KR102125521B1

KR102125521B1 - 오이 백다다기 품종의 계통 판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102125521B1
Application number: KR1020190072526A
Authority: KR
Inventors: 이혜은; 김진희; 이은수; 김도선; 홍종필; 문지혜; 이예린
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2020-07-07

Abstract

서열번호 1 내지 59번의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)중에서 선택된 2 이상의 단일염기다형성을 검출하기 위한 제제를 포함하는 오이 백다다기 품종의 유전적 차이를 식별하기 위한 조성물이 개시된다.

Description

오이 백다다기 품종의 계통 판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도{Single Nucleotide Polymorphism Marker Set for Identifying of Cucumber Baekdadagi Varieties and Uses Thereof}

본 발명은 오이 백다다기 품종의 계통 판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

오이 중 백다다기 품종은 오이 시장에서 약 75%의 점유율을 나타내고 있으며, 서울, 경기, 강원 지역 등 중부지역을 중심으로 재배되고 있다. 백다다기 품종은 취청오이 품종보다 저온에 견디는 힘이 다소 약하나, 고온에서 견디는 힘은 상대적으로 강한 편으로, 봄과 가을 재배에 적합하다. 백다다기 품종의 과실은 어깨 부위는 녹색을 나타내지만 과실 중간 부위부터는 흰색 내지 엷은 녹색을 나타내는 반백색이다. 과실 크기는 20 내지 23cm 정도이다.

백다다기 품종으로 분류되는 오이들 사이에서도 형질의 차이가 있고 그에 따른 품질의 차이가 있다. 흑침 형질을 나타내는 백다다기 오이는 유통과정에서 과실 어깨 부위가 누렇게 변색이 되어 신선도가 떨어진 것으로 오인받아 소비자들이 선호하지 않는 문제가 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 1983년부터 14년간 육종한 끝에 백침 형질을 갖는 백다다기 오이를 육성하였다. 백침 형질을 갖는 백다다기 오이는 과실 색의 변색이 더딘 장점이 있다. 이와 같이 백다다기 오이 품종 내에서도 형질의 차이 및 품질의 차이가 존재하므로, 보다 나은 품질의 백다다기 오이를 얻기 위해 동일 품종 내에서 형질이 다른 하위 계통들의 교배 및 선별이 이루어진다.

백침 형질을 갖는 백다다기 오이를 14년간 육종하여 얻은 점에서 알 수 있듯이, 종래의 선별방법은 교배하여 얻은 개체를 성장시킨 후 표현형을 확인하여 선별하고, 원하는 형질의 개체를 얻을 때까지 세대진전을 시켰기 때문에 장기간이 소요되는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 분자표지를 이용하여 빠르게 원하는 형질을 갖는 백다다기 오이를 선별할 필요가 있다. 따라서 백다다기 품종 내에서 다른 형질을 나타내는 하위 계통들을 성장 전부터 신속히 구별할 수 있는 분자 표지가 필요한 실정이다.

대한민국 공개공보 제10-2017-0136219호(2017.12.11)

일 구체예에 따르면 오이의 백다다기 품종의 계통을 판별할 수 있는 오이 백다다기 품종의 유전적 차이 식별용 조성물을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1 내지 59번의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)중에서 선택된 2 이상의 단일염기다형성을 검출하기 위한 제제를 포함하는, 오이 백다다기 품종의 유전적 차이 식별용 조성물을 제공한다.

상기 오이 백다다기 품종의 유전적 차이 식별은 백다다기 품종에 속하는 계통들을 구별하는 것일 수 있다. 상기 계통은 백다다기 품종으로 분류될 수 있는 특징을 공유하면서도 형질의 차이로 분류할 수 있는 개체들을 의미한다. 상기 오이 백다다기 품종의 유전적 차이 식별은 적어도 하나 이상의 형질이 다른 계통을 구별하는 것일 수 있다.

상기 단일염기다형성은 서열번호 1 내지 59번의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성을 의미한다. 상기 단일염기다형성은 오이의 백다다기 품종에서 계통간 차이를 나타내는 염기변이일 수 있다. 상기 단일염기다형성은 계통간 차이를 나타내는 유전자와 연관된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단일염기다형성은 각 서열번호의 61번째 염기에서 2개의 대립유전자로 이루어진 변이로서, 상기 대립유전자는 서열번호 1에서 T/C, 서열번호 2에서 A/G, 서열번호 3에서 A/G, 서열번호 4에서 G/C, 서열번호 5에서 T/C, 서열번호 6에서 A/G, 서열번호 7에서 T/C, 서열번호 8에서 A/G, 서열번호 9에서 A/G, 서열번호 10에서 A/T, 서열번호 11에서 G/C, 서열번호 12에서 G/C, 서열번호 13에서 A/C, 서열번호 14에서 A/G, 서열번호 15에서 T/C, 서열번호 16에서 A/G, 서열번호 17에서 G/C, 서열번호 18에서 A/C, 서열번호 19에서 T/C, 서열번호 20에서 T/G, 서열번호 21에서 A/G, 서열번호 22에서 A/G, 서열번호 23에서 T/G, 서열번호 24에서 A/G, 서열번호 25에서 A/G, 서열번호 26에서 G/C, 서열번호 27에서 T/G, 서열번호 28에서 A/G, 서열번호 29에서 T/C, 서열번호 30에서 A/G, 서열번호 31에서 T/G, 서열번호 32에서 A/T, 서열번호 33에서 T/C, 서열번호 34에서 G/C, 서열번호 35에서 A/G, 서열번호 36에서 G/C, 서열번호 37에서 A/G, 서열번호 38에서 T/C, 서열번호 39에서 T/C, 서열번호 40에서 A/G, 서열번호 41에서 A/G, 서열번호 42에서 A/G, 서열번호 43에서 A/C, 서열번호 44에서 A/G, 서열번호 45에서 A/T, 서열번호 46에서 T/C, 서열번호 47에서 A/C, 서열번호 48에서 A/T, 서열번호 49에서 T/C, 서열번호 50에서 A/G, 서열번호 51에서 A/G, 서열번호 52에서 A/G, 서열번호 53에서 T/C, 서열번호 54에서 A/G, 서열번호 55에서 A/G, 서열번호 56에서 G/C, 서열번호 57에서 A/T, 서열번호 58에서 T/C, 및 서열번호 59에서 T/C이다.

일 구체예에 따르면, 상기 제제는 선택된 단일염기다형성에 해당하는 염기를 포함하는 연속염기와 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 연속염기는 5 내지 121개의 염기로 이루어진 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 서열번호 1 내지 59의 염기서열 중 어느 하나에서, 61번째에 위치한 대립유전자 중 어느 하나의 염기 및 이의 측면 서열의 전부 또는 일부로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 상보적인 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 식별할 수 있는 오이 백다다기 품종의 유전적 차이는 백다다기 품종의 계통간 형질 차이인 것일 수 있다. 상기 백다다기 품종의 계통간 형질 차이는 구체적으로 침색, 내서성(더위에 견디는 성질), 절성성(오이 마디에 암꽃이 피거나 맺히는 배율), 마디당 자화수(암꽃의 수), 과장(과실의 길이), 과색(과실의 색), 흰가루병 저항성, 내한성, 광택, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 제제는 프로브, 프라이머, 및 이들의 조합 중 어느 하나인 것일 수 있다.

용어 “프로브”는 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 상기 단일염기다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 특이적 결합을 이룰 수 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 단일염기다형성의 염기 차이에 따라 결합력의 차이가 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있는 것일 수 있다.

용어 "프라이머"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 통상 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 상기 프라이머의 서열은 서열번호 1 내지 59번의 염기서열 중 일부 연속염기와 동일하거나 상보적일 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다양한 인자, 예를 들어 온도 및 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 HRM(High Resolution Melting) 분석용 프라이머인 경우, HRM 분석에 용이한 크기(예를 들면 50 내지 500bp 크기)의 증폭산물을 생성할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.

