KR101740634B1 - 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 유전자 조성물은 와규에 특화된 SNP 마커로 구성되어 와규 집단에 대해 높은 분리값(separation value)과 낮은 위양성 및 위음성 비율을 가지므로, 와규의 친자를 감별하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물{GENE COMPOSITION FOR PARENTAGE TESTING IN WAGYU}
본 발명은 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 와규에 특화된 SNP 마커를 검출할 수 있는 유전자 조성물, DNA 칩 및 이를 이용한 와규의 친자 감별 방법에 관한 것이다.
와규는 일본의 대표적인 가축으로서, 풍부한 마블링(근육내 지방) 및 부드러운 육질로 인해 국내에서도 상당한 인기를 끌고 있다. 와규는 19세기 말부터 재래 품종과 서양 소를 여러 번 교배해 개량한 품종으로서, 육질 개량을 통해 그 가치를 인정받고 있다.
와규의 유전 능력을 향상시키기 위해 그 혈통을 확인하는 것이 필수적이다. 와규의 정확한 친자 감별은 육종 프로그램의 성공을 위해 필수적이며, 이를 통해 생산력이 정확한 가계에 다시 이어져 육종가의 예상치를 개선할 수 있다. 하지만, 상업적인 육종 프로그램에서는 자료 손실, 인간의 실수 또는 고의적인 위조로 인해 혈통 문제가 일어날 수 있다. 이와 같은 경우, DNA 기반의 친자 감별이 와규의 혈통을 밝히고 육종 프로그램을 개선하는데 도움을 줄 수 있다.
이와 관련하여, 국제 동물 유전학 학회(International Society for Animal Genetics; ISAG)에서는 유럽 가축우(Bos Taurus cattle)의 혈통 검사를 위한 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 마커 세트를 제안한 바 있다. 상기 SNP 마커 세트는 100개의 코어(core) SNP 및 부가적인 100개의 마커로 구성되어 있다(ISAG CMMPT. (2012) Cattle Molecular Markers and Parentage Testing Workshop. In: ISAG Conference, Cairns). 하지만, 상기 코어 SNP는 주로 유럽 황소 품종에 특이적인 SNP로만 구성되어 있기 때문에, 상기 마커 세트는 이들과 혈연관계가 없는 품종, 예를 들면 와규에서의 친자 감별에 적합하지 않다(Werner F.A. et al., (2004) Detection and characterization of SNPs useful for identity control and parentage testing in major European dairy breeds. Anim Genet 35, 44-9).
따라서, 와규의 친자 감별에 특화된 새로운 SNP 마커 및 이를 검출할 수 있는 유전자 조성물의 개발이 요구된다.
ISAG CMMPT. (2012) Cattle Molecular Markers and Parentage Testing Workshop. In: ISAG Conference, Cairns Werner F.A. et al., (2004) Detection and characterization of SNPs useful for identity control and parentage testing in major European dairy breeds. Anim Genet 35, 44-9
따라서, 본 발명의 목적은 와규의 친자 감별에 사용될 수 있는, SNP 마커를 검출하기 위한 유전자 조성물 및 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 칩을 이용하여 간편하게 와규의 친자를 감별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본원 표 2에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 구성된, 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본원 표 3에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 구성된, 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 폴리뉴클레오타이드가 고정된, 와규의 친자 감별을 위한 DNA 칩을 제공한다.
나아가, 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 와규로부터 핵산 시료를 얻는 단계; (ii) 상기 핵산 시료를 전술한 DNA 칩과 혼성화시키는 단계; 및 (iii) 상기 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 와규의 친자 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 조성물은 와규에 특화된 SNP 마커로 구성되어 와규 집단에 대해 높은 분리값(separation value)과 낮은 위양성 및 위음성 비율을 가지므로, 와규의 친자를 감별하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 ISAG 코어 패널 및 ISAG 전체 패널, 및 본 발명에 따른 코어 패널 및 전체 패널에서의 참된 아비-자식 관계와 거짓된 아비-자식 관계 사이의 분리값을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 본원 표 2에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 구성된, 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물을 제공한다.
상기 표 2에 기재된 단일염기다형 부위는 와규의 상염색체 내에 존재하는 것으로서, 종래 알려진 50K SNP 칩 패널(illumina Inc., USA)에 존재하는 SNP 마커 중 유전자형 빈도에 기초하여 선발된 마커들이다.
상기 마커는, 종래 공지된 유럽 가축우(Bos Taurus cattle)의 친자 감별을 위한 ISAG 패널과 비교하여, 와규 집단에 대한 참된 아비-자식(sire-offspring) 관계와 거짓된 아비-자식 관계 사이의 분리값(separation value)이 높고 위양성 비율(false-positive rate) 및 위음성 비율(false-negative rate)이 낮아, 와규 집단의 친자 감별에 적합하다.
본 발명에 따른 유전자 조성물은, 본원 표 3에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
