KR102527604B1 - 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 - Google Patents

황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102527604B1
KR102527604B1 KR1020220177486A KR20220177486A KR102527604B1 KR 102527604 B1 KR102527604 B1 KR 102527604B1 KR 1020220177486 A KR1020220177486 A KR 1020220177486A KR 20220177486 A KR20220177486 A KR 20220177486A KR 102527604 B1 KR102527604 B1 KR 102527604B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
trha
marker
genetic
analysis
paternity
Prior art date
Application number
KR1020220177486A
Other languages
English (en)
Inventor
김두호
김영빈
최종국
이상우
이규성
오세현
이성희
김보람
한지성
이원세
권호용
김나리
Original Assignee
울산광역시 울주군
울산광역시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울산광역시 울주군, 울산광역시 filed Critical 울산광역시 울주군
Priority to KR1020220177486A priority Critical patent/KR102527604B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102527604B1 publication Critical patent/KR102527604B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Abstract

본 발명의 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인법을 제공함으로써 황어 식별용 황어에 대한 정확한 유전형 분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자 유전학적 연구를 과학적이고 체계적으로 수행할 수 있다.

Description

황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법{Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis.}
본 발명은 황어에 대한 유전적다양성 및 집단구조분석, 혈연 관계 확인, 가계 선발, 육종 등에 대해 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 시간과 비용절감이 가능한 동시증폭마커(multiplex PCR set)를 개발하여 황어에 대한 정확한 유전형분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자유전학적연구를 과학적이고 체계적으로 수행 가능할 수 있는 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법에 관한 것이다.
황어(Tribolodon hakonensis)는 잉어과(Cyprinidae), 황어아과(Leuciscinae)에 속하는 회유성 어류로 번식 시기에 황갈색의 줄이 몸에 나타나는 것이 특징이며 대부분 일생을 바다에서 보내고 봄에 물이 맑고 물의 흐름이 잔잔한 하천으로 소상하여 자갈이나 모랫바닥에 집단으로 알을 낳는다. 이러한 소하성(anadromous) 행동은 잉어과 어류에서는 드문 현상으로 황어의 이주 및 생식 생태에 대한 자세한 연구 자료는 아직 없는 실정이다.
황어는 잡식성으로, 수온이 낮을 때는 강바닥의 수생곤충 등을 먹고 살다가 수온이 상승하면 육지에서 흘러온 지렁이 등을 섭이한다. 몸은 길게 옆으로 납작하고, 성어가 되면 3열의 굵은 황금색 줄이 선명하게 드러난다. 길이는 성어 기준으로 평균 40cm 내외로 큰 편이다. 산란기는 4~6월로 배에 붉은 띠가 나타나고 지느러미도 붉은색으로 변하여 혼인색을 갖는다. 이러한 색은 수컷에서 두드러지며 강을 거슬러 오를 때 한 마리의 암컷에 여러 마리의 수컷이 뒤따른다.
황어는 한국 동해와 남해로 유입하는 하천에 주로 분포하며, 일본 전 지역과 사할린 등지의 여러 하천에도 서식하는 것으로 알려져 있다. Tribolodon속에도 여러 종이 존재하지만, 황어와 같이 동북아 전체에 걸쳐 광범위한 분포역을 가지면서 소하성 행동을 보이는 종은 없다. 또한 황어는 지역에 따라서 귀중한 수산자원으로 또는 game fish로서 그 가치를 인정받고 있기도 하다.
그러나, 황어의 자원관리에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이에 산업 경재력 확보를 위해서 황어의 육종기술에 의한 우량 양식품종 개발이 필요하다. 선발육종은 기존의 양식품종을 유전적으로 우수한 개체나 집단을 선발해 이들의 자손을 보다 우수한 품종으로 개량하는 것이다.
이는 기존 품종의 개량에만 국한되는 것이 아니라 실용가치가 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발해 산업화하는 것까지 포함된다. 선발 육종에 따른 유전적 개량량은 세대를 거듭할수록 누진적으로 커지게 되어 생산성을 지속적으로 제고시킬 수 있다.