상기 프라이머는 플루이다임(Fluidigm) SNP 분석용 프라이머일 수 있다. 플루이다임 시스템을 이용하면 2가지 대립유전자형 SNP를 대량으로 신속히 검출할 수 있다. 플루이다임 프라이머는 LSP(Locus Specific Primer), ASP(Allele Specific Primer) 1, 및 ASP 2를 사용하고 선택적으로 STA(Specific Target Amplification Primer)를 사용한다. 상기 ASP1 및 ASP2는 단일염기다형성의 대립유전자에 대응하여 제작될 수 있다. 상기 ASP1 및 ASP2의 5' 말단 또는 3' 말단은 각각 분석하고자 하는 단일염기다형성의 대립유전자와 동일 또는 상보적인 염기를 가지는 것일 수 있다. 플루이다임 SNP 분석은 프로브로서 FAM, HEX를 사용할 수 있다. FAM 및 HEM은 각각 ASP1 및 ASP2 중 어느 하나에 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, ASP1 및 ASP2는 SNP의 2개의 대립유전자에 각각 특이적으로 혼성화되어 결과물이 증폭되고, ASP 1 및 ASP2에 연결되어 있는 FAM, HEX 서열의 동반 증폭에 의해 SNP의 유전자형을 확인할 수 있다. 플루이다임 시스템용 프라이머는 플루이다임사에 주문하여 제작할 수 있다.

다른 양상은 상기 오이 백다다기 품종의 유전적 차이를 식별하기 위한 조성물을 포함하는 오이 백다다기 품종의 유전적 차이 식별용 키트를 제공한다.

일 구체예에 따르면 상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 플루이다임 SNP 분석용 키트인 것일 수 있다.

상기 PCR 키트는 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 PCR 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우(klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파아지 T7 중합효소인 것일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유하는 것일 수 있다. 또한 상기 PCR 키트는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 PCR 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 상기 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물일 수 있다.

상기 마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것일 수 있다.

상기 플루이다임 SNP 분석용 키트는 플루이다임 시스템용 프라이머를 포함할 수 있고, 구체적으로 STA, LSP, 및 ASP 1&2 프라이머를 포함할 수 있다. 플루이다임 SNP 분석용 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. DNA 중합효소 및 PCR 완충 용액은 상기 PCR 키트에서 설명한 내용을 참조하여 이해될 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 1 내지 59의 염기서열에 있어서, 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 중에서 선택된 단일염기다형성을 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 이용하여 오이 백다다기 품종의 유전적 차이를 식별하는 방법을 제공한다.

상기 방법은, 예를 들면 형질을 알고 있는 복수의 계통의 단일염기다형성 검출 결과인 제 1 결과를 얻는 단계, 형질을 알고자 하는 계통의 단일염기다형성의 검출 결과인 제 2 결과를 얻는 단계, 제 1 결과와 제 2 결과를 비교하여 제 2 결과의 일치도가 높은 계통을 검색하는 단계를 포함할 수 있다. 그 결과, 가장 일치도가 높은 계통과 비슷한 형질을 가지는 것으로 판단함으로써 형질 예측에 도움을 줄 수 있다.

상기 방법은 여교배에 활용할 수 있다. 예를 들면, 백다다기 품종 반복친의 단일염기다형성 검출 결과와 백다다기 품종 여교배 후손의 단일염기다형성 검출 결과를 비교함으로써, 반복친의 검출 결과와 일치도가 높은 여교배 후손을 선별함으로써 여교배 세대진전을 단축하는데 도움을 줄 수 있다.

일 구체예에 따른 오이 백다다기 품종의 유전적 차이를 식별하기 위한 조성물을 이용하면, 오이 백다다기 품종에 속하면서도 형질의 차이가 있는 하위 계통들을 효과적으로 구별할 수 있다.

도 1은 본 발명의 단일염기다형성을 선별하는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 오이 육종의 핵심계통인 C01 내지 C38의 전사체 염기서열분석(sequencing) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 오이의 핵심계통 중 C30(흑침반백)의 사이클별 평균 염기 품질 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 4 내지 도 7은 59개의 SNP를 이용하여 백다다기 품종에 대해 SNP 유전자형을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 4 및 도 5는 A사로부터 얻은 백다다기 20 계통(계통명 D01 내지 D20) 및 이를 교배한 자손(F₁)인 E01 내지 E10에 대한 SNP 유전자형 분석 결과이다. 도 6 및 도 7은 B사로부터 얻은 백다다기 16 계통(계통명 N01 내지 N16)에 대한 SNP 유전자형 분석 결과이다. 상기 도 4 내지 도 7에서 A는 FAM, B는 HEX, H는 FAM 및 HEX, N은 미검출을 의미한다. A 및 B는 하기 표 7에 나타낸 단일염기다형성의 대립유전자가 중 하나(homogeneous)가 검출된 것이고 H는 둘 모두(heterogeneous)가 검출된 것이다.
도 8는 본 발명의 59개 SNP를 이용하여 백다다기 품종의 하위 계통들의 계통수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: SNP 선별

1-1.오이 핵심계통 선별

오이의 육종에 활용할 수 있는 SNP를 선발하기 위해 오이 핵심계통 38개(C01 내지 C38)를 선별하였다. 오이 핵심계통 38개는 각각 열대반백, 피클, 미니백다다기, 슬라이스(베이트알파, Beit Alpha), 흑침반백, 및 취청 6 종류 중 하나에 속하며, 실제 오이 육종에서 활용되고 있는 계통들이다. 하기 표 1을 참조하면, 상기 선별된 오이 핵심계통 38개는 오이의 육종에서 확인하는 대표적인 형질인 침색깔(백, 흑), 내서성(고, 중고, 중, 저), 절성성(고, 중고, 중, 저) 자화/절(1-4), 과장(7 내지 29cm), 과색(반색, 담록, 녹, 농록), 및 흰가루병 저항성(강, 중강, 약) 7 가지 형질에 대해서 완전히 중복되지 않는 것으로 하였다.

계통명	분류	침색	내서성	절성성	흰가루병 저항성	자화/절	과장 (cm)	과색
C01	열대반백	백	고	저	-	1	16	담록
C02		백	고	저	-	1	13	담록
C03		백	고	저	-	1	19	담록
C04	피클 (pickle)	백	고	고	-	2	-	녹
C05		백	고	고	-	1	-	녹
C06		백	고	저	-	1	-	녹
C07		백	고	고	-	1	-	녹
C08		백	고	고	-	1	-	담록
C09		백	고	고	-	3~4	-	녹
C10		백	고	고	-	2~3	-	녹
C11		백	고	고	-	2~3	-	녹
C12		백	고	저	-	1	-	녹
C13		백	고	고	-	3	-	녹
C14		백	고	고	-	4	-	녹
C15		백	고	고	-	4	-	녹
C16		백	고	고	-	3	-	녹
C17	미니 백다다기	백	중고	-	강	1	7	반백
C18		백	중고	-	강	3~4	9	반백
C19		백	중고	-	강	2	9	반백
C20		백	중고	-	강	3	12	반백
C21		백	중고	-	강	1~2	12	반백
C22	슬라이스 : 베이트알파 (Beit Alpha)	백	중고	고	강	3~4	10	농록
C23		백	중고	고	강	2~3	13	농록
C24		백	고	고	중강	2	16	농록
C25		백	고	고	중강	2	16	농록
C26		백	중	저	약	1	25	농록
C27		백	중	고	약	1	29	농록
C28		백	중고	고	중강	1	28	농록
C29		백	고	고	-	1	14	농록
C30	흑침반백	흑	중	저	약	1	-	반백
C31	흑침반백	흑	중	고	약	1	-	반백
C32	취청	흑	고	저	강	1	-	녹
C33		흑	저	저	약	1	-	녹
C34		흑	저	저	약	1	-	녹
C35		흑	저	저	약	1	-	녹
C36		백	고	중고	강	1	-	녹
C37		백	고	중고	강	1	-	녹
C38		백	고	중고	강	1	-	녹

1-2. 오이 핵심계통의 전사체 염기서열 분석 및 SNP 선발

상기 선별한 오이 핵심계통들의 전사체에서 mRNA를 추출하고 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 어린 잎(신초)에서 RNA를 추출하고 DNase를 처리하여 DNA를 제거하였다. mRNA purification kit를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA를 Nanodrop을 이용하여 확인한 결과, A260/280 값이 1.8 이상이고 농도가 400ng/μL로서 기준에 충족함을 확인하였다. 짧은 판독물(Short read)로 서열 분석(sequencing)을 하기 위해, mRNA를 무작위로 절단하였다. 절단된 mRNA 조각들을 역전사(reverse transcription)하여 cDNA 로 제작하고, cDNA의 양 끝에 서로 다른 어뎁터(adapter)를 접합(ligation) 시켰다. 어뎁터가 접합된 cDNA를 서열 분석이 가능한 정도로 증폭시키고, 200 내지 400bp size에 해당하는 조각만을 선별하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. cDNA 라이브러리 구축 과정은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

cDNA 라이브러리는 Illumina Hiseq 4000을 이용하여 핵심계통 각각에 대해 염기 분석을 실시하고, Trimmomatic 프로그램으로 adapter 서열을 제거하였다(trimming). 도 2를 참조하면, 핵심 계통 38개 각각에 대해 평균적으로 35,990,890 개의 판독물(reads)을 얻었으며 평균 GC 함량은 45%, Q30은 96%였다.

