植物と他のトマト植物と又はそれ自身とを交配して種子を生産すること、
c)該種子をトマト植物に育成して子孫植物を生産すること、
d)任意的に、段階b)及びc)の交配段階及び育成段階を繰り返すこと、そして、
e)該対立遺伝子がホモ接合型で存在する植物を、該子孫植物のうちから選抜すること、
の段階を含む上記方法に関係する。
−ToTV抵抗性トマト植物を選抜する為に、又は、
−ToTV感受性トマト品種に、ToTVに対する抵抗性を、該品種における該抵抗性対立遺伝子の存在の頻度を増加することにより与える為に、
ToTVに対する抵抗性を与える対立遺伝子を使用する方法に関係し、該対立遺伝子は、トマトの4番染色体上のAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、P13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域内に位置する。
本明細書において用いられるときに、語「対立遺伝子」は、1つの遺伝子の1以上の選択的な型のいずれかを意味し、該対立遺伝子の全てが、少なくとも1の形質又は特徴に関係する。二倍体細胞又は生物において、或る遺伝子の2の対立遺伝子が、1対の相同染色体上の対応する座位を占める。本発明は、1以上の遺伝子を(調節配列をも)含みうるゲノム領域を同定する為の段階を含む方法に関係するので、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」(すなわち染色体セグメントの対立遺伝子)ということが、いくつかの例ではより正確であり、しかしながら、それらの例において、語「対立遺伝子」は、語「ハプロタイプ」を含むと理解されるべきである。
−寄託されたウィルスToTV DSM 1699により引き起こされる症状と同じ又は同様の症状を有する、トマト植物における病気を結果する、病気の原因因子である全てのウィルスに対する抵抗性を与え、
−ToTV(その分類学上の順位付けは、なお決定される必要がある)の分類群と同じ分類群に属する全ての植物ウィルス、好ましくは同じ科の、より好ましくは同じ属の、さらにより好ましくは同じ種の植物ウィルスに対する抵抗性を与え、
−ToTV DSM 16999に対する抵抗性を与える。
−ToTVに感染した根茎上に健康な接ぎ穂を育成すること、又はその逆;
−該ウィルスを含有する伝染ベクター(感染した植物、例えばネナシカズラ類のような寄生植物を含む)へ健康な植物を曝露すること;
−ToTVウィルスゲノムのコーディング領域を宿す発現ベクターを健康な植物へと導入すること;
−ToTVウィルスゲノムのコーディング領域を宿す発現ベクターを含むアグロバクテリウム ツメファシエンス株などの、土壌伝染性クローンの使用
により達成されうる。
i)病徴が不在のままである;又は、ウィルス粒子又はウィルスRNAが検出されることができない:該植物は抵抗性である;
ii)病徴が重症度において遅らされ又は減少される;又はウィルス粒子若しくはウィルスRNAの全身的に低い力価が検出されることができる:該植物は部分的に抵抗性である;
iii)病徴が重度であるが、局在的なままであり、接種された葉に限定され且つ、接種された組織を超えて全身的に広がらない;又はウィルス粒子又はウィルスRNAが局所的にだけ検出されうる:該植物は過敏性である;
iv)もし病徴が不在であるならば、及びウィルス粒子又はウィルスRNAが検出されることができるならば:該植物は耐性である。
v)もし該植物が病徴を進展し且つ高い全身的なウィルス力価を有するならば、該植物は感受性且つ敏感性である。そのような植物の例は、本発明のウィルスが単離された該植物である。これらの植物は、本発明の方法において適当な対照植物として役立ちうる。
− 抵抗性(A)=全体の感染率が25%未満である
− 分離性(H)=全体の感染率が25〜75%である
− 感受性(B)=全体の感染率が75%超である
である。
表3 BSAの使用により同定されたマーカーの総括、及び、これは次に、32のF2植物についてスクリーニングされる。マーカーは、最もよく期待された順に順序付けられる。マーカーP11/M35−F−216が正確に置かれるかどうかが疑問視される。
表5 3つの最もよく連鎖するマーカーの使用により産生されたデータ。マーカーP14/M49−F−282は、150の表現型系統についてスクリーニングされ、及び、マーカーP11/M35−F−216及び2対立遺伝子性P13/M38−F−311/313はサブセットについてスクリーニングされた。
試験集団の夫々の植物からのトマト組織のDNA試料が、標準の調製技術を用いることにより調製された(マイクロプレップ、例えばFulton TM, Chunwongse J, and Tanksley SD. (1995) Microprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants. Plant Molecular Biology Reporter 13 (3): 207-209.)。
−dNTP’s(2mM ストック)(Amersham Bioscience)
−SuperThermポリメラーゼ(Integro)
−順方向プライマー(10ng/μl)
−逆方向プライマー(10ng/μl)
−10×PCRバッファー 25mM MgCl2
−ローディングバッファー
−エチジウムブロマイド(10mg/ml)
−1×TE
−0.5×TBE(Duchefa)
−制限酵素MseI(New England Biolabs)
2.0 μl 10×PCRバッファー(25mM MgCl2)
2.0 μl dNTP’s混合物(2mMの夫々のdNTP’s)
3.0 μl 順方向プライマー(10ng/μl)
