KR101663404B1

KR101663404B1 - Tdrkh 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법

Info

Publication number: KR101663404B1
Application number: KR1020150006347A
Authority: KR
Inventors: 오동엽; 하재정; 박상일; 조영직
Original assignee: 오동엽; 하재정; 박상일; 조영직
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2016-10-06
Also published as: KR20160087245A

Abstract

본 발명은 TDRKH 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 SNP 마커를 이용한 한우 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공한다. 이를 토대로 육질이 우수한 한우품종을 조기에 선발하여 개량하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

TDRKH 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법{Single nucleotide polymorphism marker in TDRKH gene for diagnosis of meat quality in Hanwoo and method for diagnosis of meat quality in Hanwoo using same marker}

본 발명은 TDRKH 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것이다.

우리나라 한우산업은 총 생산액이 연간 약 4조6천억 원으로 전체 축산물 생산액의 27.95%를 차지하고 있어(2012 농축식품통계) 산업적 경제적 부가가치가 가장 높은 동물자원으로 농가소득 및 농촌경제에 큰 영향을 미치는 농촌의 대표적 기간산업으로 인정받고 있다. 그러나 최근 한미 FTA 협상과 미국산 쇠고기 수입재개, 그리고 앞으로 이어질 EU, 일본, 호주, 중국과 FTA에 따른 쇠고기의 수입은 한우 사육농가의 위기의식과 더불어 큰 피해가 예상되고 있어 우리나라 소비자들이 선호하는 고품질 차별화 한우쇠고기 생산을 통한 경쟁력 향상이 강력히 요구되고 있는 실정이다.

쇠고기의 육질은 품종에 따라 크게 차이가 나며 같은 품종이라도 성별, 거세유무 등에 따라 달라지고 동일한 도체 내에서도 부위에 따라 근육 및 지방분포 상태가 다르며 육질에도 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 우리나라 고유의 쇠고기 생산 자원인 한우는 성장 속도가 느린 만숙종으로서 비육 생리상 외국의 육우와는 달리 육질을 결정하는 근내지방의 침착이 늦게 이루어지는 특성을 갖고 있는 반면 육질이 우수하여 고급육 생산을 위한 비육우로서 그 유전적 자질이 높게 평가되고 있다.

현재까지 한우의 육질관련 DNA marker 개발 연구에 주로 이용되어진 방법으로는 대부분 생리적으로 지방대사(lipid metabolism) 또는 근내지방 축적(intramuscular fat deposition)에 관련된 후보유전자를 탐색하여 선발 (candidate gene approach) 하거나 또는 기 보고된 관련 형질의 QTL (Quantitative Trait Locus)에 인접한 유전자를 선발하여 SNP를 탐색하고, 경제형질과 연관성을 분석하는 수준에 머물러 있는 실정이다. 그러나 이와 같은 방법으로 개발된 마커들의 경우, 후보유전자 선정 시 기 보고된 유전자의 생리적 특성에만 의존하여 후보유전자를 선정하기 때문에 관련 형질과 밀접한 연관성을 갖거나 육질발현 및 결정에 직접 관여하는 후보유전자를 정확히 선발하기에는 한계가 있고 이용 가능한 후보유전자들의 수가 제한적이다.

따라서, 특정 유전자에서 이미 알려진 생리적 또는 생물학적 특성에 의존하여 후보유전자를 선발하는 기존의 한우 경제형질 관련 후보유전자 검색 방법에 비해 보다 정확하고 다수의 기능성 후보유전자 선발 방법이 필요하며, 또한 단일 SNP marker가 아닌 다수의 SNP marker를 조합하여 multiple DNA marker를 이용하는 분자육종 기술 개발이 무엇보다도 시급한 실정이다.

한국공개특허 10-2014-0057761(2014.05.14 공개)

본 발명의 목적은 TDRKH 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 한우 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 유전자형으로 한우 육질을 판단하는 단계를 포함하는 한우 육질의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 한우 육질 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 TDRKH 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 고밀도 SNP 패널을 이용한 한우 유전체 전단 가축화 기원 선발신호분석 및 차세대염기서열분석을 이용한 육질 표현형 연관 영역에 대한 엑손 유전체서열 분석을 통해 육질 표현형 조절과 관련된 신규 SNP를 검출하여 유전체 활용 선발기법을 개발하고, 농가 현장검증을 통해 이들 마커의 산업적 적용 가능 여부를 검토하여 한우 육종개량의 효율성을 개선시킬 수 있는 실용화 기술을 개발하여 농가 소득 향상에 크게 기여할 것이다.

