KR101388281B1 - 질병 내성 오이 식물체 - Google Patents

질병 내성 오이 식물체 Download PDF

Info

Publication number
KR101388281B1
KR101388281B1 KR1020087012860A KR20087012860A KR101388281B1 KR 101388281 B1 KR101388281 B1 KR 101388281B1 KR 1020087012860 A KR1020087012860 A KR 1020087012860A KR 20087012860 A KR20087012860 A KR 20087012860A KR 101388281 B1 KR101388281 B1 KR 101388281B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
cucumber
resistance
marker
powdery mildew
Prior art date
Application number
KR1020087012860A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080077140A (ko
Inventor
르네 요하네스 마리아 홉스테드
와우터 피터 요하네스 드 루이터
Original Assignee
드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이. filed Critical 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
Publication of KR20080077140A publication Critical patent/KR20080077140A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101388281B1 publication Critical patent/KR101388281B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/34—Cucurbitaceae, e.g. bitter melon, cucumber or watermelon 
    • A01H6/346—Cucumis sativus[cucumber]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Abstract

본 발명은 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대해 내성인 식물체로, 여기서 상기 식물체는 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus ) 종이고, 상기 식물체는 단일 염색체에 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 하나 이상의 염색체 영역과 흰가루병균 내성을 제공하는 하나 이상의 염색체 영역을 포함하고, 여기서 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 하나 이상의 영역은 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결되고 그리고 상기 흰가루병균 내성을 제공하는 하나 이상의 영역은 SEQ ID NO:1의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 39T→G, SEQ ID NO:2의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 29G→A, SEQ ID NO:3의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 193C→T, SEQ ID NO:4의 위치 221에서 삽입 돌연변이 5'-AATTT-3', 그리고 마커 E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001, E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 및 E14/M59-F-200로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결된다.
오이 클로스테로바이러스, 오이 흰가루병균, 질병 내성 오이