3.0 μl 逆方向プライマー(10ng/μl)
0.05 μl SuperThermポリメラーゼ
8.95 μl H2O
1.1 μl テンプレートDNA
94℃で3分;(94℃で30秒、65℃で1分及び72℃で1分)について32サイクル;4℃での保持
スコア1=360bp+260bp =ホモ接合性感受性
スコア2=420bp+360bp+260bp=ヘテロ接合性
スコア3=420bp+260bp=ホモ接合性抵抗性
表現型は、ハイブリッドから独立にスコア化された。
ゲルの写真が図2に提示され、全部で3の植物のタイプからなる試験集団の消化されたPCR産物を示す;泳動は下から上であり、マーカーは100、200、300bp等の断片を示す)。
−10系統が、スコア「2」を与えるとき、表現型はヘテロ接合性感受性であった。
−24系統が、スコア「1」を与えるとき、表現型はホモ接合性感受性であった。
−45系統が、スコア「3」を与えるとき、表現型はホモ接合性抵抗性であった。
−マーカースコアは、試験された材料の95%において、観察された表現型と一致する。
Claims (29)
- トマトトラドウィルス(ToTV)に対する抵抗性を与える遺伝子の少なくとも1の対立遺伝子をゲノム内に有する植物であって、該ウィルスがDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに、2004年11月24日に、寄託者参照番号ToTV−E01(DSM 16999)下で寄託された、上記植物。
- 該植物が、ソラナセアエ(Solanaceae)属の植物であり、より好ましくはトマト植物である、請求項1に記載の植物。
- 該植物が、ソラヌム リコペルシクム(Solanum lycopersicum)種の植物である、請求項1に記載の植物。
- 該対立遺伝子が、AFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、P13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域内に位置する、請求項3に記載の植物。
- 該対立遺伝子が、4番染色体上に位置し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282及びP11/M35−F−216の間、さらにより好ましくはAFLPマーカーP13/M38−F−311/313及びCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900の間に位置するゲノム領域内に位置する、請求項4に記載の植物。
- 該対立遺伝子がホモ接合型で存在する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の植物。
- 該抵抗性が、感染の確立に対する抵抗性として表される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の植物。
- 該植物が、請求項1において定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)による感染を含む抵抗性バイオアッセイにおいて同定され、任意的に該ToTV抵抗性遺伝子の該対立遺伝子と連鎖する少なくとも1の分子マーカーの存在についてスクリーニングすることを含む方法が続く、請求項1〜7のいずれか1項に記載の植物。
- 該植物が、該ToTV抵抗性遺伝子の該対立遺伝子に連鎖する少なくとも1の分子マーカーの存在についてスクリーニングすることを含む方法により生産され、任意的に請求項1に定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)による感染を含む抵抗性バイオアッセイが続く、請求項1〜8のいずれか1項に記載の植物。
- 該少なくとも1の分子マーカーが、AFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、及びP13/M38−F−311/313並びにCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900から成る群から選ばれ、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及びP13/M38−F−311/313並びにCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900から成る群から選ばれ、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及びP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900から成る群から選ばれる、請求項9に記載の植物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の植物に由来する植物部分。
- 該部分が果実又は種子である、請求項10に記載の植物部分。
- 請求項1に定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)に対して抵抗性である植物を選抜する方法であって、
a)該ウィルスの接種原を用意すること、
b)植物を該接種原に曝すこと、
c)十分なインキュベーション時間を許すこと、そして
d)該インキュベーション時間の経過後に、該植物において感染が確立しない場合に該植物を選抜すること、
の段階を含む上記方法。 - 請求項1に定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)に対する抵抗性を与える遺伝子の少なくとも1の対立遺伝子をゲノム内に有する植物を選抜する方法であって、AFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域の存在について植物のゲノムDNAをスクリーニングすることの段階を含む上記方法。