상기 표 3에 기재된 단일염기다형 부위는 상기 표 2에 기재된 단일염기다형 부위 외에 추가적으로 ISAG 패널에서의 부가적인 단일염기다형 부위를 포함한다. 즉, 본 발명에 따른 유전자 조성물은, 표 2에 기재된 99개의 코어 패널(core panel), 및 ISAG 패널에서의 부가적인 100개의 마커로 구성된, 총 199개의 전체 패널(full panel)이다.
상기 전체 패널은 전술한 99개의 마커로 구성된 코어 패널에 비해 분리값이 높고, 위양성 비율 및 위음성 비율이 낮아, 와규 집단의 친자 감별에 더 적합하다.
한편, 본 발명은 전술한 폴리뉴클레오타이드가 고정된, 와규의 친자 감별을 위한 DNA 칩을 제공한다. 상기 DNA 칩은 전술한 폴리뉴클레오타이드가 고정된 것을 제외하면, 종래 통상적인 DNA 칩과 크게 다르지 않다. 상기 DNA 칩의 구성 및 제조방법은 종래 공지된 방법을 참조한다.
또한, 본 발명은 (i) 와규로부터 핵산 시료를 얻는 단계; (ii) 상기 핵산 시료를 전술한 DNA 칩과 혼성화시키는 단계; 및 (iii) 상기 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 와규의 친자 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (i)은 와규로부터 핵산 시료를 얻는 과정으로서, 이는 당해 기술분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 상기 핵산 시료는 와규의 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 상기 핵산 시료가 게놈 DNA인 경우, 게놈 DNA의 분리는, 본 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers S. O. and A.J. Bendich. 1988, In Plant Molecular Biology Manual).
또한 상기 핵산 시료가 mRNA인 경우에는, mRNA의 분리는 본 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 총 RNA를 분리함으로써 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2001; Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987; 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156, 1987). 상기 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있는데, 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이어서 mRNA의 말단에 폴리-A 테일을 갖고 있으므로, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)에서는 본 발명의 단일염기다형을 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 프로브는 본 발명의 단일염기다형 부위와 혼성화되며, 이때 발생하는 혼성화 신호를 검출하여 단일염기다형 변이 여부를 직접 결정할 수 있다. 상기 이용되는 프로브로서, 상기 단일염기다형을 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 단일염기다형 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 단일염기다형 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2001 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, 1985]에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 단계 (iii)의 결과 분석은 본 기술분야에 널리 알려진 공지된 방법을 적용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 단일염기다형을 분석하기 위한 방법으로서, 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 또는 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 유전자 조성물의 확인은 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시될 수 있다. 단일염기다형이 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP(single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.
본 발명에서는 폴리뉴클레오타이드의 크기를 20 ~ 200 bp로 한정하였으나, 이것은 현재의 혼성화 기술로 재현이 가능한 수준에서 기술적인 구체성을 나타내도록 바람직하게 한정한 것에 불과하며, 상기 단일염기다형을 식별할 수 있는 정도라면 사용하는 기술에 따라 상기 범위를 벗어나는 크기로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 와규의 친자 감별 방법은 종래 공지된 ISAG 패널을 이용한 방법에 비해 정확도가 우수하므로, 와규의 육종 프로그램에서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 와규 친자 감별을 위한 SNP 마커의 선발
<1-1> 코어 패널을 위한 SNP 마커의 선발
종래 공지된 50K SNP 칩 패널(illumina Inc., USA)로부터 유전자형 빈도를 비교분석하는 과정을 통하여, 와규 품종에 특이적인 245개의 SNP 마커를 1차 선발하였다. 상기 SNP 마커는 119마리의 동물의 집단으로부터 선발하였고, 상기 선발은 high call rate(GC score), 하디-웨인버그 평형에서의 SNP(미래의 마커 고정의 가능성을 최소화하기 위해), 및 높은 수준의 개체 차별화를 달성하기 위해 높은 최소 대립유전자 빈도(minor allele frequency) 및 이형접합성에 의해 표시되는 마커 다양성에 기초하였고, 마커 간 연관성을 줄이기 위해 염색체 전역에 고르게 분포하는 마커를 선발하였다.
상기 선발된 245개의 SNP 마커를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112015035851754-pat00001
Figure 112015035851754-pat00002
Figure 112015035851754-pat00003
Figure 112015035851754-pat00004
Figure 112015035851754-pat00005
Figure 112015035851754-pat00006