특히, 어류는 일회 산란수가 많고 표현형(phenotype)의 유전적 변이가 커서 선발육종에 의한 유전적 개량에 이점을 가지고 있어 체중, 체장 등 어류의 주요 계측형질들은 생산성 관련 형질로써 직접 선발에 이용되어 질 수 있다. 따라서, 황어의 지속적 개량 및 소득 증대를 위해서는 DNA 마커를 활용한 분자육종 기술방법 개발이 필요하다.
유전자 표지자(genetic marker)는 DNA서열로 생물에서 의 알려진 위치를 확인 할 수 있는 수단으로 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다.
유전자 표지자는 짧은 DNA서열로, 예를 들어 하나의 염기의 변화로 생긴 단일 염기 다형성(SNP), RFLP(제한효소 절편길이 다형성, Restriction fragment length polymorphism), SSLP(단순 염기서열 길이 다형성, Simple sequence length polymorphism), AFLP(유전자 증폭산물 길이 다형성, Amplified fragment length polymorphism), RAPD(DNA 다형성 무작위 증폭, Random amplification of polymorphic DNA) VNTR(가변수 직렬반복, Variable number tandem repeat) SSR, 단순 서열반복, Simple sequence repeat) 같은 것들이 있다.
SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. 이를 이용한 SSR 마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.
일반적으로 사람 및 동물에서처럼 많은 유전체 연구가 진행된 경우는 데이터베이스상에서 SSR 정보를 확인 및 선발을 통해 마커 개발이 가능하나 수산분야에서는 현재 많은 유전체분석 연구가 진행되지 않아 직접 대량의 염기서열 데이터 정보를 확보하고 목적에 맞는 마커를 발굴해 나아가야 한다.
최근에는 수산전문기관에서 각 수산 종에 대한 NGS 분석(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)뿐만 아니라 다른 여러 유전체분석 방법을 이용하여 목적에 맞는 마커 발굴 및 개발을 진행하고 있다. 우선적으로는 확보되는 전장유전체염기서열을 이용하여 SSR 영역을 탐색하고 변별력, 효율성, 정확성 등을 검증함으로써 SSR 마커를 개발하고 있는 추세이다.
또한 많은 종에 대한 판별 및 집단, 계통분석, 친자확인 등에 과학적인 조사 방법으로 이용이 되고 있어 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있고, 국내 등록특허번호 제10-2077917호에는 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있으나, 상기 선행문헌은 본 발명과 대상 어종이 상이한 차이점이 있다.
이에 본 발명은 NGS를 이용하여 황어의 염기서열을 밝혀내고 SSR 부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 대한 마커를 제공하고 이를 이용한 친자확인법을 제공하고자 한다.
국내 등록특허번호 제10-2077917호에는 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 넙치 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 넙치 친자관계 및 혈연 관계의 식별이 가능한 넙치 친자 및 혈연 관계식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법을 제공함으로써 개발한 마커의 부위는 변별력이높고 증폭률이 우수한 마커로서, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터 생산과 더불어, 보다 높은 친자감별이 가능한 효과가 있는 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 마이크로새틀라이트 마커 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제1세트와; 마이크로새틀라이트 마커 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27,PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제2세트;를 포함하여 문치가자미(Limandayokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공함으로써, 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2064039호에는 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 미세위성 마커는 붉바리의 친어 집단에 대한 개체 식별 및 친자 확인을 위하여 매우 효율성이 높은 마커를 제공할 수 있으며, 개체식별 및 친자 확인에 효과적으로 사용가능 한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2062452호에는 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 터봇 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 터봇 친자관계 및 혈연 관계의 식별이 가능한 터봇 친자 및 혈연 관계식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법을 제공함으로써, 차세대 시퀀싱을 기반으로 개발한 마커의 부위는 변별력이 높고 증폭율이 우수한 마커로서, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터 생산과 더불어, 보다 높은 친자감별이 가능한 효과가 있는 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 이러한 분석을 기초로 황어의 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석하여 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 황어의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사, 선발육종 등 유전학적 연구에 과학적이고 정확한 기초자료로 이용할 수 있는 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인법을 제공하고자 한다.