Description

질병 내성 오이 식물체{DISEASE RESISTENT CUCUMBER PLANTS}
본 발명은 질병 내성 식물체 및 식물체 육종, 특히 흰가루병균 및 클로스테로바이러스(closterovirus)-내성 오이 식물체의 육종에 관한 것이다.
상업적 오이(쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus)) 생산은 다양한 질병에 걸릴 수 있다. 황화 바이러스(Yellowing viruses)는 이러한 질병을 야기하며 오이 생산에서 상당한 경제적 손실을 가져올 수 있다. 오이에게 영향을 미치는 황화 바이러스의 가장 높은 분류학상 집단을 형성하는 클로스터바이러스 과(클로스테로비리대(Closteroviridae))는, 30 이상의 굴곡성 및 사상형, 곤충-매개 식물체 바이러스를 포함한다. 과는 세 가지 속으로 이루어지고, 그것의 가루이(whitefly)-매개 크리니바이러스(Crinivirus) 유전자는 오이에 특히 중요한 종을 포함한다. 이 유전자는 그중에서도 특히, 조롱박 황화 위축병 바이러스(CYSDV), 양상치 감염성 황화 바이러스 (LIYV) 및 사탕무 유사-황화 바이러스(BPYV) 종을 포함한다. CYSDV 및 BPYV는 오이 재배자를 가장 위협한다.
바이러스들은 보통 곤충 벡터에 존재하고, 곤충의 섭식활동에 의하여 식물체에 전염된다. 오이 클로스테로바이러스는 따라서 살충제 처리에 의하여 억제될 수 있다. 그러나 바람직하게, 농업 및 원예에서 클로스테로바이러스의 억제는 숙주 식 물체의 바이러스 내성 품종의 제공에 의해 얻을 수 있다. 현재, 내성 오이 품종의 게놈에서 적어도 2개의 정량적 형질 기원 또는 QTL이 오이의 클로스테로바이러스 내성과 관련된다고 인식된다(WO 02/22836 참조). 그러므로, 클로스테로바이러스 내성과 관련된 유전적 물질의 자손 식물계로의 유전질침투(introgression)는 이들 QTL과 연결된 특이 마커를 검출함에 의해 모니터될 수 있다. 그러므로, QTL에 대한 지식은 클로스테로바이러스 내성 재배변종식물의 육종을 도울 수 있다.
상업적 오이 생산에 영향을 미치는 또 다른 중요한 질병은 오이 흰가루병(PM)이다. 호리병박의 흰가루병은 곰팡이 흰가루병균(S. fuliginea) 및 토마토 흰가루병(E. cichoracearum)에 의해 야기될 수 있다. 질병은 만연되어 있고 연중 발생할 수 있다. 증상은 감염된 잎 표면상에 미세 흰 곰팡이실의 작은 점으로 시작되고, 이 점은 자라서 결국 포자와 균사의 흰 분말 매스로 줄기와 잎을 덮는다.
심각한 감염은 탈색과 잎 손실을 가져오고 과실의 수와 크기의 감소를 수반한다. 비록 많은 살충제들이 가루병균에 효과적이지만, 화학약품에 대한 균들의 내성이 나타나고 있다.
여러 오이 균주들이 가루병균에 대한 어느 정도 수준의 내성을 나타낸다. 이와 같은 균주는 예를 들면, 인도 야생 오이 발병 PI 197088 및 발병 PI 200815, PI 200818 뿐 아니라 재배변종식물 나쯔푸시나리 및 아소미도리(the cultivars Natsufushinari and Asomidori (Morishita et al. 2003))를 포함한다.
또한 PM에 대한 내성과 관련된 여러 유전자들이 알려져 있고(Fanourakis, 1984; Fujieda and Akiya, 1962; Kooistra, 1968, 1971; Shanmugasundarum et al., 1971, 1972), 나쯔푸시나리의 pm-1 및 pm-2, PI 200815 및 PI 200818의 pm-3 및 재배형 식물 Wis. SMR 18의 "pm-h" (유전자 "pm-h"은 이하 pm-h로 표시되는 pm 유전자 자리에 대한 편견이 없다)을 포함한다. 비록 PM에 부분적인 내성을 갖는 약간의 상업적 오이 변종이 이용가능하지만, 대부분의 상업적 재배자들은 여전히 잎의 살균제의 사용에 의존한다. 이것은 부분적으로 PM 내성을 다른 형태의 내성을 나타내는 계에 도입하기가 어렵다는 사실 때문이다. 예를 들면, PM 내성 대립형질을 획득한 계는 클로스테로바이러스에 걸리기 쉽고 또 그 역으로 된다는 것이 단점으로 육종업자에게 발생한 반면, 전에는 그들은 그렇지 않았다. 사실, 교차 시험들은 따라서 PM과 클로스테로바이러스에 대한 내성을 나타내는 오이 계에 결과를 나타내지 않았다. 그러므로, 유익한 이중 내성 재조합체는 지금까지 획득되지 않았다. 이것은 대체로 다양한 형질이 단일 게놈에 융합되는 것이 비교적 직접적인 육종 과정에 의해 수행되기 때문에 놀랍다.
본 발명의 목적은 오이에 영향을 미치는 클로스테로바이러스과의 바이러스, 특히 BPYV 및 CYSDV에 대한 내성을 나타내고 그것 이외에 곰팡이 흰가루병균(S. fuliginea) 및 토마토 흰가루병(E. cichoracearum)에 의한 오이 흰가루병에 대해 내성을 나타내는 오이 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 CYSDY 및 PM 모두에 내성을 나타내는 많은 오이 식물체를 발견하였다. 더우기, 본 발명자들은 이들 이중-내성 오이 식물체가 클로스테로바이러스 내성(QTL-I로 기재)과 관련된 하나의 주요 QTL 뿐 아니라 흰가루병균 내성((pm-l 및 pm-h로 기재)과 관련된 2개의 정성적 특징 유전자 자리(QTLs)를 포함한다는 것을 발견하였다. 더욱 중요하기는, 본 발명자들은 모든 QTLs가 단일 유전적 연관군에 위치한다는 것을 발견하였다. 그러므로, 본 발명자들은 본질적으로 이들 식물체에서, 클로스테로바이러스와 흰가루병균에 내성인 유전자가 단일 염색체에 존재한다는 것을 발견하였다. 이와 같은 식물체는 식물 육종에 사용하기에 매우 유리하다. 더우기, 본 발명자들은 이중 내성 오이 식물체가 교차 실험을 통해 앞에서 얻어질 수 없는지 가능한 메카니즘을 발견하였다. 이론에 얽매임 없이, 하나의 질병에 내성이기에 필수적인 유전적 요소의 유전질침투는 다른 질병에 내성이기에 필수적인 유전적 요소의 손실을 가져온다고 믿어진다. 이 발견에 의해, 본 발명자들은 이 문제를 해결하는 육종 스킴을 개발하였고, 그것에 의해 필수적인 이중-내성 식물체를 얻었다.
제1면에서, 본 발명은 오이 흰가루병균에 대한 내성 뿐 아니라 오이 클로스테로바이러스에 대한 내성을 나타내는 식물인 오이종의 식물을 제공한다.
본 발명의 이와 같은 식물체의 바람직한 구현예에서, 클로스테로바이러스-내성 (QTL-I)에 책임이 있는 유전적 영역(들)과 흰가루병균 내성(pm-h 및/또는 pm-l)에 책임이 있는 유전적 영역(들)이 단일 염색체에 존재한다
본 발명의 식물체의 추가의 구현예에서, QTL-I의 존재는 WO 02/22836에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 측면 마커의 존재에 의해 표시되고, 그것에 대한 발현 참조는 본 내용을 구성한다.
본 발명의 식물체의 또 다른 구현예에서, pm-h로 언급되는 QTL의 존재는 상기 식물체에서 흰가루병균 내성과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)으로부터 생성된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 핵산의 존재에 의해 나타내고, 여기서 상기 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)은 하기 표2에 나타낸 바와 같이 SNP1 및 SNP2로부터 선택된다.
본 발명의 식물체의 또 다른 구현예에서, pm-l로 명명되는 QTL의 존재는 상기 식물체의 흰가루병균 내성과 관련된, 하기 표3에 SNP 3로 표시된 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)으로부터 생성된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 또는 상기 식물체에 흰가루병균 내성과 관련된 하기 표3에 5-bp 삽입 5'-AATTT-3'로 나타낸 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 핵산 서열의 존재에 의해 표시된다.
그러므로, 본 발명은 바람직하기는 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 내성을 갖는 식물체를 제공하고, 여기서 상기 식물체는 오이종의 식물체이고, 상기 식물체는 단일 염색체 상에 적어도 하나의 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 염색체 영역 및 흰가루병균 내성을 제공하는 적어도 하나의 염색체 영역을 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 염색체 영역은 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커에 연결되고 그리고 상기 흰가루병균 내성을 제공하는 적어도 하나의 염색체 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커에 연결된다:
- SEQ ID NO:1의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 39T→G,
- SEQ ID NO: 2에서 단일 뉴클레오티드 다형 마커 29G→A,
- SEQ ID NO: 3에서 단일 뉴클레오티드 다형 마커 193C→T,
- SEQ ID NO:4의 221 위치에서 삽입 돌연변이 5'-AATTT-3', 및
- 마커 E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001, E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 및E14/M59-F-200.
본 발명의 식물체는 임의로 클로스테로바이러스 내성과 관련된 제2 QTL을 포함할 수 있다(WO 02/22836에 기재된 바와 같이 QTL-2, 상세한 것은 이 QTL의 국지화 및 특성에 대한 상세를 위한 이 문헌의 명세서에 명백히 참조된다). 이 QTL은 개별적인 염색체에 위치한다는 것이 나타난다.
또 다른 면에서, 본 발명은 상기와 같이 본 발명의 오이 식물체의 일부를 제공한다. 바람직하기는, 상기 식물체 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗, 원형질체 및 칼리로부터 선택되고, 가장 바람직하기는 씨앗이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 이중(클로스테로바이러스 플러스 PM 내성[PM-잎(pm-l)과 PM-배축(pm-h) 내성 표현형 모두를 포함]) 내성 오이 식물체와, 제2 오이 식물체 또는 다른 식물체 변종, 바람직하기는 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 오이계 식물체의 이종교배에 의해 얻어진 F1 씨앗을 제공한다. 바람직하기는, 상기 제2 오이 식물체는 이것이 열성형질 유전자이므로 적어도 pm-h를 포함한다. 상기 제2 오이 식물체는 적어도 잡종성, 바람직하기는 열성형질 pm-h 형질에 동형이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 제2 오이 식물체는 클로스테로바이러스에 감염될 수 있고 더욱 바람직하기는 동종교배 식물이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 상기와 같이 본 발명의 성장에 의해 얻어진 혼성화 식물체를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 혼성화 식물체의 일부를 제공한다. 바람직하기는 상기 식물체 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗, 원형질체 및 칼리로부터 선택되고, 가장 바람직하기는 과실이다.
상기와 같이, 각각 오직 하나의 질병에만 내성인 식물체의 이종교배에 의해 PM 또는 클로스테로바이러스 내성에 필수적인 유전 요소의 유전질침투는 다른 질병에 대한 내성에 필수적인 유전자의 손실을 가져온다고 믿어진다. 이 발견에 의해, 본 발명자들은 이 문제를 해결할 수 있는 육종 스킴을 개발하였고, 그것에 의해 요구되는 이중-내성 식물체를 얻었다. 본 발명자들은 내성이 QTL-I에 의해 가져와지는 클로스테로바이러스-내성 부모 오이계의 식물체와, 내성이 pm-h와 pm-l에 의해 가져와지는 PM-내성 오이계의 식물체의 이종교배로부터 이중-내성 오이 식물체를 효과적으로 생산하기 위해, 육종 과정은 반드시 재조합체의 형성을 허용하는 단계(즉, 하나의 염색체에 동질의 재조합 사산의 발현을 허용하는 단계)와 이어서 단일 염색체에 QTL-I와 pm-l 또는 QTL-I와 pm-h를 갖는 식물체를 선택하는 단계를 포함하여야 한다는 것을 발견하였다. 바람직하기는 상기 선택 단계는 단일 염색체에 QTL-I, pm-l 및 pm-h를 갖는 식물체를 선택하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하기는, QTL-I는 pm-l와 pm-h를 수확하는 게놈성 영역들 사이의 게놈성 영역에 유전질 침투되어, 효과적으로 클로스테로바이러스 내성에 대한 QTL-I이 PM 내성에 대한 2개의 QTL 사이에 샌드위치되는 것이다.
PM 또는 클로스테로바이러스에 대한 내성과 관현되어 본 명세서에 정의된 바와 같이 어느 QTL의 존재의 동정은 식물체의 염색체상의 대표적인 QTL에 연결된 하나 이상의 유전적 마커, 식물체의 염색체 상의 대표적인 QTL과의 연관 불균형의 유전적 마커, 또는 그들의 조합체를 검출함에 의해 수행될 수 있다.
상기 식물체에서 상기 QTLs의 존재 및/또는 위치를 검출하기 위한 적합한 방법은 상기 QTLs를 특성화하는 AFLP 마커의 사용을 포함한다. 바람직하기는 단일 염색체에 QTL-I, pm-l 및/또는 pm-h를 갖는 식물체를 선택하는 상기 단계는 p/n-4에 대한 정량적 형질 유전자 자리를 수확하는 동일 염색체 상에서, 또는 선택적으로 PM-내성과 관련된 pm-h에 대한 정량적 형질 유전자 자리(QTL)를 수확하는 동일한 염색체 상에서, 바람직하기는 두 정량적 형질 유전자 자리 pm-h와 pm-l 모두를 수확하는 동일한 염색체 상에서의 클로스테로바이러스-내성과 관련된 정량적 형질 유전적 자리 QTL-1을 특성화하는 적어도 하나의 AFLP 마커의 검출을 포함하고, 여기서 상기 QTL-I 마커는 QTL pm-h 및 QTL pm-l 사이의 염색체 영역에 위치한다. 그러므로, 선택과정은 표 2, 3, 및 4의 마커로 이루어진 마커의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 검출을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 오이 식물체에서 QTL-I의 단일 염색체, 및 QTLs pm-l 및 pm- h의 적어도 하나의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 오이 클로스테로바이러스와 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 오이의 식물체를 선택하는 방법을 제공한다.
이와 같은 방법의 한 구현예에서, 상기 방법은
a) 오이 식물체로부터 게놈성 DNA의 샘플을 제공하는 단계 (상기 샘플은 충분한 길이의 게놈성 DNA 단편을 포함한다);
b) 적어도 하나의 제1 QTL 또는 QTL-I, pm-l and pm-h으로 이루어진 군으로부터 그것과 관련된 분자 마커를 포함하는 단편을 선택하기 위한 정제 반응을 수행하는 단계;
c) 적어도 하나의 제2 QTL 또는 QTL-I, pm-l 및 pm-h으로 이루어진 군으로부터 그것과 관련된 분자 마커를 포함하는 단편을 검출하기 위해 상기 선택된 단편 상에서 증폭반응을 수행하는 단계
d) 단계 c)의 반응 생성물에서 예정된 길이 또는 예정된 핵산 서열을 갖는 증폭된 DNA 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 단계 b)는 상기 제1 QTL에 대한 분자 마커를 한정하는 적어도 하나의 프라이머 세트, 또는 상기 마커를 한정하는 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 염기서열을 갖는 적어도 하나의 핵산 프로브의 사용을 포함하고 상기 핵산 프로브는 엄격한 혼성 조건하에서 상기 마커(들)을 한정하는 핵산 서열과 특이적으로 혼성화한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 단계 c)는 상기 제2 QTL에 대한 분자 마커를 한정하는 적어도 하나의 프라이머 세트 또는 엄격한 조건하에서 상기 제2 QTL에 대한 분자 마커의 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 프라이머 세트의 사용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 식물체에서 단일 염색체 상의 상기 QTLs 존재의 검출 단계는 인시츄 혼성화기술 또는 인시츄 증폭 기술의 사용에 의해 수행된다. 즉, 상기 QTL에 대한 프로브와 프라이머, 또는 엄격한 조건하에서 상기 QTL에 대한 분자 마커의 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하는 분자 마커를 한정하는 프로브와 프라이머는 이와 같은 방법에서 적절히 사용된다.
본 발명의 면에서, 분자 마커는 바람직하기는 SNP 삽입 돌연변이 마커 또는 AFLP 마커이고, 더욱 바람직하기는 본 목적을 위해 명백히 인용된 참조문헌으로부터 뿐 아니라 표 2~4에 기재된 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 재한 내성을 나타내는 식물체인 Cucumis satiυus 종의 식물체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a) 상기 식물체 게놈에서 마커 E16/M50-244, E16/M50-188, 및 E11/M48-251로 표시되는 오이 클로스테로바이러스 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재를 검출함에 의해, 오이 클로스테로바이러스에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 제1 오이 식물체를 선택하는 단계;
b) 상기 식물체 게놈에서 하기 마커들로 표시되는 제1 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재를 검출함에 의해,
- SEQ ID NO:1의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 39T→G,
- SEQ ID NO:2의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 29G→A,
- 마커 E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001;
또는
상기 식물체 게놈에서 하기 마커들로 표시되는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재를 검출함에 의해,
- SEQ ID NO:3의 단일 뉴클레오티드 다형 마커 193C→T,
- SEQ ID NO:4의 221 위치에서 삽입 돌연변이 5'-AATTT-3', 및
- 마커 E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 및 E14/M59-F-200;
오이 흰가루병균에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 제2 오이 식물체를 선택하는 단계:
c) 단계 a) 및 단계 b)로 부터 F1 씨앗을 생산하기 위해 상기 식물체를 이종교배하는 단계;
d) 많은 F1 씨앗을 Fl 식물체로 성장시키고, 상기 F1 식물체로부터 이종교배 또는 자가생식에 의해 상기 F1 식물체로부터 추가의 자손 개체를 발생시키는 단계; 및
e) 상기 추가의 자손 식물체들 중에서 상기 단계 a)에 정의된 오이 클로스테로바이러스 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커 및 단계 b)에 정의된 바와 같은 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커를 포함하는 식물체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 분야의 당업자는 상기 추가의 자손 개체가 단일 염색체 중에 적어도 2개의 동질성 재조합 사상을 겪은 상기 추가의 자손 개체 중에서 식물체의 존재를 검출할 수 있도록 충분한 크기여야 한다는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 약 1000개의 식물체 개체가 충분할 것이다. 현재까지 제안된 마커 선택 기술의 이점은, 이와 같은 개체 크기가 관심있는 유전자형의 존재에 대해 쉽게 스크린될 수 있고, 이것은 표현형으로는 검출할 수 없을 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 b)에서 제2 오이 식물체를 선택하는 단계는, 상기 제1 또는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL 중 오직 하나를 갖는 제2 오이 식물체를 선택하는 것을 포함하고, 여기서 상기 방법은 추가로
f) 상기 제1 또는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL과 다른 것(즉, 상기 제2 오이 식물체에 존재하지 않는 QTL)을 갖는 제3 오이 식물체를 선택하는 단계;
g) 단계 e)에서 얻어진 F1 식물체를 추가의 자손 식물체를 생산하기 위해 상기 제3 오이 식물체와 이종교배하는 단계, 및
h) 자손 식물체 중에서 단계 a)에 정의된 오이 클로스테로바이러스 내성-제공 QTL과 단계 b)에서 정의된 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL들 모두를 포함하는 식물체를 선택하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 흰가루병균 내성을 제공하는 유전자 자리 pm-h 및 pm-l 모두를 포함하는 식물체가 선택되고 여기서 QTL-I에의해 특성화되는 클로스테로바이러스 내성 제공 유전자자리는 흰가루병균 내성 제공 유전자 자리 pm-h 및 pm-l 둘 사이에 위치한다.
그러므로, 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 쿠쿠미스 사티부스 종의 식물체를 생산하는 방법에서, 단계 b), e), f) 또는 h)에 정의된 바와 같은 오이 흰가루병균 에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 오이 식물체를 선택하는 단계는:
- 상기 식물체 게놈에서, SEQ ID NO:1의 SNP 마커 39T→G, SEQ ID NO:2의 SNP 마커 29G→A, 및 마커 E16/M50-F-194, E11/M48-F-251 및 E23/M38-M001에 의해 표시되는 제1 오이 흰가루 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재를 검출하는 단계; 및
- 상기 식물체 게놈에서 SEQ ID NO:3의 SNP 마커 193C→T, SEQ ID NO:4의 위치 221에서 삽입 돌연변이 5'-AATTT-3', 및 마커 E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 및 E14/M59-F-200에 의해 표시되는 제2 오이 흰가루 내성-제공 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 물체를 생산하는 방법에서, 단계 a), b), e), f) 또는 h) 중 적어도 하나의 단계는 상기 식물체로부터 게놈성 DNA의 샘플을 제공하고 상기 게놈성 DNA의 샘플에서 적어도 하나의 마커를 검출하는 것을 포함한다.
선택적인 바람직한 구현예에서, 단계 e)는 식물체의 게놈에서 QTL-I과 관련된 적어도 하나의 마커와 pm-h 또는 pm-l과 관련된 적어도 하나의 마커를 검출하는 것, 바람직하기는 식물체의 게놈과 단일 염색체에서, 바람직하기는 표 2, 3 및 4에 기재된 마커의 군으로부터 선택되는 마커를 포함하여 QTL-I와 관련된 적어도 하나의 마커, pm-h와 관련된 적어도 하나의 마커 및 pm-l과 관련된 적어도 하나의 마커를 검출하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 e)는 상기와 같은 쿠쿠미스 사티부스 종의 이중-내성 식물체를 선택하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수행된다.
단계 c) 내지 e)에 기재된 바와 같은, 단일 염색체 중의 적어도 2개의 동형 재조합 사상이 이중-내성 Fl을 생산하는 단일 이종교배에서 발생하는 공정은 또한 다중 발생에 걸쳐 얻을 수 있고, 단일 염색체의 제안된 (적어도 2개의) 동형 재조합 사상, 및 그러므로 이중 내성 식물체의 형성은 F2, F3, F4, F5 또는 어느 순차적 발생에서 인식된다. 이와 같은 변종은 현재 청구된 발명의 범위 내이고, 당업자에 의해 쉽게 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 쿠쿠미스 사티부스 종의 식물체를 생산하는 선택적 방법에서, 상기 방법은
a)오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 쿠쿠미스 사티부스 종의 제1 식물체를 본 발명의 방법을 수행함에 의해 선택하는 단계;
b)상기 QTLs에 대해 동형 식물계를 생산하도록 상기 식물체를 육종하는 단계;
c) 단계 a) 및 단계 b)로부터 F1 씨앗을 생산하기 위해 상기 식물체를 이종교배하는 단계;
d) 상기 F1 씨앗을 F1 식물체로 성장시키는 단계를 포함한다.
또 다른 본 발명의 면은 본 발명의 방법에 의해 생산된 식물체 또는 그것의 일부이다.
본 발명은 이중 내성을 나타낼 것 같은 식물체를 선택하기 위해 자손 식물체를 매우 빠르게 스크리닝할 수 있게 한다. 예를 들면, 자손 식물체 중에서 적어도 하나의 pm-h 마커, 적어도 하나의 pm-l 마커 및 적어도 하나의 QTL-I 마커를 갖는 식물체를 검출할 수 있다. 이와 같은 식물체는 원하는 유전질 침투를 얻을 것이다. 추가 마커에 대한 스크리닝은 자손 식물체가 이중 내성을 나타낸다는 예상에 대한 확신 수준을 높일 것이다. 3개의 QTL의 각각에 대한 적어도 하나의 마커의 검출에 따라, 식물체는 선택되고 육종 프로그램, 또는 추가의 특성화 실험에서 사용될 것이다.