도 1은 한우 등심 조직 채취부위를 나타낸다.
도 2는 SNP 유전자형 분석방법을 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 한우 육질 진단은 도체중을 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 g.17257 A>G로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 TDRKH 유전자 내에 위치한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미한다. 한편, 본 명세서 서열번호 1의 염기서열은 다중염기기재 방식에 따라 작성하였다.

바람직하게는, 상기 한우 육질 판단은 도체중을 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 DNA의 공급부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며 (참조: Rogers & Bendich (1994), 출발물질이 mRNA인 경우에는, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있다.

상기 진단용 키트에는 본 발명의 한우 육질 진단용 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

상기 "증폭시킬 수 있는 프라이머"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 실험동물

실험동물은 1차 년도에 확립된 경북 지역의 14곳의 시, 군 단위에서 사육 되어진 거세우로, 참품한우 사양관리 지침에 따라 26~33개월에서 출하하는 612두의 genomic DNA sample과 능력 자료를 사용하였다.

본 발명에서 사용 되어진 한우의 등심조직은 흉추 제 13, 요추 제 1마디 38번 최장근부분에서 절개하여 채취하였으며(도 1), 각 조직은 근외지방을 제거한 뒤 -80℃에서 보관하였다.

2. 실험 대상 형질

본 발명에 사용되어진 형질은 도체중, 등심단면적, 등지방두께, 근내지방도이며 농림수산식품부 고시 제2011-46호에 의거하여 4가지 형질을 조사하였다. 조사방법은 아래와 같다.

(1) 도체중

도체중은 도축경영자가 측정하여 제출한 도체 한 마리 분의 중량을 ㎏ 단위로 적용하였다.

(2) 배최장근단면적

등급판정부위에서 가로, 세로가 1cm 단위로 표시된 면적자를 이용하여 배최장근의 단면적을 cm² 단위로 측정한다. 다만, 배최장근 주위의 배다열근, 두반극근과 배반극근은 제외한다.

(3) 등지방두께

등급판정부위에서 배최장근단면의 오른쪽면을 따라 복부쪽으로 3분의 2 들어간 지점의 등지방을 ㎜단위로 측정한다. 다만, 등지방두께가 1㎜ 이하인 경우에는 1㎜로 한다.

(4) 근내지방도

등급판정부위에서 배최장근단면에 나타난 지방분포정도를 근내지방도 기준(농림수산식품부고시 제2011-46호; 제1장 제5조 관련)과 비교하여 판정하였다.

3. Genomic DNA 추출

Genomic DNA 추출은 한우 조직의 약 12mg을 1.5ml tube에 넣고 Cell Lysis Solution (AL buffer) 300㎕를 첨가한 뒤, 단백질을 제거하기 위해 단백질 분해효소인 Proteinase K (10mg/㎖, Promega Co, USA)를 total volume의 1/100배인 150㎕를 넣어 37℃에서 12시간 동안 배양시켰다.

배양 후 단백질 침전을 위해 동일 량의 TE (Tri-EDTA) : phenol (1:1)을 넣고 2시간 동안 20분 간격으로 천천히 흔들어 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 DNA 수용액 층을 채취하고 다시 동일 량의 Phenol : Chloroform : Iso-amylalchol (25:24:1)을 넣고 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 재차 DNA 수용액 층을 채취하였다.

에틸 에테르(Ethyl ether) 2 volume을 넣어 백색의 DNA 수용액 층이 투명해질 때까지 흔든 후 3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 에틸 에테르(Ethyl ether)를 휘발시켜 제거하였다. 3M 소듐 아세테이트(sodium acetate; pH 5.2)를 total volume의 1/10배를 첨가하고, 100% 에탄올(ethanol)을 넣어 DNA를 응축시키고 70% ethanol을 20정도 넣고 DNA를 세정하였다. 완전히 에탄올(ethanol)을 제거한 후, TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)를 약 1 ~ 2㎖정도 넣어 DNA를 용해시켜 4℃에 보관하였다.

DNA를 완전히 용해시키고 정량분석을 위해 3차 증류수 950㎕ 에 50㎕의 DNA를 첨가하여 20배 희석한 후 spectrophotometer (SHIMADZU, Japan)를 이용하여 260nm와 280nm 흡광도에서 측정하여 OD₂₆₀ / OD₂₈₀의 비가 1.8 ~ 2.0정도인 DNA를 사용하였다.

4. SNP genotype

본 발명에서 SNP genotyping은 SBE (single-based extension, Vreeland 등, 2002) 방식을 이용하는 ABI PRISM® SNaPshot^TM Multiplex Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다.