본 발명의 실시예에 따른 황어의 친자 식별용 프라이머 세트는 TrHa(3)014, TrHa(4)005, TrHa(4)003, TrHa(4)014, TrHa(4)007, TrHa(4)015, TrHa(3)012, TrHa(4)001의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 프라이머 쌍을 포함하는 황어 친자 식별용 마커 조성물 및 황어 친자 식별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 황어 친자 확인 방법은 분석하고자 하는 황어의 핵산 시료를 황어 친자 식별용 프라이머 또는 키트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계,상기 증폭 단계에서 증폭된 산물을 이용하여 유전적 다양성을 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전적 다양성 분석은 유전자좌당 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수 (Polymorphic Information Content; PIC), 대립유전자 수(K), 관찰치 및 기대치 이형접합체율(Ho, He), 대립유전자 수 보정치(Allelic richness; Ar)와 유전자 다양성(Gene diversity) 지수, 근교계수(FIS) 값 중에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 동시 증폭 마커(multiplex PCR ) 2set을 제공함으로써 황어에 대한 유전형 분석시간과 비용절감이 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 황어 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 마커별 대립유전자 빈도를 나타낸다.
본 발명의 용어 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 Simple sequence repeats (SSR)라 불리는 microsatellite는 non-coding 부위에 존재하는 1-6 bp의 단순 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마커로써 집단유전학, 유연관계 분석, 친자확인 및 개체식별에 있어 유용한 DNA 마커를 지칭한다.
본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머들이라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA가닥을 연장할 수 있다.
그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다.
전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.
분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커를 개발할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용하고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는 데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.
본 발명은 NGS를 이용하여 황어의 염기서열을 밝혀내고 SSR부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 적용할 수 있는 마커를 제공하고자 한다.
본 발명의 최종 선발된 8개쌍의 동시다중증폭마커세트(Multiplex PCR set)는 식별력, 증폭효율, 안정성, 마커의 다양성이 우수하며 개체식별력은 1.166X10-9으로 매우 높다. 또한 8개쌍의 마커를 1set로 구성하여 동시에 증폭할 수 있는 multiplex PCR set를 개발함으로써 빠르고 신속하게 분석이 가능하도록 함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 조성물을 이용한 유전자 분석 및 이를 이용한 친자 확인방법은 황어의 방류효과조사, 선발육종, 교배지침, 유전적 다양성 및 집단구조분석 등 전반적인 분자 유전학적연구를 포함하는 것일 수 있다. 이하, 본 발명의 실험예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실험예 1> 황어 DNA 추출과정
NGS 분석하기 위해서는 High quality DNA를 추출하며, 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 수행하였다. NGS(Next-Generation Sequencing, 차세대염기서열분석법) 수행 시 정확한 데이터 생산을 위해 High quality DNA 추출을 진행하였다.
High quality DNA를 추출하기 위해서는 샘플 수령 후 다음 날 즉시 채취된 조직의 약 1 cm2 내외로 절단하고 멸균 3차 증류수로 세정 후 BIONEER/OMEGA사의 DNA 추출키트를 이용하여 진행하였다.
<실험예 2> Library 제작
DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다. Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다.
Illumina sequencer 인 Hiseq4000을 이용하여 넙치의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산된 Total base reads를 확인한 후 Q20에 해당하는 data를 filter 하여 정렬하였다.
<실험예 3> 마커 선발
3-1 NGS 분석진행 후 SSR 영역 marker design
Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘 못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다.
생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~350bp 마커를 디자인하였다.
3-2 동시 증폭 위한 marker 제작
최종선발되는 마커는 모든 분석을 마친 후에 되므로 사이즈별 구간을 나누어 random 하게 형광 Dye를 부착하였다. labeled primer는 정방향 올리고 (forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지의 형광물질을 부착하고 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지시켰다. 또한 PCR 조합은 각 마커 간에 사이즈가 오버랩 되지 않으며 형광dye가 겹치지 않도록 임의조합을 구성하고 진행하였다.
하기의 표 1은 황어에 대해 개발된 동시 증폭(Multiplex) 유전자 마커 정보를 나타내고, 도 1은 본 발명의 황어 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.