형질이 하나의 그리고 동일한 염색체에 위치하는 본 발명의 식물체의 이점은 이들이 통상의 육종을 사용할 때, 다른 (혼성) 식물체로 내성의 두 형태를 쉽게 조절할 수 있는 유전자를 이동하는데 개선된 가능성을 제공하는 것이고 반면, 형질이 개별적인 염색체에 존재한다면, 통상의 육종 기술을 사용하여 결합된 두 형질을 포함하는 혼성물을 생산하는 것이 더욱 어려울 것이다.
도 1~6은 여러 가능한 재조합 시나리오를 나타내고, 여기서 2개의 개별적인 식물페로부터 흰가루병균(pm)과 클로스테로바이러스(QTL-I) 내성이 단일 자손 식물 체로 결합된다. 다중 내성 유전자 자리를 갖는 것으로 표시된 여러 부모는 그들 스스로 이종교배 또는 자가생식의 결과일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러므로, QTLs pm-l 및 pm-h 모두를 갖는 식물체는 단일 QTL을 갖는 식물체들의 이종교배에 의해 얻어질 수 있다.
도 7은 단일 연결기에서 쿠쿠미스 사티부스 NPI로부터 흰가루병균 내성(pm) 및 C. sativus Khira로부터 클로스테로바이러스 내성(ATL-1)에 대한 여러 유전자의 위치를 나타낸다. Pm-leaf 1은 본 명세서에 사용된 pm-l과 동등하고 Pm hypo는 본 명세서에 사용된 pm-h와 동등하다.
도 8은 본 명세서의 표 2 및 표 3에서 각각의 SEQ ID로 표시된 바와 같은 SPN 주변과 삽입마커에서의 DNA 서열을 나타낸다.
정의
본 명세서에서 사용된 바에 따르면, 용어 "오이"는 오이, 아메리칸 작은오이(American gherkin), 카사바나나(Cassabanana), 큐크(Cuke), 게르킨(Gherkin), 온실오이(Hothouse cucumber), 레몬 오이(Lemon cucumber), 만데라 오이(Mandera cucumber), 피클링 오이(Pickling cucumber), 독사 오이(Serpent cucumber), 슬라이싱 오이(Slicing cucumber), 뱀 오이(Snake cucumber), 및 웨스턴 인디안 게르킨(West Indian gherkin)으로 일반적으로 명칭되는 식물체를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아닌, 쿠쿠미스 사티부스 종의 식물체 또는 그것의 일부를 말하지한다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "식물체 일부"는 식물체에 고유한 식물 세포와 같은 단일 세포 및 세포 조직, 세포 덩어리 및 재생될 수 있는 식물로부터의 조직 배양물을 포함하는, 식물체의 일부를 말한다. 식물체 일부의 예는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗으로부터의 단일 세포 및 조직; 뿐 아니라 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗 원형질체 및 칼리 등을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "클로스테로바이러스"는 조롱박 황화 위축병 바이러스(CYSDV), 양상치 감염성 황화 바이러스 (LIYV) 및 사탕무 유사-황화 바이러스(BPYV; 또한, 오이 백화 반점 바이러스(CCSV), 오이 황화 바이러스, 머스크멜론 황화 바이러스 또는 딸기 팔리도시스 바이러스로도 알려져 있다)를 포함하고, 바람직하기는 BPYV 및 CYSDV, 더욱 바람직하기는 CYSDV를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 바람직하기는, 오이 식물체에 있어서, 용어 "클로스테로바이러스"는 오이 식물체에 특히 중요한 속, 즉 Crini υ iideae를 말한다.
본 명에서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "흰가루병균"은 흰가루병균 (또한, 그것의 동의어 Podosphaera xanthii 및 S. cucurbitae로 알려짐)에 의해 및/또는 토마토 흰가루병균(Erysiphe cichoracearum, 또한 그것의 동의어 Golovinomyces cichoracearum로 알려짐)에 의해 및/또는 레베일룰라 타우리카균(Leveillula taurica, 또한 그것의 동의어 Oidiopsis taurica , Erysiphe taurica , Ovulariopsis cynarea, Leveillula solanacearum로 알려짐)에 의해 오이(Cucumis sativus L.)에 발생되는 병균을 말한다..
용어 "QTL"은 본 명세서에서 연속적으로 분포된 (정량적) 표현성 형질의 발현과 관련된 대립형질을 함유하는 (즉, 유전자 또는 조절 서열의 형태의) 염색체 영역의 본-분야에 알려진 의미로 사용된다. 용어 "질병 내성에 대한 QTL"은, 내성을 암호화하는 적어도 하나의 유전자 또는 조절 영역, 즉 내성에 관여되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 염색체의 영역과 관련된 특정 염색체상에 위치하는 영역을 말한다. 내성과 관련된 QTL을 어드레스하기 위해, 더 짧은 동등물: "내성 제공 유전자 자리"가 사용된다. QTL은 하나 이상의 분자적 게놈성 마커를 사용하는 특이 쿠쿠미스 사티부스 접근의 게놈에서의 그들의 유전적 위치를 나타냄으로써 정의될 수 있다. 하나 이상의 마커는, 차례로, 특이 유전자 자리를 표시한다. 유전자 자리들 간의 거리는 보통 동일 염색체 상의 유전자 자리들 간의 교차 빈도로 측정된다.
두 유전자 자리가 더 떨어져 있을수록, 그들 간의 교차는 더 용이하다. 거꾸로 말하면, 두개의 유전자 자리가 가까우면, (이들 간의) 이종교배는 덜 발생할 것이다. 대개, 1 센티모간(Kosambi map function (cM))은 유전자 자리간의 1% 재조합과 거의 동일하다(markers) (Lui, 1997). QTL이 다중 마커로 표시될 수 있으면, 말단-지점 마커들 사이의 유전자 거리는 QTL의 크기를 나타낸다.
용어 "염색체"는 본 명세서에서 세포 DNA를 함유하고 그리고 그 뉴클레오티드에 유전자의 선형 배열을 갖는 세포핵에서 자가-복제 유전자 구조의 아트-인식(art-recognised) 의미로 사용된다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "연결기"는 동일한 염색체에 위치하는 유전자 또는 유전적 형질 모두를 말한다. 연결기 내에서, 서로 충분히 가까운 유전자 자리들은 유전적 이종 교배에서 연결을 나타낸다. 교차의 가능성은 염색체 상의 유전자들 사이의 거리와 함께 증가하므로, 연결기 내에서 서로로부터 위치가 멀리 떨어진 유전자들은 직접적인 유전자 시험에서 어느 검출가능한 연결을 나타내지 않을 것이다. 용어 "연결기"는 염색체 할당이 아직 이루어지지 않은 유전적 시스템에서 연결된 습성을 나타내는 유전적 유전자 자리를 말하는데 주로 사용된다. 그러므로, 본 내용에서, 용어 "연결기"는 염색체(의 물리적 엔티티)와 동의어이다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "대립형질"은 유전자의 하나 이상의 선택적인 형태를 의미하고, 모든 대립형질은 적어도 하나의 형질 또는 특징에서 관련된다. 이배성 세포에서, 주어진 유전자의 2개의 대립형질은 한쌍의 동형 염색체 상의 대응하는 유전자 자리를 점유한다. 본 발명은 QTL, 즉 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 포함하는 유전적 영역에 관련되므로, 몇몇 경우에는 "대립형질" 보다 "하플로형(haplotype)" (즉, 염색체 세그먼트의 대립형질)로 명칭하는 것이 더 정확하다. 그러나, 이들 경우, 용어 "대립형질"은 "하플로형"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"유전자"는 염색체 상의 특정 부위를 점유하고 유기체에서 특정한 특질 또는 형질에 대한 유전적 지시를 함유하는 DNA 서열로 이루어진 유전적 단위로 정의된다
"유전자 자리"는 주어진 종의 염색체에서 주어진 유전자 또는 조절 서열이 점유하는 위치를 말한다.
"동형 재조합"은 동일한 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 쌍을 이루는 염색체의 염색 분체 간 또는 2개의 DNA 분자들 간의 DNA 단편의 교환("교차")을 말한다. "재조합 사상"은 여기서 감수분열 교차를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "분자 마커"는 핵산 서열의 특성의 차이를 가시화하기 위한 방법에 사용되는 표시기를 말한다. 이와 같은 표시기의 예는 제한 단편 길이 다형(RFLP) 마커, 증폭된 단편 길이 다형(AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형 (SNPs), 삽입 돌연변이, 미세 부수체부분 마커 (SSRs), 서열 ㅌ트특성화 증폭 영역(SCARs), 쪼개진 증폭 다형성 서열(CAPS) 마커 또는 이소자임 마커 또는 특이 유전 및 염색체의 위치를 한정하는 것으로 본 명세서에 기재된 마커들의 조합이다. 본 명세서에 정의된 바에 따르면 "QTL에 연결된 분자 마커"는 그러므로 SNP, 삽입 돌연변이 뿐 아니라 더 일반적인 AFLP 마커 또는 본 분야에 사용되는 어느 형태의 마커일 수 있다. 여기에 명명된 AFLP 마커의 컨텍스트에서, 마커는 2개의 AFLP-프라이머에 의해 플랭크된 오이-특이적 DNA 서열을 나타내고, 상기 프라이머는 제한 효소 EcoRI and Msel, (Vos et al., 1995; Bai et al. 2003)의 제한 부위에 대응하는 "코어 프라이머" E 및 M, 이어서 나타낸 바와 같은 2 또는 3개의 여분의 선택 염기로 이루어지고, 각각은 선택적 뉴클레오티드를 동정하는 2-숫자 코드가 이어지고 그것에 의해 "코어 프라이머"가 연장된다(코드에 대해, 표 1 참조). E16/M50-244는 총 길이 244 bp를 갖는 단편을 생성하기 위해 증폭 프라이머 EcoRI + CC 및 Msel + CAT를 사용하여 얻어진 마커를 나타낸다. 단편의 길이는 단편을 검출하는데 사용되는 방법에 의존하고, 그것의 진짜 길이보다 오직 수개의 염 기가 많거나 적은 정도로, 거의 유사하다. 본 명세서에 제공된 마커를 정의하기 위해, 연결지도의 다른 마커에 대한 그 마커의 염색체상의 위치를 언급해야 한다. 그러므로, 마커 E16/M50-244는 그것의 프라이머의 서열에 의해서 뿐 아니라, 증폭산물로서의 그것의 프라이머의 길이에 의해, E14/M59-F-200 및/또는 E23/M38-M003에 대한 위치에 의해, 또는 본 명세서에 제공된 바와 같이, 그리고 표 4의 매트릭스에 cM 단위의 대응 거리로 순서대로 기재된 다른 마커에 대한 상대적 거리로 표시된다. 그러나, 식물들 간의 이종교배는 특정 마커가 손실될 수 있고, 따라서 특정 마커의 부재는 질병에 대한 내성을 제공하는 유전 요소의 존재를 배제하지 않고 마커는 그것에 연결된다고 말하여 진다는 것을 고려해야 한다.
표 1: AFLP 분석물에 일반적으로 적용되고 본 명세서에 사용된 바와 같은 프라이머 연장(Source: Keygene, Wageningen, The Netherlands)
Figure 112008038280193-pct00001
용어 "오이-특이 DNA 서열"은 바람직하기는 QTL-I의 마커, QTL-I 마커에 플랭크된 오이 어세션 PI 250147의 DNA 서열의 일부의 경우, 그것과 가장 큰 유사성을 나타내는 쿠쿠미스 사티부스 종의 게놈 서열과 80% 이상, 바람직하기는 85% 이상, 더욱 바람직하기는 90%이상, 더욱 바람직하기는 95% 이상, 더욱 바람직하기는 97%이상, 가장 바람직하기는 99% 이상의 뉴클레오티드 서열 상동을 갖는 폴리뉴클레오디트 서열을 나타낸다.
용어 "뉴클레오티드 서열 상동"은 본 명세서에 사용된 바에 따르면 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 상동의 존재를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 2개의 서열에서 뉴클레오티드의 서열이 최대 대응을 위해 배열될 때 동일하다면 "상동" 서열을 갖는다. 2개 이상의 폴리뉴클레오디트 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국소적 영역을 동정하고 비교하기 위해 2개 서열의 일부를 비교함으로써 수행된다.
비교창은 일반적으로 약 20 내지 200개의 연속적인 뉴클레오티드이다. 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 or 100 % 서열 상동성과 같은, 뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성 퍼센트"는 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로서 결정되고, 여기서 비교창에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2 서열의 (추가 또는 결실을 포함하지 않는) 최적 배열을 위한 참조 서열과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 (a) 매치된 위치의 수를 얻기 위해 두 서열에서 동일한 핵산 염기가 발생하는 위치의 수를 결정하고; (b) 매치된 위치의 수를 비교 창에서 위치의 총 수로 나누고; 그리고 (c) 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동 퍼센트를 구함으로써 산출된다. 비교를 위한 최적의 서열 배열은 공지의 알고리즘의 수행을 컴퓨터화하여 수행되거나 또는 가시적 관찰에 의해 수행될 수 있다.
쉽게 얻을 수 있는 서열 비교 및 다중 서열 배열 알고리즘은 각각, the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990; Altschul et al, 1997)과 ClustalW programs으로, 둘 다 인터넷 상에서 이용할 수 있다. 다른 적절한 프로그램은 GAP, BestFit, PlotSimilarity, 및 위스콘신 유전 소프트웨어 매키지의 FASTA(Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA) (Devereux et al, 1984)를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바에 따르면 용어 "pm-h"는 배축에서 발현되는 추정의 흰색가루병균을 말하며, 바람직하기는 표 2의 특이 SNP의 서열로 정의된다.
표 2. QTL pm-h로 표시되는 흰색가루병균 내성 표현형과 완전히 관련됨을 나타내는 SNPs
Figure 112008038280193-pct00002
본 명세서에서 사용되는 바에 따르면, 용어 "pm-l"은, 바람직하기는 표 3의 특이적 돌연변이의 존재에 의해 정의되는 바와 같은, 추정의 흰색가루병균 내성 유전자 pm-leaf를 말한다.
표 3. QTL pm-l로 표시되는 흰색가루병균 내성 표현형과 완전히 관련됨을 나타내는 돌연변이.
Figure 112008038280193-pct00003
용어 "QTL-I"은 WO 02/22836에 더욱 상세히 기재된 마커 E16/M50-244, E16/M50-188, 및/또는 E11/M48- 251에 의해 정의되는 바와 같이 클로스테로바이러스 내성에 연결된 게놈성 영역을 말한다.
용어 "자손" 식물은 식물의 자식 또는 하나 이상의 부모 식물로부터의 유성생식으로 생겨난 어느 식물 또는 그것의 후손을 말한다. 예를 들면, 자손 식물은 부모식물의 클로닝 또는 자가생식에 의해, 또는 두 부모 식물의 이종교배에 의해 얻어질 수 있고 F1 또는 F2 또는 추가의 발생과 같은 자가생식을 포함한다. Fl 은 부모 중 적어도 하나는 처음에 형질 공여자(donor)로 사용되는 부모로부터 생성된 제1-세대 자손이고, 반면 제2 세대 자손(F2) 또는 이후 세대(F3, F4, etc.)는 Fl's, F2's 등의 자식으로부터 생성되는 시편이다. 그러므로 Fl은 2개의 진정한 양육 부모로부터의 혼성일 수 있고(주로 혼성이고), 반면 F2는 상기 F1 혼성의 자가-수분으로부터의 자손(주로 자손)일 수 있다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "이형접합체"는 다른 대립형질이 동형 염색체상의 상응하는 유전자 자리에 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "동형접합체"는 동일한 대립형질이 동형 염색체상의 상응하는 유전자 자리에 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
식물 양육의 컨텍스트에서 용어 "혼성화"는 다른 계 또는 품종 또는 종의 부모의 이종교배에 의해 생산된 유전적을 다른 부모의 자손인 식물을 말하고, 두 동종교배 계들 간의 이종교배를 포함하지만, 이것을 제한되는 것은 아니다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "동종교배"는 실질적으로 동형접합체 개인 또는 계를 말한다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "유전질 침투", " 유전질 침투된" 그리고 "유전질침투하는"은 그것에 의해 하나의 종, 변종 또는 재배변종 식물의 게놈 영역이 이들 종들의 이종교배에 의해 또 다른 종, 변종 또는 재배변종 식물의 게놈으로 이동하는 천연 및 인공적 공정 모두를 말한다. 이 공정은 임의로 순환 부모로의 역교배에 의해 완전해질 수 있다.
"유전공학" "변형" 및 "유전적 변경"은 모두 여기서 단리되고 암호화된 유전자의 DNA, 보통은 다른 기관의 염색체 DNA 또는 게놈으로의 트랜스퍼와 동의어로 사용된다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "개체군"는 일반적인 유전적 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 이형적인 수집물을 의미한다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "변종" 또는 "재배 변종 식물"은 동일 종 내에서 구조 또는 유전적 특성 및/또는 성능에 의해 다른 변종과 구별될 수 있는 유사 식물의 군을 의미한다.
용어 "내성의" 및 "내성"은 감염에 대한 부분적인 그리고 완전한 내성 모두를 의미한다. 병에 걸리기 쉬운 식물은 감염에 대해 내성이 없거나 또는 내성 수준이 낮을 수 있다. 용어는 "완전 내성", "면역성", "중간의 내성", "부분적 내성" "과민성" 및 "항독성"과 같은 내성의 개별적으로 동정가능한 형태를 포함한다.
"완전 내성"은 감염 후 질병에 걸리는 것이 완전히 실패하는 것을 말하고, 질병이 세포에 침입하는 것이 실패한 결과이거나(초기 감염 없음) 세포에서 번식하고 이후 세포를 감염시키는 힘의 실패의 결과(잠재적 감염 없음, 확산 없음)일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "감염되기 쉬운"은 식물이 질병에 의해 공격받은 결과 질병에 대한 내성을 갖지 않은 식물을 말하는데 사용된다. 그러므로, 용어 "감염되기 쉬운"은 "비-내성"과 동의어이다.
핵산 컨텍스트에서 용어 "혼성"은 이중-가닥 핵산 분자, 또는 상보적 뉴클레오티드 염기들 간의 수소 결합에 의해 형성된 복식(duplex)을 말한다. 용어 "혼성화" 또는 "풀림(anneal)"은 상보적 염기들 간의 수소화 결합을 통해 핵산 서열의 단일 가닥이 이중-나선 분획을 형성하는 과정을 말한다.
용어 "프로브"는 표적 핵산 서열 피분석물 또는 그것의 cDNA 유도체에서 상보적 서열과 수소-결합된 복식을 형성하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 DNA 폴리머라제가 공격할 수 있도록 증폭 표적으로 어닐링될 수 있고, 그것에 의해 프라이머 연장 산물의 합성이이 유도되는 조건에 놓일 때, 즉 뉴클레오디드 및 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머화제의 존재하에, 그리고 적합한 온도 및 pH에서, DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오디드를 말한다.
(증폭) 프라이머는 바람직하기는 증폭에서 최대 효율을 위해 단일 가닥이다. 바람직하기는, 프라이머는 올리고테옥시리보뉴클레오디드이다. 프라이머는 폴리머화용 약제의 존재시 연장 산물의 합성을 프라임하기에 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 조성(A/T en G/C 함량)을 포함하여, 여러 인자에 의존할 것이다. 한 쌍의 이-방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 분야에 일반적으로 사용되는 바와 같이 하나의 전방 및 하나의 역 프라이머로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "프라이머"는, 특히 증폭될 표적 영역의 터미날 서열(들)의 리딩 정보에 약간의 모호함이 있는 경우, 하나 이상의 프라이머를 말한다. 그러므로, "프라이머"는 서열에서 가능한 변형을 나타내는 서열을 함유하는 프라이머 올리고 뉴클레오디드의 수집물 또는 통상의 염기쌍을 허용하는 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 어느 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 특이 서열의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있고, 예를 들면, 적당한 서열의 클로닝 및 제한, 그리고 직접적인 화학적 합성을 포함한다. 화학적 합성법은 예를 들면, 포스포 디- 또는 트리-에스테스법, 디에틸포스포르아미데이트법 및 예를 들면, U.S. Pat. No. 4,458,066에 기재된 고체 담체법을 포함할 수 있다. 프라이머는 필요에 따라, 분광, 형광, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 수단들을 병합함에 의해 라벨될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)의 주형-의존 연장은 적절한 염, 금속 양이온, 및 pH 완충 시스템의로 구성된 반응 매질에서, 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트((dATP, dGTP, dCTP and dTTP, 즉. dNTPs) 또는 동등물의 충분한 양의 존재하에 폴리머화 약제에 의해 촉매화될 수 있다. 적절한 폴리머화제는 프라이머- 및 주형-의존 DNA 합성을 촉매하는 것으로 알려진 효소이다. 공지의 DNA 폴리머라제는, 예를 들면, E. coli DNA 폴리머라제 I 또는 그것의 Klenow 단편, T4 DNA 폴리머라제, 및 Taq DNA 폴리머라제를 포함한다. DNA 합성을 이들 DNA 폴리머라제 로 촉매화하기 위한 반응 조건은 본 분야에 알려져 있다. 합성 산물은 주형 가닥과 프라이머 연장 가닥으로 이루어진 복식 분자로, 표적 서열을 포함한다. 이들 산물은, 차례로, 또 다른 복제 라운드에서의 주형으로 작용한다. 복재의 두번째 라운드에서, 첫번째 순환의 프라이머 연장 가닥은 그것의 상보적 프라이머로 어닐링된다; 합성은 프라이머 서열 또는 그것의 보체에 의해 5'- 및 3'-말단 모두에 결합된 "짧은" 산물을 생산한다. 변성, 프라이머 어닐링, 및 연장의 반복된 순환은 프라이머에 의해 정의된 표적 영역의 지수적 축적을 가져온다. 핵산의 표적 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 원하는 양을 얻기 위해 충분한 순환이 이루어진다. 원하는 양은 변할 수 있고, 이것은 산물 폴리뉴클레오티드가 사용되는 기능에 의해 결정된다. PCR법은 핸드북에 잘 기재되어 있고 당업자들에게 알려져 있다. PCR에 의한 증폭 후, 표적 폴리뉴클레오티드는 혼성화 및 세척 조건을 적절히 엄격하게 하기 위한 엄격한 조건하에서 표적 서열의 것과 안정한 혼성을 형성하는 프로브 폴리뉴클레오티드와 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 프로브가 표적 서열에 대해 본질적으로완전히 상보적(즉, 약 99% 이상)일 것으로 기대된다면, 엄격한 조건이 사용될 것이다. 약간의 미스매칭이 예상된다면, 예를 들면, 변이 균주는 프로브가 완전히 상보적이 아닌 결과를 예상할 것이고, 혼성화의 엄격성은 느슨할 것이다. 그러나, 조건은 비특이적/우연한 결합을 배제하여 선택된다. 혼성화에 영향을 미치고, 비특이적 결합 대해 선택하는 조건이 본 분야에, 예를 들면 Sambrook 및 Russell, 2001에 기재되어 있다. 일반적으로, 염 농도가 낮고 온도가 높을수록, 혼성화 조건의 엄격성이 증가한다.
"엄격한 혼성화 조건"은 폴리뉴클레오티드가 그것의 표적 서열에, 통상적으로 핵산의 복합체 혼합물에서, 그러나 본질적으로 다른 서열이 없이 혼성화되는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경에서는 다를 것이다.
서열이 길수록 특이적으로 높은 온도에서 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 Tijssen, 1993에서 발견되었다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특이 서열에 대한 열적 녹는점(Tm)보다 약 5~100℃ 낮도록 선택된다. Tm은 (정해진 이온강도, pH, 및 핵산 농도에서) 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화되는 온도(표적 서열이 과량으로 존재하고, Tm에서 프로브의 50%는 평형에 있다)이다. 엄격한 조건은 염농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 나트륨 이온농도 미만, 통상적으로 약 0.01~1.0M 나트륨 이온농도이고 온도는 짧은 프로브(예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오디트)에 대해 약 300℃ 미만이고 긴 프로브(예를 들면, 50 뉴클레오티드 초과)에 대해 약 600℃인 조건이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가에 의해서도 달성될 수 있다. 선택적인 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 적어도 배경의 2배일 수 있고, 바람직하기는 배경 혼성화의 10배이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 종종: 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 420℃에서 배양, 또는 5×SSC, 1% SDS, 650℃에서 배양, 0.2×SSC 및 0.1% SDS 65℃에서 세척을 포함한다. PCR을 위해, 약 360℃의 온도는 낮은 엄격한 증폭에 통상적이고, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 320℃ 및 48℃ 사이에서 변할 수 있다. 혼성화 계수를 결정하기 위한 추가의 지침은 여러 참조에서 제공된다(예를 들면, Ausubel, et al. 1999).