FastQC 프로그램을 사용하여 사이클 별로 평균 염기 품질을 박스 플롯으로 나타내어 서열 품질을 판단하였다. 핵심 계통 모두에서 프레드 품질 점수가 20 이상으로 품질이 양호하였다. 대표적으로 핵심 계통 중 C30에 대한 품질을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.

판독물의 맵핑은(Read Mapping) 박과(cucurbitaceae) 유전체 데이터베이스 사이트인 cucurbitgenomics.org에 공개된 Cucumber(Chinese Long) genome v2 데이터를 참조 유전체(reference genome)로 이용하여 TopHapt 프로그램으로 수행하였다. 각 핵심계통의 평균적인 전체 판독물 맵핑율(overall read mapping rate)는 92.8%였다.

SNP 분자 마커를 추출하기 위해, SAM Tools 프로그램을 이용하여 참조 유전체의 유전자와 핵심계통 유전자 간의 유전체 변이 정보를 탐색하는 SNP 콜링(calling)을 진행하였다. 이어서 SNP 필터링(filtering)을 진행하여 SNP를 선별하였다. 선별 조건으로는 염기서열 신뢰도(depth), 다형성지수(PIC, polymorphism information content), 동형접합성, 분리비, SNP 근접 정도의 기준에 따라 선별하였다. 구체적으로, 첫번째로 Depth가 10x 이상인 유전자형 결과를 선발하고, 계통 간 유전자형이 다른 것들을 분류하여 총 62,378개의 SNP를 선발하였다. 두번째로서, 2종류의 유전자형과 2종류의 대립유전자로 나타나는 것을 선별하여 58,436개의 SNP를 얻었다(3종류 이상의 유전자형에 의한 SNP 또는 3종류 이상의 대립유전자가 관여하는 SNP는 제외). 세번째로 최소한 6 계통 이상을 구분할 수 있는 경우만을 선발하여 51,435개의 SNP를 얻었다. 네번째로 두 유전자형의 계통 분리비가 균등하게 나타난 SNP를 선발하여 4,985개를 얻었다(두 개의 유전자형에 대한 분산을 구하여 이 값이 1을 넘으면 제외함). 마지막으로 프라이머(또는 탐침) 디자인을 용이하게 하기 위해 하나의 SNP의 위치로부터 양 옆 60bp 구간에 다른 SNP가 없는 경우를 선발하여 2,462개의 SNP를 얻었다(표 2 참조).

선발된 2,462개의 SNP 중에서 여교배 검정 또는 순도 검정에 사용하기 적합한 SNP를 선발하기 위해, 유전자 좌위의 다형성 지수(Polymorphism Information Content, PIC)의 값이 약 0.5에 가깝고, 38개의 오이 핵심 계통 중 35개 이상에서 공통적으로 확인된 SNP만으로 한정하여 371개의 SNP를 선발하였다(표 2 참조). 371개의 SNP는 PIC 값이 높은 것을 기준으로 선별하였기 때문에, 선발된 SNP는 오이 계통간 다형성 판별의 효율성이 높은 것으로 판단되었다.

371개 SNP의 염색체상의 분포를 조사한 결과, 3번 염색체에 가장 많은 78개가 위치하였고, 5번 염색체에 가장 적은 22개가 위치하였다. SNP 밀도(SNP density, SNPs/Mb)는 7번 염색체가 2.77 SNPs/Mb로 가장 높았고, 1번 염색체가 1.63 SNPs/Mb으로 가장 낮았으며, 전체 염색체(약 161Mb)에 대한 371개의 SNP 밀도는 2.3 SNPs/Mb였다(하기 표 3 참조).

실시예 2: SNP 효용성 검정

2-1. SNP 프라이머 세트 제작

플루이다임(Fluidigm^® EP1^TM) 유전자형 분석시스템에 사용하기 위한 SNP 유전자형 분석 세트를 제작하였다. 플루이다임 SNP 유전자형 분석 세트는 앞서 선별한 371개의 SNP 위치에서 상류(upstream) 및 하류(downstream) 방향에 연결된 60bp 염기서열인 측면 서열(flanking sequence) 정보를 기초로 제작한 프라이머(STA, LSP, 및 ASP 1&2)로 구성되었다. 371개의 SNP 중에서 플루이다임사 D3 assay design 사이트를 통해 디자인이 불가능한 8개를 제외하고 363개의 SNP에 대한 프라이머를 제작하였다.

2-2. SNP의 효용성 검정

363개의 SNP의 효용성을 검정하기 위해 백다다기 품종에 대해 플루이다임 SNP type assay를 실시하였다. 효용성 검정에 사용된 백다다기 품종은 서로 다른 표현형을 나타내는 계통들로 구성된 것으로, A사로부터 얻은 백다다기 20 계통(계통명 D01 내지 D20, 이하 D 계통으로 지칭될 수 있다), D 계통을 교배시킨 자손 F₁인 E01 내지 E10 계통(이하 E 계통으로 지칭될 수 있다), 그리고 B사로부터 얻은 백다다기 계통 16개(계통명 N01 내지 N16, 이하 N 계통으로 지칭될 수 있다)가 사용되었다. 상기 D 계통, E 계통, 및 N 계통의 형질은 하기 표 4 및 표 5에 나타나있다.

상기 표 5 및 표 6에서 과피색은 상기 표 1의 과색과 동일한 의미이다. 상기 D 계통, E 계통, 및 N 계통에 대해 SNP 유전자형을 분석한 결과, 363개의 SNP는 백다다기 품종의 계통 분석에 유용함을 확인하였다. 363개의 SNP 중 백다다기 계통(D01 내지 D20 및 N01 내지 N16)에서 PIC(다형성지수)가 높게 나타난 59개의 단일염기다형성을 최종 선발하였다. 선발된 59개 단일염기다형성들의 PIC 값은 최소값 0.31, 최대값 0.5, 평균 0.45 이다. PIC 값은 하기 식 1로 계산하였다.

[식 1]

상기 식 1에서 PIC는 1에서 서로 다른 대립유전자들의 빈도 제곱의 합을 제외한 값이고, i는 분자표지 번호이고, j는 대립유전자 개수이다.

도 4 내지 도 7에는 백다다기 품종의 계통에 대한 59개의 SNP의 유전자형 분석 결과를 나타내었다. 각 계통마다 SNP 유전자형이 구별되므로, 단일염기다형성 분석에 의해 조기에 계통을 구별할 수 있음을 확인하였다.

상기 59 개의 플루이다임 프라이머에 대한 정보는 하기 표 6에 나타나있다.