- 請求項13又は14の方法を実施することにより、請求項1に定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)に対する抵抗性を与える遺伝子の少なくとも1の対立遺伝子をゲノム内に有する植物を選抜すること及び該選抜された植物とそれ自身と又は他の植物とを交配して種子を生産すること、そして該種子を植物へと育成することを含む、植物の生産方法。
- 請求項1に定義されたとおりのトマトトラドウィルス(ToTV)に対して抵抗性である植物の生産方法であって、
a)該トマトトラドウィルス(ToTV)に対する抵抗性を与える遺伝子の少なくとも1の対立遺伝子をゲノム内に有する植物を、請求項13又は14の方法を実施することにより選抜すること、
b)該選抜された植物と他の植物と又はそれ自身とを交配して種子を生産すること、
c)該種子を植物へと育成して子孫植物を生産すること、
d)任意的に段階b)及び段階c)の交配段階及び育成段階を繰り返すこと、そして、
e)該子孫植物のうちから該対立遺伝子がホモ接合型で存在する植物を選抜すること、
の段階を含む上記方法。 - 段階e)における該選抜が、AFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖する該ゲノム領域のホモ接合的存在について該子孫植物のDNAをスクリーニングすることにより実施される、請求項16に記載の方法。
- 段階e)における該選抜が、該ウィルスを用いる抵抗性バイオアッセイにより実施される、請求項16に記載の方法。
- 該植物が、ソラナセアエ属、より好ましくはトマト植物、さらにより好ましくはソラヌム リコペルシクム種の植物である、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項13〜20のいずれか1項に記載の方法により得られる植物。
- 該植物が、ソラナセアエ属、より好ましくはトマト植物、さらにより好ましくはソラヌム リコペルシクム種の植物である、請求項20に記載の植物。
- 請求項21に記載の植物に由来する植物部分。
- 該部分が果実又は種子である、請求項22に記載の植物部分。
- −ToTV抵抗性トマト植物を選抜する為に、又は
−ToTV感受性トマト品種内にToTVに対する抵抗性を、該品種内の抵抗性対立遺伝子の存在の頻度を増加することにより与える為に、
ToTVに対する抵抗性を与える対立遺伝子を使用する方法であって、
該対立遺伝子が、トマトの4番染色体上のAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、P13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域の中に位置する上記方法。 - 植物の収量を増大する為に及び/又は、ToTV感染から結果する、植物における収量損失を防ぐ為に、ToTV抵抗性植物を使用する方法であって、該ToTV抵抗性植物が、トマトの4番染色体上のAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、P13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域内に位置する対立遺伝子のホモ接合的存在により特徴付けられる上記方法。
- ToTV抵抗性植物を生産する為に又は植物又は植物の集団におけるトラド病(又はmarchitez病又はチョコレート斑点病などの関連する病気)の発生を防ぐ為に、ToTV抵抗性植物の種子を使用する方法であって、該植物が請求項1〜11、20又は21のいずれか1項において定義される上記方法。
- ToTVに対する抵抗性を与える少なくとも1の対立遺伝子を含む植物又はToTVに対する抵抗性を与える対立遺伝子についてホモ接合性である植物を、ToTV抵抗性トマト植物として又は該対立遺伝子のホモ接合的存在から結果するToTV抵抗性表現型を他の植物に備えることを目的とした育種プログラムにおいて親植物として使用する方法であって、該対立遺伝子が、トマトの4番染色体上のAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216、P21/M61−F−583、P25/M51−F−131、P15/M49−F−330、P13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖し、好ましくはAFLPマーカーP14/M49−F−282、P11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313に連鎖し、最も好ましくはAFLPマーカーP11/M35−F−216及び/又はP13/M38−F−311/313及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900に連鎖するゲノム領域内に位置する上記方法。
- 植物においてToTVに対する抵抗性を与える対立遺伝子の存在を検出する為に、AFLPマーカーP13/M38−F−311/313、P11/M35−F−216及び/又はCOSII/CAPSマーカーC2_At5g25900を使用する方法。
- 該植物がトマト植物である、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
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