바람직한 구현예의 설명
이중 내성 식물의 생산
농업 및 원예에서 육종 프로그램의 목적은 그들의 유전적 조성물을 개선함에 의해 식물의 성능을 강화하는 것이다. 본질적으로, 이 개선은 관심물의 성능 특성에 영향을 미치는 유전자에 대하여 가장 유리한 대립형질의 빈도를 증가시킴에 의해 이루어진다. 야생 식물계는 유전적 그리고 표현형 변이의 풍부한 공급원을 제공한다. 통상적으로, 농업 또는 원예의 실행은 원하는 유전형 또는 잠재적 표현형 특성을 갖도록 야생 식물계 또는 그것의 자손을 선택하고, 이것을 추가의 원하는 유전형 또는 잠재적 표현형 특성을 갖는 계와 이종교배시키고, 그리고 자손 식물체 중에서 원하는 유전형 또는 잠재형 표현형 특성(의 증가된 빈도)를 나타내는 이들 식물체를 선택하는 것에 의해 이 돌연변이를 사용한다. 분자 유전 기술과 결합하여 멘델의 유전법칙의 증가된 이해 및 이용은 지난 세기 중 이 선택 과정을 용이하게 하였다. 예를 들면, 원하는 유전형 또는 잠재적 표현형 특성을 갖도록 식물체를 선택하는 방법은 정량적 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 대해, 즉 연속적으로 분포된(정량적인) 표현형 형질의 발현과 관련된 대립형질을 함유하는 염색 영역의 존재에 대해 상기 식물체를 실험하는 것을 기재로 이용가능하다. 보통 QTL은 표현형 형질에서 정량적인 변화와 통계적으로 연관되고 본질적으로 유전자와 동의어인 하나 이상의 마커에 의해 특징된다. QTL 매핑은 관심의 형질의 발현을 수행하는 후보자 유전자 자리를 동정하게 한다. 식물체 육종에서, 이것은 마커-관련 선택(MAS), 즉 이들 식물체에서 QTL 관련 마커의 검출에 의해 원하는 대립형질을 갖는 식물체의 선택을 가능하게 한다.
재배된 식물체의 육종 프로그램에서 주요 문제 중 하나는 개별적인 형질간의 부정적 유전적 관련의 존재이다. 이것은 예를 들면, 번식 용량과 여러 질병-내성 식물계의 생산간의 부정적 유전적 관련을 갖는 경우이다. 하나의 식물체의 게놈에서 다른 것으로의 DNA의 유전질 침투는 번식 형질의 발현을 간섭하거나 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타냄을 이해하여야 한다. 한편, 하나의 식물체에서 다른 것으로의 내성-제공 유전자 서열의 유전질 침투에 대한 시도는 수용 세포계에 이미 존재하는 내성 형질을 제거할 수 있다.
여러 형질의 유전에 대한 지식은 예를 들면 질병 내성과 관련된 QTL에 대한 동형계의 선택을 허용한다. 육종 프로그램에서 유전적 기원 및 원하는 형질의 위치에 대한 지식을 사용하는 것은 종래의 육종 프로그램과 비교하여 예상된 육종 산물의 정확도를 증가시키고 선택 속도를 빠르게 할 것이다. 예를 들면, 원하는 형질의 유전적 근거는 물려줄 수 있게 연결되어 자손들 중 2개의 형질에 대한 균일성을 증가시키도록 돕는데, 이것은 원하는 대립형질에 대한 부모 동형은 자손에서 감소된 차별로서 나타나는 대부분의 자손에게서는 없어질 것이기 때문이다.
상기와 같이, 본 발명자들은 클로스테로바이러스와 흰가루병균병 모두에 내성인 식물체를 발견하였다. 이와 같은 식물체는 지금까지 알려지지 않았다.
클로스테로바이러스 내성계로부터 이미 흰가루병균 내성 식물계로, 또는 반대로 DNA를 유전질 침투시키려는 시도는 지금까지 성공하지 못하였다.
더우기, 본 발명자들은 이중 내성 식물체에서, 클로스테로바이러스와 흰가루 병균에 대한 내성을 갖는 유전자는 매우 밀접하게 연결되어 이들은 실제로 단일 유니트와 같이 공동-유전된다는 것을 발견하였다. 이와 같은 밀접하게 연결된 유전자들 간의 유전적 배열은 때때로 커플링 상(시스)인 대립형질(유전자)로 언급된다. 이와 같은 경우, 이것은 일반적으로 유전자가 단일 유전자에 존재한다고 받아들여진다. 사실, 단일 염색체 상의 유전자 또는 QTL의 존재를 참조한다면, 이것은 이들이 커플링 상임을 의미한다.
본 발명자들은 이중 내성 식물체에서, 클로스테로바이러스와 흰가루병균에 대한 내성 유전자가 연결기 4에 존재한다는 것을 발견하였다.
Horejsi et al. (2000)에 따르면, 쿠쿠미스 사티부스 L의 연결기 4는 또한 노균병(dm) 내성에 대한 내성을 위한 유전자를 포함한다. LG 4는 추가로 이어지는 RFLP 마커의 하나 또는 조합에 의해 특징된다(the Software package INTMAP, Keygene, Wageningen, The Netherlands에 의해 결정; 괄호 안에 cM 단위의 맵 위치): CsC032a/El (25.9); CsP357/H3 (31.7); CsC588/H3 (34.2); CsC477H3 (35.3); CsC694/E5 (38.5); CsP347/H3 (38.5); CsC365/El (41); CsC386/El (41); CsC230/El (41.7); CsP064/El (45.5).
결정적인 염색체 수는 클로스테로바이러스 내성에 대한 QTL1과 흰가루병균에 대한 pm-l 및 pm-h가 위치하는 오이 염색체에 아직 할당되지 않았다. 그러나, 염색체는 이들과 다른 유전 영역이 위치하는 연결기(LG 4)를 참조로 설계되었다. 용어 "연결기"는 본 명세서에서 내성-제공 대립형질이 위치하는 물리적 게놈 단위를 말하고, 이것은 염색체와 동일한 계급 수준을 갖는다.
클로스테로바이러스 en pm 내성에 대한 유전자가 단일 염색체 상에 있다는 발견의 영향은 이중적이다.
우선, 이것은 이들은 후손 식물에 함께 전해질 것이므로, 단일 염색체 상에, 더욱 바람직하기는 하나의 작은 연속한 염색체 분획상에 위치된 유전자를 갖고자 하는 육종 목적에 매우 유리하다. 흰가루병-내성에 대한 책임이 있는 유전자와 클로스테로바이러스-내성에 대한 책임이 있는 유전자들 간의 물리적 연결 결과에 따라, 본 발명의 이중 내성 식물체가 부모 식물체로 사용되는 이종교배의 자손 식물체는 자손 식물체에서 분리의 빈도가 낮다.
두번째, 이 지식은 왜 2개의 형질이 단일 식물체계에 결합하는 것이 어려운가에 대해 가능한 설명을 제공하기 때문에 식물체 육종을 도울 수 있다. 이론에 얽매임을 원함 없이, 클로스테로바이러스 내성에 책임이 있는 QTL의 특정 위치와 그 QTL에 대한 선택이 원하는 유전질 침투의 형성을 막거나 최소한 약간의 원하는 유전질 침투가 일어나도록 허용한다고 믿어진다.
흰가루병 내성과 관련된 QTLs 및 클로스테로바이러스 내성을 위한 QTL은 이와같이 밀접한 위치에 놓여있고, 제2 내성 형질(예를 들면 클로스테로바이러스)에 대한 QTL의 이미 제1 내성(예를 들면, 흰가루병)을 갖는 식물체계로의 유전질 침투는 제1 내성 형질의 (부분적) 손실을 가져올 수 있었다. 식물계가 흰가루병균(pm-l and pm-h)에 대한 둘 다의 QTL을 갖는 경우, 클로스테로바이러스 내성에 대한 QTL의 유전질 침투는, 흰가루병균 내성에 대한 잠재적인 유전적 정보에 대한 "손상"없이, 오직 게놈의 매우 작은 부위에서만 발생할 수 있다.
그러므로, 여러 내성 유전자가 단일 염색체에 위치한다는 발견과 달리, 두개의 흰가루병균 내성 대립형질이 이중 내성 식물체에 존재하고, 클로스테로바이러스 내성관련 QTL(QTL-I) 은 PM 내성(pm-h and pm-l)과 관련된 두개의 QTL 사이에 놓여있다는 것을 발견하였다. 이 발견은 적어도 부분적으로 원하는 유전형으로의 재조합의 낮은 빈도를 더욱 설명할 것이다. 또한, 이것은 그들의 생산을 위한 여러 재생법을 허용하는, 이와 같은 식물체가 존재할 수 있는 적어도 3가지 시나리오를 전재조건으로 한다.
첫번째 방법은 관심의 제1계의 식물체로부터 클로스테로바이러스 내성-제공 유전자 자리(이하 QTL-I로 정의)를 2개의 PM-내성 제공 유전자 자리 pm-h and pm-l을 소유하는 관심의 제2계의 흰가루병균으로 유전질 침투하는 것을 포함한다. 이것이 관심의 제2계의 유전적 배경을 가져온다면, 상기 방법은 관심의 제2계의 유전적 배경을 갖는 자손 식물체에서 배열 pm-l - QTL-I -pm-h을 갖는 게놈 DNA 서열 조립체를 갖도록, 2개의 PM-내성-제공 유전자자리 pm-h 및 pm-l 사이의 게놈 영역으로 QTL-I의 유전질 침투를 포함할 것이다(도 1 참조). 이것을 근거로, 단일 염색체의 특이 영역에서 오직 이중 동형 재조합 사상(즉, 각 교차에 대해 하나의 사상)이 관심의 제2계의 유전적 배경에서 클로스테로바이러스와 PM 내성 모두에 대한 이중 내성 표현형을 가져올 수 있다. 자손 식물체에서 적합한 유전질 침투의 확립은 QTL-I, pm-1 및 pm-h 특이 마커를 사용함에 의해 모니터될 수 있다.
두번째 방법에서, 다른 유전적 배경에, 예를 들면 관심의 제1계에 내성 형질을 결합하고자 할 수 있다. 이와 같은 방법은 관심의 제2계의 식물체로부터 pm-내 성-제공 유전자 자리 pm-h 및 pm-l 모두를 QTL-I 유전자 자리를 소유하는 관심의 제1계의 클로스테로바이러스 내성 식물체로 유전질 침투를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 관심의 제2계의 유전적 배경을 갖는 자손 식물체에 배열 pm-l -WTL-I - pm-h를 갖는 게놈성 DNA 서열 조립체를 갖도록, QTL-I 유전자 자리의 어느 한 측면에 독립적으로 두개의 pm-h 및 pm-l 유전자 자리의 침투를 포함할 것이다(도 2 참조). 이 배열을 기준으로, 단일 염색체의 특이 영역에서 적어도 2개의 이중 동형 재조합 사상(즉, 4개의 교차 사상)이, 클로스테로바이러스와 PM 내성 모두의 이중 내성 표현형을 가져오는데 요구된다는 것이 예상된다. 즉, 자손 식물체에서 적합한 유전질 침투의 확립은 QTL-I, pm-l 및 pm-h 특이 마커의 사용에 의해 모니터될 수 있다.
상기는 예를 들면, 야생 상속에서 예를 들면, PM 내성 시판 오이계로의 야생 CYSDV 내성의 유전질 침투가 매우 드문 사상인지를 설명할 것이다. 이것은 또한 예를 들면 야생 상속에서 예를 들면 클로스테로바이러스-내성 시판 오이계로의 PM 내성 유전자 자리 모두가 거의 드문 사상인지를 또한 설명할 것이다.
재조합은 감수분열 동안 2개의 동형 염색체들 간의 정보 교환이다. 재조합 식물체에서, 염색체 내의 특이 위치에 원래 존재하는 DNA는 다른 식물체의 DNA로 교환된다(즉, 부모의 모성 또는 그 반대로). 이중 재조합에서, 이 교환은 두번, 즉 유전자/유전자 자리의 두 측면에서 발생한다. 오직 원하는 재료만을 교환하고, 그리고 가능한 한 많은 염색체 상의 가치있는 원래의 정보를 유지하기 위해, 발생하는 4개의 교차 사상이 요구될 것이다(상기 참조). 이와 같은 이중 재조합을 발견하 는 일반적인 방법은 F2-식물체의 개체를 스크린하는 것이다. 이 개체는 드문 (빈도가 낮은) 이중 재조합을 검출하기 위해 충분한 크기여야 한다. 이중 재조합의 빈도는 단일 재조합의 빈도들의 곱이다. 예를 들면, 10 cM 면적에서의 재조합은 10%의 빈도로 발견될 수 있고, 이중 재조합은 10% x 10% = 1 %의 빈도로 발견될 수 있다 (1 센티모간은 시험교차에서 1% 재조합 소산으로 정의된다).
낮은 빈도에 관한 이 문제를 극복하기 위한 한 방법은, "변형 재조합"을 수행하는 것이다. 기본적으로 이것은 2개의 재조합 사상이 2개의 다른 식물체에서 개별적으로 일어나도록 허용되고, 그 후 재조합 사상은 단순한 교차 및 생성된 F2의 선택에 의해 하나의 식물체에 결합된다는 것을 의미한다. 이것은 스크린되어질 식물체의 수의 감소를 가져온다.
그러므로, 이중 내성 식물체를 생산하기 위한 제3의 방법은 배치 pm-l - QTL-1 또는 QTL-1 -pm-h를 갖는 게놈성 DNA 서열 조립체를 얻기 위해 관심의 제1계로부터 2개의 PM-내성-제공 유전자 자리 pm-h 또는 pm-l 중 하나를 QTL-I 유전자 자리를 소유하는 제2계의 클로스테로바이러스 내성 식물체로 유전질 침투하고, 그리고 배열 QTL-1 -pm-h 또는 pm-l-QTL-I를 갖는 게놈성 DNA 서열 조립체를 얻기 위해 관심의 제3계로부터 2개의 PM-내성-제공 유전자 자리 pm-h 또는 pm-l의 나머지를 QTL-I 유전자 자리를 소유하는 관심의 제2계의 또 다른 클로스테로바이러스 내성 식물체에 유전질 침투하는 것을 포함할 것이다(도 3 참조). 이어서, 각각의 개별적인 재조합체로부터 유전질 침투를 포함하는 후손 식물체가 교차되어 배열 pm-l-QTL-I-pm-h를 갖는 게놈성 DNA 서열 조립체를 가져온다(도 3 참조). 즉, 여러 후 손 식물체에서 적합한 유전질 침투의 확립은 추가의 교차를 위해 선택된 식물체를 기준으로 QTL-I, pm-l 및 pm-h 특이 마커를 사용하여 모니터될 수 있다. 다른 방법은 도 4~6으로부터 당업자에 의해 유도될 수 있다.
스크린될 식물체의 수를 제한하는 방법은 예를 들면 다음과 같이 수행된다: 하나는 PM-내성 대립형질을 둘 다 포함하고(pm-l 및 pm-h) 그리고 하나는 QTL 내성 대립형질 QTL-T를 포함하는 두개의 개체를 이종교배시킴. pm-대립형질 중 하나와 QTL-I 사이의 1 이종교배를 갖는 식물체의 선택은 다음과 같다: 두 pm 대립형질의 두 말단점 사이의 유전적 거리가 10cM이면 QTLl은 중간(따라서 QTLl과 pm-l 또는 pm-h 중 어느 하나 사이는 5cM)이고, 그러므로 QTLl과 둘 중 하나 pm-유전자 자리 간의 재조합은 5%의 빈도로 일어난다. 그러므로, 이종교배의 자손 식물체의 첫번째 스크린 200은 그것의 10은 재조합 타입 A이고 10은 재조합 타입 B이다. 이와 같이 동정된 재조합체를 자가생식하고, QTL-I과 pm-유전자 자리 둘 다에 플랭크되는 마커를 작업하여 동형접합체에 대한 자손의 식물체를 10 스크린한다. 동형접합체 A x B (lOA'을 10 B'와 이종교배)사이의 10 이종교배를 실시하고 생성된 F2's를 1 이중 재조합을 찾도록 10 식물체를 스크린한다.
마지막에, 이것은 10 독립적인 이중 재조합을 전달한다. 그리고 나서 많은 식물체를 총 500까지 스크린하고, 통상의 방법에서, 이것은 10 독립적인 이중 재조합체에서의 4000 식물의 스크리닝을 요구한다(QTL-I와 어느 pm-locus 사이의 거리는 5cM, 이중 재조합의 빈도는 0.05 x 0.05 = 0.25 %).
이제 본 발명은 마커 도움 선택(MAS)을 위한 더 나은 모델을 제공한다. 그러 므로, 본 발명은 식물 육종법 및 식물체 선택법, 특히 오이 식물체, 특히 육종 프로그램에 사용하기 위한 육종 식물체로서의 배양된 오이 식물체 또는 원하는 유전형 또는 잠재적 표현형 특성을 갖기 위한 배양된 오이 식물체 선택법에 관한 것이고, 특히 상업적으로 가치있는 식물체로 언급되는 가치있는 오이 열매를 생산하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서, 배양된 식물체는 특별히 선택된 또는 원하는 유전형 또는 잠재적 표현형 특성을 갖도록 농업 또는 원예에서 특별히 선택된 식물, 특히 근친교배에 의해 얻어진 식물로부터 유래된 것으로 정의된다.
본 발명의 이중 내성 식물체는 예를 들면, 유전형 AABBcc, AABbcc, AaBBcc 또는 AaBbcc를 가질 수 있고, 여기서 "A" 는 영역 pm-l 유전자자리를 기준으로 하는 내성 유전형이고, "a"는 그것의 상응하는 비-내성 대립형질이고; "B"는 QTL-I 유전자 자리를 기준으로 하는 내성 유전형이고, 그리고 "b"는 그것의 상응하는 감염되기 쉬운 대립형질이고; 그리고 "c" 는 열성의 pm-h 유전자 자리를 기준으로 하는 내성 유전형이다. 그러므로, 본 발명의 이중 내성 식물체는 동형접합체 뿐 아니라 혼성 식물체 둘 다를 포함한다. 이들 유전형들은 다음의 이종교배를 생산함에 의해 얻어질 수 있다 (부모 생식체의 유전형): ABc x ABc; ABc x Abe; ABc x aBc; ABc x abc, 및 Abe x aBc. 그러므로, 생식체 abc를 생산하는 식물체(이 식물체는 pm-h를 제외하고는 비-내성이다)는 본 발명의 이중-내성 (혼성) 식물체을 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 이중 내성 식물체는 내성 대립형질에 대해 근친 교배된 식물체, 동형 접합체이다.
pm-h 유전자 자리는 열성 유전자자리이므로, 이것은 (통상의 육종에서와 같 이) F1 또는 BC1에서 감염되기 쉬운 부모가 F1/BC1을 생산하는데 사용되는지를 생검을 사용함에 의해 모니터할 수 없다. 그러므로, 자손 식물체에서 적합한 유전질 침투의 확립이 본 명세서에 제공된 바와 같이 QTL-특이 마커를 사용함에 의해 모니터될 수 있다는 것이 특히 유리하다. MAS 또는 MAB 법을 사용함에 의해, 당업자는 식물체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 오이 클로스테로바이러스와 오이 흰가루분말에 대한 내성을 나타내는 종 쿠쿠미스 사티부스의 식물체를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 식물체에서 여기에 정의된 바와 같은 QTL-I의 존재, 그리고 적어도 본 명세서에 정의된 바와 같은 QTL pm-l과 pm-h 중 적어도 하나의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 이와같은 식물체를 선택하기 위한 바람직한 방법에서, 상기 방법은: a) 오이 식물체로부터 게놈성 DNA의 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 게놈성 DNA 샘플에서 QTL-I, pm-l 및 pm-h로 이루어진 군으로부터 선택된 QTK에 연결된 적어도 하나의 분자 마커를 검출하고, 더욱 바람직하기는 상기 군으로부터 적어도 2개의 분자마커를 검출하는 단계를 포함하고 여기서 하나의 마커는 클로스테로바이러스를 검출하고 다른 하나는 흰가루병균을 검출한다.
오이 식물체로부터 게놈성 DNA의 샘플을 제공하는 단계는 본 분야에 잘 알려진 표준 DNA 단리법으로 수행될 수 있다.
분자 마커를 검출하는 단계(단계 b)는 바람직한 구현예에서, 이후 QTL에 대한 적합한 마커로 증명된 증폭 산물을 생산하는 AFLP 방법에 사용되는 이-지향성 프라이머의 세트의 사용을 포함한다. 이와 같은 프라이머 세트는 여기서 AFLP 마커 또는 마커-특이 프라이머를 한정하는 프라이머로 언급된다. 이-지향성은 프라이머의 방향이 핵산의 증폭 반응에서 하나는 전방 프라이머로 하나는 역 프라이머로 작용하는 것을 의미한다.
선택적으로, 또 다른 바람직한 구현예에서, 분자 마커를 검출하는 단계(단계 b)는 상기 분자 마커를 정의하는 핵산 서열에 실질적으로 상보적이고 핵산이 상기 분자 마커를 한정하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 특이적으로 혼성화하는 염기 서열을 갖는 핵산 프로브의 사용을 포함한다. 적절한 핵산 프로브는 예를 들면 마커에 상응하는 증폭 산물의 단일 가닥일 수 있다.
분자 마커를 검출하는 단계(단계 b)는 또한 하나 이상의 QTL을 검출하기 위해 상기 게놈성 DNA 상에 핵산 증폭반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 마커-특이 프라이머의 세트를 사용하는 PCR 반응을 수행함에 의해 적당히 행해질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 단계 b)는 상기 QTL에 대한 AFLP 마커를 한정하는 적어도 하나의 프라이머 세트, 또는 엄격한 조건하에서 상기 QTL에 대한 AFLP 마커의 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하는 프라이머의 세트의 사용을 포함한다.
단계 d)의 추정된 길이 또는 추정된 핵산 서열을 갖는 증폭된 DNA 단편을 검출하는 단계는
바람직하기는 증폭된 DNA 단편이, 마커가 처음 검출된 식물체의 DNA를 갖는 동일한 프라이머 또는, 상기 마커가 처음 검출된 식물체에서 QTL과 관련된 마커의 서열을 기준으로 예상되는 서열에 상응하는(80% 이상, 바람직하기는 90% 이상, 더 욱 바람직하기는 95% 이상, 더욱 바람직하기는 97% 이상, 가장 바람직하기는 99%이상의 상동성을 갖는) 핵산 서열과 유사한 반응을 기준으로 예상되는 길이에 상응하는 길이(수개의 염기 범위, 즉 하나, 둘 또는 세 개의 염기의 길이)를 갖도록 수행된다. 당업자는 그 마커들이 감염되기 쉬운 부모(들) (소위 트란스-마커)에 존재하는 반면, 내성 식물체에 부재하는 마커들이, 비록 특정 형질의 존재를 검출하는데 마커의 부재를 시험하는 것이 최적을 아닐지라도, 또한 자손 식물체 중에서 내성을 검출하기 위한 조사에 유용하다는 것을 이해할 것이다.
예상되는 길이 또는 예상되는 핵산 서열을 갖는 증폭된 DAN 단편을 검출하는 단계는 표준 겔-전기영동 기술에 의해 또는 자동화된 DNA 서열화기를 사용함에 의해 수행될 수 있다. 이 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으므로 본 명세서에서 기재할 필요는 없다.
식물체에서 단일 염색체 상의 2개의 QTL을 검출하기 위해, 염색체 염색법이 또한 사용된다. 이와 같은 방법에서, 적어도 제1 QTL과 적어도 제2 QTL이 인시츄 혼성화 또는 인시츄 PCR 기술에 의해 동일 염색체에서 검출될 수 있다. 이와 같은 기술은 또한 상기 염색체상의 pm-l 및 pm-h 에 대한 QTL-I의 위치를 어세스하는데 사용될 수 있고 본 분야에 알려져 있다(예를 들면, vide Jiang et al., 1995). 더욱 편리하기는, 두 개의 QTL이 단일 염색체 상에 존재한다는 사실은 그들이 커플링 상으로 존재하는 것을 측정함으로써 확인될 수 있다. 즉, 형질은 개별 염색체 상에 존재하는 유전자와 비교하였을 때 감소된 분리를 나타낸다.
분자 마커와 QTL
분자 마커는 핵산 서열의 차이를 가시화하는데 사용된다. 이 가시화는 제한 효소(RFLP)로 소화 후 DNA-DNA 혼성화 기술로 인해 및/또는 폴리머라제 사슬 반응을 이용한 기술(예를 들면, STS, microsatellites, AFLP)로 인해 가능하다. 두 부모 유전자형들 간의 모든 차이는 이들 부모 유전자형의 이종교배를 근거로 매핑 개체군(예를 들면, BC1, F2; 도 2 참조)을 분리한다. 다른 마커들의 분리를 비교할 수 있고 재조합 빈도를 산출할 수 있다. 다른 염색체 상의 분자 마커들의 재조합 빈도는 일반적으로 50%이다. 동일한 염색체 상에 위치하는 분자 마커들 간의 재조합 빈도는 마커들 간의 거리에 의존한다. 낮은 재조합 빈도는 염색체 상의 마커들 간의 낮은 유전적 거리에 상응한다. 모든 재조합 빈도를 비교하는 것은 염색체 상의 분자 마커의 가장 논리적인 순서를 가져올 것이다. 이 가장 논리적인 순서는 연기 맵에 표현될 수 있다(Paterson, 1996). 질병에 대한 내성, 예를 들면, 질병 약제와 감염성 접촉 후 질병을 얻는 감소된 발병 및/또는 감염의 확립 후 감소된 병변 성장률에 대한의 증가된 수준과 관련된 연결 맵 상의 주변의 또는 연속적인 마커의 군은 상기 질병에 대한 내성과 관련된 QTL의 위치를 정확히 나타낸다.
본 명세서에서 동정된 마커들은 이제 설명되는 바와 같이, 본 발명의 여러 면에서 사용될 수 있다. 본 발명의 면은 여기서 동정된 마커의 사용으로 제한되지 않는다. 본 면이 마커를 사용할 수 있다는 점은 본 명세서에 명확하게 기재되지 않거나 아직 확인되지 않았다는 점을 강조한다. 유전적 단위 "유전자" 이외에, 표현형 발현은 예측될 수 없는 많은 인자에 따르고, 유전적 단위 "QTL"은 표현형의 정 량화가능한 형질에 직접 관여하는 게놈상의 영역을 말한다. 그러므로, 본질적으로 게놈이 식물체 육종과 관련이 없거나 또는 거의 없을 때, QTL은 직접적으로 식물 육종에 적용할 수 있다. 본 발명자들은 본 명세서에 정의된 바와 같은 오이에서의 클로스테로바이러스-내성 및 흰가루병균-내성에 대한 QTL이 자손 식물체의 게놈에서 서로에 대해 특이적 구성을 가져야 한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 다른 QTL에 속하는 일련의 연속적인 게놈성 마커의 존재가 두 표현형 내성 형질 존재에 관련되고 이들은 게놈성 조직이 멘델의 일반 유전법칙에 따라 상속될 수 있다는 것을 나타낸다는 관찰을 근거로 이 발명을 완성하였다.
여기서 동정된 바와 같은 QTL은 단일 염색체 또는 연결기 상에 존재하고 그들의 위치는 자의적인 마커의 수에 의해 가장 특성화된다. 본 조사에서, 증폭된 단편 길이 다형(AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형(SNPs), 및 삽입 돌연변이 마커가 사용되었고, 제한 단편 길이 다형(RFLP) 마커, 미세부수체 부분 마커(예를 들면, SSRs), 서열-특성화 증폭 영역(SCAR) 마커, 분열 증폭 다형 서열(GAPS) 마커 또는 효소 마커 또는 이들 마커의 조합이 또한 사용된다. 일반적으로, a QTL은 수백만 염기의 영역에 걸칠 것이다. 그러므로, QTL에 대한 완전 서열 정보의 제공은 실제적으로 실행할 수 없고 또한 불필요하다. QTL이 처음 검출되는 방법 - 일련의 연속적인 유전적 마커들의 존재와 특정의 표현형 형질의 존재 사이의 관찰된 관계에 의해- 은 자손 식물체의 개체 중에서 특정 표현형 형질을 나타내기 위한 유전적 잠재력을 갖는 이들 식물체를 추적할 수 있도록 한다. 마커의 비-제한적 리스크를 제공함에 의해, 본 발명은 육종 프로그램에서 QTL의 효율적인 유용성을 제공한다.
마커는 육종의 특정계에 특이적이다. 그러므로, 특이적 형질은 특정 마커에 관련된다. 본 출원에 나타낸 바와 같은 마커는 QTL의 위치를 표시할 뿐 아니라 식물체에서의 특이 표현형 형질의 존재에 상호관련된다. 게놈 상에 QTL의 위치를 나타내는 연속 게놈성 마커는 기본적으로 자의적이거나 또는 비-제한적임을 기억하는 것이 중요하다. 일반적으로, QTL의 위치는 표현형 형질과 통계적 상호관계를 나타내는 인접하는 일련의 마커에 의해 표시된다. 일단 마커가 스트링의 외부에서 발견되면 (즉, 어느 역치 이하의 LOD-점수를 갖는 것은 그 마커가 너무 떨어져 있어서, 마커와 QTL 사이의 영역에서 재조합이 너무 자주 일어나서 마커의 존재는 표현형의 존재에 통계적으로 중요한 방법으로 관련되지 않는다는 것을 나타낸다), QTL의 경계가 설정된다. 그러므로, 특정 영역 내에 위치하는 다른 마커에 의해 QTL의 위치를 나타내는 것 역시 가능하다.