상기 선발된 245개의 SNP 마커로부터 염색체 위치, 마커간의 거리 및 유전자형 빈도를 고려하여 코어 패널(core panel)을 위한 99개의 SNP 마커를 2차 선발하였다.
상기 선발된 99개의 SNP 마커를 표 2에 나타내었다.
Figure 112015035851754-pat00007
Figure 112015035851754-pat00008
Figure 112015035851754-pat00009

<1-2> 전체 패널의 제작
코어 패널로서 실시예 1에서 선발된 99개의 SNP 마커 외에, 국제 동물 유전학 학회(International Society for Animal Genetics; ISAG)으로부터 제안된 100개의 부가적인 SNP 마커(http://www.isag.us/committees.asp?autotry=true&ULnotkn=true)를 포함하여 총 199개의 마커로 구성된 전체 패널(full panel)을 완성하였다.
상기 와규의 친자 감별을 위한 전체 패널을 구성하는 SNP 마커를 표 3에 나타내었다.
Figure 112015035851754-pat00010
Figure 112015035851754-pat00011
Figure 112015035851754-pat00012
Figure 112015035851754-pat00013
Figure 112015035851754-pat00014

실시예 2: 마커 패널의 효율성 비교
실시예 1에서 제작된 코어 패널 및 전체 패널의 효율성을 종래 공지된 패널과 비교하였다. 비교를 위한 패널로서, 100개의 마커로 구성된 ISAG 코어 패널 및 상기 ISAG 코어 패널에 추가된 부가적인 100개의 마커(총 200개)로 구성된 ISAG 전체 패널(http://www.isag.us/committees.asp?autotry=true&ULnotkn=true)을 선택하였다.
상기 마커 패널들의 효율성을 순수한 검정 오스트레일리아 와규의 집단(33마리)에 대해 시험하였다. 상기 와규 집단은 반형매 집단의 후대검정우로서, 개체의 아비의 유전자형을 포함한 집단이다.
<2-1> 와규 집단의 유전자형 분석
상기 와규 집단을 50K BovineSNP50 v2 Beadchip (Matukumalliet al. 2009; Illumina, Inc.)을 이용하여 유전자형을 분석한 결과, 상기 집단은 5마리의 아비(sire)와 상기 아비로부터 태어난 27마리의 자식(offspring; 아비 당 2 내지 13마리의 자식)으로 구성되어 있었다. 아비들 간의 관련성에 관한 정보는 이용할 수 없었으나, 이들 품종의 작은 집단 크기로 인해 아비들이 어느 정도 관련되어 있을 것으로 예상되었다.
<2-2> 배제력(exclulsion power) 계산
본 발명에 따른 코어 패널 및 전체 패널이 얼마나 효과적으로 작동하는지 예측하기 위한 1차 평가로서, 상기 패널에 대해 문헌[Jamieson A. & Taylor S.C. (1997) Animal Genetics 28, 397-400)에 따라 하나의 공지된 부모의 시나리오에 대한 배제력을 계산하였다. 비교를 위해, ISAG 코어 패널 및 ISAG 전체 패널을 사용하였다.
상기 배제력 계산 결과, ISAG 코어 및 전체 패널은 와규 집단에서 0.99의 총 배제력을 나타낸 반면, 본 발명의 코어 패널은 0.99의 배제력을 나타내었고 본 발명의 전체 패널은 1의 배제력을 나타내었다.
상기 결과는 본 발명에 따른 패널 및 ISAG 패널이 잘못된 아비-자식 할당을 확인하는데 잘 작동할 것임을 보여주며, 특히 본 발명에 따른 전체 패널이 ISAG 전체 패널보다 더 우수하다는 것을 입증한다.
<2-3> 분리값 계산
각 집단에 대해, 마커 유전자형을 사용하여 각 동물의 대립 동형접합체의 수를 계산하였다(Ferdosi M.H., Kinghorn B.B.P., Werf J.H.J.V.D. & Gondro C. (2014) Genetics, Selection, Evolution, 46, 11). 임의의 주어진 마커에 대한 대립 동형접합체는 하나의 개체가 하나의 대립유전자 변이체에 대해 동형접합이고 다른 개체는 대체 대립유전자에 대해 동형접합인 것으로 정의된다. 이것은 지노타이핑 오류 또는 일어날 것 같지 않은 돌연변이를 제외한, 참된 아비-자식 관계에서 일어나지 않아야 하는, 멘델의 비일관성을 확인하는 쉬운 방법이다. 반면, 대립 동형접합체는 관련이 없는 동물 사이에서 더 빈번하게 일어나야 하며, 혈통 관계를 배제하는데 사용될 수 있다(Hayes B.J. (2011) Journal of Dairy Science 94, 2114-7).