Marker Name	Allele	ASP1	ASP2	ASP1 seq	ASP2 seq	LSP seq	STA seq
CsaDPT001	TC	T	C	GAGAGGATGGACTGAAGCTTTCA	AGAGGATGGACTGAAGCTTTCG	CCACCACTTGAATAAGAAGTTGTTCACA	TGAGGAAAGCAGATGCTGGA
CsaDPT002	AG	A	G	GTCCTCAATCAGCTCTGATTCTCTA	TCCTCAATCAGCTCTGATTCTCTG	GAACACCTGCTGCAGCCA	AGCATACCAAGTGCATTGTCC
CsaDPT003	AG	A	G	GAGCGGTGGTATTCCGAGAT	GAGCGGTGGTATTCCGAGAC	CCTCCTATCATCTTCTTTACCTTAACAAGTACAT	CAGGATTTTGAGACCCGAAGG
CsaDPT004	GC	G	C	TGGGATGCTGCCTGATTATCC	TGGGATGCTGCCTGATTATCG	GGGTGACTTCTATGTTGCCGC	CTGTGCTCTGTGGTTGGT
CsaDPT005	TC	T	C	GTTGTTTGCAGCGTGGTTTCT	TGTTTGCAGCGTGGTTTCC	TCCATGCATCCATGGAGTTACAACTT	CCTTCAAAGTTATGAGTGTGAGTTTGTTA
CsaDPT006	AG	A	G	GCTCTTTCACATCTCTGAACAGTCTTA	CTCTTTCACATCTCTGAACAGTCTTG	ACATACCTATTGGAATTGACTTGAATATCAGTTTCA	CTCGCTTTATGATGCAGCTCTT
CsaDPT007	TC	T	C	CATGTGACTCAAAGTTACTGTCACAA	CATGTGACTCAAAGTTACTGTCACAG	GCAAATTTCATTGAATAAACCTGATGTATGAGAGC	TGTTGGAAGAATTAAAATAGTAGCATGTGA
CsaDPT008	AG	A	G	CACTTGTGATTCCAGAGCCTCA	ACTTGTGATTCCAGAGCCTCG	TGATTTAATTTGTTACTGCATTTGCAGTCGA	CCTTGACAGTCACCTTGCTTTTC
CsaDPT009	AG	A	G	GCCTACATCACATCAAGGTCCTAATTTA	CCTACATCACATCAAGGTCCTAATTTG	GGCAAAACCTTTGCTTTGAAAATGAAATTCTT	GGGAAAATGGCCTACATCACA
CsaDPT010	AT	A	T	TTTAATCAAGAGGAAGAGTCTTGGCT	TTTAATCAAGAGGAAGAGTCTTGGCA	TCCAAGAACTCGTGCTCGGAA	TTCAGCACCTCATATCAAAAGGTTTAA
CsaDPT011	GC	G	C	TGCAGAGAATCCACTAACAGCC	TGCAGAGAATCCACTAACAGCG	CTGCCAAGGATGCGCTTGTT	TGGTCGGGAGTGAGCTTT
CsaDPT012	GC	G	C	ACAGTTACCCATCCACCACC	ACAGTTACCCATCCACCACG	ATAAATATATCTTAGTTCTTGGCTAGTTGTTTAGGTCTAT	CTCATACTGGAAGCCTTATTTCTGA
CsaDPT013	AC	A	C	AAGGCAAAATTGAACGTAAACATGAAATAATATTTA	AGGCAAAATTGAACGTAAACATGAAATAATATTTC	TCAGGATTGATTTAATCTACCTGTGTAAGAACAAA	TTCCAAATTCTAAGGCAAAATTGAACG
CsaDPT014	AG	A	G	GTTCCTTTCCATACTCCAGATCGA	TTCCTTTCCATACTCCAGATCGG	ACATGTGGGAGGACCACCG	AGAAATAGCTTCTCCACCACTAGTT
CsaDPT015	TC	T	C	GTCTCTGCATCAGCGTCTGT	TCTCTGCATCAGCGTCTGC	GCTTTGACGGAACAAGGGCA	TCCCGCTTAGCCGTTCA
CsaDPT016	AG	A	G	TTTGACGATCTCAATGAACAACAACAAT	TGACGATCTCAATGAACAACAACAAC	ACTGTTGTGCCCAGAAGCAGA	CACATAAATTTTCTTGCTTGATTTGACG
CsaDPT017	GC	G	C	TGAATCAACTCCACTTTTGCAAGC	TGAATCAACTCCACTTTTGCAAGG	TGTACCCTCAGCCAAGGTTGT	GTAGCAACACAGCAGCTTGA
CsaDPT018	AC	A	C	GAAGAGGCTGTCAAATGTGCA	GAAGAGGCTGTCAAATGTGCC	AGCCAACAAGTCCTCATGAGCT	ACTGTGAGGTACAAAGTGGAAGAT
CsaDPT019	TG	T	G	GTCAATGTATGCACAAGAAATGGATCT	TCAATGTATGCACAAGAAATGGATCG	TCCTTCCGCCCAGTAAAACCA	GGGCTCAAAACGAATGGTCAAT
CsaDPT020	TG	T	G	GGATGTCATACTGGACAGGAACA	GGATGTCATACTGGACAGGAACC	AGTACAAAAAAACACCTAAACAACCTAAATCCAG	TTGTTAAGCAACGGTCAGTAAGG
CsaDPT021	AG	A	G	GAGAAATGTTTCCCAATGGGGTTA	AGAAATGTTTCCCAATGGGGTTG	TTTATGAGATTCTTCTTCCTGTCAATGATCTTCA	TTGTACTACTTTAGGAGACATTGGAGA
CsaDPT022	AG	A	G	AAGTCCTGTTGTTAGTCCAGCA	AGTCCTGTTGTTAGTCCAGCG	ACAACCTTCCTATAACTTTGACACACTGT	TGTATGCGACTTCAATCAAAAGCA
CsaDPT023	TG	T	G	ACAAAGTCCTCCCTGAAAGAAAGAAA	CAAAGTCCTCCCTGAAAGAAAGAAC	ACAGTGCTCTCTGCTGAACAGA	TTTGAAGTGTGAGAGTCAACAAAGT
CsaDPT024	AG	A	G	CCTCTTTCATATGATGCGTTTATGGTT	CCTCTTTCATATGATGCGTTTATGGTC	ACCTACCATTTACATTCTGTTTTATCACAACTTCT	TCACATAACCCACCCCTCTT
CsaDPT025	AG	A	G	GGATTGGAAAGCACACATTGAACTTA	GATTGGAAAGCACACATTGAACTTG	CTCTAATTTACACTCACAAATTATTTCAATCAACTCCT	ATGAAGTTGGATTGGAAAGCACA
CsaDPT026	GC	G	C	GACAATGTAATATTTTTGAATTTGTACCCAAGG	GACAATGTAATATTTTTGAATTTGTACCCAAGC	TGCACAATCCCTAATACTTTCAAGGACT	AATCTGGAATGAGTGTGACAATGTAATAT
CsaDPT027	TG	T	G	GTGTAGAAAATGTAGTCCAGAGTTCCT	TGTAGAAAATGTAGTCCAGAGTTCCG	CAACAAATGAACCCTTATTTACAAATTGTACTAGAGAT	AAGGATGAGCATACCTGTGTAGA
CsaDPT028	AG	A	G	CATCCATGGGTTTCCCTTTCTTTT	CATCCATGGGTTTCCCTTTCTTTC	CCGCAGCTTTGGTCATCGT	CAAATACCTACGCTCTGAAGCAT
CsaDPT029	TC	T	C	TTCTTCCTTCAATTATCCCCCTCAAT	TCTTCCTTCAATTATCCCCCTCAAC	ACGGTGTCGAATTATCTGTGGTTGA	CTCCTCCTCAATTTGAACCTTCTT