(1) Primer 제작 및 PCR 증폭

먼저 후보 SNP 발굴을 위해 NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 활용하였으며 SNP에 사용된 primer는 primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)를 이용하여 합성하였다. 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 실시하였으며, 그 조건은 다음과 같다.

20ng genomic DNA, 0.25U Taq polymerase (Solgent Co., Ltd, South Korea), 1x buffer, 0.2mM dNTP, 5pmol primer (forward/reverse)를 첨가하여 전체 15㎕가 되도록 하고 혼합한 후 94℃ 5분에서 1 cycle, 94℃에서 30초, 합성온도에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 35 cycle, 72℃ 3분에서 1cycle을 반응시켰다. 생성된 PCR product에서 1㎕를 전기영동하여 생성물을 확인하였다.

(2) PCR product 정제

PCR product에 5U SAP (shrimp alkaline phosphatase)와 2U Exo I (exonuclease I, E. coli)을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 75℃에서 15분간 불활성화 시켰다.

(3) SBE (Single-based extension) 반응

SBE 반응을 위해 ABI PRISM® SNaPshot^TM Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였고, 그 조건은 다음과 같다. 정제된 PCR product 1㎕, SNaPShot multiplex ready reaction mix 1㎕, 5pmol SNaPShot primer 1㎕를 넣어 전체 10㎕가 되게 하고 잘 혼합하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초의 조건으로 25 cycle을 반응시켰다. 반응된 PCR product에 1U SAP를 첨가해준 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였고 75℃에서 15분 동안 불활성화 시켰다.

5. SNPs genotyping

최종적으로 준비된 PCR product 1㎕를 GeneScan-120 LIZ size standard (Applied Biosystems, Foster City, CA) 0.25㎕와 Hi-Di formamide 9.5㎕ (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 첨가하여 잘 섞어준 다음 95℃에서 5분간 변성시킨 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer에 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 PCR product는 GeneMapper v4.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 데이터를 입력하여 자동분석을 실시하였다(도 2).

6. 통계분석 방법

(1) 이형접합체율 (Heterozygosity)

이형접합체율(Heterozygosity)은 특정 마커에 대하여 무작위로 개체를 선발하였을 때 그 마커에 대한 이형접합 개체의 비율을 나타내며 그 값은 0~1사이의 값을 나타낸다. 이형접합체율 값이 클수록 마커의 다형성이 크며 마커의 유용성이 높다. 이형접합체율값은 다음 같이 정의된다.

H = 1-∑P_i ²

H = 이형접합체율

P_i = i번째 대립 유전자로부터의 측정된 빈도값

단, 유전자 내에서 대립 유전자의 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 유지해야 하며 이형접합체율은 모집단에서 대립유전자가 동일한 도수비율을 유지할 때 최대값을 가진다.

(2) 다양성정보량 (Polymorphism information content)

다양성 정보량은 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률을 주어진 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하게 되며 다음과 같이 정의한다(Wesis 등, 1993).

n = SNP의 대립유전자의 수

P_i = SNP의 i번째 대립유전자의 추정된 도수 비율

그리고 만약에 대립유전자의 수가 커지면 PIC(Polymorphism information content)값은 H(Heterozygosity)와 점점 비슷해진다.

(3) 하디-웨인버그 값 (Hardy-Weinberg equilibrium)

하디-웨인버그 값이란 외적인 요인이 작용하지 않는다면, 유전자와 유전자형 빈도가 모두 변하지 않고 평형을 이루게 된다는 것으로 이것을 만족하는 집단은 대립 유전형질의 독립성이 성립하게 된다. 따라서 유전자좌 내에서의 독립성 검정은 통계량을 이용한 적합도 검정으로 각 유전자형 범주에 대한 실제 관측빈도와 기대빈도를 이용 하여 다음과 같은 식으로 구하였다.

또한, DNA marker의 정보력이란 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있다. 그리고 앞서 말한 이형접합체(H)와 다양성 정보량(PIC)은 정보력의 척도로서 활용하였으며 1에 가까울수록 경제형질 관련 분석에 사용될 수 있는 유용한 marker라고 할 수 있다.

(4) 단일 유전자의 연관분석 (Association analysis)

각 SNPs의 연관분석은 ㈜참품한우에 소속되어 있는 일반농가 집단 513두의 도체중, 등지방두께, 근내지방도 및 지방산 조성의 측정기록으로 SPSS v19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 다음과 같은 통계모형으로 공 분산 분석과 유의성 검정을 실시하였다.

Y _ijkl = μ+ P _i + GS _j + SNP _k +β age _l + e _ijkl

Y_ijl = 도체형질 및 지방산 함량의 표현형,

μ = 각각의 형질에 대한 전체적인 평균,

P_i = 분만 장소의 고정 효과,

GS _j = 씨 숫소에 대한 임위 효과,

SNP_k = 마커 유전자형의 고정 효과,

βage_l = 도축일령에 대한 공변량,

e_ijkl = 임위 오차.