인접하는 게놈성 마커가 개별적인 식물체에서 QTL의(그러므로, 표현형의) 존재를 표시하는 데에도 사용될 수 있고, 즉 이들은 MAS(marker assisted selection)법에서 사용될 수 있다. 기본적으로, 잠재적으로 유용한 마커의 수는 제한적이지만 매우 크고, 당업자들은 본 출원에 언급된 추가의 마커를 쉽게 동정할 수 있다. QTL에 연결된, 예를 들면, 특정 역치 이상의 LOD 값을 갖는 마커에 의해 걸쳐진 게놈 영역의 물리적 경계 내에 있고 그것에 의해, 이종 교배에서 마커와 QTL 사이의 재조합이 거의 또는 전혀 일어나지 않는 것을 나타내는 어느 마커; 뿐 아니라 QTL에 대한 연결 비평형 상태의 어느 마커; 뿐 아니라 QTL 내의 실제적 원인의 돌연변이를 나타내는 마커들이 MAS법에 사용될 수 있다. 이것은 QTL-I에 대한 AFLP 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251와 같은 QTL에 관련된 것으로 본 출원에 동정된 마커들이 MAS법에 사용하기에 적합한 마커의 단순한 예라는 것을 의미한다. 더우기, QTL, 또는 그것의 특이적 형질-제공부가 또 다른 유전적 배경에(즉, 또 다른 식물체 중의 게놈에) 유전질 침투되면, 그리고 나서 몇몇 마커들은 그 안에 형질이 존재하지만 자손에서 더 이상 발견되지 않고, 이것은 이와 같은 마커들이 원래 부모계에서만 QTL의 특이 형질-제공부를 나타내고 새로운 유전적 배경은 다른 유전적 조직을 갖는 게놈 영역의 바깥이라는 것을 나타낸다. 부재가 자손의 유전 요소의 성공적인 도입을 나타내는 이와 같은 마커를 "트란스 마커"로 부르고 본 발명하에서 MAS법에 마찬가지로 적합할 것이다.
QTL의 동정 후, QTL 효과(내성)은 예를 들면, 조사하에 QTL에 대한 BC2S1 소산에서 내성을 평가함에 의해 확인될 수 있다. 내성의 평가는 오이 클로스테로바이러스와 오이 흰가루병균 모두에 대해 본 분야에 알려진 내성 생검법을 사용하여 바람직하게 수행된다. 예를 들면, DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Germany) 수집물 상에 수탁번호 제 PV-0592/EWSN_6호로 유지되는 CYSDV 단리물을 사용하고 예를 들면, Bemisia tabaci (생물형 B)에 의해 트란스미션을 통해 실험적 감염을 가져올 수 있다. 또한, 천연 감염 조건하의 (필드) 형질은 CYSDV 또는 다른 클로스테로바이러스에 대한 내성을 평가하는데 수행될 수 있다. 흰가루병균 내성은 실물 재료의 인공적 도입에 의해 평가된다. 본 발명에 의해 제공되는 마커들은 의심되는 흰가루병균 및/또는 클로스 테로-내성 오이 식물체에서 본 발명의 하나 이상의 QTL의 존재를 검출하는데 사용될 수 있고, 그러므로 흰가루병균 및 클로스테로바이러스 내성 오이 식물체의 마커-도움 육종 및 선택을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하기는 본 발명의 QTL의 존재의 검출은 여기에 정의된 QTL에 대한 적어도 하나의 마커에 의해 수행될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성에 대한 QTL의 존재를 검출하는 방법에 대한 또 다른 면에 관한 것으로, 예상되는 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성 오이 식물체 중에서 상기 QTL의 핵산 서열의 존재를 검출하는 것을 포함하고, 그 존재는 상기 마커의 사용에 의해 검출될 것이다.
본 발명의 QTL의 뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 상기 QTL과 관련된 하나 이상의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 그리고 상기 마커 서열의 외부 QTL 서열을 추가로 결정하는데 사용될 수 있는 상기 마커 서열에 대한 내부 프라이머를 고안하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 표 2, 3 및 4의 AFLP 마커의 뉴클레오티드 서열은 주제 식물체의 게놈에서 상기 마커의 존재의 결정에 사용된 전기영동 겔에 의해 상기 마커를 단리하고, 본 분야에 알려진, 예를 들면 디데옥시 사슬 말단화법에 의해 상기 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정함에 의해 얻을 수 있다.
의심되는 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성 오이 식물체에서 QTL의 존재를 검출하기 위한 이와 같은 방법의 구현예에서, 상기 방법은 또한 바람직하기는 표 2, 3, 및 4의 마커로부터 선택된, 상기 QTL에 연결된 마커의 아미노산 서열에 엄격한 혼성 조건하에서 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의심되는 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성 오이 식물체의 소화된 게놈성 핵산에 접촉시키는 단계, 그리고 상기 소화된 게놈성 핵산에 대한 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 특이적 혼성화의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
바람직하기는 상기 방법은, 인 시츄 혼성화법이 또한 적용될 수 있지만, 상기 의심되는 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성 오이 식물체로부터 얻어진 핵산 샘플 상에서 수행된다. 선택적으로, 그리고 가장 바람직한 구현예에서, 당업자는, 일단 QTL의 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 엄격한 조건하에서 상기 핵산 서열로 혼성화될 수 있는 특이적 혼성 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 고안하고 이와 같은 혼성화 프로브를, 의심되는 흰가루병균 및/또는 클로스테로바이러스-내성 오이 식물체에서 본 발명의 QTL의 존재를 검출하는 방법에 사용할 수 있다.
주요 클로스테로바이러스 내성 유전자의 유전자 자리에 대한 마커는 부모 변이체로부터 내려오는 내성 개체 및 민감한 개체로부터 오이 DNA의 단편의 선택적 증폭에 의해 얻어질 수 있다:
- 여기서, 상기 단편은 제한 효소(예를 들면, EcoRI 및 Msel)에 의한 소화 단계를 겪고 이어서 그들의 선단에서 하나 이상의 특이 뉴클레오티드를 갖는 프라이머에 대한 단편 보충적 어댑터의 선단에 결합하기 위해 결찰되고, 여기서 프라이머 쌍의 프라이머 중 하나는 검출을 위해 라벨된다;
- 변성 조건하에서 겔 전기영동에 의해 증폭 산물의 분리; 그리고
- 내성 유전자자리와 유전적으로 연결된 동형 밴드를 동정하기 위해, 내성 자손 및 민감성 자손의 혼합물로부터 유래된 단편의 혼합물로 얻어진 것과 부모 변이체를 기원으로 하는 단편으로 얻어진 겔 전기영동 프로필의 비교. 상기 동정 이후 변화가 모든 개인에서 발생한 변이 단계가 이어지고 및 마커와 내성 유전자 자리 사이의 유전적 재조합률이 산출된다.
기본적으로, 여기서 사용되는 개별적인 APLP 마커는 지정된 마커 코드를 갖는다. 이 코드는 2개의 프라이머를 정의하고, 임의로 정해진 수용에서 프라이머의 증폭산물의 길이를 나타내는 숫자가 결합한다(또한 상기 표 1의 설명을 참조). 그러므로, AFLP 마커는 단일 또는 이중-가닥된 DNA 단편을 오이 게놈성 DNA 상에서 증폭 반응을 수행하여 얻어지는 것으로 정의하고, 표시된 수용의 경우, 표시된 길이의 단편을 가져온다. 더우기, 마커는 5'-3' 방향에서, 제1 프라이머 서열, 오이-특이 DNA 서열 및 제2 프라이머 서열로 이루어진 서열 및 이것의 보체를 포함한다.그러므로 오이-특이 DNA 서열은 2개의 프라이머에 의해 플랭크된다. 용어 "오이-특이 DNA 서열"은 각각의 프라이머에 의해 플랭크된 영역의 뉴클레오티드를 말하고, 특정 프라이머 또는 적어도 90%, 바람직하기는 적어도 95, 가장 바람직하기는 적어도 98%의 서열 동형을 갖는 서열을 사용함에 의해 특허 출원 WO 02/22836에 기재된 바와 같이, 오이 수탁 Khira PI250147으로 증폭된 서열을 나타낸다.
유전자삽입법에 의한 흰가루병균 및 클로스테로바이러스 -내성 오이 식물체의 생산
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 적어도 하나의 QTL-I 및 하나, 바람직하기는 pm-l 및 pm-h 또는 그들의 내성-제공부를 포함하는 핵산(바람직하기는 DNA) 서서열은 본 발명의 이중-내성 오이 식물체의 생산에 사용될 수 있다. 이 면에서, 본 발명은 여기에 정의된 바와 같은 QTL 또는 그것의 내성-제공부의 용도, 이중-내성 오이 식물체를 제공하고, 이 용도는 상기 QTL을 포함하는 핵산 서열을 적합한 수용체 식물에 도입하는 것을 포함한다. 언급한 바와 같이, 상기 핵산 서열은 적합한 클로스테로바이러스 및/또는 흰가루병균-내성 공여자 식물체로부터 유도될 수 있다. QTL-I로 동정된 클로스테로바이러스 유전자 자리를 위한 적합한 기원은 파키스탄산인, 오이 란드라스 키라, PI250147이다. 많은 수의 PM 내성 cucumber cultivars는 그들의 상업적 기원과 함께 예를 들면, http://cuke.hort. ncsu.edu /cucurbit/cuke/cukemain.html에 기재되어 있다. PM 내성 식물체는 예를 들면, the Cucurbit Genetics Cooperative (CGC), Department of Horticultural Science, North Carolina State University, Ealeigh, NC 27695-7609 U.S.A.의 오이 유전자 큐레이터인 T. C. Wehner를 통해 얻을 수 있다. 여기에 기재된 바와 같이, 두 pm 유전자 자리 모두의 기원은 NPI이고, 이것은 Natsufushinari (PI 279465)와 PI 200815의 이종교배에 의해 얻어졌다. 예를 들면, 어세션은 the Centre for Genetic Resources, the Netherlands (CGN), Wageningen, The Netherlands로부터 얻을 수 있다. 여러 식물체 데이타베이스는 ECP/GR Cucurbits Database(the Center for the Conservation and Breeding of Agrodiversity (COMAV) in Valencia , Spain) 또는 the Germplasm Resources Information Network (GRIN) (the USDA's National Germplasm Resources Laboratory, Beltsville, Maryland가 주최)와 같은 적절한 저장 수집물의 선택을 돕도록 할 수 있다. 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균 모두에 대한 내성을 나타내는 다른 오이 식물체는 또한 본 발명이 이 재료를 동정하는 방법을 기재한 바에 따라 내성 공여자 식물로서도 사용될 수 있다.
일단 적합한 공여자 식물체로 동정되면, 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성에 대한 QTL 또는 그것의 내성-제공부를 포함하는 핵산 서열은 이용가능한 방법에 의해 적합한 수용체 식물체로 전이될 것이다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 감염되기 쉬운 수용체 식물과 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균 공여자 식물체의 이종교배에 의해(즉, 유전질 침투에 의해), 변형에 의해, 원형질체 융합에 의해, 이중 반수체 기법에 의해 또는 배아 구조에 의해 또는 임의로 QTL을 포함하고 내성을 나타내는 자손의 선택이 따르는 다른 핵산 전이 시스템에 의해, 전이될 수 있다. 유전자전이법을 위해, 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균 내성에 대한 QTL을 포함하는 핵산 서열, 또는 그것의 내성-제공부가 본 분야에 알려진 방법을 사용하여 상기 공여자 식물체로부터 단리될 수 있고, 이와 같이 단리된 핵산 서열은 예를 들면, 생식체 중의, 또는 상기 핵산 서열로 코팅된 탄도 입자와 같은 다른 적절한 전이 요소 중의 벡터에 의해, 유전자전이법에 의해 수용체 식물체로 전이될 수 있다.
식물체 변형은 일반적으로 식물체 세포에서 작용할 발현벡터의 구축을 포함한다. 본 발명에서, 이와 같은 벡터는 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균에 대한 QTL 또는 그것의 내성-제공부를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 이와 같은 벡터는 조절하에 있거나 또는 프로모터와 같은 조절 요소에 기능적으로 연결된, 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성-제공 유전자를 포함할 수 있다. 발현벡터는, 결합물에 함유된 유전자의 적어도 하나가 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성에 대해 암호화하는 한, 하나 이상의 기능적으로 연결된 유전자/조절요소 결합물을 함유할 수 있다. 벡터(들)은 플라즈미드 형태일 수 있고, 아그로박테리움 변형 시스템과 같은 공지의 변형법을 사용하여, 클로스테로바이러스와 흰가루병균에 대해 내성인 유전자도입 식물체를 제공하도록, 단독으로 또는 다른 플라즈미드와 결합하여 사용될 수 있다.
발현 벡터는 마커를 함유하는 변환 세포의 회수를 (선택가능한 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 억제함에 의한) 음성 선택에 의해, 또는 (마커 유전자에 의해 암호화된 산물에 대해 스크리닝함에 의한) 양성 선택에 의해 허용하는 (프로모터와 같은) 조절 요소에 기능적으로 연결된, 적어도 하나의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 식물체 변형을 위해 일반적으로 많이 사용되는 선택가능한 마커 유전자는 본 분야에 알려져 있고, 예를 들면, 항생물질 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학적 약제를 대사적으로 해독하는 효소를 암호화하는 유전자, 또는 억제제에 대해 민감하지 않은 변형된 표적을 암호화하는 유전자를 포함한다. 선택적으로, 마커-없는 변형이 언급된 마커 유전자 없이 식물체를 얻기 위해 사용될 수 있고, 그 기술이 본 분야에 알려져 있다.
발현벡터를 식물체에 도입하는데 사용되는 방법은 아그로박테리움( Agrobacterium )의 천연 변환 시스템을 기준으로 한다(예를 들면, Horsch et al., 1985 참조). 뿌리혹박테리아(A. tumefaciens ) 및 아그로박테리움 라이조진(A. rhizogenes)은 유전적으로 식물 세포를 변형시키는 식물체 병원성 토양 박테리아이다. 각각 A. tumefaciens 및 A. rhizogenes의 Ti 및 Ri 플라즈미드는 식물체의 유전자 변이에 대한 책임을 갖는 유전자를 이동하다(예를 들면 Kado, 1991 참조). 발현 벡터를 식물체 조직에 도입하는 방법은 Agrobacterium tumefaciens으로의 직접 감염 또는 식물체 세포의 공동-배양을 포함한다(Horsch et al., 1985). 아그로박테리움-조정 유전자 전이에 대한 아그로박테리움 벡터 시스템과 방법의 설명은 Gruber 및 Crosby, 1993 과 Moloney et al., 1989에 기재되었다. 또한, U. S. Pat. No. 5,591,616 참조. 식물체 발현 벡터와 리포터 유전자 및 아그로박테리움 벡터 시스템과 아그로박테리움-조정 유전자 전이를 위한 방법에 대한 설명을 Gruber 및 Crosby, 1993에서 발견할 수 있다. 식물체 조직을 배양하는 일반적 방법은 예를 들면, Miki et al., 1993 및 Phillips, et al., 1988에 의해 발견되었다. 분자 클로닝 기술 및 적합한 발현 벡터를 위한 적합한 핸드북은 Sambrook and Russell, 2001이다.
발현벡터를 식물체에 도입하는 또 다른 방법은 미세발사체-조정 변형을 기준으로 하고, 여기서 DNA는 미세발사체의 표면에 있다. 발현 벡터는 식물 조직으로, 미세발사체를 식물체 세포벽과 막을 통과하기에 충분한 300 내지 600m/s로 가속하는 생탄도법(biolistic) 장비를 이용하여 도입한다 (Sanford et al., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al.,1988, 1992 참조). DNA를 식물체에 도입하는 또 다른 방법은 표적 세포의 고주파분해를 통한 것이다(Zhang et al., 1991 참조). 선택적으로, 리포좀 또는 구상원시세포 융합이 발현 벡터를 식물체에 도입하는데 사용되어왔다 (예를 들면, Deshayes et al., 1985 및 Christou et al., 1987 참조). CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 이용한 DNA의 원형질체로의 직접 섭취가 또한 보고되어 있다 (예를 들면, Hain et al. 1985 및 Draper et al., 1982 참조). 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 일렉트로포레이션(electroporation)이 또한 기재되어 있다(D'Halluin et al., 1992 및 Laursen et al., 1994).
BAC의 사용과 같은 다른 잘 알려진 기술이 유전자 전이 식물체를 생산하기 위해 BIBAC 시스템(Hamilton, 1997)과 결합하여 적용될 수 있고, 여기서 오이 게놈의 일부는 세균성 인공 염색체(BAC), 즉 세균성 E. coli(Zhao 및 Stodolsky, 2004)에서 발견된 천연적으로 발생하는 P-인자 플라즈미드를 기재로 하는 Escherichia coli 세포에서 DNA 단편(100- to 300-kb insert size; average, 150 kb)을 클론하는데 사용된 벡터에 도입된다.
오이 표적 조직의 변형에 이어, 상기 선택가능한 마커 유전자의 발현은 본 분야에 잘 알려진 재생 및 선택방법을 사용하여, 변형된 세포, 조직 및/또는 식물체의 우선적인 선택을 허용한다.
비-유전자전이법에 의한 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 - 내성 오이 식물체의 생산
클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체를 생산하기 위한 선택적인 구현예에서, 원형질체 융합법이 공여자 식물체에서 수용체 식물체로 핵산을 전이하는데 사용될 수 있다. 원형질체 융합은 단일의 이- 또는 다-핵 세포를 생산하기 위한 체세포 혼성화와 같이, 두 개 이상의 원형질체(세포벽이 효소 처리에 의해 제거된 세포) 간의 유도된 또는 자발적 결합이다. 천연적으로 교배될 수 없는 식물체 종과 얻어질 수 있는 융합 세포는 형질의 바람직한 조합을 나타내는 혼성화 식물체로 조직 배양된다. 더욱 특이적으로, 제1 원형질체는 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균에 의한 감염에 내성을 나타내는 오이 식물체 또는 다른 식물계로부터 얻을 수 있다. 제2 원형질체는 제2 오이 또는 다른 식물 변종, 바람직하기는 질병 내성 곤충 내성, 가치있는 열매 특성 등과 같은 상업적으로 가치있는 특성을 포함하는 오이계를 포함할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그리고 나서 원형질체는 통상의 원형질체 융합 과정을 사용하여 융합되고, 이것은 본 분야에 알려져 있다.
선택적으로, 배아 구제는 여기에 기재된 바와 같이 공여자 식물체에서 수용체 식물체로 하나 이상의 QTL을 포함하는 핵산의 전이에 적용될 수 있다. 배아 구제는 식물체가 실행가능한 씨앗을 생산하는데 실패한 이종교배로부터 배아를 단리하는 방법으로 사용될 수 있다. 이 방법에서, 식물체의 수정된 씨방 또는 미성숙 씨앗이 새로운 식물체를 생성하기 위해 조직 배양된다(Pierik, 1999).
본 발명은 또한 상기와 같이 본 발명에 다른 공여자 오이 식물체에서 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균에 대한 내성과 관련된 정량적 내성 유전자 자리(QTL)의 존재를 검출하는 방법을 수행하는 단계, 및 이와 같이 검출된 적어도 하나의 QTL, 또는 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성 제공부를 포함하는 핵산 서열을 상기 공여자 식물체로부터 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-감염가능 수용체 오이 식물체로 전이하는 단계를 포함하는, 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성 오이 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 서열의 전이는 상기 방법들 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다.
이와 같은 방법의 바람직한 구현예는 식물체의 이종교배에 의해 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성 공여자 오이 식물체로부터 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-감염가능 수용체 오이 식물체로 상기 핵산 서열의 유전질 침투에 의한 전이를 포함한다. 이 전이는 그러므로 통상의 육종 기술을 사용함으로써 적절히 수행된다. QTL은 바람직하기는 마커-도움 선택(MAS) 또는 마커-도움 육종(MAB)을 사용함에 의해 상업적인 오이 변종이 유전질침투 된다. MAS 및 MAB는 원하는 형질에 대해 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 자손 식물체의 동정 및 선택을 위한 하나 이상의 분자 마커의 사용을 포함한다. 현재의 경우에서, 이와 같은 동정 및 선택은 본 발명의 QTL 또는 그와 관련된 마커의 선택을 기준으로 한다. MAS는 각각의 QTL 효과를 더욱 상세히 연구할 수 있도록 또 하나 관심의 QTL을 수확하는 거의-동질 유전자계(NIL)를 발생시키는데 사용될 수 있고, 여교배계(backcross inbred line, BIL) 개체의 발생을 위한 효과적인 방법이다 (예를 들면, Nesbitt et al., 2001; van Berloo et al., 2001 참조). 본 구현예에 따라 발생된 오이 식물체는 수용체 식물체로부터 그들의 형질의 대부분을 유리하게 얻을 수 있고, 공여자 식물체로부터 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성을 얻을 수 있다.
위에서 간단히 논의한 바와 같이, 통상의 육종기술은 클로스테로바이러스 또 는 흰가루병균 내성에 대해 암호화하는 핵산 서열을 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-감염가능한 수용체 오이 식물체로 유전질 침투시키는데 사용될 수 있다. 혈통 육종으로 언급되는 한 방법에서, 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균에 대한 내성을 나타내고 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균에 대해 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 오이 식물체가, 이것으로 한정됨 없이, 질병 내성, 곤충 내성 가치있는 열매 특성 등을 갖는 상업적으로 바람직한 특성을 나타내는 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-감염가능 수용체 오이 식물체와 이종교배된다. 생성된 식물체 개체(F1 혼성으로 표시)는 그리고 나서 자가-수분되고 씨앗을 결실한다(F2 씨앗). F2 씨앗으로부터 자란 F2 식물체는 그리고 나서 클로스테로바이러스와 흰가루병균에 대한 내성에 대해 스크리닝된다. 개체들은 많은 다양한 방법으로 스크리닝될 수 있다.
첫째, 개체군은 통상의 질병 스크린을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이와 같은 질병 스크린은 본 분야에 알려져 있다. 바람직하기는, 정량 생검이 사용된다. 둘째, 마커-도움 선택법이 하나 이상의 상기 분자 마커를 사용하여 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성을 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 그들의 소산을 동정하는데 사용될 수 있다. 위에서 QTL의 존재를 검출하는 방법으로 언급된 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 또한, 마커-도움 선택은 정량 생검으로부터 얻은 결과를 확인하는데 사용될 수 있고, 그러므로, 여러 방법이 또한 조합하여 사용될 수 있다.