혈통 마커 패널의 효율성을 평가하는 직관적인 접근법은 모든 거짓된 아비-자식 관계에서 발견되는 대립 동형접합체의 최소수(즉, 실제 부모-자식 쌍을 제외한 모든 쌍별 조합(pairwise combination))와 정확한 아비-자식 쌍에서의 대립 동형접합체의 최대수 사이의 차이를 계산하는 것이다(Hayes B.J. (2011) Journal of Dairy Science 94, 2114-7). 이 차이는 상이한 패널 크기 사이의 비교를 위해 패널 내의 SNP의 총 수로 나뉠 수 있다. 이 차이를 분리값(separation value)으로 지칭하였다. 직관적으로, 상기 값이 클수록 패널의 혈통 할당이 더 우수하며, 만약 상기 값이 0이나 음수가 되면, 참된 아비-자식 관계와 거짓된 아비-자식 관계의 완벽한 분리가 불가능하다. 대립 동형접합체의 수가 패널, 집단 및 동물에 특이적이기 때문에, 실제적인 분리 값은 데이터 세트 내에서만 의미가 있다는 점에 유의해야 한다.
상기 분리값 측정 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, ISAG 코어 패널의 분리값은 와규 집단에서 0으로 나타났다. 상기 결과는 ISAG 코어 패널이 참된 아비-자식 관계와 거짓된 아비-자식 관계를 분리하기 어렵다는 것을 보여주었는데, 이는 ISAG 코어 패널의 높은 배제력과 대조적이었다. 반면, 본 발명에 따른 코어 패널의 분리값은 양수를 나타내어, 본 발명의 코어 패널이 ISAG 코어 패널보다 우수하다는 것을 입증하였다.
한편, 본 발명에 따른 전체 패널은 ISAG 전체 패널보다 높은 분리값을 나타내었는데, 이는 본 발명의 전체 패널이 ISAG 전체 패널보다 우수하다는 것을 입증한다.
<2-4> 위양성 및 위음성 비율 계산
이후, 모든 쌍별 아비-자식 조합으로부터 확인된 관계의 총 수로부터 잘못 할당된 아비-자식 관계의 비율로서 위양성 비율(false-positive rate)을 계산하였다. 또한, 가능한 참된 관계의 총 수로부터 잘못 배제된 아비-자식 관계의 비율로서 위음성 비율(false-negative rate)을 계산하였다. ISAG 지침에 따라 그리고 지노타이핑 오류를 수용하기 위해, 허용된 혈통에서 최대 하나의 대립 동형접합체를 허용하였다.
상기 계산 결과를 표 4에 나타내었다.
집단
(#아비/자식)		 패널 MAF He 코어 패널 전체 패널
fp% fn% fp% fn%
와규
(5/27)		 ISAG 0.29 0.39 3.57 0 0 0
와규 0.39 0.48 0 0 0 0
MAF: 모든 마커들의 평균 소수 대립유전자 빈도
He: 모든 마커들의 평균 이형접합성
fp: 위양성 비율
fn: 위음성 비율
상기 표 4에서 보는 바와 같이, ISAG 코어 패널의 위양성 비율은 3.57%였고, 위음성 비율은 0%였다. 또한, ISAG 전체 패널의 위양성 비율은 0%였고, 위음성 비율은 0%였다.
반면, 본 발명에 따른 코어 패널은 0%의 위양성 비율 및 0%의 위음성 비율을 나타내었고, 본 발명에 따른 전체 패널도 0%의 위양성 비율 및 0%의 위음성 비율을 나타내었다.
상기 결과는, 본 발명에 따른 코어 패널 및 전체 패널이 와규의 친자 감별에 있어 종래 알려진 ISAG 패널에 비해 효과적임을 입증한다.

Claims (4)

  1. 하기 표 2에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 각각 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 모두로 구성된, 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물.
    <표 2>
    Figure 112016122771472-pat00015

    Figure 112016122771472-pat00016

    Figure 112016122771472-pat00017

  2. 하기 표 3에 기재된 단일염기다형(SNP) 부위를 각각 포함하는 20개 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 모두로 구성된, 와규의 친자 감별을 위한 유전자 조성물.
    <표 3>
    Figure 112016122771472-pat00018

    Figure 112016122771472-pat00019

    Figure 112016122771472-pat00020

    Figure 112016122771472-pat00021

    Figure 112016122771472-pat00022

  3. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오타이드가 고정된, 와규의 친자 감별을 위한 DNA 칩.
  4. (i) 와규로부터 핵산 시료를 얻는 단계;
    (ii) 상기 핵산 시료를 제3항에 따른 DNA 칩과 혼성화시키는 단계; 및
    (iii) 상기 혼성화 결과를 분석하는 단계
    를 포함하는, 와규의 친자 감별 방법.
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