CsaDPT030	AG	A	G	TGGCAGGAAGGGAAGAAATCTT	TGGCAGGAAGGGAAGAAATCTC	CCATGCATGATGTATTCAAACTTATCAGCT	TCCTTCAAATGAACTTAATTTTTGGCAG
CsaDPT031	TG	T	G	AATACTCAGCATGTGAGAATAGTGCT	ACTCAGCATGTGAGAATAGTGCG	GTGATAACCAAGCATTCTGGACCG	ACAGAGAACTTCTAAAACAATACTCAGC
CsaDPT032	AT	A	T	GGTGATGAAGATTTCTACTTGAAACAGATT	TGGTGATGAAGATTTCTACTTGAAACAGATA	GGTCCTTTTCACAAACCCAAATATGGA	ACAAAAGCAGATGTGGTGATGAA
CsaDPT033	TC	T	C	GTCCAATCTCAAGCTTTGATATTCAAAGA	TCCAATCTCAAGCTTTGATATTCAAAGG	TCTGTTAATCATACTCTTGTATCATTCAATTTCAGGAA	GCGTGGCTGGTCCAATC
CsaDPT034	GC	G	C	CAGCAGCAGAAGGCGG	CAGCAGCAGAAGGCGC	TCCTTGCTAAGAACGCTTAGGTCTTT	CATTCTAAATGTTCCACAACCAGC
CsaDPT035	AG	A	G	TTTGATCACTGCAATTTCATGCACTAT	TGATCACTGCAATTTCATGCACTAC	GGCAAATATAGTTTTGAGAAAATACAGAGTTATTCACA	CATCCTTTGTCTTGTTGCTTTGAT
CsaDPT036	GC	G	C	CCTCTAACAGGTTCACCACTGAG	CCTCTAACAGGTTCACCACTGAC	TGCCAGAATTGCCACCGTTG	GAAAGGCCTGATACAATATCACCT
CsaDPT037	AG	A	G	GCTTGCTCAGCTGCTTTGA	GCTTGCTCAGCTGCTTTGG	ACAACCTTCTATGAGTTCTTATAAAATTATCTGTATTTAA	AGCATTATTCTTTGGTGGAGCTT
CsaDPT038	TC	T	C	GATTGGAACCATAGCATTCGCA	GATTGGAACCATAGCATTCGCG	CAGGCTGCACAGTCTCCTCA	AATGCAGGCTGGCTGTG
CsaDPT039	TC	T	C	TGGAGCTTCAGCTACTAATCAAACA	TGGAGCTTCAGCTACTAATCAAACG	GGCTTTCTTGCCCCCAACA	TCGTAACTTAAGGGAGATGGAGC
CsaDPT040	AG	A	G	TCCCCAAAATGGCACTCGAT	CCCCAAAATGGCACTCGAC	TGGCGGCGGTGCTCA	CCTGTTTATGCCCTAGTTTTATCCA
CsaDPT041	AG	A	G	GCGAATTCCTTGGCATCCTCA	CGAATTCCTTGGCATCCTCG	TCTCGAAGACCAGCGTGCA	CCAAGAAAAACAAACCTTCTTTCTCAG
CsaDPT042	AG	A	G	GAACTATGGATTTGATTATCTTCAGCCTTTTTA	ACTATGGATTTGATTATCTTCAGCCTTTTTG	ATTACCATATCTCATACATTAGATCATTTGATGTAATTGC	GTGGTTTAGATCCAATAGAACTATGGATT
CsaDPT043	AC	A	C	GCTTAAACGTCCTGGACTTCTTTTTT	GCTTAAACGTCCTGGACTTCTTTTTG	GGCATGATCTGATTGATGAACGCT	CCATTCGCTTCTTCAAACAGCTTA
CsaDPT044	AG	A	G	CTTATAAACACAATCACTCTGCAAGACTATT	CTTATAAACACAATCACTCTGCAAGACTATC	TTCACAACGGATTAAACATATAAAGCAAGACATAAATT	GCCTTATAAACACAATCACTCTGCA
CsaDPT045	AT	A	T	GTCAGTCGTCTCCTTCTGCT	GTCAGTCGTCTCCTTCTGCA	GCAGTTGCCAACCCTTGAGT	ACGAGTAGCAATAAATGCACTCATC
CsaDPT046	TC	T	C	CAGATATGACGATAAGCCGATCGT	AGATATGACGATAAGCCGATCGC	GTGCACGAACCCGATCCC	CGTTTCATCTGGGGTTCCAGATA
CsaDPT047	AC	A	C	CAATTCTCGAATTTTCGAGCGATGA	AATTCTCGAATTTTCGAGCGATGC	CCACGTCGGAATCATCCTCATCA	GATAGCTCAGATAACATAGGTGCAAT
CsaDPT048	AT	A	T	CTTCCCACCACTTCCTTGTCTATT	CTTCCCACCACTTCCTTGTCTATA	AGCTTCTCGAGGAATGCAGGT	CTGTCCCAATTTTTTAATCTTTCCTCTT
CsaDPT049	TG	T	G	AAACAAAACTTGCATCAGATGAAAGAGA	ACAAAACTTGCATCAGATGAAAGAGC	CATTTCGTCTGGAGAGATCTATTGGCT	CGAAAAATTGAAGGGTGGAAACAAA
CsaDPT050	AG	A	G	ACACAAATGCAATGAAAGTTCCCAAT	CACAAATGCAATGAAAGTTCCCAAC	GGTTGTTGGAATTAAATCGTTAAAGACCGA	ACTCTGACATCGTCCACACA
CsaDPT051	AG	A	G	ACACATACTTTGTTAATGTTATGTTATTTGTCTGT	CACATACTTTGTTAATGTTATGTTATTTGTCTGC	GTATTAGAAATATAATACATCACAGATTTATACATATCCC	AATTAATCTCTTTTGAACATAACACATACTTTGTT
CsaDPT052	AG	A	G	ATTTGTTTGGTGGCTAAATACAGCAA	TTTGTTTGGTGGCTAAATACAGCAG	AAGCTTACAGATAATGGAGAAGTTCCATGT	TCAGTTCAAGAAAATTTGTTTGGTGG
CsaDPT053	TC	T	C	CAACAGTATCGATCTCTCATTTGCA	CAACAGTATCGATCTCTCATTTGCG	GGGCTGTCTTCTGCTAGCCA	AAAATGAAGACACGAGCAACAGT
CsaDPT054	AG	A	G	ACTACAAAGCCATCCTGATTGAGAATAA	ACTACAAAGCCATCCTGATTGAGAATAG	GGATTGGTAGAAGTGATTTGTTTGATCAAGATATTAA	GACAACTCCATGAAAGCACTACAA
CsaDPT055	AG	A	G	ACACGTGGGACAAACACCTT	ACACGTGGGACAAACACCTC	GCCCCACCAAGAATGCCT	CGGAATCATCGATTTCATGAGACAA
CsaDPT056	GC	G	C	GAACCCCAAAATCTATTGGACGC	GAACCCCAAAATCTATTGGACGG	GGATCAAAAAGACATGGCCCCT	CTTCAACCTTTGATGGGATTGGA
CsaDPT057	AT	A	T	CCTAATTCCTCCAATCTTCACCCA	CCTAATTCCTCCAATCTTCACCCT	CCCTGCCATGGCTTCTGG	CTGGTTTTGGAAATTGTATTGTTCCT
CsaDPT058	TC	T	C	GATCATGCTCAAGCTGATGCAA	GATCATGCTCAAGCTGATGCAG	CTTTTTGTTACAAGAAAACAAAAGCAAACTCATCA	GCAAAGGAATGGGAAACTGAGA
CsaDPT059	TC	T	C	ATGCGTAATTTGCAAGCACCA	TGCGTAATTTGCAAGCACCG	CTCTGAAGTTTTATTGCATTAATCAGTCTGGT	TCATTATTTAGGCAGTGATATGATGCG