< 실시예 1> 근내지방도 및 도체형질에 연관된 26개 후보 SNPs 의 유전정보

근내지방도 및 도체형질에 연관된 26개의 후보 SNPs들에 대하여 현장검정을 실시하기 위해 먼저 각각 primer design을 한 결과는 표 1 및 표 2에서 확인할 수 있다.

도체형질 및 근내지방도와 연관된 26 SNPs의 프라이머 염기서열 정보(1)

유전자	SNP	염색체	아미노산 변화	염기서열		온도 (℃)	프라이머 크기
PLA1A	c.385 G>T	1	V385V	F	CTTTCTTGGCCCCACATCTA	60	238
				R	AGCAGCCAGAACTCACCCTA
				E	GTGATTGCTGTGGACTGGGT
PIK3R4	c.3633 T>C	1	C3633R	F	CGATCAAGGAGGGAAACAGA	60	400
				R	TACATTGTCACAGGCCCTCA
				E	CCTATAGCCGAGTCGGGGGC
PLCB1	c.459 T>C	13	D459D	F	TTCAGGAATGGACAAATGAGG	60	416
				R	GGCAGATGTAGGGCTGAAGA
				E	GCCCAAAACATGTCCAGGGA
	c.1308 C>T		F1308F	F	GGCATTCACATCCACACAAG	60	259
				R	GCTTACCGGGTACTTGTCCA
				E	GAGTACTGCAGACTCATCTT
	c.1524 C>T		A1524A	F	GAATCTGGAGTTCCCCTTCC	60	352
				R	CTGGGGGCTCATATGTTTGT
				E	GAGCCCTCGTCCCCAGGAGC
	c.2226 C>T		V2226V	F	TCAATTGGCTCAGCAGAAAC	58	431
				R	GGCAAGAGTTGACTGGCCTA
				E	CTCAATGTCCTATAGGTGGT
C/EBPα	c.271 A>C	18	D271A	F	ATGTAGGCGCTGATGTCGAT	60	216
				R	TTAGCTCCCCCATGGAGTC
				E	GCGCCGCTTTCGGCTTTCCC
LOC538552	g.191 C>T	3	T62I	F	CACAGGGGTGAGGGAATTTA	58	252
				R	GCTCAGGCCTACAAGACTGG
				E	CCCCATGTACTTCTTCCTTA
OR10Z1	g.136 A>G		I46V	F	GGGAACTGCAACTCTTGCTC	58	204
				R	CCTCTGACAAGGCCAGAAAG
				E	TGACCAGCAATGTCTTCATT
C3H1ORF92	g.5311 G>A		A188T	F	GAAGAGGGGAATGAGGAAGG	58	370
				R	AAGGGGACCCTACTGCTTGT
				E	AGACCCTGACTACCTTCATC
ASH1L	g.31857 C>A		F672L	F	GCCAAGTTTGACTTCTGAATCC	58	320
				R	TTTGCTGGCTCGGAATTACT
				E	ACCCCTTCAGTTGTTAACTT
ADAR	g.7923 A>T		D221V	F	AGTCCCAGTTCAGGCTCAGA	58	275
				R	TCCAAGTCAATCAGCACAGC
				E	CCCAGGAGCTCCAAGCCCAG
LOC513884	g.929 G>T		C310F	F	TCCCATCCTCTGTTGGAAGA	58	464
				R	CCCTCATCTGCACAGACCTC
				E	AACAATGACCCAAACTTCAT

F: 포워드(forward) 서열, R: 리버스(reverse) 서열, E: 신장(extension) 서열

도체형질 및 근내지방도와 연관된 26 SNPs의 프라이머 염기서열 정보(2)

