KR101653480B1 - Adam15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법 - Google Patents

Adam15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ADAM15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 SNP 마커를 이용한 한우 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공한다. 이를 토대로 육질이 우수한 한우품종을 조기에 선발하여 개량하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ADAM15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법{Single nucleotide polymorphism marker in ADAM15 gene for diagnosis of meat quality in Hanwoo and method for diagnosis of meat quality in Hanwoo using same marker}
본 발명은 ADAM15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것이다.
우리나라 한우산업은 총 생산액이 연간 약 4조6천억 원으로 전체 축산물 생산액의 27.95%를 차지하고 있어(2012 농축식품통계) 산업적 경제적 부가가치가 가장 높은 동물자원으로 농가소득 및 농촌경제에 큰 영향을 미치는 농촌의 대표적 기간산업으로 인정받고 있다. 그러나 최근 한미 FTA 협상과 미국산 쇠고기 수입재개, 그리고 앞으로 이어질 EU, 일본, 호주, 중국과 FTA에 따른 쇠고기의 수입은 한우 사육농가의 위기의식과 더불어 큰 피해가 예상되고 있어 우리나라 소비자들이 선호하는 고품질 차별화 한우쇠고기 생산을 통한 경쟁력 향상이 강력히 요구되고 있는 실정이다.
쇠고기의 육질은 품종에 따라 크게 차이가 나며 같은 품종이라도 성별, 거세유무 등에 따라 달라지고 동일한 도체 내에서도 부위에 따라 근육 및 지방분포 상태가 다르며 육질에도 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 우리나라 고유의 쇠고기 생산 자원인 한우는 성장 속도가 느린 만숙종으로서 비육 생리상 외국의 육우와는 달리 육질을 결정하는 근내지방의 침착이 늦게 이루어지는 특성을 갖고 있는 반면 육질이 우수하여 고급육 생산을 위한 비육우로서 그 유전적 자질이 높게 평가되고 있다.
현재까지 한우의 육질관련 DNA marker 개발 연구에 주로 이용되어진 방법으로는 대부분 생리적으로 지방대사(lipid metabolism) 또는 근내지방 축적(intramuscular fat deposition)에 관련된 후보유전자를 탐색하여 선발 (candidate gene approach) 하거나 또는 기 보고된 관련 형질의 QTL (Quantitative Trait Locus)에 인접한 유전자를 선발하여 SNP를 탐색하고, 경제형질과 연관성을 분석하는 수준에 머물러 있는 실정이다. 그러나 이와 같은 방법으로 개발된 마커들의 경우, 후보유전자 선정 시 기 보고된 유전자의 생리적 특성에만 의존하여 후보유전자를 선정하기 때문에 관련 형질과 밀접한 연관성을 갖거나 육질발현 및 결정에 직접 관여하는 후보유전자를 정확히 선발하기에는 한계가 있고 이용 가능한 후보유전자들의 수가 제한적이다.
따라서, 특정 유전자에서 이미 알려진 생리적 또는 생물학적 특성에 의존하여 후보유전자를 선발하는 기존의 한우 경제형질 관련 후보유전자 검색 방법에 비해 보다 정확하고 다수의 기능성 후보유전자 선발 방법이 필요하며, 또한 단일 SNP marker가 아닌 다수의 SNP marker를 조합하여 multiple DNA marker를 이용하는 분자육종 기술 개발이 무엇보다도 시급한 실정이다.
한국공개특허 10-2014-0057761(2014.05.14 공개)
본 발명의 목적은 ADAM15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 한우 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 유전자형으로 한우 육질을 판단하는 단계를 포함하는 한우 육질의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 한우 육질 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 ADAM15 유전자 내의 한우 육질 진단용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 고밀도 SNP 패널을 이용한 한우 유전체 전단 가축화 기원 선발신호분석 및 차세대염기서열분석을 이용한 육질 표현형 연관 영역에 대한 엑손 유전체서열 분석을 통해 육질 표현형 조절과 관련된 신규 SNP를 검출하여 유전체 활용 선발기법을 개발하고, 농가 현장검증을 통해 이들 마커의 산업적 적용 가능 여부를 검토하여 한우 육종개량의 효율성을 개선시킬 수 있는 실용화 기술을 개발하여 농가 소득 향상에 크게 기여할 것이다.
도 1은 한우 등심 조직 채취부위를 나타낸다.
도 2는 SNP 유전자형 분석방법을 나타낸다.
도 3은 MVP 시스템 구축을 위한 MDR 방법의 절차를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 육질 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드 및 서열번호 4의 250번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 한우 육질 진단은 도체중, 등지방두께, 근내지방도 또는 등심단면적을 진단할 수 있다.
상기 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 g.3060 G>A로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 ADAM15 유전자 내에 위치한다.
상기 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 g.3229 C>T로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 ADAM15 유전자 내에 위치한다.
상기 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 c.459 T>C로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 PLCB1 유전자 내에 위치한다.
상기 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 c.271 A>C로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 C/EBPα 유전자 내에 위치한다.
상기 서열번호 4의 250번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 g.17257 A>G로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 TDRKH 유전자 내에 위치한다.
상기 SNP 마커는 그 개개로도 한우 육질 진단용 마커로서 유용하며, 상기 마커를 조합하여 마커수를 많이 포함할수록 육질 진단의 정확도가 높아질 수 있다.
한편 상기 SNP 마커는 각각으로도 한우 육질 판단을 위한 마커로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 SNP의 haplotype 조합으로 더욱 우수한 마커로서 작용할 수 있는데, 이는 SNPs간에 연관불평형을 구성하고 있기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연관불평형(Linkage Disequilibrium)"이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하는 둘 이상의 유전자좌 (loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관 (non-random association)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미한다. 한편, 본 명세서의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열은 각각 다중염기기재 방식에 따라 작성하였다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 유전자형으로 한우 육질을 판단하는 단계를 포함하는 한우 육질의 진단방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계 이후 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드 및 서열번호 4의 250번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 한우 육질 판단은 도체중, 등지방두께, 근내지방도 또는 등심단면적을 진단할 수 있다.
상기 DNA의 공급부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며 (참조: Rogers & Bendich (1994), 출발물질이 mRNA인 경우에는, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 한우 육질 진단용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 키트는 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드 및 서열번호 4의 250번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
상기 진단용 키트에는 본 발명의 한우 육질 진단용 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.
상기 "증폭시킬 수 있는 프라이머"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험동물
실험동물은 1차 년도에 확립된 경북 지역의 14곳의 시, 군 단위에서 사육 되어진 거세우로, 참품한우 사양관리 지침에 따라 26~33개월에서 출하하는 612두의 genomic DNA sample과 능력 자료를 사용하였다.
본 발명에서 사용 되어진 한우의 등심조직은 흉추 제 13, 요추 제 1마디 38번 최장근부분에서 절개하여 채취하였으며(도 1), 각 조직은 근외지방을 제거한 뒤 -80℃에서 보관하였다.
2. 실험 대상 형질
본 발명에 사용되어진 형질은 도체중, 등심단면적, 등지방두께, 근내지방도이며 농림수산식품부 고시 제2011-46호에 의거하여 4가지 형질을 조사하였다. 조사방법은 아래와 같다.
(1) 도체중
도체중은 도축경영자가 측정하여 제출한 도체 한 마리 분의 중량을 ㎏ 단위로 적용하였다.
(2) 배최장근단면적
등급판정부위에서 가로, 세로가 1cm 단위로 표시된 면적자를 이용하여 배최장근의 단면적을 cm2 단위로 측정한다. 다만, 배최장근 주위의 배다열근, 두반극근과 배반극근은 제외한다.
(3) 등지방두께
등급판정부위에서 배최장근단면의 오른쪽면을 따라 복부쪽으로 3분의 2 들어간 지점의 등지방을 ㎜단위로 측정한다. 다만, 등지방두께가 1㎜ 이하인 경우에는 1㎜로 한다.
(4) 근내지방도
등급판정부위에서 배최장근단면에 나타난 지방분포정도를 근내지방도 기준(농림수산식품부고시 제2011-46호; 제1장 제5조 관련)과 비교하여 판정하였다.
3. Genomic DNA 추출
Genomic DNA 추출은 한우 조직의 약 12mg을 1.5ml tube에 넣고 Cell Lysis Solution (AL buffer) 300㎕를 첨가한 뒤, 단백질을 제거하기 위해 단백질 분해효소인 Proteinase K (10mg/㎖, Promega Co, USA)를 total volume의 1/100배인 150㎕를 넣어 37℃에서 12시간 동안 배양시켰다.