동종교배된 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체계는 순환 선택 및 역교배, 자가 및/또는 이반수체의 기술 또는 부모계를 제조하는데 사용된 다른 기술의 사용에 의해 발생될 수 있다. 순환 선택 및 역교배의 방법에서, 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성은 순환 부모를 제1 공여자 식물체와 이종교배시킴에 의해 표적 수용체 식물체(순환 부모)로 유전질침투될 수 있고, 이것은 순환 부모와는 다르고 본 명세서에서 "비-순환 부모"로 명칭된다. 순환 부모는 클로스테로바이러스 및 흰가루병균에 대한 내성이 없거나 내성 수준이 낮은 식물체이고, 상업적으로 바람직한 특질, 예를 들면, (추가의) 질병 내성, 곤충 내성, 가치있는 열매 특질 등을 소유하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 비-순환 부모는 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성을 나타내고 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성에 대해 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 비-순환 부모는 순환 부모와 이종교배-산출되는 어느 식물체 변종 또는 동종교배계 일 수 있다. 순환 부모와 비-순환 부모 사이의 이종교배로 얻은 소산은 순환 부모로 역교배된다. 생성된 식물체 개체는 그리고 나서 원하는 특질에 대해 스크리닝되고, 이 스크린은 여러 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 개체는 본 분야에 알려진 바와 같은 표현형 병리학 스크린 또는 정량적 생검을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 선택적으로, 생검 대신, 마커-도움 선택(MAS)이 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성에 대해 암호화하는 핵산서열을 포함하는 이들 소산을 동정하기 위해, 상기 분자 마커, 혼성 프로브 또는 핵산 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, MAS가 정량 생검으로부터 얻은 결과를 확인하는데 사용될 수 있다. 즉, pm-h의 수용성 특성은 이 유전자가 내성 생검과 같은 표현형 스크린을 사용한 F1 또는 BC1 개체에서 스크린될 수 없다는 것을 의미한다. 여기에 정의된 마커들은 그러므로, 유전자형 스크리닝에 의해 적합한 자손 식물체를 선택하는데 매우 적합하다.
스크리닝에 이어, 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성 표현형 또는 더욱 바람직하기는 유전자형을 나타내고, 그러므로 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성에 대해 암호화하는 필수적인 핵산 서열을 포함하는 F1 혼성 식물체가 선택되고 오이 식물체가 동종교배되는 것을 점점 더 증가시키기 위해 많은 수의 세대의 순환 부모로 역교배된다. 이 과정은 2 내지 5 또는 그 이상의 세대에 대해 수행된다. 기본적으로 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 비-순환 부모과 순환 부모의 이종교배 과정에 의해 생성된 소산은 클로스테로바이러스 및 흰가루병균을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 이형성이다. 예를 들면, pm-l와 pm-h 모두가 식물체계로 유전자침입될 때, pm-h 유전자 자리는 수용성이고 내성 표현형은, 동형 pm-h 식물체가 형성되는 조건하에서, 자손 식물체에서만 나타날 것이다.
일반적으로, 원하는 형질을 혼성 오이 변이체에 도입하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) F1 소산 식물체를 생성하기 위해, 동종교배된 오이 부모를 하나 이상의 원하는 형질을 갖는 다른 오이 식물체와 이종교배하는 단계 (여기서 원하는 형질은 클로스테로바이러스 내성과 흰가루병균 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된다);
(b) 선택된 F1 소산 식물체를 생성하기 위해, 바람직하기는 여기서 정의된 분자 마커를 사용하여 원하는 형질을 갖는 상기 F1 소산 식물체를 선택하는 단계 ;
(c) 역교배 소산 식물체를 생성하기 위해 상기 동종교배된 오이 부모와 선택된 소산 식물체를 역교배하는 단계;
(d) 원하는 형질과 상기 동종교배 부모 식물체의 형태상 및 생리학상 특질을 갖는 역교배 소산 식물체를 선택하고(여기서, 상기 선택은 게놈성 DNA의 단리를 포함한다) 그리고 QTL-I, pm-l 및/또는 pm-h에 대한 적어도 하나의 분자 마커의 존재에 대해, 바람직하기는 상기된 바와 같이, 상기 DNA의 존재를 시험하는 단계;
(e) 선택된 제 3의 또는 더 높은 역교배 소산 식물체를 얻기 위해, 단계 (c)와 (d)를 2회 이상 연속적으로 반복하는 단계;
(f) 동종 식물체를 동정하기 위해 임의로 선택된 역교배 소산을 자가생식하는 단계;
(g) 동일한 환경 조건에서 성장하였을 때, 원하는 형질과 혼성 오이 변이체의 모든 형태상 및 생리학상 특질을 갖는 혼성 오이 변이체를 발생하기 위해, 상기 역교배 소산 또는 자가생식된 식물체 중 적어도 하나를 또 다른 동종교배 오이 부모 식물체(바람직하기는 하나는 pm hypo 내성, 즉 동형 pm-h이다)와 이종교배시키는 단계.
나타낸 바와 같이, 마지막 역교배 세대는 클로스테로바이러스와 흰가루병균 내성에 대한 동형의 순수한 육종(동종교배) 소산을 제공하기 위해 자가생식될 수 있다. 그러므로, 순환 선택, 역교배 및 자가생식의 결과는 상업적 관심의 형질과 관련된 다른 유전자 뿐 아니라 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성과 관련된 유전자에 유전적으로 동형인 계의 생산이다.
클로스테로바이러스 및 흰가루병균 -내성 오이 식물체 및 씨앗
식물체 육종의 목적은 단일 변종 또는 혼성물에 여러 원하는 형질을 결합하는 것이다. 상업적 작물의 경우, 이러한 형질은 질병 및 곤충에 대한 내성, 열과 가뭄에 대한 견딤, 작물 성숙을 위한 시간의 감소, 수득률 증대, 및 더 나은 작물 품질을 포함한다. 발아 및 스탠드 확립, 성장 속도, 성숙과 같은 식물 성장체의 균일성이 또한 중요할 수 있다.
시판되는 작물들은 수분법의 이점을 취하는 기술을 통해 육종된다. 식물체는 한 꽃의 꽃가루가 동일한 또는 동일한 식물체의 다른 꽃으로 전이된다면 자가-수분된다. 식물체는 동일한 과 또는 계내의 개체들이 수분을 위해 사용된다면, 친족 수분된다. 꽃가루가 다른 과 또는 계의 다른 식물체의 꽃으로부터 온다면 이종-수분이다.
자가-수분되고 여러 세대의 타입에 대해 선택된 식물체는 거의 모든 유전자자리에서 동일해지고 참된 육종 소산의 균질한 개체군을 생산한다. 2개의 다른 동형계 사이의 이종교배는 많은 유전자 자리에서 이형일 수 있는 혼성화 식물체의 균일한 개체군을 생산한다. 많은 유전자 자리에서 각각 이형성인 두 식물체의 이종교배는 유전적으로 다르고 균일하지 않은 이형성 식물체의 개체군을 형성할 것이다.
오이 식물체 육종 프로그램에서 혼성화 오이 변이체의 성장은 3 단계를 포함한다: (1) 초기 육종 이종교배를 위해 다양한 생식세포 풀로부터 선택하는 단계; (2) 동종교배계를 생산하기 위해 여러 세대 동안 육종 이종교배로부터 선택된 식물 체를 자가생식하는 단계(이것은 개별적으로 육종된 순종이고 매우 균일하다); 그리고 (3)선택된 동종교배계를 관련없는 동종교배계와 이종교배하여 혼성 소산(F1)을 생산하는 단계. 충분한 양의 동종교배 후 동종교배된 연속 후손 세대는 주로 성장된 동종교배의 씨앗을 증가시키는 작용을 한다. 바람직하기는, 동종교배계는 그것의 유전자 자리와 약 95%의 동형 대립형질을 포함하여야 한다.
동종교배계의 동형접합과 동질성의 중요한 결과는 정해진 쌍의 동종교배를 이종교배하여 생산된 혼성물이 언제나 동일하다는 것이다. 일단 우수한 혼성물을 생성한 동종교배가 동일하다면, 혼성화 씨앗의 연속적인 공급은 이들 동종교배 부모를 이용하여 생산될 수 있고 그리고 나서 혼성화 오이 식물체는 이 혼성화 씨앗 공급물로부터 발생될 것이다.
본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체, 또는 그들의 일부는 본 발명의 면이다.
본 발명의 또 다른 면은 상기된 바와 같이 어떠한 배열의 QTL을 포함하는, 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체 또는 그것의 일부에 관한 것이고, 여기서 상기 QTL 중 적어도 하나는 그것의 천연 유전적 배경이 아니다. 본 발명의 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체는 동종교배, 혼성, 반수체, 이반수체 또는 유전자삽입과 같은 어느 유전적 형태일 수 있다. 더우기, 본 발명의 식물체는 내성 특성에 대해 이형접합체 또는 동형접합체일 수 있고, 바람직하기는 동형접합체이다. 비록 본 발명의 QTL이, 그것의 내성-제공부와 함께, 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 식물체를 제공하기 위해 어느 식물체에 전이되 더라도, 본 발명의 방법 및 식물체는 바람직하기는 쿠쿠미스 사티부스 종 식물체에 관련된다.
본 명세서에 기재된 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성 동종교배 오이계는 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 혼성화 식물체를 생성하기 위해 추가 이종교배에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 제1 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 동종교배 오이 식물체는 질병 내성, 곤충 내성, 바람직한 열매 특질 등과 같은, 그러나 이것으로 제한되지 않는, 상업적으로 바람직한 형질을 소유하는 제2 동종교배 오이 식물체와 이종교배될 수 있다. 제2 동종교배 오이계는 클로스테로바이러스 또는 흰가루병균-내성일 수도 또는 아닐 수도 있다. 바람직하기는, 이계는 수용체 형질이 혼성 자손 식물계에 발현되도록 pm-h에 대해 동형접합체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체로 성장될 수 있는 씨앗의 제조방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이 방법은 본 발명의 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체를 제공하는 단계, 상기 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성 식물체와 다른 오이 식물체를 이종교배하는 단계, 그리고 상기 이종교배에 의한, 심었을 때 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체를 생산하는 씨앗을 수집하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체를 제공하는 단계, 상기 클로스테로바이러스 및 흰가루병균 내성 식물체를 오이 식물체와 이종교배하는 단계, 상기 이종교배에 의해 생성된 씨앗 을 수집하는 단계, 상기 씨앗을 식물체로 재생시키는 단계, 상기 방법 중 어느 것에 의해 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 식물체를 수집하는 단계, 식물체에 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성을 제공하는 대립형질에 고정되는 식물체를 얻기 위해 충분한 수의 세대로 선택된 식물체를 자가-수분하는 단계, 이와 같이 생성된 식물체를, 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성이고 원하는 표현형 형질을 갖는 오이 식물체를 얻기 위해 충분한 수의 세대 동안 원하는 표현형 형질을 갖는 오이 식물체와 역교배하는 단계, 그리고 최종 역교배로부터 얻은 식물체로부터, 심었을 때 클로스테로바이러스 및 흰가루병균-내성 오이 식물체를 생산하는, 생산된 씨앗을 수집하는 단계를 포함한다.
표 4는 이중 내성 식물체에서 pm-내성 또는 클로스테로바이러스-내성 부모 기원(내성 부모에 존재한다고 표시)으로 존재한다고 알려진 마커의 부재 또는 존재를 매트릭스 포맷으로 나타낸다. 매트릭스는 추가로 이중 (PM 및 클로스테로바이러스) 내성 식물체와 관련된 AFLP 마커의 기원과 상대적 위치를 나타낸다. pm-l 및 pm-h로 표시되는 "마커"들은 여기서 언급되는 2개의 각 흰가루병균 내성 유전자 자리의 중심 위치를 나타낸다. 클로스테로바이러스-관련 마커의 위치를 사용하여 유전자 자리가 두개의 pm 유전자 자리 사이에 위치되는지를 결정할 수 있지만, QTL-I 유전자 자리에 대해 확립된 위치는 없다. 표로부터, 풀 번호 1~6은 풀 번호 10~15의 것보다 클로스테로바이러스-내성 부모로부터 더 짧은 유전질침투를 얻는다. 매트릭스의 해석은 다음과 같다: 예를 들면, 마커 E23/M40-M003 (56.9 cM)는 pm-내성 부모에 존재하였고 이중 내성 자손에도 존재한 반면, 마커 E11/M80-M003 (79.1 cM) 는 클로스테로바이러스-내성 부모에는 존재하지만 이중 내성 자손에는 존재하지 않았다. 그러므로, 마커 E23/M40-M003는 PM 관련 마커이고, 이 존재는 시험된 식물체계의 pm-l 관련 유전자 영역의 존재를 나타내고, 다른 한편, 마커 E11/M80-M003는 클로스테로바이러스 내성과 관련된 QTL-I의 이웃의 유전적 영역을 나타내지만, pm-hypo (pm-h)내성의 발현에 필수적인 것은 아니다.
표 4. 본 발명의 이중 내성 식물체에서의 AFLP 마커 스코어
Figure 112008038280193-pct00004
+ = 동형접합체 존재 (고 강도 밴드)
- = 부재 (밴드 없음)
+/- = 이형접합체 존재 (저 강도 밴드)
D = 중간체 존재 (중간 강도 밴드)
-J = PM 내성 부모로서 마커 스코어
(존재 [+]와 부재[-] 모두의 정보를 제공)
3 = 클로스테로바이러스 내성 부모로서의 마커 스코어
H = 부모계에 마커의 존재가 확립되지 않음
REFERENCES
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD , Seidman JG , Smith JA , Struhl K (eds.) (1998) Current Protocols in Molecular Biology Wiley, New York.
Bai YL , Huang CC, van der Hulst R, Meijer Dekens F, Bonnema G, Lindhout P (2003) QTLs for tomato powdery mildew resistance (Oidium lycopersici) in Lycopersicon parviflorum Gl.1601 co-localize with two qualitative powdery mildew resistance genes. Mol. plant microbe interactions 16: 169-176.
Christou P, Murphy JE , and Swain WF (1987) Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus. Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:3962-3966.
Deshayes A, Herrera - Estrella L, Caboche M (1985) Liposome-mediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid. EMBO J. 4:2731-2737.
D'Halluin K, Bonne E, Bossut M, De Beuckeleer M, Leemans J (1992) Plant. Cell 4: 1495-1505.
Draper J, Davey MR, Freeman JP, Cocking EC and Cox BJ (1982) Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid- transformed Petunia protoplasts. Plant and Cell Physiol. 23, 451-458.
Fanourakis NE (1984) Inheritance and linkage studies of the fruit epidermis structure and investigation of linkage relations of several traits and of meiosis in cucumber. Ph.D. Diss., Univ. of Wisconsin, Madison.
Fujieda K, and Akiya R (1962) Genetic study of powdery mildew resistance and spine color on fruit in cucumber. J. Jpn . Soc . HoH . Sci . 31:30-32.
Ganal MW (1996) Isolation and analysis of high- molecular-weight DNA from plants, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide. Academic Press Inc., San Diego, 61-73.
Gruber MY, Crosby WL (1993) Vectors for plant transformation. In BR Glick, JE Thompson, eds, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Baton Rouge, LA, pp 89-119.
Hain R, Stabel P, Czernilofsky AP, Steinbliss HH , Herrera - Estrella L, Schell J (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimaeric gene to plant protoplasts. Mol . Gen. Genet. 199:161-168.
Hamilton CM. (1997) A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular- weight DNA. Gene 200: 107-116.
Horejsi T, Staub JE and Thomas C. (2000) Linkage of random amplified polymorphic DNA markers to downy mildew resistance in cucumber (Cucumis sativus L.) Euphytica 115 (2):105-113.
Horsch RB , Fraley RT, Rogers SG , Sanders PR, Lloyd A (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229-1231.
Jiang J, Gill BS, Wang GL , Ronald PC and Ward DC (1995) Metaphase and interphase fluorescence in situ hybridization mapping of the rice genome with bacterial artificial chromosomes. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 92:4487-4491.
Kado CI (1991): Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. Crit . Rev. Plant Sci. 10, 1-32.
Klein TM , Gradziel T, Fromm ME, Sanford JC (1988). Factors influencing gene delivery into zea mays cells by high velocity microprojectiles. Biotechnology 6: 559-563.
Klein TM , Arentzen R, Lewis PA, and Fitzpatrick- McElligott S (1992) Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Bio /Technology 10:286-291.
Kleine M, Cai D, Hermann RG , and Jung C (1995) Physical mapping and cloning of a translocation in sugar beet (Beta vulgaris L.) carrying a gene for nematode (Heterodera schachtii) resistance from B. procumbens . Theor Appl Genet 90: 399-406.
Kooistra E (1968) Powdery mildew resistance in cucumber. Euphytica 17:236- 244.
Kooistra E (1971) Inheritance of flesh and skin colors in powdery mildew resistant cucumbers (Cucumis sativus L.). Euphytica 20:521-523.
Lui BH (1997) Statistical Genomics: Linkage Mapping and QTL Analysis. CRC Press, pg 18-19.
Miki BL , Fobert PF , Charest PJ , Iyer VN . 1993. Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants. In: Glick BR and Thompson JE (Eds.) Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, CRC Press, pp. 67-88.
Moloney MM, Walker JM , Sharma KK (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacteriuin vectors. Plant Cell Rep 8: 238- 242.
Morishita M, Sugiyama K, Saito T, and Sakata Y (2003) Review: Powdery Mildew Resistance in Cucumber. JARQ 37(1), 7-14.
Nesbitt TC , Tanksley SD (2001) fw2.2 directly affects the size of developing tomato fruit, with secondary effects on fruit number and photosynthate distribution. Plant Physiol. 127: 575-583.
Paterson AH (1996) Mapping genes responsible for differences in phenotype. p.41-54. In A.H. Paterson (ed.) Genome mapping in plants. R.G. Landes Company.
Phillips RL , Somers DA, Hibberd KA. 1988. Cell/tissue culture and in vitro manipulation. In: G.F. Sprague & J. W. Dudley, eds. Corn and corn improvement, 3rd ed., p. 345-387. Madison, WI, USA, American Society of Agronomy.
Pierik , R.L.M. (1999) In vitro Culture of Higher Plants, 4th edition. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht.
Sambrook J, and Russell DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, NY, USA., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sanford JC , Klein TM , Wolf ED, Allen N (1987). Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Particulate Sci. Technol. 5:27-37.
Sanford JC (1988) The biolistic process. Trends in Biotechnology 6:299-302.
Sanford JC (1990) Biolistic plant transformation. Physiologica Plantarum, 79, 206-209.
Sanford JC , Smith FD , and Russell JA (1993) Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods in Enzymology 217:483-509.
Shanmugasundarum S, Williams PH, and Peterson CE (1971) Inheritance of resistance to powdery mildew in cucumber. Phytopathology 61:1218- 1221.
Shanmugasundarum S, Williams PH, and Peterson CE (1972) A recessive cotyledon marker gene in cucumber with pleiotropic effects. HortScience 7:555-556.
Tijssen P (1993) Hybridization with Nucleic Acid Probes. Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation. In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier.
Van Berloo R, Aalbers H, Werkman A, Niks RE (2001) Resistance QTL confirmed through development of QTL-NILs for barley leaf rust resistance. Mol. Breeding 8: 187-195.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Homes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl . Acids Res. 23: 4407-4414.
Zhang L, Cheng L, Xu N, Zhao M, Li C, Yuan J, and Jia S (1991) Efficient transformation of tobacco by ultrasonication. Biotechnology. 9:996-997.
Zhao S, and Stodolsky M (2004) Bacterial Artificial Chromosomes. Methods in Molecular Biology VoI 255. Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA.

Claims (24)

  1. 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대해 내성인 식물체로, 여기서 상기 식물체는 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus) 종이고, 상기 식물체는 단일 염색체에 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 하나 이상의 염색체 영역과 흰가루병균 내성을 제공하는 하나 이상의 염색체 영역을 포함하고,
    여기서 상기 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 하나 이상의 영역은 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결되고
    그리고 상기 흰가루병균 내성을 제공하는 하나 이상의 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결되는 것인 식물체:
    - SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 2 이상의, 흰가루병균 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하고,
    여기서, 상기 2 이상의 영역 중 첫번째는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결되고:
    - SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    그리고 여기서 상기 2 이상의 영역 중 두번째는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 연결되는 식물체:
    - SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이.
  3. 제2항에 있어서, 클로스테로바이러스 내성을 제공하는 상기 하나 이상의 영역은 제2항에 정의된 바와 같은 흰가루병균 내성을 제공하는 상기 2 이상의 영역 사이에 위치하는 것인 식물체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 오이 식물체의 일부.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물체 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정 점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗, 원형질체 및 칼리로부터 선택되는 것인 식물체 일부.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 오이 식물체를 제2 오이 식물체 또는 다른 식물체 변종과 이종교배하여 얻어지는 F1 씨앗으로, 여기서 상기 씨앗은:
    마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251로 이루어진 군으로부터 선택되는, 클로스테로바이러스 내성을 위한 하나 이상의 마커, 및
    다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 흰가루병균 내성을 위한 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 F1 씨앗:
    - SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 제2 오이 식물체는 클로스테로바이러스에 감염되기 쉽고 여기서 상기 흰가루병균 내성을 위한 하나 이상의 마커는 동형접합체로 존재 하는 것인 씨앗.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제2 오이 식물체는 동종교배된 식물체인 것을 특징으로 하는 씨앗.
  9. 제6항에 따른 씨앗을 성장시켜 얻어진 혼성 식물체.
  10. 제9항에 따른 혼성 식물체의 일부.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물체의 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗, 원형질체 및 칼리로부터 선택되는 것인 식물체 일부.
  12. 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대해 내성인 식물체를 선택하는 방법으로, 상기 식물체는 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus) 종이고, 상기 방법은 마커 검출 조사를 수행하는 것을 포함하고, 여기서 상기 조사는
    a) 상기 식물체의 게놈에서, 마커 E16/M50-244, E16/M50-188 및 E11/M48-251로 이루어진 군으로부터 선택되는 클로스테로바이러스 내성에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출하는 단계, 및
    b) 상기 식물체의 게놈에서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 흰가루병균 내성에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법:
    - SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 단일 뉴클레오티드 다형 마커,
    - SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 그리고
    - SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이.
  13. 제12항에 있어서, 상기 b) 단계는
    - 상기 식물체의 게놈에서, SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 SNP 마커, 및 SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 SNP 마커로 표시된 제1 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출하는 단계; 그리고
    - 상기 식물체의 게놈에서, SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 SNP 마커, 및 SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이로 표시된 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은
    a) 상기 식물체로부터 게놈성 DNA의 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 식물체의 게놈성 DNA의 샘플에서 상기 클로스테로바이러스 내성에 연결된 하나 이상의 마커와 상기 흰가루병균 내성에 연결된 하나 이상의 마커를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 마커(들)을 정의하는 하나 이상의 프라이머 세트, 또는 상기 마커를 정의하는 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는 하나 이상의 핵산 프로브의 사용을 포함하고 상기 핵산 프로브는 상기 마커(들)을 정의하는 핵산 서열과 엄격한 조건하에서 특이적으로 혼성화하는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 추가적으로, 상기 마커는 그들이 존재하고 커플링 상임을 나타냄으로써, 커플링되지 않은 마커와 비교하였을 때 이종교배 실험에서 마커들 사이의 감소된 분리를 설명함에 의해, 동일한 염색체 상에 존재하는 것을 입증하는 것인 방법.
  17. 제12항에 따른 방법에 의해 선택된 식물체.
  18. 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 식물체인 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus)종 식물체를 생산하는 방법으로, 상기 방법은:
    a) 상기 식물체의 게놈에서, 마커 E16/M50-244, E16/M50-188, 및 Ell/M48-251에 의해 표시되는 오이 클로스테로바이러스 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출함에 의해, 오이 클로스테로바이러스에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 제1 오이 식물체를 선택하는 단계;
    b) 상기 식물체의 게놈에서 다음의 마커에 의해 표시되는 제1 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출함에 의해,
    - SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 단일 뉴클레오티드 다형 마커;
    또는
    상기 식물체의 게놈에서 다음의 마커에 의해 표시되는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출함에 의해,
    - SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 단일 뉴클레오티드 다형 마커, 및
    - SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이,
    오이 흰가루병균에 대한 내성을 제공하는 하나 이상의 염색체 영역을 포함하는 제2 오이 식물체를 선택하는 단계;
    c) 단계 a)와 단계 b)로부터의 상기 식물체들을 이종교배하여 F1 씨앗을 생산하는 단계;
    d) 많은 양의 F1 씨앗을 F1 식물체로 성장시키고, 상기 F1 식물체로부터 이종교배 또는 자가수정에 의해 추가의 자손 개체를 발생시키는 단계; 그리고
    e) 상기 추가의 자손 식물체로부터, 단계 a)에 정의된 바와 같은 오이 클로스테로바이러스 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커와, 단계 b)에 정의된 바와 같은 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커를 포함하는 식물체를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 b)에서 제2 오이 식물체를 선택하는 단계는 상기 제1 또는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL 중 하나를 갖는 제2 오이 식물체를 선택하는 것을 포함하고, 그리고 상기 방법은 추가로
    f) 상기 제1 또는 제2 오이 흰가루분말 내성-제공 QTL과 다른 것(즉, 상기 제2 오이 식물체에 존재하지 않는 QTL)을 갖는 제3의 오이 식물체를 선택하는 단계;
    g) 추가의 자손 식물체를 생산하기 위해 단계 e)에서 얻은 F1 식물체를 상기 제3 오이 식물체와 이종교배하는 단계; 그리고
    h) 자손 식물체로부터, 단계 a)에 정의된 바와 같은 오이 클로스테로바이러 스 내성-제공 QTL과 단계 b)에서 정의된 바와 같은 양쪽 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL들을 포함하는 식물체를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 단계 b), e), f) 또는 h)에 정의된 바와 같은 오이 흰가루병균에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 오이 식물체를 선택하는 단계는
    - 상기 식물체의 게놈에서, SEQ ID NO:1의 위치 39에서 T→G인 SNP 마커, 및 SEQ ID NO:2의 위치 29에서 G→A인 SNP 마커로 표시되는 제1 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커를 검출하는 단계, 그리고
    - 상기 식물체의 게놈에서, SEQ ID NO:3의 위치 193에서 C→T인 SNP 마커, 및 SEQ ID NO:4의 위치 221에서 5'-AATTT-3'가 삽입되는 돌연변이로 표시되는 제2 오이 흰가루병균 내성-제공 QTL에 연결된 하나 이상의 마커의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 단계 a), b), e), f) 또는 h)중 어느 한 단계는 상기 식물체 유래의 게놈성 DNA의 샘플을 제공하는 단계 그리고 상기 게놈성 DNA의 샘플에서 상기 하나 이상의 마커를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 오이 클로스테로바이러스 및 오이 흰가루병균에 대한 내성을 나타내는 식물체인 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus) 종의 식물체의 생산 방법으로, 상기 방법은
    a) 제12항의 방법을 수행함에 의해 오이 클로스테로바이러스와 오이 흰가루병균에 대한 내성을 제공하는 염색체 영역을 포함하는 Cucumis sativus 종의 식물체를 선택하는 단계;
    b) 상기 QTL에 대한 식물체계 동형접합체를 생산하도록 상기 식물체를 동종교배하는 단계;
    c) 단계 b)로부터의 상기 식물체계 동형접합체 식물체를 질병 내성, 곤충 내성, 및 가치있는 열매 특성에서 선택되는 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 제2 오이 식물체와, F1 씨앗을 생성하기 위해 이종교배하는 단계; 그리고
    d) 상기 F1 씨앗을 F1 자손 식물체로 성장시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 제18항 또는 제22항에 따른 방법으로 얻을 수 있는 식물체.
  24. 제23항에 정의된 바와 같은 식물체의 일부로서,
    상기 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗으로부터의 단일 세포 및 조직; 그리고 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 정점, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 어린 가지, 접지, 근경, 씨앗 원형질체 및 칼리에서 선택되는 일부.
KR1020087012860A 2005-11-04 2006-11-06 질병 내성 오이 식물체 KR101388281B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05077528.7 2005-11-04
EP05077528A EP1782685A1 (en) 2005-11-04 2005-11-04 Disease resistant cucumber plants
PCT/NL2006/000553 WO2007053015A2 (en) 2005-11-04 2006-11-06 Disease resistent cucumber plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080077140A KR20080077140A (ko) 2008-08-21
KR101388281B1 true KR101388281B1 (ko) 2014-04-22