유전자	SNP	염색체	아미노산 변화	염기서열		온도 (℃)	프라이머 크기
BT.106399	g.341911 C>T	3	P333L	F	CCTGTTGTCTCCTCCTCCAG	58	335
				R	CTCTCGTCCGTGTTGGACTC
				E	TCTCCCACCCGAGGACACCC
BT.94719	g.1347 G>A		A118T	F	TCCATCCAAATCCAAAGTCC	58	425
				R	GAAGGTGGTGGGAAGTGAAA
				E	CGTTTGTGATTCAGGGCATA
TDRKH	g.17257 A>G		T235A	F	TCAGGAACGCAGAAGGAAGT	58	399
				R	TTTCTCCCAGGAACCCTCTT
				E	CAGGTGGAGCCAGAGAGCCA
ADAM15	g.3060 G>A		G158R	F	GTACAAGCGGTCGATTCCAT	58	236
				R	CACAGATGTAGGCCAGCTCA
				E	ACTCTGTGGAGCTGGGGCCC
	g.3229 C>T		L218F	F	TGAGCTGGCCTACATCTGTG	58	365
				R	TTGAGTCAAGTGCCTGCATC
				E	GGAGGGCTGGGCTTCTGTTG
MRPL9	g.6616 C>G		A256G	F	GGGTACCTATGTCCGTGGTG	57	315
				R	AAGGCCAAACGTGGTAACTG
				E	GTACTGGTTAGCCCAGCAAG
BCL9	c.3891 C>T		I228	F	CATTGCCGGTGGTTCTTTAT	57	224
				R	GGGCTGTGCTTCTCTCTGTC
				E	TCTTTCCACATCCAGAACAT
DCLK2	g.180451 C>T	17	A622	F	CACAGCCAACCTGTGAAATG	57	301
				R	GATGTGCCACCATCCTCTG
				E	CTCTTCGACCAGATCTTGGC
C13H20ORF151	g.9481 C>T	13	R173C	F	TGGCCTTTCTGATCGTCTCT	57	393
				R	GTCCGTGCCTCATGAAGATT
				E	ACGAGGAGACAGAGGATGGC
PIGK	g.35314 G>A	3	T143	F	CAGGAAGAAGAAGGAATGTTTTT	57	379
				R	CACTGCTTTCAAATTTCACTTCAA
				E	TGGGAGGATTCCATCTAGCAC
PEAR1	g.15686 G>A		V596I	F	GATCCTGTTCACGGACACCT	57	373
				R	CATCTGGCACTGGACTGAAA
				E	GGGCACCTGCATCCCCAAGA
	g.15675 A>C		N592T	F	GATCCTGTTCACGGACACCT	57	373
				R	CATCTGGCACTGGACTGAAA
				E	TGGCAACTGC
CDH22	g.82929 G>A	13	E708	F	GACACCGAAGCCTACGACAT	57	376
				R	AGATAGGCGAAGTCCTGCTC
				E	CAGGGGCCGCCGAGCCCCGA

이후 26개의 후보 SNPs에 대해서 다형성 확인을 위하여 우선적으로 96두에 대하여 1차 실험을 수행하였다.

SNP 마커로써의 정보력과 다양성을 알아보기 위하여 H, PIC값을 구하였으며, 후보 SNP들을 사용하였을 때 다음 세대에서 어느 정도의 동일한 유전자형의 비율을 가지는지 알아보기 위하여 HWE값을 구하였다.

26개 SNP의 유전자형 및 빈도

Gene	SNP	유전자형 (두수)				H¹	PIC²	HWE³
		빈도
PLA1A	c.385 G>T	GG (60)	GT (31)	TT (5)	N⁴(96)	0.336	0.608	0.931
		0.625	0.323	0.052	1
PIK3R4	c.3633 T>C	CC (89)	CT (7)	TT (0)	N (96)	0.07	0.927	0.933
		0.927	0.073	0.000	1
PLCB1	c.459 T>C	TT (31)	TC (46)	CC (19)	N (96)	0.492	0.387	0.970
		0.323	0.479	0.198	1
	c.1308 C>T	CC (25)	CT (54)	TT (17)	N (96)	0.496	0.38	0.428
		0.260	0.563	0.177	1
	c.1524 C>T	CC (24)	CT (47)	TT (25)	N (96)	0.499	0.375	0.979
		0.250	0.490	0.260	1
	c.2226 C>T	CC (25)	CT (45)	TT (26)	N (96)	0.499	0.375	0.829
		0.260	0.469	0.271	1
C/EBPα	c.271 A>C	AA (27)	AC (53)	CC (16)	N (96)	0.493	0.384	0.507
		0.281	0.552	0.167	1
LOC538552	g.191 C>T	CC (66)	CT (30)	TT (0)	N (96)	0.264	0.702	0.069
		0.688	0.312	0.000	1
OR10Z1	g.136 A>G	AA (68)	AG (15)	GG (13)	N (96)	0.336	0.608	-
		0.708	0.156	0.135	1
C3H1ORF92	g.5311 G>A	GG (68)	GA (24)	AA (4)	N (96)	0.278	0.683	0.327
		0.708	0.250	0.042	1
ASH1L	g.31857 C>A	CC (25)	CA (71)	AA (0)	N (96)	0.466	0.425	-
		0.260	0.740	0.000	1
ADAR	g.7923 A>T	AA (64)	AT (30)	TT (2)	N (96)	0.291	0.666	0.479
		0.667	0.312	0.021	1
LOC513884	g.929 G>T	GG (86)	GT (3)	TT (7)	N (96)	0.161	0.826	-
		0.896	0.031	0.073	1
BT.106399	g.341911 C>T	CC (61)	CT (26)	TT (9)	N (96)	0.353	0.584	0.022
		0.635	0.271	0.094	1
BT.94719	g.1347 G>A	AA (4)	AG (10)	GG (82)	N (96)	0.169	0.815	-
		0.042	0.104	0.854	1
TDRKH	g.17257 A>G	AA (2)	AG (17)	GG (77)	N (96)	0.195	0.786	0.672
		0.021	0.177	0.802	1
ADAM15	g.3060 G>A	GG (42)	GA (41)	AA (13)	N (96)	0.454	0.442	0.556
		0.438	0.427	0.135	1
	g.3229 C>T	CC (5)	CT (43)	TT (48)	N (96)	0.399	0.520	0.497
		0.052	0.448	0.500	1
MRPL9	g.6616 C>G	CC (96)	CG (0)	GG (0)	N (96)	0.000	1	-
		1.000	0.000	0.000	1
BCL9	c.3891 C>T	CC (96)	CT (0)	TT (0)	N (96)	0.000	1	-
		1.000	0.000	0.000	1
DCLK2	g.180451 C>T	CC (96)	CT (0)	TT (0)	N (96)	0.000	1	-
		1.000	0.000	0.000	1
C13H20ORF151	g.9481 C>T	CC (52)	CT (40)	TT (4)	N (96)	0.378	0.551	0.314
		0.538	0.418	0.044	1
PIGK	g.35314 G>A	GG (50)	GA (20)	AA (24)	N (96)	0.462	0.432	-
		0.523	0.231	0.246	1
PEAR1	g.15686 G>A	GG (66)	GA (27)	AA (3)	N (96)	0.287	0.671	0.874
		0.685	0.283	0.033	1
	g.15675 A>C	AA (66)	AC (27)	CC (3)	N (96)	0.287	0.671	0.874
		0.685	0.283	0.033	1
CDH22	g.82929 G>A	GG (96)	GA (0)	AA (0)	N (96)	0.000	1	-
		1.000	0.000	0.000	1

¹이형접합성, ²최소 대립유전자 빈도, ³하디-웨인버그값, ⁴전체두수

표 3에서 살펴보면 LOC538552(g.191 C>T), OR10Z1(g.136 A>G), ASH1L(g.31857 C>A), LOC513884(g.929 G>T), BT.106399(g.341911 C>T), BT.94719(g.1347 G>A), MRPL9(g.6616 C>G), BCL9(c.3891 C>T), DCLK2(g.180451 C>T), PIGK(g.35314 G>A), CDH22(g.82929 G>A)의 11개의 SNPs를 제외한 15개의 후보 SNP는 각각 0.500 정도의 heterozygosity 값이 나타났고, 하디-웨인버그 값을 이용하여 다형성을 한 번 더 확인할 수 있었다.

근내지방도와 연관되는 SNP를 규명하기 위해서 일차적으로 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹(High/Low)의 한우 96두를 대상으로 15개의 후보 SNPs에서 특이하게 차이를 나타나는 것을 바탕으로 쇠고기 육질에 연관되는 SNP 마커로서의 가능성을 부여하고 이를 바탕으로 전체 시험 대상에 심도 있는 연구를 진행하였다.

근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹간의 빈도(1)

유전자	SNP	유전자형	근내지방도	두수	빈도	유의확률¹	전체
PLA1A	c.385 G>T	GG	High	29	0.604	0.861	N²(96)
		GG	Low	31	0.646
		GT	High	16	0.333
		GT	Low	15	0.312		1
		TT	High	3	0.063
		TT	Low	2	0.042
PIK3R4	c.3633 T>C	CC	High	45	0.937	0.695	N²(96)
		CC	Low	11	0.917
		CT	High	3	0.063
		CT	Low	4	0.083		1
		TT	High	0	0.000
		TT	Low	0	0.000
PLCB1	c.459 T>C	CC	High	10	0.208	0.047	N²(96)
		CC	Low	21	0.438
		CT	High	26	0.542
		CT	Low	20	0.417		1
		TT	High	12	0.250
		TT	Low	7	0.146
	c.1308 C>T	CC	High	15	0.313	0.449	N²(96)
		CC	Low	10	0.208
		CT	High	26	0.542
		CT	Low	28	0.583		1
		TT	High	7	0.146
		TT	Low	10	0.208
	c.1524 C>T	CC	High	10	0.208	0.638	N²(96)
		CC	Low	14	0.292
		CT	High	25	0.521
		CT	Low	22	0.458		1
		TT	High	13	0.271
		TT	Low	12	0.250
	c.2226 C>T	CC	High	10	0.208	0.508	N²(96)
		CC	Low	15	0.313
		CT	High	24	0.500
		CT	Low	21	0.438		1
		TT	High	14	0.292
		TT	Low	12	0.250
C/EBPα	c.271 A>C	AA	High	23	0.479	0.000	N²(96)
		AA	Low	4	0.083
		AC	High	20	0.417
		AC	Low	33	0.688		1
		CC	High	5	0.104
		CC	Low	11	0.229

¹카이제곱검정, ²전체 두수

근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹간의 빈도(2)

유전자	SNP	유전자형	근내지방도	두수	빈도	유의확률¹	전체
C3H1ORF92	g.5311 G>A	GG	High	33	0.688	0.893	N²(96)
		GG	Low	35	0.729
		GA	High	13	0.271
		GA	Low	11	0.229		1
		AA	High	2	0.042
		AA	Low	2	0.042
ADAR	g.7923 A>T	AA	High	32	0.667	1.000	N²(96)
		AA	Low	32	0.667
		AT	High	15	0.312
		AT	Low	15	0.312		1
		TT	High	1	0.021
		TT	Low	1	0.021
TDRKH	g.17257 A>G	AA	High	0	0.000	0.015	N²(96)
		AA	Low	2	0.042
		AG	High	4	0.083
		AG	Low	13	0.271		1
		GG	High	44	0.917
		GG	Low	33	0.688
ADAM15	g.3060 G>A	GG	High	17	0.354	0.070	N²(96)
		GG	Low	25	0.521
		GA	High	21	0.438
		GA	Low	20	0.417		1
		AA	High	10	0.208
		AA	Low	3	0.062
	g.3229 C>T	CC	High	0	0.000	0.004	N²(96)
		CC	Low	5	0.104
		CT	High	17	0.354
		CT	Low	26	0.542		1
		TT	High	31	0.646
		TT	Low	17	0.354
C13H20ORF151	g.9481 C>T	CC	High	27	0.556	0.944	N²(96)
		CC	Low	25	0.522
		CT	High	19	0.400
		CT	Low	21	0.435		1
		TT	High	2	0.044
		TT	Low	2	0.043
PEAR1	g.15686 G>A	GG	High	33	0.690	0.840	N²(96)
		GG	Low	32	0.670
		GA	High	14	0.290
		GA	Low	14	0.290		1
		AA	High	1	0.020
		AA	Low	2	0.040
	g.15675 A>C	AA	High	33	0.690	0.840	N²(96)
		AA	Low	32	0.670
		AC	High	14	0.290
		AC	Low	14	0.290		1
		CC	High	1	0.020
		CC	Low	2	0.040

¹카이제곱검정, ²전체 두수

표 4 및 표 5의 결과에서 보면 7개의 후보 SNPs 중에서 염색체 13번의 PLCB1 유전자내에 위치한 c.459 T>C와 18번 염색체상의 C/EBPa 유전자 영역에 있는 c.271 A>C의 2개의 후보 SNPs에서 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹에서 빈도가 최소 20%이상 차이가 나는 것을 알 수 있었다. 또한 염색체 3번에 존재하는 TDRKH 및 ADAM15유전자내 g.17257 A>G, g.3060 G>A, g.3229 C>T에서 빈도가 15%이상 차이가 나며 카이제곱검장에서도 유의적인 확률이 나타났다. 하지만 나머지 10개의 후보 SNPs는 그 차이가 미미하였다.

PLCB1의 유전자에 위치한 c.459 T>C의 경우 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹에서 CC, 유전자형 빈도가 23.0%이상의 차이를 나타내었으며, ²검정결과 근내지방도 (근내지방도가 높은 그룹 & 근내지방도가 낮은 그룹)와 유전자형 간에 따라 통계적으로 유의한 차이가 보였고, C/EBPa 유전자 영역에 있는 c.271 A>C의 경우 또한 AA, AC 유전자형 빈도가 47.1%, 27.1%이상의 차이를 보여주었다.

TDRKH 유전자내 g.17257 A>G의 경우 AG유전자형에서 18.8%이상의 차이를 나타내고 ADAM15유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T의 경우 AA유전자형에서 15%, 28.9%이상의 차이를 보여주었다.