황어 SSR marker set-A 정보
Dye Name 서열번호 Sequence(5' to 3') Repeat Motif Size range
FAM TrHa(3)014_F 1 TGGCTTCATTCGGTGCTTTG AGA 371~458
TrHa(3)014_R 2 TGAAGTCGTCTGCTTCAGAGA
TrHa(4)005_F 3 AGGGAAGACGGCAAACTTTT AGAT 132~256
TrHa(4)005_R 4 GTTTTGCATCACAGGTGCCA
VIC TrHa(4)003_F 5 ACTCTCCACTTGAGCGCTTT ATAG 130~182
TrHa(4)003_R 6 CTGCATAACCACTTTGAGGAGAATAGC
TrHa(4)014_F 7 TGGTGGCCCACTCATTCAAA TATC 303~399
TrHa(4)014_R 8 CGCCATTAAGAACTGATCTAGGATCAG
NED TrHa(4)007_F 9 GGAAACAGCGAGATGTGGCTTT CTAT 94~186
TrHa(4)007_R 10 TGGTTGTACAATGCAGCGTG
TrHa(4)015_F 11 CAGTTCAGTGGTGTGAACAAAGTC TATC 330~390
TrHa(4)015_R 12 CTCATGCCATCACCAAAGTGT
PET TrHa(3)012_F 13 AGGCCCCGACACCAATTAAA TTC 330~390
TrHa(3)012_R 14 TGGCGGTAATGCACTTGTCT
TrHa(4)001_F 15 TGGCTGCCATGTTACCATACA CTAT 104~192
TrHa(4)001_R 16 ATGGATAAGGAGAGACCCTGA
<실험예 4> 동시증폭 중합효소 연쇄 반응(Multiplex PCR 증폭)
8개의 marker를 포함한 Multiplex PCR set을 구성하여 황어의 유전형분석을 실시하였다. 다중 동시 증폭 시스템(multiplex PCR)의 경우 annealing temperature(마커 결합온도), 혼합 시약 조성 및 농도, 조건 등에 대한 최적화 과정이 매우 중요하다.
따라서 황어의 유전형분석을 최적화하였으며 이에 대한 시약 조성은DNA template 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(10mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(2.5U/ul) 0.6ul, 형광이 표지된 8개 마커 세트의 경우 TrHa(3)_014는 0.35ul, TrHa(4)_005는 0.15ul, TrHa(4)_003은 0.1ul, TrHa(4)_014는 0.35ul, TrHa(4)_007는 0.1ul TrHa(4)_015는 0.35ul, TrHa(3)_012는 0.35ul, TrHa(4)_001는 0.1ul로 혼합하고 총량이 15ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다.
PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 5분 간 최종신장반응을 시켜준 후 8℃로 마무리하였다.
<실험예 5> 유전자형 분석(Genotyping analysis)
증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다.
상기 시료는 자동염기서열 분석장치 인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하였다. 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 마커별 대립유전자 빈도를 나타낸다. 각 마커 별로 사이즈가 오버랩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료 색 차이로 구분될 수 있으며 파란색으로 나타나는 피크는 FAM, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC, 노란색으로 나타나는 피크는 NED, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET이며 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 를 이용하여 각 마커에 대한 증폭 사이즈(bp)를 알 수 있었다. 각 마커에 대한 빈도를 확인한 결과 전체적으로 안정적인 빈도분포가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 마커에 대한 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석
개발된 황어의 multiplex PCR set를 이용하여 총 100개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다. 대립유전자의 수는 평균 15.3개로 높게 나타났다. 대립유전자 수 보정치(allele richness)를 적용하여 분석한 결과도 평균 15.3개로 대립유전자의 수(K)와 유사하게 나타나 증폭효율성면에서도 매우 우수한 것을 알 수 있다.
다형성정보지수(PIC)는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률로 다시 말하면 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하는 것으로 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있다. 개발된 16개의 마커에 대한 값은 평균 0.777로 매우 식별력이 높은 마커라는 것이 확인되었다.
8 loci에 대해 개발된 황어 multiplex PCR set를 이용하여 울주군 태화강생태관에서 관리 중인 종자 192개체 및 강원도 양양 남애항 인근의 위판장에서 채집된 96개체 총 288개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다.
하기의 표 2는 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석결과를 나타낸다. 총 288개체에 대한 집단유전학적 분석의 결과를 확인하였을 때 대립유전자의 수(K)는 13~28개로 평균 19.38로 나타났으며, 집단의 크기를 보정한 대립유전자 수인 대립유전자 수 보정치(Ar, allele richness)의 평균 값도 14.25로 마커의 증폭효율성면에서 매우 우수한 것을 알 수 있다.