2-3. 59개의 SNP 세트에 대한 유전체 정보

실시예 2-2에서 최종 선발된 59개의 단일염기다형성에 대한 유전체 정보는 하기 표 7에 나타나있다. 표 7의 각 염기서열은 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 및 이의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 각각에 60개의 염기로 구성된 측면 서열을 포함하고 있다.

서열번호	SNP Marker Name	Chromo some	Genetic distance (position)	Flanking sequence(downstream 60bp, upstream 60bp)
1	CsaDPT001	Chr2	6014204	TTTCTCAAGATGGTCCCACCACTTGAATAAGAAGTTGTTCACAACTAGTTTGAACCATGG[T/C]GAAAGCTTCAGTCCATCCTCTCCAGCATCTGCTTTCCTCACCAATTCTTTCAATTGTTCC
2	CsaDPT002	Chr2	6016870	AAATGATACCTTTATCACAAGCATACCAAGTGCATTGTCCTCAATCAGCTCTGATTCTCT[A/G]TACAATGGATGGCTGCAGCAGGTGTTCGTCCAAACAAGAGGAAATGTTACCTTTGTTGCA
3	CsaDPT003	Chr2	7644479	TTTTGCATCCCATCTCATTCCTCCTATCATCTTCTTTACCTTAACAAGTACATCAACTTC[A/G]TCTCGGAATACCACCGCTCCTTCGGGTCTCAAAATCCTGTCCATCTCCAGAAGAATATCC
4	CsaDPT004	Chr2	8565570	TCCATGCCCAAGTGCATCGGCAATTCCTACACAAGGGGTGACTTCTATGTTGCCGCCATC[G/C]GATAATCAGGCAGCATCCCACCAACCACAGAGCACAGCAACTGAACTTCCAGCAGGTGTA
5	CsaDPT005	Chr2	15871155	GCCGAGAGTTTCCTTCAAAGTTATGAGTGTGAGTTTGTTAGTTGTTTGCAGCGTGGTTTC[T/C]TCTTCTGAAATAAAAGTTGTAACTCCATGGATGCATGGAAGTGAACTTTGTTTTGTAATT
6	CsaDPT006	Chr2	17308908	TTGCCATTGTAATATTTTCTCGCTTTATGATGCAGCTCTTTCACATCTCTGAACAGTCTT[A/G]CATATGAAACTGATATTCAAGTCAATTCCAATAGGTATGTAAATCCTCATTTGAAGGCCT
7	CsaDPT007	Chr2	20561070	TCCATCGTCAGCAAATAACTATGCAAATTTCATTGAATAAACCTGATGTATGAGAGCTTA[T/C]TGTGACAGTAACTTTGAGTCACATGCTACTATTTTAATTCTTCCAACATTCTCACTGGAA
8	CsaDPT008	Chr2	20562428	CAAGCCAAAAAAAAATACCTTGACAGTCACCTTGCTTTTCACTTGTGATTCCAGAGCCTC[A/G]GTCATCGACTGCAAATGCAGTAACAAATTAAATCAAACAAGACCTAAATTCTAAACACAA
9	CsaDPT009	Chr2	20581659	CTGTTCCAAGTTAAAAGAAAAATAGGGAAAATGGCCTACATCACATCAAGGTCCTAATTT[A/G]CAAGAGTAAAATGTTTATGAAGAATTTCATTTTCAAAGCAAAGGTTTTGCCTTGGACTTG
10	CsaDPT010	Chr2	20583240	CTGAAAGATACTGCATAACAAACTTCTCCAAGAACTCGTGCTCGGAAATTTTCAATGCCA[A/T]GCCAAGACTCTTCCTCTTGATTAAACCTTTTGATATGAGGTGCTGAAGGATAGACGACCT
11	CsaDPT011	Chr2	20641023	TCTTTTTTGCATTTCCAGTGAAGAGGCTGCCAAGGATGCGCTTGTTTACAGTTACAAGAC[G/C]GCTGTTAGTGGATTCTCTGCAAAGCTCACTCCCGACCAGGTTTCTCGAGTTTCCCGTAAG
12	CsaDPT012	Chr3	7988709	TGAGTTCGCTACTTACTTGATAAATATATCTTAGTTCTTGGCTAGTTGTTTAGGTCTATT[G/C]GTGGTGGATGGGTAACTGTCAGAAATAAGGCTTCCAGTATGAGGAATCAGTAGTAGATTT
13	CsaDPT013	Chr3	8160271	TTAGAATTTAGAAGTTCCAAATTCTAAGGCAAAATTGAACGTAAACATGAAATAATATTT[A/C]TTCTTATTTTGTTCTTACACAGGTAGATTAAATCAATCCTGATTGTAAACTAGCGTTGGG
14	CsaDPT014	Chr3	8255622	ATCACAGCCACTGAAAGAAATAGCTTCTCCACCACTAGTTCCTTTCCATACTCCAGATCG[A/G]GGGCGGTGGTCCTCCCACATGTATTGTCCACTCCTACAACCAAGGGGAAAATCGAAAAAC
15	CsaDPT015	Chr3	8286608	CAGCCGGAGAAAACTCTAGGGTTTTCCCGCTTAGCCGTTCAGTCTCTGCATCAGCGTCTG[T/C]CCAGAGGTGCCCTTGTTCCGTCAAAGCCTCAACAATGGTACTCATGCTTTCTCCCGTCTT
16	CsaDPT016	Chr3	8334172	CTTTTGCAACTTGTTGGCAGCCGTTCAACTGTTGTGCCCAGAAGCAGATATCAACTACAG[A/G]TTGTTGTTGTTCATTGAGATCGTCAAATCAAGCAAGAAAATTTATGTGCTTTTGTAAAAA
17	CsaDPT017	Chr3	10172590	TTTCTTACTTCTGTTTGAATCGTTTTGAACTTTTGTACCCTCAGCCAAGGTTGTGGTTGA[G/C]CTTGCAAAAGTGGAGTTGATTCAAGCTGCTGTGTTGCTACATCCTTCGTTTGTCACAGTC
18	CsaDPT018	Chr3	10173958	GGTTTCTCATGGGTGGACTGTGAGGTACAAAGTGGAAGATGAAGAGGCTGTCAAATGTGC[A/C]GATGAAGCTCATGAGGACTTGTTGGCTTGGTTTACTAAGTATGTTAAGTAATTGAATTGG
19	CsaDPT019	Chr3	13532139	GGCTCCAACCTGTCTCCTGGGCTCAAAACGAATGGTCAATGTATGCACAAGAAATGGATC[T/G]AGAGGAGGATCATCTGGTTTTACTGGGCGGAAGGATGAAAAAGGTATCCTGACCTGCCAA
20	CsaDPT020	Chr3	18855987	CAGATTGATAAGCACAACAAAAATAAGTACAAAAAAACACCTAAACAACCTAAATCCAGA[T/G]GTTCCTGTCCAGTATGACATCCTTACTGACCGTTGCTTAACAATTGCACGAGCTCGCTCT
21	CsaDPT021	Chr3	21687259	ATTCCATTTCATTCTTGTACTACTTTAGGAGACATTGGAGAAATGTTTCCCAATGGGGTT[A/G]TGAAGATCATTGACAGGAAGAAGAATCTCATAAAACTATCCCAAGGAGAATACATAGCAC
22	CsaDPT022	Chr3	21728298	TCTGCAGGAGTTGGATTGTATGCGACTTCAATCAAAAGCAAGTCCTGTTGTTAGTCCAGC[A/G]TGTGTTTAACAGTGTGTCAAAGTTATAGGAAGGTTGTTCAAGACATTTTGAAGTTTATCA
23	CsaDPT023	Chr3	27909991	AAGAAATGATTTTACAACACACAGTGCTCTCTGCTGAACAGAATCAAAGTTTTTGGCTTC[T/G]TTCTTTCTTTCAGGGAGGACTTTGTTGACTCTCACACTTCAAAAGAGCCGATCTTTGAGA
24	CsaDPT024	Chr3	29376156	AAACAAATGTGCAGTGAAAACCTACCATTTACATTCTGTTTTATCACAACTTCTAAATAC[A/G]ACCATAAACGCATCATATGAAAGAGGGGTGGGTTATGTGAAAAATCGAGACCTCCAACCA
25	CsaDPT025	Chr3	29451948	GTTTGTGTGATCAAGATAGAGTGAAGAATGAAGTTGGATTGGAAAGCACACATTGAACTT[A/G]AAGAGGAGTTGATTGAAATAATTTGTGAGTGTAAATTAGAGTATGGCTTTCTTCTCTCTA
26	CsaDPT026	Chr3	29541230	GTCAACAAGTGGAATCTGGAATGAGTGTGACAATGTAATATTTTTGAATTTGTACCCAAG[G/C]AAAATGAATAAGTCCTTGAAAGTATTAGGGATTGTGCAAGTAGAAAGGAGGGTTGTATTA
27	CsaDPT027	Chr3	30707319	AAAATGAACAGCAGCCGGAAGGATGAGCATACCTGTGTAGAAAATGTAGTCCAGAGTTCC[T/G]ATAAAATCTCTAGTACAATTTGTAAATAAGGGTTCATTTGTTGTAGGATCCAGTCTTTTC
28	CsaDPT028	Chr3	31011324	GGCCTGGGTCTTTGTGTTTCTTTTCTTTCCGCAGCTTTGGTCATCGTTAGTGACTTGAAA[A/G]AAAGAAAGGGAAACCCATGGATGCTTCAGAGCGTAGGTATTTGGAGGATGATGATACGTC