Family

ID=36021833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087012860A KR101388281B1 (ko) 2005-11-04 2006-11-06 질병 내성 오이 식물체

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8895812B2 (ko)
EP (2) EP1782685A1 (ko)
JP (1) JP5694644B2 (ko)
KR (1) KR101388281B1 (ko)
CN (1) CN101351116B (ko)
CA (1) CA2628423C (ko)
IL (1) IL191146A (ko)
MA (1) MA29982B1 (ko)
NO (1) NO20082558L (ko)
RU (1) RU2418405C2 (ko)
WO (1) WO2007053015A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102108751B1 (ko) 2018-12-11 2020-05-08 대한민국 오이 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기다형성 탐침

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008003356A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Enza Zaden Beheer B.V. Resistance to powdery mildew and absence of necrosis in cucumis sativus
ES2751104T3 (es) 2008-04-16 2020-03-30 Seminis Vegetable Seeds Inc Plantas de pepino resistentes al mildiu velloso
WO2010071431A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Monsanto Invest N.V. Method of breeding cysdv-resistant cucumber plants
MX2011009032A (es) 2009-02-27 2011-09-22 Monsanto Invest Nv Plantas de pepino resistentes a fusarium.
KR20120101005A (ko) 2009-10-22 2012-09-12 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드 노균병 저항성 오이 식물의 확인을 위한 방법 및 조성물
NZ601341A (en) 2010-01-22 2014-02-28 Bayer Ip Gmbh Acaricide and/or insecticide active substance combinations
KR20130116074A (ko) 2010-11-02 2013-10-22 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 Ｎ-헤타릴메틸 피라졸릴카르복사미드
AR083875A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Bayer Cropscience Ag N-aril pirazol(tio)carboxamidas
US20130289077A1 (en) 2010-12-29 2013-10-31 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
CN103502268B (zh) * 2011-03-01 2015-12-02 安莎种子公司 黄瓜中的白粉病抗性提供基因
US9265252B2 (en) 2011-08-10 2016-02-23 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
US9167760B2 (en) 2013-04-30 2015-10-27 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Cucumber hybrid SV8975CB and parents thereof
JP6835580B2 (ja) * 2013-07-22 2021-02-24 サイエンザ・バイオテクノロジーズ５・ベスローテン・フェンノートシャップＳｃｉＥＮＺＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ５ Ｂ．Ｖ． ヒマワリにおけるベト病抵抗性付与遺伝子
RU2723581C2 (ru) * 2014-10-16 2020-06-16 Нунхемс Б. В. Qtl урожая в растениях огурца
WO2016059090A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Nunhems B.V. Yield qtls in cucumber plants
RU2731639C2 (ru) * 2014-10-30 2020-09-07 Нунхемс Б.В. Растения салат-латук, имеющие резистентность против nasonovia ribisnigri биотипа 1
CN104560983B (zh) * 2015-01-30 2017-03-08 扬州大学 与黄瓜抗白粉病紧密连锁的两个snp标记及其应用
WO2016177696A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-10 Nunhems B.V. Introgression of a yield qtl in cucumis sativus plants
CN105660365A (zh) * 2016-01-26 2016-06-15 吉林省蔬菜花卉科学研究院 一种利用航天技术选育及繁育黄瓜新品种的方法
WO2017178520A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Nunhems B.V. Introgression of two yield qtls in cucumis sativus plants
CN105969860A (zh) * 2016-05-17 2016-09-28 青岛市农业科学研究院 一个黄瓜抗白粉病主效qtl定位
CA3030339A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 Nunhems B.V. Tolcndv resistant melon plants
NL2019209B1 (en) * 2017-07-10 2019-01-16 Duemmen Group Bv Powdery mildew resistant rose
JP6306252B1 (ja) 2017-07-31 2018-04-04 タキイ種苗株式会社 セイヨウカボチャ植物のうどんこ病抵抗性マーカー、うどんこ病抵抗性セイヨウカボチャ植物、それを用いたうどんこ病抵抗性セイヨウカボチャ植物の製造方法、およびセイヨウカボチャ植物へのうどんこ病抵抗性の付与方法
AU2018312486A1 (en) * 2017-08-03 2020-02-13 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Cucumber plants with improved pest resistance
KR102282490B1 (ko) * 2018-01-12 2021-07-28 주식회사 엠디헬스케어 패칼리박테리움 프라우스니찌 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102250596B1 (ko) * 2018-02-02 2021-05-12 주식회사 엠디헬스케어 비피도박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102194274B1 (ko) * 2018-02-20 2020-12-22 주식회사 엠디헬스케어 카테니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102122852B1 (ko) * 2018-02-22 2020-06-15 주식회사 엠디헬스케어 지오바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102122885B1 (ko) * 2018-02-23 2020-06-15 주식회사 엠디헬스케어 엑시구오박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102122898B1 (ko) * 2018-02-26 2020-06-15 주식회사 엠디헬스케어 블라우티아 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102230479B1 (ko) * 2018-02-26 2021-03-22 주식회사 엠디헬스케어 투리시박터 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118199B1 (ko) * 2018-02-26 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 아토포비움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102185981B1 (ko) * 2018-02-28 2020-12-03 주식회사 엠디헬스케어 스트렙토코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102142327B1 (ko) * 2018-02-28 2020-08-07 주식회사 엠디헬스케어 아시네토박터 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118197B1 (ko) * 2018-02-28 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 마이크로코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118198B1 (ko) * 2018-02-28 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 리조비움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102185982B1 (ko) * 2018-02-28 2020-12-03 주식회사 엠디헬스케어 슈도모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118989B1 (ko) * 2018-03-05 2020-06-05 주식회사 엠디헬스케어 엔히드로박터 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102185985B1 (ko) * 2018-03-05 2020-12-03 주식회사 엠디헬스케어 알로이오코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118201B1 (ko) * 2018-03-05 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 메틸로박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118993B1 (ko) * 2018-03-06 2020-06-05 주식회사 엠디헬스케어 프레보텔라 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118203B1 (ko) * 2018-03-06 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 코프로코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102185983B1 (ko) * 2018-03-06 2020-12-03 주식회사 엠디헬스케어 콜린셀라 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118996B1 (ko) * 2018-03-06 2020-06-05 주식회사 엠디헬스케어 베일로넬라 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
CN108148926A (zh) * 2018-03-13 2018-06-12 山东省农业科学院作物研究所 一种用于大豆抗烟粉虱育种的分子标记及其标记方法
CN108546778B (zh) * 2018-07-19 2021-06-01 上海市农业科学院 一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的snp分子标记及其应用
KR102125521B1 (ko) * 2019-06-18 2020-07-07 대한민국 오이 백다다기 품종의 계통 판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도
KR102265754B1 (ko) * 2020-04-08 2021-06-17 대한민국 오이흰가루병균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법
US11350586B2 (en) 2020-04-24 2022-06-07 Hm.Clause, Inc. Hybrid cucumber plant named DIXON
KR102380677B1 (ko) * 2020-10-06 2022-03-29 세종대학교산학협력단 오이 흰가루병 저항성 개체 선별용 마커 및 이를 이용한 선별 방법
US11930754B2 (en) 2022-02-09 2024-03-19 Hm.Clause, Inc. Hybrid cucumber plant named HM 258

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1188833A1 (en) * 2000-09-14 2002-03-20 De Ruiter Seeds C.V. A method for producing plants which are resistant to closteroviruses

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DE69334225D1 (de) 1992-07-07 2008-07-31 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
AU6223399A (en) * 1998-10-28 2000-05-15 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Sequence encoding cysdv coat protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1188833A1 (en) * 2000-09-14 2002-03-20 De Ruiter Seeds C.V. A method for producing plants which are resistant to closteroviruses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Theor Appl Genet, 112권, 페이지 243-250(2006년) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102108751B1 (ko) 2018-12-11 2020-05-08 대한민국 오이 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기다형성 탐침

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009514523A (ja) 2009-04-09
US8895812B2 (en) 2014-11-25
EP1956887A2 (en) 2008-08-20
RU2418405C2 (ru) 2011-05-20
EP1782685A1 (en) 2007-05-09
CN101351116B (zh) 2012-02-22
MA29982B1 (fr) 2008-11-03
CA2628423C (en) 2021-06-15
JP5694644B2 (ja) 2015-04-01
US20080307540A1 (en) 2008-12-11
IL191146A0 (en) 2008-12-29
NO20082558L (no) 2008-07-18
IL191146A (en) 2013-11-28
RU2008122333A (ru) 2009-12-10
WO2007053015A2 (en) 2007-05-10
WO2007053015A3 (en) 2007-07-12
CN101351116A (zh) 2009-01-21
KR20080077140A (ko) 2008-08-21
CA2628423A1 (en) 2007-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101388281B1 (ko) 질병 내성 오이 식물체
ES2366228T3 (es) Plantas de melones resistentes a closterovirus.
EP2480065B1 (en) Brassica oleracea plants resistant to Albugo candida
US10340026B2 (en) QTL responsible for tomato fruit firmness
US20220295719A1 (en) Prolific flowering watermelon
EP3442324A1 (en) Begomovirus-resistant melon plants
EP2467487B1 (en) Disease resistant tomato plants
WO2022002795A1 (en) Novel disease resistant melon plants
US20230323385A1 (en) Plants with improved nematode resistance

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170410

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180404

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190409

Year of fee payment: 6