다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석결과
Loci k Ar He PIC
TrHa(3)_012(R) 15.00 15.00 0.804 0.777
TrHa(3)_014(B) 19.00 18.92 0.882 0.869
TrHa(4)_001(R) 20.00 19.98 0.902 0.892
TrHa(4)_003(G) 13.00 13.00 0.825 0.806
TrHa(4)_005(B) 28.00 27.94 0.916 0.908
TrHa(4)_007(Y) 22.00 21.99 0.924 0.917
TrHa(4)_014(G) 23.00 22.98 0.930 0.924
TrHa(4)_015(Y) 15.00 15.00 0.854 0.838
Average 19.38 19.35 0.880 0.866
이형접합률의 평균도 0.880로 높게 나타났으며 다형성정보지수(PIC)는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률을 말하며 이는 개체식별 및 친자분석을 위한 마커의 다양성 척도라고 할 수 있다. 개발된 8개쌍의 마커에 대한 다형성 정보지수의 값은 평균 0.866으로 매우 우수하다는 것이 확인되었다.
<실험예 7>친자확인 분석 및 혈연관계 분석위한 마커 식별력 검증
가축이나 어류에서 친자확인법은 주로 maximum likelihood 방법을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 여기서 중요한 것은 사용되는 마커가 높은 식별력을 가지는 정확한 마커를 사용해야하며 식별력 계산은 하기의 공식에 따라 산정되었다.
<식별력 계산 공식>
Figure 112022136008444-pat00001
하기의 표 3은 마커별 식별력 계산값을 나타낸다. 황어 100개체 분석 결과에 대한 1개의 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석하였다. 마커 전체의 Exclusion power는 1.166X10-9으로 높은 변별력을 나타내었으며, 이는 개체식별 시 99.999999….% 이상으로 통계적 신뢰수준이 높다는 것을 말한다. 또한 대립유전자빈도에서도 각 마커들이 특정 유전형에 편중된 것이 아닌 것으로 보아 마커의 식별력은 우수하는 것을 뒷받침한다.
각 마커별 식별력 계산 값
Maker Power of each marker
TrHa(3)_012(R) 0.1933
TrHa(3)_014(B) 0.0857
TrHa(4)_001(R) 0.0640
TrHa(4)_003(G) 0.1477
TrHa(4)_005(B) 0.0459
TrHa(4)_007(Y) 0.0403
TrHa(4)_014(G) 0.0346
TrHa(4)_015(Y) 0.1164
Exclusion Power 1.166E-0009
따라서 이후에는 본 개발 마커를 이용하여 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계검증, 개체식별, 선발육종 등 많은 부분에 사용 가능한 마커로 나타났다. 그러나 추가적으로 마커의 고도화를 위해 실제 친자관계의 가계를 이용한 마커 검증과 친자식별력을 분석하고 최종적으로는 오류의 가능성을 고려한 통계적 친자관계 판정을 위해 LOD Score(log of likelihood ratio, 관계지수 로그 값)을 확립하는 과정이 필요할 것이다.