29	CsaDPT029	Chr3	37756613	TACCCTCCCCCTCCCCCTCCTCCTCAATTTGAACCTTCTTCCTTCAATTATCCCCCTCAA[T/C]CTCAACCACAGATAATTCGACACCGTTTTTCCTCAACAGGTAACTTTATTATTCAAAATT
30	CsaDPT030	Chr4	3069256	AGCCTTCATCTGAAAGTTTGTATGTTTTACCATGCATGATGTATTCAAACTTATCAGCTA[A/G]AGATTTCTTCCCTTCCTGCCAAAAATTAAGTTCATTTGAAGGATATTACCACTAAAATTT
31	CsaDPT031	Chr4	3076819	TTTTTCTTTTGTATTACACAGAGAACTTCTAAAACAATACTCAGCATGTGAGAATAGTGC[T/G]GATATTATTTCGGTCCAGAATGCTTGGTTATCACAACAACGACAAGTCCCCAAAGAACCG
32	CsaDPT032	Chr4	7778016	TGGCTTCTCTTTAGTAAATACAGGTCCTTTTCACAAACCCAAATATGGAAAAAGTTCAAA[A/T]ATCTGTTTCAAGTAGAAATCTTCATCACCACATCTGCTTTTGTGGAAGAGAGGAGAAATT
33	CsaDPT033	Chr4	21190616	CCGTCGGTAACACATGTAAGATCTGTTAATCATACTCTTGTATCATTCAATTTCAGGAAT[T/C]CTTTGAATATCAAAGCTTGAGATTGGACCAGCCACGCTTGTGTGGTTCTCTTTTGTTTAA
34	CsaDPT034	Chr4	21192090	CTGTCTAAGAAAGAAATAATGCCATTCTAAATGTTCCACAACCAGCAGCAGCAGAAGGCG[G/C]TAAAATAATATTGAAAGACCTAAGCGTTCTTAGCAAGGATAGCCAGGAGTACATTCAATA
35	CsaDPT035	Chr4	21193622	GAAGTAAAAGTAAACATGGCAAATATAGTTTTGAGAAAATACAGAGTTATTCACACAAGC[A/G]TAGTGCATGAAATTGCAGTGATCAAAGCAACAAGACAAAGGATGGTCGATTTCATCTCTA
36	CsaDPT036	Chr4	21193879	TCTGCTGCCGATACATTGAAAGGCCTGATACAATATCACCTCTAACAGGTTCACCACTGA[G/C]AGATTCTTGTGCACTCACCAACGGTGGCAATTCTGGCAAAAAATCAATCCCAGCCAAATG
37	CsaDPT037	Chr4	22447205	CTCAGTTTGTTATCGGCAGCATTATTCTTTGGTGGAGCTTATGCTTGCTCAGCTGCTTTG[A/G]CTTTAAATACAGATAATTTTATAAGAACTCATAGAAGGTTGTAAGTTATTGTTTAGATTA
38	CsaDPT038	Chr5	9952907	AGTTTGGAACCCGACTGATACGCTTGCAGGCTGCACAGTCTCCTCATAAGCAGTTGCACC[T/C]GCGAATGCTATGGTTCCAATCACAGCCAGCCTGCATTCACTTGTCGATTCATTTGAACGG
39	CsaDPT039	Chr6	15592419	CTGATGTAGTTCCAACCATTCATTGGCTTTCTTGCCCCCAACAATATCCTCATTCCTCAT[T/C]GTTTGATTAGTAGCTGAAGCTCCATCTCCCTTAAGTTACGATATCCTTTCATTTCATCTT
40	CsaDPT040	Chr6	15593595	AGATTTGGGTATGGAAGCGGCGGCGCACATGGTGGCGGCGGTGCTCAGTTGTATACAGTT[A/G]TCGAGTGCCATTTTGGGGATGGATAAAACTAGGGCATAAACAGGGGGATGTCTTTGTTTT
41	CsaDPT041	Chr6	24814833	CAGTGCTGAGGTCTCCAAGAAAAACAAACCTTCTTTCTCAGCGAATTCCTTGGCATCCTC[A/G]GTGGGGACTGCACGCTGGTCTTCGAGATCACTTTTGTTTCCTATTAAGATAATAACGATG
42	CsaDPT042	Chr6	24822000	ATGATTTTACTGTGGTTTAGATCCAATAGAACTATGGATTTGATTATCTTCAGCCTTTTT[A/G]TTGCAATTACATCAAATGATCTAATGTATGAGATATGGTAATAGTTCATCAGGAACCTAT
43	CsaDPT043	Chr6	24835630	GAGCATAGTGGAGGACAAAGTCATGTTGGGAGGCATGATCTGATTGATGAACGCTTAAAT[A/C]AAAAAGAAGTCCAGGACGTTTAAGCTGTTTGAAGAAGCGAATGGATATAGCTTAGGATTC
44	CsaDPT044	Chr7	711769	CAAGAAATTTCACAACGGATTAAACATATAAAGCAAGACATAAATTTTTTATGTTATGAT[A/G]ATAGTCTTGCAGAGTGATTGTGTTTATAAGGCTAATACATAGAATCAGGTATATAAAGTA
45	CsaDPT045	Chr7	3734366	TCACTCCTCGGGTTGTTGGTGCCAAAGGAAAGATGCAGTTGCCAACCCTTGAGTTCTACG[A/T]GCAGAAGGAGACGACTGACGATGAGTGCATTTATTGCTACTCGTGCATGGGAGTCCTGCA
46	CsaDPT046	Chr7	3855546	AGGAGGCTTTGTGCTGCCTGCGTTTCATCTGGGGTTCCAGATATGACGATAAGCCGATCG[T/C]TCGTTATGGGATCGGGTTCGTGCACTATCACCTTTGCACCGGAAATCTGCATAAAACCAT
47	CsaDPT047	Chr7	12208217	ATGGTGAAGGTTCAGATAGCTCAGATAACATAGGTGCAATTCTCGAATTTTCGAGCGATG[A/C]TCGTGAGAGTGATGAGGATGATTCCGACGTGGATGGTAGAACTCAAACAAACTCCAATGA
48	CsaDPT048	Chr7	12228706	CGATGGACGATACGAATGGGTTGAACTCGTTCTTTGAGCTTCTCGAGGAATGCAGGTTGC[A/T]ATAGACAAGGAAGTGGTGGGAAGAGGAAAGATTAAAAAATTGGGACAGCCCCCAGTTGGA
49	CsaDPT049	Chr7	13509358	GCGACAACAGCTGCTTCCATTTCCCATTTCGTCTGGAGAGATCTATTGGCTTATCGATGT[T/G]CTCTTTCATCTGATGCAAGTTTTGTTTCCACCCTTCAATTTTTCGCCTACTTTCACTTTC
50	CsaDPT050	Chr7	13513970	ACACAATTATCCTACTTGAATCCTTATTGGTTGTTGGAATTAAATCGTTAAAGACCGAGG[A/G]TTGGGAACTTTCATTGCATTTGTGTGGACGATGTCAGAGTAGAAACGTCAAATAAAGTGG
51	CsaDPT051	Chr7	13514400	GGGCCTTCCAAAAGGTAAAGTATTAGAAATATAATACATCACAGATTTATACATATCCCA[A/G]CAGACAAATAACATAACATTAACAAAGTATGTGTTATGTTCAAAAGAGATTAATTAAGCA
52	CsaDPT052	Chr7	16479485	TACTTTTTCTATTCAATGAAACTCAGTTCAAGAAAATTTGTTTGGTGGCTAAATACAGCA[A/G]TCTTATCAACATGGAACTTCTCCATTATCTGTAAGCTTACAAGAAATGAGTACAACACAA
53	CsaDPT053	Chr7	18080313	GAAAACATATGCAATACAATTGGGCTGTCTTCTGCTAGCCACAAAGCTCGATGCACGCAA[T/C]GCAAATGAGAGATCGATACTGTTGCTCGTGTCTTCATTTTTCTTTAATATGGACCTAGCA
54	CsaDPT054	Chr7	18110886	AGAAGTTTAAAAATATGACAACTCCATGAAAGCACTACAAAGCCATCCTGATTGAGAATA[A/G]GTTAATATCTTGATCAAACAAATCACTTCTACCAATCCCACCACTATGATGCCCACCATA
55	CsaDPT055	Chr7	18195273	CACGGTGGGAGATGAGTTCTTTGCCCCACCAAGAATGCCTGTAGCCTTTACCCAAGTCTC[A/G]AGGTGTTTGTCCCACGTGTATTGTCTCATGAAATCGATGATTCCGATAACCAGTTCGTGT
56	CsaDPT056	Chr7	18215553	ATTATTTTTGCAGTTTGCTCGACTGTACCCATTGGATCAAAAAGACATGGCCCCTGCTCT[G/C]CGTCCAATAGATTTTGGGGTTCCAATCCCATCAAAGGTTGAAGTTGAAAAATCTGCTCGA
57	CsaDPT057	Chr7	18736683	TATTCTAAGCCTTACTGGTTTTGGAAATTGTATTGTTCCTAATTCCTCCAATCTTCACCC[A/T]CAAATCCAGAAGCCATGGCAGGGTTAGAATTAGTAAACAACTACTTTCTTTCTTAATCTT
58	CsaDPT058	Chr7	18796570	GGATTTTCATGCTGCAAATCTGATCTTTTTGTTACAAGAAAACAAAAGCAAACTCATCAC[T/C]TGCATCAGCTTGAGCATGATCTCAGTTTCCCATTCCTTTGCCTGCATTAATATTTAGAAG
59	CsaDPT059	Chr7	18814293	TAGGGACTCGTTTGCTGCTACTCTGAAGTTTTATTGCATTAATCAGTCTGGTATTGTTTC[T/C]GGTGCTTGCAAATTACGCATCATATCACTGCCTAAATAATGAAAATAGATCATGTCATCA