하지만 앞서 선발되어지지 못한 10개의 후보 SNPs들의 근내지방도와 유전자간의 차이를 비교해보면 빈도 차이가 미비할 뿐만 아니라 유의적 검정에서도 0.5이상으로 선택된 2개의 후보 SNP와 많은 차이를 나타내고 있었다. 등급과 연관되는 SNP를 규명하기 위해서 일차적으로 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹의 한우 45두를 대상으로 5개의 후보 SNPs에서 특이하게 차이를 나타나는 것을 바탕으로 쇠고기 등급에 연관되는 근내지방도 관련 SNP 마커로서의 가능성을 부여하고 이를 바탕으로 전체 시험 대상에 심도 있는 연구를 진행하였다.

< 실시예 2> TDRKH 유전자의 후보 SNP 에 대한 경제형질 능력 검정

앞서 분석한 근내지방도의 능력이 high와 low 그룹에서 유의적으로 차이(x²<0.05)를 나타낸 유전자를 대상으로 612두를 유전적 능력검정을 실시하였다.

표 6에서는 TDRKH 유전자의 g.17257 A>G 후보 SNP에 대하여 앞서 분석한 다른 유전자와 마찬가지로 4가지의 형질(도체중, 등지방두께, 근내지방도, 배최장근 단면적)과 각각의 유전적 형질간의 연관분석을 실시하였다.

TDRKH 유전자 내 다형성 SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석

형질	g.17257 A>G			P-value	Genetic effect
	AA	AG	GG		Additive	Dominance
	(N=8)	(N=138)	(N=466)
	LSmean±SE	LSmean±SE	LSmean±SE
도체중(kg)	437.000±15.42^a	436.869±3.71^ab	424.238±2.02^b	0.009^**	12.761±15.56^*	-12.500±17.24
등지방두께 (mm)	12.250±1.84	12.972±0.44	13.257±0.24	0.752	-1.003±1.86	-0.438±2.06
근내지방도 (1-9)	4.625±0.68	5.297±0.16	5.435±0.09	0.399	-0.810±0.69	-0.533±0.76
배최장근단면적	91.500±3.51	91.775±0.85	90.688±0.46	0.523	0.811±3.54	-1.361±3.93

^{a, b, c} 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.

TDRKH 유전자의 g.17257 A>G SNP의 경우 도체중에서 AA유전자형과 AG유전자형이 437.0kg, 436.87kg으로 가장 높게 유의적인 차이를 보여주고 있으며 다른 3가지 형질과는 아무런 차이를 보여주고 있지 못하였다.

따라서 TDRKH 유전자의 g.17257 A>G의 후보 SNPs가 경제형질 중 도체중에 연관이 있다는 점에서 쇠고기 등급을 향상시킬 수 있는 척도로서 활용가능성이 있을 것으로 판단된다.

<110> OH, Dong Yep HA, Jae Jung PARK, Sang il CHO, Young Jig <120> Single nucleotide polymorphism marker in TDRKH gene for diagnosis of meat quality in Hanwoo and method for diagnosis of meat quality in Hanwoo using same marker <130> DP-2014-0303 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 748 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 1 ggcaagcagt agctacctga ttgtatctga gagtgagaag aaccctttac tccatcctgg 60 gtcagtatct gaccatgtag atatcatccc ttctcttatt ttccacggca tttgatactg 120 gagaaagttt cagaagatga agaacttagg aagagaattg ctcattctgc agaaaccaga 180 gttccacgga agcagccaat cagcgtaaga agagaggaag tgacagagcc aggtggagcc 240 agagagccar ctttatggaa aaacactggc actagcttaa aacaggctgc acctctggca 300 gttcctcccc acaaaggaga tggtgacgtg gctgctgtgg gaccagaaga gggttcctgg 360 gagaaaccta atgatgacag ctttcagagg tctgctgtcc agaccagtcc agagatgtcc 420 atgtttgaaa gtatgtaaca aaggggaccc cttagccata tggaagatag gcatactggc 480 tatgtgtgta tgctcagttg tgtctgactg tttggaaacc caaacccgaa gtatggctca 540 gatacaaaaa aaacaagagt catgttgtga ataaagattg aacacagtcc ggaaggaaaa 600 aggctctcgt cctctgggag cagctctttt ttattaaagc catgtacaca aatagtagac 660 tagtgacaga tgcggggaaa ggtcggtagt gagtataaag ttaatatgac gcgcggggaa 720 acaaaaatcg gcatcagcta ctggagga 748

Claims

서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 도체중 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A>G인 것을 특징으로 하는 한우 도체중 예측용 조성물.
삭제
(1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
(2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
(3) 상기 유전자형으로 한우 도체중을 예측하는 단계를 포함하는 한우 도체중 예측방법.
삭제
서열번호 1의 250번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 한우 도체중 예측용 키트.