배양 후 단백질 침전을 위해 동일 량의 TE (Tri-EDTA) : phenol (1:1)을 넣고 2시간 동안 20분 간격으로 천천히 흔들어 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 DNA 수용액 층을 채취하고 다시 동일 량의 Phenol : Chloroform : Iso-amylalchol (25:24:1)을 넣고 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 재차 DNA 수용액 층을 채취하였다.
에틸 에테르(Ethyl ether) 2 volume을 넣어 백색의 DNA 수용액 층이 투명해질 때까지 흔든 후 3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 에틸 에테르(Ethyl ether)를 휘발시켜 제거하였다. 3M 소듐 아세테이트(sodium acetate; pH 5.2)를 total volume의 1/10배를 첨가하고, 100% 에탄올(ethanol)을 넣어 DNA를 응축시키고 70% ethanol을 20정도 넣고 DNA를 세정하였다. 완전히 에탄올(ethanol)을 제거한 후, TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)를 약 1 ~ 2㎖정도 넣어 DNA를 용해시켜 4℃에 보관하였다.
DNA를 완전히 용해시키고 정량분석을 위해 3차 증류수 950㎕ 에 50㎕의 DNA를 첨가하여 20배 희석한 후 spectrophotometer (SHIMADZU, Japan)를 이용하여 260nm와 280nm 흡광도에서 측정하여 OD260 / OD280의 비가 1.8 ~ 2.0정도인 DNA를 사용하였다.
4. SNP genotype
본 발명에서 SNP genotyping은 SBE (single-based extension, Vreeland 등, 2002) 방식을 이용하는 ABI PRISM? SNaPshotTM Multiplex Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다.
(1) Primer 제작 및 PCR 증폭
먼저 후보 SNP 발굴을 위해 NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 활용하였으며 SNP에 사용된 primer는 primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)를 이용하여 합성하였다. 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 실시하였으며, 그 조건은 다음과 같다.
20ng genomic DNA, 0.25U Taq polymerase (Solgent Co., Ltd, South Korea), 1x buffer, 0.2mM dNTP, 5pmol primer (forward/reverse)를 첨가하여 전체 15㎕가 되도록 하고 혼합한 후 94℃ 5분에서 1 cycle, 94℃에서 30초, 합성온도에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 35 cycle, 72℃ 3분에서 1cycle을 반응시켰다. 생성된 PCR product에서 1㎕를 전기영동하여 생성물을 확인하였다.
(2) PCR product 정제
PCR product에 5U SAP (shrimp alkaline phosphatase)와 2U Exo I (exonuclease I, E. coli)을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 75℃에서 15분간 불활성화 시켰다.
(3) SBE (Single-based extension) 반응
SBE 반응을 위해 ABI PRISM? SNaPshotTM Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였고, 그 조건은 다음과 같다. 정제된 PCR product 1㎕, SNaPShot multiplex ready reaction mix 1㎕, 5pmol SNaPShot primer 1㎕를 넣어 전체 10㎕가 되게 하고 잘 혼합하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초의 조건으로 25 cycle을 반응시켰다. 반응된 PCR product에 1U SAP를 첨가해준 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였고 75℃에서 15분 동안 불활성화 시켰다.
5. SNPs genotyping
최종적으로 준비된 PCR product 1㎕를 GeneScan-120 LIZ size standard (Applied Biosystems, Foster City, CA) 0.25㎕와 Hi-Di formamide 9.5㎕ (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 첨가하여 잘 섞어준 다음 95℃에서 5분간 변성시킨 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer에 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 PCR product는 GeneMapper v4.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 데이터를 입력하여 자동분석을 실시하였다(도 2).
6. 통계분석 방법
(1) 이형접합체율 (Heterozygosity)
이형접합체율(Heterozygosity)은 특정 마커에 대하여 무작위로 개체를 선발하였을 때 그 마커에 대한 이형접합 개체의 비율을 나타내며 그 값은 0~1사이의 값을 나타낸다.
이형접합체율 값이 클수록 마커의 다형성이 크며 마커의 유용성이 높다. 이형접합체율값은 다음 같이 정의된다.
H = 1-∑Pi 2
H = 이형접합체율
Pi = i번째 대립 유전자로부터의 측정된 빈도값
단, 유전자 내에서 대립 유전자의 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 유지해야 하며 이형접합체율은 모집단에서 대립유전자가 동일한 도수비율을 유지할 때 최대값을 가진다.
(2) 다양성정보량 (Polymorphism information content)
다양성 정보량은 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률을 주어진 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하게 되며 다음과 같이 정의한다(Wesis 등, 1993).
Figure 112015003507342-pat00001
n = SNP의 대립유전자의 수
Pi = SNP의 i번째 대립유전자의 추정된 도수 비율
그리고 만약에 대립유전자의 수가 커지면 PIC(Polymorphism information content)값은 H(Heterozygosity)와 점점 비슷해진다.
(3) 하디-웨인버그 값 (Hardy-Weinberg equilibrium)
하디-웨인버그 값이란 외적인 요인이 작용하지 않는다면, 유전자와 유전자형 빈도가 모두 변하지 않고 평형을 이루게 된다는 것으로 이것을 만족하는 집단은 대립 유전형질의 독립성이 성립하게 된다. 따라서 유전자좌 내에서의 독립성 검정은 통계량을 이용한 적합도 검정으로 각 유전자형 범주에 대한 실제 관측빈도와 기대빈도를 이용 하여 다음과 같은 식으로 구하였다.
Figure 112015003507342-pat00002

또한, DNA marker의 정보력이란 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있다. 그리고 앞서 말한 이형접합체(H)와 다양성 정보량(PIC)은 정보력의 척도로서 활용하였으며 1에 가까울수록 경제형질 관련 분석에 사용될 수 있는 유용한 marker라고 할 수 있다.
(4) 단일 유전자의 연관분석 (Association analysis)
각 SNPs의 연관분석은 ㈜참품한우에 소속되어 있는 일반농가 집단 513두의 도체중, 등지방두께, 근내지방도 및 지방산 조성의 측정기록으로 SPSS v19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 다음과 같은 통계모형으로 공 분산 분석과 유의성 검정을 실시하였다.
Y ijkl = μ+ P i + GS j + SNP k +β age l + e ijkl
Yijl = 도체형질 및 지방산 함량의 표현형,
μ = 각각의 형질에 대한 전체적인 평균,
Pi = 분만 장소의 고정 효과,
GS j = 씨 숫소에 대한 임위 효과,
SNPk = 마커 유전자형의 고정 효과,
βagel = 도축일령에 대한 공변량,
eijkl = 임위 오차.
(5) MVP시스템 구축을 위한 마커 조합
육질등급에 연관되는 각각의 선발된 우수 SNPs들간의 염색체 위치에 상관없이 최상의 조합을 만들기 위하여 Qxpak software (Perez-Enciso 와 Misztal, 2004) 프로그램을 이용하여 다음과 같은 통계모형으로 유의성 검정을 실시하였다.
Var (y - (μ+ farm + day )) = var ( kpn ) = 상가적 유전분산
Y = 지방산 및 등급에 대한 값,
μ = 지방산 및 등급에 대한 평균값,
Farm = 612두에 대한 지역,
Day = 각각의 개체에 대한 도축일령,
Var = 씨 숫소효과에 대한 분산 값.
먼저 아비의 kpn 번호에 따라 상가적 유전분산 값을 각각의 형질별로 모두 구하였으며, 각각의 마커의 대한 분산 값을 아래의 식을 이용하여 구하였다.
Figure 112015003507342-pat00003
VA = 씨 숫소효과에 대한 분산 값,
P = p에 대한 대립유전자 빈도,
q = q에 대한 대립유전자 빈도,
a = 상가적 유전자 값,
d = 우성 유전자 값.
이후 아비의 상가적 유전분산과 마커의 분산값을 이용하여 SNPs들간의 상호 연관성을 아래에 있는 통계모델로 분석하여 최상의 조합을 찾고자 분석을 실시하였다.
Y = age + farm + SNP1 + SNP2 + SNP1 * SNP2 + e
Y = 지방산 및 등급에 대한 값,
age = 각각의 개체에 대한 도축일령,
Farm = 612두에 대한 지역,
SNP1 = 1번째 후보 단일 SNP의 효과,
SNP2 = 2번째 후보 단일 SNP의 효과,
SNP1 *SNP2= 1,2번째 SNP의 상호작용,
e = 임위 오차.
통계량 값 (SNP 상호작용에 대한)
Figure 112015003507342-pat00004
F = 검정 통계량 값,
MSE(F) = SNP1*SNP2의 상호작용에 대한 평균 제곱합,
SSR(F) = SNP1*SNP2의 상호작용에 대한 처리 제곱합,
SSR(R) = SNP1*SNP2의 상호작용을 베제한 처리 제곱합,
df(f) = SNP1*SNP2의 상호작용에 대한 자유도,
df(r) = SNP1*SNP2의 상호작용을 베제한 자유도.
< 실시예 1> 근내지방도 및 도체형질에 연관된 26개 후보 SNPs 의 유전정보
근내지방도 및 도체형질에 연관된 26개의 후보 SNPs들에 대하여 현장검정을 실시하기 위해 먼저 각각 primer design을 한 결과는 표 1 및 표 2에서 확인할 수 있다.
도체형질 및 근내지방도와 연관된 26 SNPs의 프라이머 염기서열 정보(1)
유전자 SNP 염색체 아미노산
변화		 염기서열 온도
(℃)		 프라이머
크기
PLA1A c.385 G>T 1 V385V F CTTTCTTGGCCCCACATCTA 60 238
R AGCAGCCAGAACTCACCCTA
E GTGATTGCTGTGGACTGGGT
PIK3R4 c.3633 T>C 1 C3633R F CGATCAAGGAGGGAAACAGA 60 400
R TACATTGTCACAGGCCCTCA
E CCTATAGCCGAGTCGGGGGC
PLCB1 c.459 T>C 13 D459D F TTCAGGAATGGACAAATGAGG 60 416
R GGCAGATGTAGGGCTGAAGA
E GCCCAAAACATGTCCAGGGA
c.1308 C>T F1308F F GGCATTCACATCCACACAAG 60 259
R GCTTACCGGGTACTTGTCCA
E GAGTACTGCAGACTCATCTT
c.1524 C>T A1524A F GAATCTGGAGTTCCCCTTCC 60 352
R CTGGGGGCTCATATGTTTGT
E GAGCCCTCGTCCCCAGGAGC
c.2226 C>T V2226V F TCAATTGGCTCAGCAGAAAC 58 431
R GGCAAGAGTTGACTGGCCTA
E CTCAATGTCCTATAGGTGGT
C/EBPα c.271 A>C 18 D271A F ATGTAGGCGCTGATGTCGAT 60 216
R TTAGCTCCCCCATGGAGTC
E GCGCCGCTTTCGGCTTTCCC
LOC538552 g.191 C>T 3 T62I F CACAGGGGTGAGGGAATTTA 58 252
R GCTCAGGCCTACAAGACTGG
E CCCCATGTACTTCTTCCTTA
OR10Z1 g.136 A>G I46V F GGGAACTGCAACTCTTGCTC 58 204
R CCTCTGACAAGGCCAGAAAG
E TGACCAGCAATGTCTTCATT
C3H1ORF92 g.5311 G>A A188T F GAAGAGGGGAATGAGGAAGG 58 370
R AAGGGGACCCTACTGCTTGT
E AGACCCTGACTACCTTCATC
ASH1L g.31857 C>A F672L F GCCAAGTTTGACTTCTGAATCC 58 320
R TTTGCTGGCTCGGAATTACT
E ACCCCTTCAGTTGTTAACTT
ADAR g.7923 A>T D221V F AGTCCCAGTTCAGGCTCAGA 58 275
R TCCAAGTCAATCAGCACAGC
E CCCAGGAGCTCCAAGCCCAG
LOC513884 g.929 G>T C310F F TCCCATCCTCTGTTGGAAGA 58 464
R CCCTCATCTGCACAGACCTC
E AACAATGACCCAAACTTCAT
F: 포워드(forward) 서열, R: 리버스(reverse) 서열, E: 신장(extension) 서열
도체형질 및 근내지방도와 연관된 26 SNPs의 프라이머 염기서열 정보(2)
유전자 SNP 염색체 아미노산
변화		 염기서열 온도
(℃)		 프라이머
크기
BT.106399 g.341911 C>T 3 P333L F CCTGTTGTCTCCTCCTCCAG 58 335
R CTCTCGTCCGTGTTGGACTC
E TCTCCCACCCGAGGACACCC
BT.94719 g.1347 G>A A118T F TCCATCCAAATCCAAAGTCC 58 425
R GAAGGTGGTGGGAAGTGAAA
E CGTTTGTGATTCAGGGCATA
TDRKH g.17257 A>G T235A F TCAGGAACGCAGAAGGAAGT 58 399
R TTTCTCCCAGGAACCCTCTT
E CAGGTGGAGCCAGAGAGCCA
ADAM15 g.3060 G>A G158R F GTACAAGCGGTCGATTCCAT 58 236
R CACAGATGTAGGCCAGCTCA
E ACTCTGTGGAGCTGGGGCCC
g.3229 C>T L218F F TGAGCTGGCCTACATCTGTG 58 365
R TTGAGTCAAGTGCCTGCATC
E GGAGGGCTGGGCTTCTGTTG
MRPL9 g.6616 C>G A256G F GGGTACCTATGTCCGTGGTG 57 315
R AAGGCCAAACGTGGTAACTG
E GTACTGGTTAGCCCAGCAAG
BCL9 c.3891 C>T I228 F CATTGCCGGTGGTTCTTTAT 57 224
R GGGCTGTGCTTCTCTCTGTC
E TCTTTCCACATCCAGAACAT
DCLK2 g.180451 C>T 17 A622 F CACAGCCAACCTGTGAAATG 57 301
R GATGTGCCACCATCCTCTG
E CTCTTCGACCAGATCTTGGC
C13H20ORF151 g.9481 C>T 13 R173C F TGGCCTTTCTGATCGTCTCT 57 393
R GTCCGTGCCTCATGAAGATT
E ACGAGGAGACAGAGGATGGC
PIGK g.35314 G>A 3 T143 F CAGGAAGAAGAAGGAATGTTTTT 57 379
R CACTGCTTTCAAATTTCACTTCAA
E TGGGAGGATTCCATCTAGCAC
PEAR1 g.15686 G>A V596I F GATCCTGTTCACGGACACCT 57 373
R CATCTGGCACTGGACTGAAA
E GGGCACCTGCATCCCCAAGA
g.15675 A>C N592T F GATCCTGTTCACGGACACCT 57 373
R CATCTGGCACTGGACTGAAA
E TGGCAACTGC
CDH22 g.82929 G>A 13 E708 F GACACCGAAGCCTACGACAT 57 376
R AGATAGGCGAAGTCCTGCTC
E CAGGGGCCGCCGAGCCCCGA
F: 포워드(forward) 서열, R: 리버스(reverse) 서열, E: 신장(extension) 서열
이후 26개의 후보 SNPs에 대해서 다형성 확인을 위하여 우선적으로 96두에 대하여 1차 실험을 수행하였다.
SNP 마커로써의 정보력과 다양성을 알아보기 위하여 H, PIC값을 구하였으며, 후보 SNP들을 사용하였을 때 다음 세대에서 어느 정도의 동일한 유전자형의 비율을 가지는지 알아보기 위하여 HWE값을 구하였다.
26개 SNP의 유전자형 및 빈도
Gene SNP 유전자형 (두수) H1 PIC2 HWE3
빈도
PLA1A c.385 G>T GG (60) GT (31) TT (5) N4(96) 0.336 0.608 0.931
0.625 0.323 0.052 1
PIK3R4 c.3633 T>C CC (89) CT (7) TT (0) N (96) 0.07 0.927 0.933
0.927 0.073 0.000 1
PLCB1 c.459 T>C TT (31) TC (46) CC (19) N (96) 0.492 0.387 0.970
0.323 0.479 0.198 1
c.1308 C>T CC (25) CT (54) TT (17) N (96) 0.496 0.38 0.428
0.260 0.563 0.177 1
c.1524 C>T CC (24) CT (47) TT (25) N (96) 0.499 0.375 0.979
0.250 0.490 0.260 1
c.2226 C>T CC (25) CT (45) TT (26) N (96) 0.499 0.375 0.829
0.260 0.469 0.271 1
C/EBPα c.271 A>C AA (27) AC (53) CC (16) N (96) 0.493 0.384 0.507
0.281 0.552 0.167 1
LOC538552 g.191 C>T CC (66) CT (30) TT (0) N (96) 0.264 0.702 0.069
0.688 0.312 0.000 1
OR10Z1 g.136 A>G AA (68) AG (15) GG (13) N (96) 0.336 0.608 -
0.708 0.156 0.135 1
C3H1ORF92 g.5311 G>A GG (68) GA (24) AA (4) N (96) 0.278 0.683 0.327
0.708 0.250 0.042 1
ASH1L g.31857 C>A CC (25) CA (71) AA (0) N (96) 0.466 0.425 -
0.260 0.740 0.000 1
ADAR g.7923 A>T AA (64) AT (30) TT (2) N (96) 0.291 0.666 0.479
0.667 0.312 0.021 1
LOC513884 g.929 G>T GG (86) GT (3) TT (7) N (96) 0.161 0.826 -
0.896 0.031 0.073 1
BT.106399 g.341911 C>T CC (61) CT (26) TT (9) N (96) 0.353 0.584 0.022
0.635 0.271 0.094 1
BT.94719 g.1347 G>A AA (4) AG (10) GG (82) N (96) 0.169 0.815 -
0.042 0.104 0.854 1
TDRKH g.17257 A>G AA (2) AG (17) GG (77) N (96) 0.195 0.786 0.672
0.021 0.177 0.802 1
ADAM15 g.3060 G>A GG (42) GA (41) AA (13) N (96) 0.454 0.442 0.556
0.438 0.427 0.135 1
g.3229 C>T CC (5) CT (43) TT (48) N (96) 0.399 0.520 0.497
0.052 0.448 0.500 1
MRPL9 g.6616 C>G CC (96) CG (0) GG (0) N (96) 0.000 1 -
1.000 0.000 0.000 1
BCL9 c.3891 C>T CC (96) CT (0) TT (0) N (96) 0.000 1 -
1.000 0.000 0.000 1
DCLK2 g.180451 C>T CC (96) CT (0) TT (0) N (96) 0.000 1 -
1.000 0.000 0.000 1
C13H20ORF151 g.9481 C>T CC (52) CT (40) TT (4) N (96) 0.378 0.551 0.314
0.538 0.418 0.044 1
PIGK g.35314 G>A GG (50) GA (20) AA (24) N (96) 0.462 0.432 -
0.523 0.231 0.246 1
PEAR1 g.15686 G>A GG (66) GA (27) AA (3) N (96) 0.287 0.671 0.874
0.685 0.283 0.033 1
g.15675 A>C AA (66) AC (27) CC (3) N (96) 0.287 0.671 0.874
0.685 0.283 0.033 1
CDH22 g.82929 G>A GG (96) GA (0) AA (0) N (96) 0.000 1 -
1.000 0.000 0.000 1
1이형접합성, 2최소 대립유전자 빈도, 3하디-웨인버그값, 4전체두수
표 3에서 살펴보면 LOC538552(g.191 C>T), OR10Z1(g.136 A>G), ASH1L(g.31857 C>A), LOC513884(g.929 G>T), BT.106399(g.341911 C>T), BT.94719(g.1347 G>A), MRPL9(g.6616 C>G), BCL9(c.3891 C>T), DCLK2(g.180451 C>T), PIGK(g.35314 G>A), CDH22(g.82929 G>A)의 11개의 SNPs를 제외한 15개의 후보 SNP는 각각 0.500 정도의 heterozygosity 값이 나타났고, 하디-웨인버그 값을 이용하여 다형성을 한 번 더 확인할 수 있었다.
근내지방도와 연관되는 SNP를 규명하기 위해서 일차적으로 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹(High/Low)의 한우 96두를 대상으로 15개의 후보 SNPs에서 특이하게 차이를 나타나는 것을 바탕으로 쇠고기 육질에 연관되는 SNP 마커로서의 가능성을 부여하고 이를 바탕으로 전체 시험 대상에 심도 있는 연구를 진행하였다.
근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹간의 빈도(1)
유전자 SNP 유전자형 근내지방도 두수 빈도 유의확률1 전체
PLA1A c.385 G>T GG High 29 0.604 0.861 N2(96)
Low 31 0.646
GT High 16 0.333
Low 15 0.312 1
TT High 3 0.063
Low 2 0.042
PIK3R4 c.3633 T>C CC High 45 0.937 0.695 N2(96)
Low 11 0.917
CT High 3 0.063
Low 4 0.083 1
TT High 0 0.000
Low 0 0.000
PLCB1 c.459 T>C CC High 10 0.208 0.047 N2(96)
Low 21 0.438
CT High 26 0.542
Low 20 0.417 1
TT High 12 0.250
Low 7 0.146
c.1308 C>T CC High 15 0.313 0.449 N2(96)
Low 10 0.208
CT High 26 0.542
Low 28 0.583 1
TT High 7 0.146
Low 10 0.208
c.1524 C>T CC High 10 0.208 0.638 N2(96)
Low 14 0.292
CT High 25 0.521
Low 22 0.458 1
TT High 13 0.271
Low 12 0.250
c.2226 C>T CC High 10 0.208 0.508 N2(96)
Low 15 0.313
CT High 24 0.500
Low 21 0.438 1
TT High 14 0.292
Low 12 0.250
C/EBPα c.271 A>C AA High 23 0.479 0.000 N2(96)
Low 4 0.083
AC High 20 0.417
Low 33 0.688 1
CC High 5 0.104
Low 11 0.229
1카이제곱 검정, 2전체 두수
근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹간의 빈도(2)
유전자 SNP 유전자형 근내지방도 두수 빈도 유의확률1 전체
C3H1ORF92 g.5311 G>A GG High 33 0.688 0.893 N2(96)
Low 35 0.729
GA High 13 0.271
Low 11 0.229 1
AA High 2 0.042
Low 2 0.042
ADAR g.7923 A>T AA High 32 0.667 1.000 N2(96)
Low 32 0.667
AT High 15 0.312
Low 15 0.312 1
TT High 1 0.021
Low 1 0.021
TDRKH g.17257 A>G AA High 0 0.000 0.015 N2(96)
Low 2 0.042
AG High 4 0.083
Low 13 0.271 1
GG High 44 0.917
Low 33 0.688
ADAM15 g.3060 G>A GG High 17 0.354 0.070 N2(96)
Low 25 0.521
GA High 21 0.438
Low 20 0.417 1
AA High 10 0.208
Low 3 0.062
g.3229 C>T CC High 0 0.000 0.004 N2(96)
Low 5 0.104
CT High 17 0.354
Low 26 0.542 1
TT High 31 0.646
Low 17 0.354
C13H20ORF151 g.9481 C>T CC High 27 0.556 0.944 N2(96)
Low 25 0.522
CT High 19 0.400
Low 21 0.435 1
TT High 2 0.044
Low 2 0.043
PEAR1 g.15686 G>A GG High 33 0.690 0.840 N2(96)
Low 32 0.670
GA High 14 0.290
Low 14 0.290 1
AA High 1 0.020
Low 2 0.040
g.15675 A>C AA High 33 0.690 0.840 N2(96)
Low 32 0.670
AC High 14 0.290
Low 14 0.290 1
CC High 1 0.020
Low 2 0.040
1카이제곱 검정, 2전체 두수
표 4 및 표 5의 결과에서 보면 7개의 후보 SNPs 중에서 염색체 13번의 PLCB1 유전자내에 위치한 c.459 T>C와 18번 염색체상의 C/EBPa 유전자 영역에 있는 c.271 A>C의 2개의 후보 SNPs에서 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹에서 빈도가 최소 20%이상 차이가 나는 것을 알 수 있었다. 또한 염색체 3번에 존재하는 TDRKH 및 ADAM15유전자내 g.17257 A>G, g.3060 G>A, g.3229 C>T에서 빈도가 15%이상 차이가 나며 카이제곱검장에서도 유의적인 확률이 나타났다. 하지만 나머지 10개의 후보 SNPs는 그 차이가 미미하였다.
PLCB1의 유전자에 위치한 c.459 T>C의 경우 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹에서 CC, 유전자형 빈도가 23.0%이상의 차이를 나타내었으며, 2검정결과 근내지방도 (근내지방도가 높은 그룹 & 근내지방도가 낮은 그룹)와 유전자형 간에 따라 통계적으로 유의한 차이가 보였고, C/EBPa 유전자 영역에 있는 c.271 A>C의 경우 또한 AA, AC 유전자형 빈도가 47.1%, 27.1%이상의 차이를 보여주었다.
TDRKH 유전자내 g.17257 A>G의 경우 AG유전자형에서 18.8%이상의 차이를 나타내고 ADAM15유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T의 경우 AA유전자형에서 15%, 28.9%이상의 차이를 보여주었다.
하지만 앞서 선발되어지지 못한 10개의 후보 SNPs들의 근내지방도와 유전자간의 차이를 비교해보면 빈도 차이가 미비할 뿐만 아니라 유의적 검정에서도 0.5이상으로 선택된 2개의 후보 SNP와 많은 차이를 나타내고 있었다. 등급과 연관되는 SNP를 규명하기 위해서 일차적으로 근내지방도가 높은 그룹과 낮은 그룹의 한우 45두를 대상으로 5개의 후보 SNPs에서 특이하게 차이를 나타나는 것을 바탕으로 쇠고기 등급에 연관되는 근내지방도 관련 SNP 마커로서의 가능성을 부여하고 이를 바탕으로 전체 시험 대상에 심도 있는 연구를 진행하였다.
< 실시예 2> 5개 후보 SNPs에 대한 경제형질 능력 검정
앞서 분석한 근내지방도의 능력이 high와 low 그룹에서 유의적으로 차이(x2<0.05)를 나타낸 유전자를 대상으로 612두를 유전적 능력검정을 실시하였다.
1. PLCB1 유전자의 후보 SNP
소의 경제형질 중에서 등급의 경우 근내지방도 수치가 클수록 높은 등급을 받을 수 있고, 등지방두께의 경우 숫자가 작을수록 좋은 등급을 받을 수 있기 때문에 이러한 점에 착안하여 분석을 실시하였으며 표 4에서는 PLCB1 유전자의 c.459 T>C에 대하여 도체중과 등지방두께, 근내지방도, 배최장근 단면적에 대한 각 유전자형별 능력과, 각 형질별로 공분산 분석을 실시하였다.
c.459 T>C SNP의 경우 도체중에서 TT 유전자형을 가지는 개체가 439.10kg으로써 유의적으로 가장 높게 나타났으며 (P<0.05), 근내지방도 및 배최장근 단면적에서 또한 5.78, 93.92로 가장 높게 유의적으로 차이가 나타났다.
PLCB1 유전자 내 다형성 SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석
형질 c.459 T>C P-value Genetic effect
TT TC CC Additive Dominance
(N=124) (N=269) (N=219)
LSmean±SE LSmean±SE LSmean±SE
도체중 (kg) 439.104±3.91a 426.000±2.65ab 422.082±2.94b 0.002** 17.022±4.89*** -9.187±7.22
등지방 두께 (mm) 12.306±0.47 13.427±0.32 13.360±0.35 0.112 -1.054±0.58 1.187±0.86
근내지방도 (1-9) 5.782±0.17a 5.390±0.12ab 5.178±0.13b 0.020* -0.604±0.22** -0.179±0.32
배최장근 단면적 93.919±0.88a 90.531±0.60ab 89.767±0.66b 0.0006*** 4.152±1.10*** -2.623±0.63
a, b, c 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.
이러한 결과는 CC 유전자형이 근내지방도가 높고 낮은 그룹에서 20%차이를 보여주는 표 4의 결과와 CC 유전자형이 5.17로 가장 낮은 수치를 보여주고 있는 표 6의 결과와 일치하는 점을 볼 수 있었다.
2. C/ EBP α 유전자의 후보 SNP
C/EBPa 유전자의 c.271 A>C 후보 SNP 또한 앞서 분석한 PLCB1 유전자와 마찬가지로 4가지의 형질(도체중, 등지방두께, 근내지방도, 배최장근 단면적) 과 각각의 유전적 형질간의 연관분석을 실시하였다.
C/EBPα 유전자 내 다형성 SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석
형질 c.271 A>C P-value Genetic effect
AA AC CC Additive Dominance
(N=201) (N=295) (N=116)
LSmean±SE LSmean±SE LSmean±SE
도체중(kg) 425.582±3.10 429.128±2.56 425.379±4.08 0.594 0.202±5.12 -7.296±7.24
등지방두께
(mm)		 13.059±0.37 13.376±0.30 12.870±0.48 0.626 0.189±0.61 -0.822±0.86
근내지방도
(1-9)		 5.701±0.14a 5.284±0.11ab 5.137±0.18b 0.017* 0.563±0.22* 0.269±0.32
배최장근단면적 91.572±0.70 90.427±0.58 91.172±0.92 0.435 0.399±1.16 1.890±1.64
a, b, c 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.
C/EBPa 유전자의 c.271 A>C SNP의 경우 도체중과 등지방 두께 및 배최장근 단면적 간에는 아무런 연관이 없었으나, 근내지방도에서는 AA 유전자형이 5.70으로 가장 높게 유의적인 차이를 보여주고 있었다. 이러한 결과는 표 4에서 제시한 AA 유전자형이 40%차이를 보여주며 근내지방도가 높은 그룹이 많이 있다는 점과 일치하는 점을 볼 수 있었고, 신 등(2007)이 제시한 C/EBPa 유전자의 C271A SNP에서 AA 유전자형이 근내지방도에서 가장 높은 결과와 일치하는 점을 볼 수 있었다.
3. TDRKH 유전자의 후보 SNP
표 8에서는 TDRKH 유전자의 g.17257 A>G 후보 SNP에 대하여 앞서 분석한 다른 유전자와 마찬가지로 4가지의 형질(도체중, 등지방두께, 근내지방도, 배최장근 단면적)과 각각의 유전적 형질간의 연관분석을 실시하였다.
TDRKH 유전자 내 다형성 SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석
형질 g.17257 A>G P-value Genetic effect
AA AG GG Additive Dominance
(N=8) (N=138) (N=466)
LSmean±SE LSmean±SE LSmean±SE
도체중(kg) 437.000±15.42a 436.869±3.71ab 424.238±2.02b 0.009** 12.761±15.56* -12.500±17.24
등지방두께
(mm)		 12.250±1.84 12.972±0.44 13.257±0.24 0.752 -1.003±1.86 -0.438±2.06
근내지방도
(1-9)		 4.625±0.68 5.297±0.16 5.435±0.09 0.399 -0.810±0.69 -0.533±0.76
배최장근단면적 91.500±3.51 91.775±0.85 90.688±0.46 0.523 0.811±3.54 -1.361±3.93
a, b, c 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.
TDRKH 유전자의 g.17257 A>G SNP의 경우 도체중에서 AA유전자형과 AG유전자형이 437.0kg, 436.87kg으로 가장 높게 유의적인 차이를 보여주고 있으며 다른 3가지 형질과는 아무런 차이를 보여주고 있지 못하였다.
4. ADAM15 유전자의 후보 SNPs
앞서 분석한 다른 유전자와 마찬가지로 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A과 g.3229 C>T 후보 SNPs에 대하여 4가지의 형질(도체중, 등지방두께, 근내지방도, 배최장근 단면적) 과 각각의 유전적 형질간의 연관분석을 실시하였다.
ADAM15 유전자 내 g.3060 G>A SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석
형질 g.3060 G>A P-value Genetic effect
GG GA AA Additive Dominance
(N=258) (N=262) (N=92)
LSmean±SE LSmean±SE LSmean±SE
도체중(kg) 428.651±2.73 428.782±2.71 418.978±4.57 0.145 9.672±5.32 9.935±7.59
등지방두께
(mm)		 13.108±0.32 12.935±0.32 13.054±0.54 0.199 -0.945±0.63 -1.292±0.90
근내지방도
(1-9)		 5.143±0.12b 5.511±0.19ab 5.760±0.12a 0.013* -0.617±0.23** 0.118±0.33
배최장근단면적 90.918±0.62 91.423±0.61 89.652±1.03 0.338 1.266±1.21 2.276±1.72
a, b, c 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.
먼저 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A SNP의 경우 도체중과 등지방 두께 및 배최장근 단면적 간에는 아무런 연관이 없었으나, 근내지방도에서는 AA 유전자형이 5.76으로 가장 높게 유의적인 차이를 보여주고 있었다.

ADAM15 유전자 내 g.3229 C>T SNP와 도체형질 및 근내지방도 분석
형질 g.3229 C>T P-value Genetic effect
CC CT TT Additive Dominance
(N=47) (N=263) (N=302)
LSmean±SE LSmean±SE LSmean±SE
도체중(kg) 420.000±6.40 428.501±2.71 427.294±2.53 0.473 -7.294±6.88 -9.709±8.76
등지방두께
(mm)		 13.723±0.76 12.844±0.32 13.380±0.29 0.357 0.332±0.82 1.415±1.04
근내지방도
(1-9)		 4.914±0.28b 5.182±0.12ab 5.652±0.11a 0.003** -0.737±0.30** 0.202±0.38
배최장근단면적 88.829±1.45 90.984±0.61 91.238±0.57 0.301 -2.408±1.56 -1.901±1.98
a, b, c 사후분석-다중비교를 통한 유의확률 검정(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns = 효과없음.
ADAM15 g.3229 C>T SNP 또한 유전자의 또한 TT유전자형에서 5.65로 가장 높게 유의적인 차이를 보여주고 있었으며 이러한 결과는 표 5에서 제시한 AA 유전자형과 TT유전자형이 15%와 29%차이를 보여주며 근내지방도가 높은 그룹이 많이 있다는 점과 일치하는 점을 볼 수 있었다.
따라서 PLCB1 유전자중 c.459 T>C와 C/EBPα 유전자의 c.271 A>C, TDRKH 유전자의 g.17257 A>G 및 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T의 총 5개의 후보 SNPs가 경제형질 중 도체중과 근내지방도에 연관이 있다는 점에서 쇠고기 등급을 향상시킬 수 있는 척도로서 활용가능성이 있을 것으로 판단된다.
< 실시예 3> 5개 후보 SNPs 와 육질등급
일반적으로 근내지방도가 높을수록 쇠고기 맛을 향상시킬 뿐만 아니라 육질 상태가 우수하며 부드러운 조직감을 가진다고 평가 받고 있는 결과들과 같이 PLCB1 유전자의 c.459 T>C와 C/EBPα 유전자의 c.271 A>C 및 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T을 대상으로 등급분포로 나타내 보았다.
근내지방도와 유의적인 차이를 갖는 SNP의 등급분포도
유전자 SNP 유전자형 등급 전체
1++ 1+ 1 2 1+이상
PLCB1 c.459 T>C TT 28 51 30 15 79 124
22.60% 41.10% 24.20% 12.10% 63.70% 100%
TC 39 104 77 49 143 269
14.50% 38.70% 28.60% 18.20% 53.20% 100%
CC 22 93 55 47 115 217
10.10% 42.90% 25.30% 21.70% 53.00% 100%
C/EBPα c.271 A>C AA 33 89 53 26 122 201
16.40% 44.30% 26.40% 12.90% 60.70% 100%
AC 42 116 77 59 158 294
14.30% 39.50% 26.20% 20.10% 53.80% 100%
CC 14 43 32 26 57 115
12.20% 37.40% 27.80% 22.60% 49.60% 100%
ADAM15 g.3060 G>A GG 30 93 76 59 123 258
11.60% 36.00% 29.50% 22.90% 47.60% 100%
GA 43 112 63 44 155 262
16.40% 42.70% 24.00% 16.80% 59.10% 100%
AA 16 43 23 10 59 92
17.40% 46.70% 25.00% 10.90% 64.10% 100%
g.3229 C>T CC 4 21 11 11 25 47
8.50% 44.70% 23.40% 23.40% 53.20% 100%
CT 31 100 76 56 131 263
11.80% 38.00% 28.90% 21.30% 49.80% 100%
TT 54 127 75 46 181 302
17.90% 42.10% 14.80% 18.30% 60.00% 100%
전체 89 248 162 111 337 610
14.60% 40.70% 26.60% 18.20% 55.30% 100%
먼저 PLCB1의 c.459 T>C 경우 TT 유전자형을 가지는 개체가 TC, CC 유전자형을 가지는 개체 보다 1++ 등급에서 22.60%로 상대적으로 많이 출현하였으며, 1+등급이상에서도 63.70%로 다른 유전자형을 가지는 개체보다 상대적으로 많이 출현하였다. 또한 C/EBPα의 c.271 A>C의 후보 SNP에서 AA 유전자형을 가지는 개체는 1++등급에서 16.40%로 다른 유전자형을 가지는 개체보다 많이 출현하였다. 이러한 결과는 앞서 본 표 4와 5의 결과에서 TT, AA 유전자형을 가지는 개체가 등급에서 5.78, 5.70로 가장 높은 수치가 나타난 점과 일치하는 결과를 볼 수 있었다. ADAM15 유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T SNP의 경우 AA, TT유전자형을 가지는 개체가 1++ 등급에서 각각 17.40% 및 17.90%로 많이 분포되어 있었으며 표 9와 10의 결과에서 5.76, 5.65로 가장 높게 나타난 결과와 일치하는 점을 볼 수 있었다.
이러한 결론들을 미루어 볼 때 PLCB1 유전자중 c.459 T>C와 C/EBPα 유전자의 c.271 A>C 및 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A, g.3229 C>T 4개의 후보 SNPs모두 품질이 우수한 쇠고기로 볼 수 있는 근내지방도와 깊은 연관성을 볼 수 있었다.
< 실시예 4> 5개 후보 SNPs 에 대한 MVP 시스템 구축
MVP(Molecular Value Prediction)는 이미 호주에서 소의 유전적 능력개량에 새로운 지표로 활용되어지고 있으며 GeneSTAR MVP 제품을 제작하여 육질에 가장 큰 효과를 주는 근내지방도, 사료효율성, 연도에 대해 유전자 분석을 실시하여 유전자 예측값을 농가에게 제공하고 있다.
한우 육질형 DNA 유전능력평가 시스템은 MVP 시스템을 활용할 계획이다. MVP(molecular value prediction)란 분자육종값(molecular breeding value)으로써 경제형질에 영향을 주는 대립유전자 효과이다. 그래서 이는 유전능력에 대한 EPD(expected progeny difference)와 비슷하지만 MVP는 오직 개체의 유전자형에 대한 값이다. 그래서 여러 대립유전자의 효과에 영향을 미치는 경제형질에 대한 MVP는 효과가 서로 다른 대립유전자 값에 대한 합산인 것이다. 따라서 MVP 시스템의 목표는 모든 한우 경제형질 우수 DNA marker의 대립유전자 효과를 합하여 한우 육질 조기선발이 가능한 분자육종가를 발굴하는 것이다.
특히 본 발명에서 MVP시스템을 구축하기 위하여 쓰인 Multifacrot Dimension Reduction (MDR) 방법은 모수에 대한 추정과 모형에 대한 가정이 필요하지 않은 비모수적 방법이다. 2001년 Richie 등이 제안한 방법으로써 case-control의 이분형 자료에 적합가능한 방법이다. 또한 MDR방법은 검정력 평가를 통해서 높은 검정력이 입증된 방법으로 많은 연구에서 사용된다. MDR 방법의 일반적인 절차는 다음과 같다.
Step 1. 데이터를 랜덤으로 10개의 같은 크기로 나눈다. 그리고 그중 9개를 training set으로 1개를 testing set으로 두고, 초기 값을 설정한다.
Step 2. 분석 하고자 하는 n개의 SNP조합의 초기 값을 설정한다.
Step 3. 모든 SNP에서 n개에 해당하는 SNP조합을 생성하고 초기 값을 설정한다.
Step 4. 선택된 SNP조합에서 SNP의 각각 수준을 기초로 한 개체들을 multi- factor classes 또는 cells에 기술한다. 예를 들어서 n=2 일 경우 SNP는 3개의 수준으로 되어 있다. 따라서 32=9 개의 셀을 가진다. 각각 9개의 셀에 case의 값과 control의 값의 비를 적는다.
Step 5. Case와 control의 비를 구하여 1보다 크거나 같으면 high_risk, 1보다 작으면 low_risk라 한다. 예를 들면 1행 1열의 경우 case와 control의 비가 1보다 작으면 이 셀은 low-risk이다.
Step 6. K개의 SNP의 조합 전부에서 데이터의 9/10인 training set에서 잘못 분류된 비율인 misclassification error(ME)를 구한다. 여기서 잘못 분류된 비율인 ME는 {(Totalhigh - Casehigh) + Caselow}/N 이다. Totalhigh는 high 그룹의 전체 값이며 Casehigh는 high 그룹의 전체 case 경우의 수이며 Caselow는 low 그룹의 전체 case 경우의 수이다. 그리고 N은 전체 데이터의 수이다. Step 3의 단계부터 생성된 모든 조합에 대한 ME값을 구할 때 까지 반복한다.
Step 7. 모든 조합에서 구한 ME값을 비교하여 가장 작은 값을 가지는 조합을 선택한다.
Step 8. Training set에서 high-low로 나눈 표를 나머지 1/10의 데이터인 testing set을 이용하여 잘못 분류된 비율인 prediction error(PE)를 Step 6의 정의와 같이 구한다. Step 2에서 정의한 모든 조합에 대해 Step 8까지의 과정을 반복한다.
Step 9. Step 1에서 정의한 모든 데이터 셋에 대해 Step 8까지의 과정을 반복하여 평균 ME(Avg. ME), 평균 PE(Avg. PE), CVC값을 구한다.
Step 10. 구해진 Avg. ME, Avg. PE, CVC 값이 가장 낮은 것을 best 모형으로 선별한다.
Cross validation consistency(CVC)는 10번의 cross-validation을 시행할 때 각 시행에서 선택된 best model을 카운트하는 것이다(Chung 등, 2005). 따라서 ME와 PE의 평균이 낮고 CVC가 높은 값이 best모형이다.
1. MVP 시스템 국축을 위한 후보 SNPs 검정
먼저 최적의 SNPs 조합을 위하여 선발된 5개의 후보 SNPs와 SNPs들간의 interaction검정을 하였을 때 정확도를 계산하였다.
도체중의 경우 TDRKH유전자의 g.17257 A>G SNP가 다른 4개의 SNPs보다 54.75%로 가장 정확도가 높았으며, 특히 PLCB1 유전자의 c.459 T>C 와 TDRKH유전자의 g.17257 A>G SNP의 조합이 58.78%로 가장 좋은 조합을 나타내고 있었고, Single의 효과보다 높은 정확도를 볼 수 있었다. 또한 표 6에서 TT유전자형을 가질 때 439.10kg으로 다른 4개의 SNPs보다 좋은 성적을 나타내는 결과와 일치하는 점을 볼 수 있었다.
도체중에 대한 5개의 후보 SNPs 정확도 검정
Gene SNP Training-bal accuracy Testing-bal accuracy
TDRKH g.17257 A>G 0.5475 0.5421
PLCB1 c.459 T>C 0.5395 0.5262
ADAM15 g.3060 G>A 0.5261 0.5091
C/EBPα c.271 A>C 0.5233 0.5046
ADAM15 g.3229 C>T 0.5063 0.4823




interaction		 c.459 T>C * g.17257 A>G 0.5878 0.5693
c.459 T>C * c.271 A>C 0.5665 0.5491
c.459 T>C * g.3060 G>A 0.5499 0.5400
g.17257 A>G * g.3060 G>A 0.5511 0.5284
g.17257 A>G * g.3229 C>T 0.5499 0.5238
c.459 T>C * g.3229 C>T 0.5475 0.5226
c.271 A>C * g.17257 A>G 0.5547 0.5194
g.3060 G>A * g.3229 C>T 0.5324 0.5058
c.271 A>C * g.3060 G>A 0.5492 0.4963
c.271 A>C * g.3229 C>T 0.5309 0.4617
등지방두께의 경우 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A유전자가 다른 4개의 SNPs보다 55.95%로 가장 정확도가 높았으며, 앞서 분석한 결과와 같이 PLCB1 유전자의 c.459 T>C 와 깊은 연관성을 볼 수 있었다.
등지방두께에 대한 5개의 후보 SNPs 정확도 검정
Gene SNP Training-bal accuracy Testing-bal accuracy
ADAM15 g.3060 G>A 0.5595 0.5125
PLCB1 c.459 T>C 0.5468 0.4812
C/EBPα c.271 A>C 0.5262 0.4704
ADAM15 g.3229 C>T 0.5207 0.3969
TDRKH g.17257 A>G 0.5210 0.3436




interaction		 c.459 T>C * g.3060 G>A 0.6199 0.6199
g.3060 G>A * g.3229 C>T 0.6039 0.5661
c.459 T>C * c.271 A>C 0.6079 0.5362
g.17257 A>G * g.3060 G>A 0.5742 0.4291
c.459 T>C * g.17257 A>G 0.5603 0.4228
c.271 A>C * g.3060 G>A 0.5914 0.3989
g.17257 A>G * g.3229 C>T 0.5473 0.3923
c.271 A>C * g.3229 C>T 0.5420 0.3664
c.459 T>C * g.3229 C>T 0.5654 0.3641
c.271 A>C * g.17257 A>G 0.5422 0.2746
이후 등급을 결정하는 근내지방도의 경우 ADAM15유전자의 g.3060 G>A SNP가 다른 4개의 SNPs보다 55.39%로 가장 정확도가 높았으며, 특히 PLCB1 유전자의 c.459 T>C와 ADAM15 유전자의 g.3060 G>A SNP 조합이 58.04%로 가장 높은 정확도를 보여주고 있었다. 이러한 결론들은 앞서 밝힌 결과에서 근내지방도가 5.78, 5.76으로 다른 3개의 SNPs보다 가장 높게 형성된 점과 일치하는 모습을 보여주고 있었다.
근내지방도에 대한 5개의 후보 SNPs 정확도 검정
Gene SNP Training-bal accuracy Testing-bal accuracy
ADAM15 g.3060 G>A 0.5539 0.5539
ADAM15 g.3229 C>T 0.5529 0.5529
C/EBPα c.271 A>C 0.5424 0.5424
PLCB1 c.459 T>C 0.5300 0.5163
TDRKH g.17257 A>G 0.5092 0.5036




interaction		 c.459 T>C * g.3060 G>A 0.5804 0.5789
g.17257 A>G * g.3060 G>A 0.5784 0.5524
c.459 T>C * g.3229 C>T 0.5763 0.5471
c.271 A>C * g.3060 G>A 0.5633 0.5338
g.3060 G>A * g.3229 C>T 0.5604 0.5338
c.459 T>C * c.271 A>C 0.5580 0.5249
c.271 A>C * g.17257 A>G 0.5520 0.5247
c.271 A>C * g.3229 C>T 0.5632 0.5221
g.17257 A>G * g.3229 C>T 0.5587 0.5204
c.459 T>C * g.17257 A>G 0.5383 0.4796
마지막으로 등심단면적의 경우 PLCB1 유전자의 c.459 T>C가 55.43%로 가장 높은 정확도를 보여주고 있으며 앞서 밝힌 결과에서도 93.92로 유일하게 유의적으로 차이가 나타났다. 다른 4개의 SNPs의 경우 등심단면적과 아무런 연관이 없었기 때문에 이러한 결과가 나온 것으로 유추해 볼 수 있었다.
등심단면적에 대한 5개의 후보 SNPs 정확도 검정
Gene SNP Training-bal accuracy Testing-bal accuracy
PLCB1 c.459 T>C 0.5543 0.5543
TDRKH g.17257 A>G 0.5326 0.5271
ADAM15 g.3060 G>A 0.5409 0.5064
C/EBPα c.271 A>C 0.5198 0.4939
ADAM15 g.3229 C>T 0.5176 0.4913




interaction		 c.459 T>C * g.17257 A>G 0.5805 0.5612
c.271 A>C * g.17257 A>G 0.5630 0.5400
g.3060 G>A * g.3229 C>T 0.5561 0.5327
c.459 T>C * c.271 A>C 0.5623 0.5225
c.459 T>C * g.3060 G>A 0.5706 0.5212
g.17257 A>G * g.3229 C>T 0.5463 0.5193
g.17257 A>G * g.3060 G>A 0.5516 0.5066
c.271 A>C * g.3060 G>A 0.5516 0.5041
c.459 T>C * g.3229 C>T 0.5586 0.4985
c.271 A>C * g.3229 C>T 0.5416 0.4790
2. MVP 시스템 국축을 위한 최적의 우수 SNPs 조합
앞서 검정된 5개의 후보 SNPs들을 대상으로 MVP 시스템을 구축하기 위한 최적의 SNPs조합은 표 16에 나타내었다. 도체중의 경우 c.459 T>C와 g.17257 A>G조합의 TTGG, CCGA, CTGA, CCAA, CTAA, TTAA 유전자 형을 가질 때 438.59kg으로 유의적인 차이를 보여주며 Single인 g.17257 A>G의 GA, AA유전자형인 436.88kg보다 1.71kg높게 형성되며 그 효과가 더욱 증가되었다는 점을 볼 수 있었다.
우수 SNPs 조합
경제형질 SNP조합 우수유전자형 두수 평균 표준
편차		 T-test (p-value)
도체중
(CW)		 g.17257 A>G GG 466 424.24 43.02 0.002
GA, AA 146 436.88 45.38
등심단면적
(LMA)		 c.459 T>C TT 124 93.92 10.49 0.000
CC, CT 488 90.19 9.65
등지방두께
(BTF)		 g.3060 G>A AA 92 14.05 5.75 0.109
GG, GA 520 13.02 5.09
근내지방도
(MS)		 g.3060 G>A GG 258 5.14 1.92 0.006
GA, AA 354 5.58 1.92
도체중
(CW)		 c.459 T>C g.17257 A>G CCGG, CTGG, TTGA 390 420.80 42.30 0.000
TTGG,CCGA,CTGA,
CCAA,CTAA,TTAA		 222 438.59 44.43
등심단면적
(LMA)		 c.459 T>C g.17257 A>G TTGG, CCGA, CTGA,
TTGA,CCAA,CTAA		 243 92.50 10.02 0.002
CCGG, CTGG, TTAA 369 89.92 9.75
등지방두께
(BTF)		 c.459 T>C g.3060 G>A CCGG, CCGA,
CTAA, TTAA		 245 13.65 5.77 0.045
CTGG,TTGG,CTGA,
TTGA,CCAA		 367 12.26 4.77
근내지방도
(MS)		 g.17257 A>G g.3060 G>A GGGG, GAGG, AAGG,
AAGA, GAAA		 288 5.13 1.93 0.001
GGGA, GAGA,
GGAA, AAAA		 324 5.63 1.90
c.459 T>C g.3060 G>A CCGG, CTGG,
CCGA, CTAA		 352 5.11 1.93 0.000
TTGG,CTGA,TTGA,
CCAA,TTAA		 260 5.77 1.87
또한 등지방두께의 경우 single에선 아무런 유의적인 차이가 나타나지 않았지만 조합에선 CTGG, TTGG ,CTGA, TTGA, CCAA 유전자형을 가질 때 12.26으로 유의적인 차이를 나타내고 있었다.
특히 근내지방도 c.459 T>C와 g.3060 G>A의 TTGG, CTGA, TTGA, CCAA, TTAA 유전자형에서 5.77로 single인 5.58보다 높게 유의적인 차이를 보여주고 있었다.
일반적으로 한우는 성장 속도가 느리며 비육 생리상 외국의 육우와는 달리 육질을 결정하는 근내지방의 침착이 늦게 이루어지는 취약성을 갖고 있다. 이러한 점을 보완하기 위해 현장농가에서는 등급을 인위적으로 높이기 위해 늦게 출하하는 것이라 유추해 볼 수 있다. 하지만 한우 산업의 경쟁력 강화를 이루기 위해 사육 개월을 줄이고 육질등급이 높은 개체를 조기에 선발하여야 한우산업의 경쟁력을 강화할 수 있을 것이다.
이러한 결론들을 모두 미루어 보아 본 연구에서 제시한 최종 선발된 5개의 SNPs를 현장농가 집단에 적용하여 도체중일 땐 c.459 T>C와 g.17257 A>G 조합된 마커를 적용하여 도체중을 증가시키고, 근내지방도일 경우 c.459 T>C와 g.3060 G>A의 TTGG, CTGA, TTGA, CCAA, TTAA유전자형 선발 할 경우 그 정확도도 높을 뿐 아니라 등급 수치를 오려 농가소득증대와 더불어 고품질 쇠고기를 생산 할 수 있는 중요한 보조수단으로 이용될 수 있을 것이다.
<110> OH, Dong Yep YEO, Jung Sou LEE, Young Wook <120> Single nucleotide polymorphism marker in ADAM15 gene for diagnosis of meat quality in Hanwoo and method for diagnosis of meat quality in Hanwoo using same marker <130> DP-2014-0304 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 551 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 1 ggaaaaatga ggtacgaggc atggagcttg taagctttct gacttcctgc atctttgctt 60 aggggcttag tgatcctgtc cccagagaga agctactctg tggagctggg gcccrgggac 120 cttcagggtc ccccagttgt ctcccggatc caagacctcc tcctgccacg ccacacttgt 180 gccctgagct ggcctacatc tgtgctccct caggctctac cggagccctc cctgggacag 240 cgtcacactc accgggtgag gagggaaggc aggagggctg ggcttctgtt gytcccgggg 300 ttggccccct ggccctcaga actattggct catagtaacg atagttcctg ctcacggagc 360 gattttgcag caccaggcgc tgtgtaaaca ttaactcctt cactcacccc agcaaccctg 420 gggcataggt gctatccaga gctctgtttt agtgagaaaa ctggctctaa gaggttaagc 480 gacttggtca aggccattca actaatacat ggtatttcca ggatttggat gcaggcattt 540 tgactcaaaa a 551 <210> 2 <211> 621 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 2 tacatcagtt ctcttatctc taggtatttt aaaaagcagg taaaattttg ttcatgggta 60 aagaccattt ccttaggaaa agagtagtca ttcagtgatc tgaatttaat tgtgtcattt 120 taacagaggg aaaaaaaggg aaaaaaccct taggcataca aattgaacta atttgtcttc 180 ctagtagcat cgctaaaaac atatgtctaa tgactgcaca gtatttaagc taatgaaagt 240 gtgattcaca tttttcagga atggacaaat gaggttttca gtttggcaac aaacctgctg 300 gcccaaaaca tgtccaggga ygcatttctg gaaaaggcgt aagtagctct aattttattg 360 caaagggtgt tgcttcatct gagtcagttt cctttctcct ttgtgagtct tttgtttatg 420 ctgcactggc ttctcacatt gataaacata aatttccctc tgggacttgt tagagaactg 480 ataggttcac tgcttggaat tggaatactt ccagtaaaga ttgctctttc ctctgagctc 540 tacatctgtg ttacactgag aatgtcaatg cctttgacac tcagtaagga gatacttcta 600 aatcctggca actatgccca g 621 <210> 3 <211> 600 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 3 gcgacaaacc ggtataaatg ctgggcccgc gcgggcctgg ccattggcga ccgggagctg 60 agcgggcgcg agcgagtagg ggctctgggt gggcggtggc agcagcggcg ccccgcgcag 120 gctggaggcc gccgaggctc gccatgccgg gaggacttta gctcccccat ggagtcggcc 180 gacttctacg aggcggagcc gcggcccccg atgagcagcc acctccagag ccccccacac 240 gcgcccagca gcgccgcttt cggctttccc mggggcgcgg gcccctcgca gccccccgcc 300 ccacctgccg ccccggagcc tctgggcggc atctgcgaac acgagacgtc catcgacatc 360 agcgcctaca tcgacccggc cgccttcaac gacgagttcc tggccgacct gttccaacac 420 agccggcagc aggagaaggc caaggcggcc gcggcccccg caggaggcgg caacgacttt 480 gactacccgg gcgcccccgt gggccccggc ggcgccgtca tgcccggggg gacgcacggt 540 ccccctcctg gctacggctg cgcggcagcc ggctacctgg acagcaggct ggagcctctg 600 600 <210> 4 <211> 748 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 4 ggcaagcagt agctacctga ttgtatctga gagtgagaag aaccctttac tccatcctgg 60 gtcagtatct gaccatgtag atatcatccc ttctcttatt ttccacggca tttgatactg 120 gagaaagttt cagaagatga agaacttagg aagagaattg ctcattctgc agaaaccaga 180 gttccacgga agcagccaat cagcgtaaga agagaggaag tgacagagcc aggtggagcc 240 agagagccar ctttatggaa aaacactggc actagcttaa aacaggctgc acctctggca 300 gttcctcccc acaaaggaga tggtgacgtg gctgctgtgg gaccagaaga gggttcctgg 360 gagaaaccta atgatgacag ctttcagagg tctgctgtcc agaccagtcc agagatgtcc 420 atgtttgaaa gtatgtaaca aaggggaccc cttagccata tggaagatag gcatactggc 480 tatgtgtgta tgctcagttg tgtctgactg tttggaaacc caaacccgaa gtatggctca 540 gatacaaaaa aaacaagagt catgttgtga ataaagattg aacacagtcc ggaaggaaaa 600 aggctctcgt cctctgggag cagctctttt ttattaaagc catgtacaca aatagtagac 660 tagtgacaga tgcggggaaa ggtcggtagt gagtataaag ttaatatgac gcgcggggaa 720 acaaaaatcg gcatcagcta ctggagga 748

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열, 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열, 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열 및 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 근내지방도 예측용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 G>A이고, 상기 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 C>T이고, 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>C이고, 상기 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A>C인 것을 특징으로 하는 한우 근내지방도 예측용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
    (2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드, 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드 및 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
    (3) 상기 유전자형으로 한우 근내지방도를 예측하는 단계를 포함하는 한우 근내지방도 예측방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 서열번호 1의 115번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열, 서열번호 1의 292번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열, 서열번호 2의 321번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열 및 서열번호 3의 271번째 뉴클레오티드의 SNP 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 한우 근내지방도 예측용 키트.
  10. 삭제
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101277024B1 (ko) 2011-11-21 2013-06-24 영남대학교 산학협력단 소 경제형질 진단용 다형성 마커 및 이를 이용한 소 경제형질의 진단방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI 검색 결과 (2009.05.22)*
S.C.shin et al., Asian-Aust.J.Anim.Sci.20(4):466-470 (2007.04.)*
심승화., 차세대염기서열 분석을 통한 한우 유전체 진단 엑손서열 및 육질 연관 유전변이 분석, 상지대 동물생명자원학과 생명공학 석사학위 논문(2013.12.16)*

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