2-4. 백다다기 계통들의 유전적 계통수 분석

선별된 59개 SNP를 이용하여 백다다기 품종에 대한 유전적 계통수(Phylogenetic tree, Dendrogram) 분석을 실시하였다. 계통수 분석에는 D01 내지 D20 계통 및 N01 내지 N16 계통이 사용되었다. 계통수 분석은 인접 결합 방법(neighbor-joining method)을 사용하여 Darwin6 소프트웨어(http://darwin.cirad.fr/)로 수행하였다. 계통도의 구조는 비가중 인접 결합 방법(unweighted neighbor-joining)에 기반하였고, 부트스트랩(bootstraps)은 1,000 반복(replicates)으로 결정하였다. D01 내지 D20 계통 및 N01 내지 N16 계통에 대한 계통수 분석 결과는 도 8 에 나타나 있다.

도 8을 참조하면, D02 및 D04, D04 및 D05, D14 및 D20은 같은 계통으로 나타났다. 상기 표 4의 형질 정보를 참조하면, D02 및 D04, D14 및 D20의 형질이 유사하므로 최종선별된 59개 SNP에 의한 계통수 분석 결과가 형질의 차이에 의해 계통을 구별한 결과와 유사하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 백다다기에서 나타나는 형질인 과형태(H형, 유선형 등), 과피색(반백연두, 반백담연두, 반백얼룩 등), 과장(22 내지 26cm)에서 같은 특징을 보이는 계통끼리 분류되는 경향을 보였다. 따라서, 상기 59개의 SNP를 이용한 계통수 분석 결과는 계통들의 표현형에 따른 분류와 유사성이 있음을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Single Nucleotide Polymorphism Marker Set for Identifying of Cucumber Baekdadagi Varieties and Uses Thereof <130> RDA-P190071 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT001 <400> 1 tttctcaaga tggtcccacc acttgaataa gaagttgttc acaactagtt tgaaccatgg 60 ygaaagcttc agtccatcct ctccagcatc tgctttcctc accaattctt tcaattgttc 120 c 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT002 <400> 2 aaatgatacc tttatcacaa gcataccaag tgcattgtcc tcaatcagct ctgattctct 60 rtacaatgga tggctgcagc aggtgttcgt ccaaacaaga ggaaatgtta cctttgttgc 120 a 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT003 <400> 3 ttttgcatcc catctcattc ctcctatcat cttctttacc ttaacaagta catcaacttc 60 rtctcggaat accaccgctc cttcgggtct caaaatcctg tccatctcca gaagaatatc 120 c 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT004 <400> 4 tccatgccca agtgcatcgg caattcctac acaaggggtg acttctatgt tgccgccatc 60 sgataatcag gcagcatccc accaaccaca gagcacagca actgaacttc cagcaggtgt 120 a 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT005 <400> 5 gccgagagtt tccttcaaag ttatgagtgt gagtttgtta gttgtttgca gcgtggtttc 60 ytcttctgaa ataaaagttg taactccatg gatgcatgga agtgaacttt gttttgtaat 120 t 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT006 <400> 6 ttgccattgt aatattttct cgctttatga tgcagctctt tcacatctct gaacagtctt 60 rcatatgaaa ctgatattca agtcaattcc aataggtatg taaatcctca tttgaaggcc 120 t 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT007 <400> 7 tccatcgtca gcaaataact atgcaaattt cattgaataa acctgatgta tgagagctta 60 ytgtgacagt aactttgagt cacatgctac tattttaatt cttccaacat tctcactgga 120 a 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT008 <400> 8 caagccaaaa aaaaatacct tgacagtcac cttgcttttc acttgtgatt ccagagcctc 60 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<210> 13 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT013 <400> 13 ttagaattta gaagttccaa attctaaggc aaaattgaac gtaaacatga aataatattt 60 mttcttattt tgttcttaca caggtagatt aaatcaatcc tgattgtaaa ctagcgttgg 120 g 121 <210> 14 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT014 <400> 14 atcacagcca ctgaaagaaa tagcttctcc accactagtt cctttccata ctccagatcg 60 rgggcggtgg tcctcccaca tgtattgtcc actcctacaa ccaaggggaa aatcgaaaaa 120 c 121 <210> 15 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT015 <400> 15 cagccggaga aaactctagg gttttcccgc ttagccgttc agtctctgca tcagcgtctg 60 yccagaggtg cccttgttcc gtcaaagcct caacaatggt actcatgctt tctcccgtct 120 t 121 <210> 16 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT016 <400> 16 cttttgcaac ttgttggcag ccgttcaact gttgtgccca gaagcagata tcaactacag 60 rttgttgttg ttcattgaga tcgtcaaatc aagcaagaaa atttatgtgc ttttgtaaaa 120 a 121 <210> 17 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT017 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CsaDPT030 <400> 30 agccttcatc tgaaagtttg tatgttttac catgcatgat gtattcaaac ttatcagcta 60 ragatttctt cccttcctgc caaaaattaa gttcatttga aggatattac cactaaaatt 120 t 121 <210> 31 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT031 <400> 31 tttttctttt gtattacaca gagaacttct aaaacaatac tcagcatgtg agaatagtgc 60 kgatattatt tcggtccaga atgcttggtt atcacaacaa cgacaagtcc ccaaagaacc 120 g 121 <210> 32 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT032 <400> 32 tggcttctct ttagtaaata caggtccttt tcacaaaccc aaatatggaa aaagttcaaa 60 watctgtttc aagtagaaat cttcatcacc acatctgctt ttgtggaaga gaggagaaat 120 t 121 <210> 33 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT033 <400> 33 ccgtcggtaa cacatgtaag atctgttaat catactcttg tatcattcaa tttcaggaat 60 yctttgaata tcaaagcttg agattggacc agccacgctt gtgtggttct cttttgttta 120 a 121 <210> 34 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsaDPT034 <400> 34 ctgtctaaga aagaaataat gccattctaa atgttccaca accagcagca 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Claims

서열번호 1 내지 59번의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1 내지 59번에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 부위를 포함하는 5 내지 121개의 연속염기, 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 형질의 차이는 침색, 내서성, 절성성, 마디당 자화수, 과장, 과색, 흰가루병 저항성, 내한성, 광택, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 제제는 프로브, 프라이머, 및 이들의 조합 중 어느 하나인 것인,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 조성물.
제 1 항의 조성물을 포함하는,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 키트.
제 6 항에 있어서,
상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 플루이다임 SNP 분석용 키트인 것인,
오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하기 위한 키트.
서열번호 1 내지 59의 염기서열에 있어서,
각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 전부를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 이용하여 오이 백다다기 품종의 계통간 형질의 차이를 식별하는 방법.