본 발명의 황어 친자 식별 마커 및 식별방법은 황어의 집단, 계통분석, 친자 확인 등에 적용하여 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터 베이스를 제공함으로써, 고부가 가치의 황어 생산에 기여함으로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (2)

  1. TrHa(3)014, TrHa(4)005, TrHa(4)003, TrHa(4)014, TrHa(4)007, TrHa(4)015, TrHa(3)012, TrHa(4)001의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며, 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 황어의 친자 식별용 프라이머 세트
  2. 분석하고자 하는 황어의 핵산 시료를 청구항 1의 황어 친자 식별용 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계,
    상기 증폭 단계에서 증폭된 산물을 이용하여 유전적 다양성을 분석하되, 상기 유전적 다양성 분석은 유전자당 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수 (Polymorphic Information Content; PIC), 대립유전자 수(K), 관찰치 및 기대치 이형접합체율(Ho, He), 대립유전자수 보정치(Allelic richness; Ar)와 유전자 다양성(Gene diversity) 지수, 근교계수(FIS)값 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 황어 친자 식별 방법
KR1020220177486A 2022-12-16 2022-12-16 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 KR102527604B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220177486A KR102527604B1 (ko) 2022-12-16 2022-12-16 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220177486A KR102527604B1 (ko) 2022-12-16 2022-12-16 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102527604B1 true KR102527604B1 (ko) 2023-05-03

Family

ID=86380173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220177486A KR102527604B1 (ko) 2022-12-16 2022-12-16 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102527604B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102062452B1 (ko) 2018-05-29 2020-01-03 주식회사 불루젠코리아 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
KR102077917B1 (ko) 2018-05-29 2020-02-17 주식회사 불루젠코리아 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102062452B1 (ko) 2018-05-29 2020-01-03 주식회사 불루젠코리아 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
KR102077917B1 (ko) 2018-05-29 2020-02-17 주식회사 불루젠코리아 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conservation genetics resources v.3 no.3 ,pp. 565 - 567 , 2011 , 1877-7252 , Springer-Verlag *
Journal of fishery sciences of China v.12 no.6 ,pp. 688 - 693 , 2005 , 1005-8737 , 中國水産科學編輯部 *
Journal of the Korean Fisheries Society v.18 no.4 ,pp. 381 - 400 , 1985 , 0374-8111 , 한국수산과학회 *
Korean journal of environment and ecology v.26 no.4 ,pp. 475 - 483 , 2012 , 1229-3857 , 한국환경생태학회 *
Korean journal of environment and ecology v.26 no.4 ,pp. 475 - 483 , 2012 , 한국환경생태학회 *
The Korean journal of zoology v.38 no.1 ,pp. 87 - 95 , 1995 , 0440-2510 , 한국통합생물학회 *
국내 등록특허번호 제10-2064039호에는 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 미세위성 마커는 붉바리의 친어 집단에 대한 개체 식별 및 친자 확인을 위하여 매우 효율성이 높은 마커를 제공할 수 있으며, 개체식별 및 친자 확인에 효과적으로 사용가능 한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 마이크로새틀라이트 마커 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제1세트와; 마이크로새틀라이트 마커 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27,PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제2세트;를 포함하여 문치가자미(Limandayokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공함으로써, 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다.
문정찬 외 14명, 멸종위기종 유전다양성 및 고유성 연구, 국립생태원 (2021) *
전창영, 박사학위논문 (2006) 여수대학교 대학원 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102077917B1 (ko) 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
KR102062452B1 (ko) 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
KR102301324B1 (ko) 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
CN109295179B (zh) 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒
CN104962634A (zh) 用于检测鸡体尺性状的试剂盒及鸡的分子育种方法
KR102064039B1 (ko) 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커
KR102039309B1 (ko) 재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법
CN104894289A (zh) 用于检测鸡生长性状的试剂盒及鸡的分子育种方法
KR102527604B1 (ko) 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법
KR102111238B1 (ko) 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법
KR102458440B1 (ko) 고추 역병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 고추 역병 저항성 판별 방법
KR102633387B1 (ko) 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 방류종자의 친자확인방법
KR102530346B1 (ko) 홍해삼 식별용 유전자 마커를 이용한 친자확인방법
KR102530342B1 (ko) 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법
JP4982746B2 (ja) Ｄｎａマーカーを用いたブタの親子判定方法
KR101535925B1 (ko) 염소 개체 식별용 초위성체 마커
CN108841930B (zh) 一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用
KR101878539B1 (ko) 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도
KR101740634B1 (ko) 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물
CN117551782B (zh) 与鸡蛋尖端蛋壳厚度相关的分子标记在鸡遗传育种中的应用
KR102369297B1 (ko) 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도
KR102491092B1 (ko) 방어 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 마커 및 이의 용도
KR102276917B1 (ko) 들깨 및 차조기 품종 판별용 est-ssr 프라이머 세트, 이를 포함하는 들깨 및 차조기 품종 판별용 키트, 그리고 이를 이용한 들깨 및 차조기 품종의 유전자원 판별 방법
KR101821554B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 칡소의 유전자 품종 식별 방법
Bayerl From low-throughput SSR genotyping to high-throughput SNP analyses of natural populations: validation of their application focused on non-invasive samples

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant