CN106906303B

CN106906303B - 一个影响猪肉品质性状的snp标记及其应用

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Publication number: CN106906303B
Application number: CN201710286616.3A
Authority: CN
Inventors: 黄路生; 麻骏武; 刘先先; 肖石军; 吴钟紫; 熊信威; 杨杰; 张志燕; 周李生
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN106906303A

Abstract

本发明涉及生物技术辅助遗传改良领域，特别涉及一种影响猪肉质性状的SNP。所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组15号染色体上的从5’端起的第133802499位点的核苷酸，所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第238位点的核苷酸，且该位点为Y，其中所述Y为T或者C。

Description

一个影响猪肉品质性状的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及动物的分子生物学技术及动物遗传育种领域，具体内容是鉴别能显著影响猪肌糖原含量、糖酵解潜能、pH、滴水损失、肉色等肉质性状的功能基因的分子标记，并创建运用该分子标记对种猪肉质性状进行遗传改良的技术。

背景技术

猪肉品质是猪的重要经济性状，提高猪肉品质是现代种猪选育工作的重要目标之一，同时也是满足消费者对猪肉风味、食品健康和营养需求的重要保障。然而，由于肉质性状的复杂性且遗传力偏低，传统的基于表型相关的育种方法难以得到好的改良效果，因此对猪肉质性状分子遗传机理的研究就显得十分必要。

pH值是肌肉组织酸度的直接体现，反映的是猪宰后肌糖原酵解速率及程度。当pH_45min<5.8并伴有肉色惨淡灰白，同时有大量渗出现象时，可判定为PSE肉。当pH_24h>6.0且伴有肉色呈暗褐色和表面干燥现象时，可判为DFD肉。这两种异常肉都将会对养猪业及猪肉类产品加工业造成很大的经济影响，尤其是火腿的加工损失及肉质的腌制损失。且在分析劣质肉时发现，pH值下降的速率及程度对系水力、肉色、多汁性、嫩度、肉质的运输和储存、货架的寿命等都是有很大影响的。然而，肌肉表现出的pH值对肉质的影响仅仅是一种表面现象，肌肉中残存的糖原含量是影响pH值及由此产生的一系列有关肉质变化的根本所在。

肌糖原酵解潜能(glycolytic potential,GP)反映猪屠宰后肌肉中糖原和葡萄糖转变成乳酸的量，是度量肉样具有的酸化潜力。其计算公式为：GP＝2×(糖原+葡萄糖+6-磷酸葡萄糖)+乳酸(单位：umol/g)。GP在很大程度上决定了猪肉终pH值的高低，进而影响肉质的加工产量和肉色等多个肉质指标，故GP的测定对育种乃至饲养管理有更深层次的意义。

目前，国内外研究小组利用多个试验群体在猪不同染色体上定位了约8974个数量性状位点(QTL；详见猪QTL数据库PigQTLdb,http://www.animalgenome.org/cgi-bin/ QTLdb/SS/index)与肉质性状相关。其中，影响pH的QTL有647个，滴水损失有1071个以及肉色的有591个。这些QTL的发现加深了对猪肉质性状分子遗传机理的认识，同时为开发影响猪肉品质性状的分子标记奠定了一定的工作基础。国际上首次报道鉴别出同时影响猪pH、滴水损失、肉色等性状的因果基因为PRKAG3。PRKAG3基因是采用图位克隆法发现的基因，该基因的发现起源于RN基因。1985年，Monion和Sellier(Meat Sci,1985,13:49-63)发现了一种猪肉，其肌肉组织外部呈苍白色、肌肉表面有水分渗出的，但渗出性比一般的PSE肉低，这种猪肉虽类似PSE肉，但并非PSE肉，为典型的―汉普夏型猪肉”。其最终pH值比正常肌肉要低。这种肉由于最终pH值异常低，所以被称为酸肉(acid meat)。1990年，Le Roy(GeneticalResearch,1990,55:33-40)等也通过分离分析方法证实了rn⁺/RN^-基因的存在。相比于正常的基因型rn+来说，RN-为显性缺陷基因，携带RN基因型的个体，其骨骼肌组织中的含糖量比正常猪肉高出70％，从而导致猪屠宰后乳酸含量增加，肉质终pH较低(终pH<5.5)，同时伴随着系水力的降低，滴水损失的增加，蛋白质和干物质含量也相应降低。2000年，Milan等(Science,2000,288:1248-1251)利用RT-PCR方法对rn+/rn+和RN-/RN-两种纯合子个体完整的PRKAG3编码序列进行了分析，结果找到了7个多态性位点，在对这7个多态位点扫描后发现5个不同的PRKAG3等位基因，但结果证实只有R225Q错义突变与RN-的突变有专一性。后来进一步发现R225Q的突变发生在AMPKγ3中最保守的区域—第一个胱硫醚β-合酶结构域上。因此通过一系列的分析和假设验证，Milan等最后确定PRKAG3基因上引起糖原含量升高近70％的R225Q突变(精氨酸突变为谷氨酸)就是RN-突变位点，该成果发表在Science上。但是，R225Q突变的选育只能在汉普夏或者含有汉普夏血缘的猪种中，在世界主流的商品猪中该位点并没有分离，因此也具有其选育的极限性。

杜洛克、长白、大白是世界主流的商业猪种，它们的三元杂交猪杜长大在中国生猪养殖量中超过70％，然而与中国地方猪种相比，肉质总体表现较差，PSE或DFD劣质肉发生率近10％，导致全球每年超过十亿美元的经济损失，且高劣质肉发生率也严重影响消费者的购买欲和食用口感，因此对其肉质遗传改良是十分必要的。猪肉品质属复杂性状，受到众多因素的影响，遗传、品种、年龄、性别、生理、营养、屠宰前的管理、屠宰技术、屠宰后的加工处理和包装以及烹调方法等都会影响猪肉的品质。而仅根据表性特征进行选种的常规育种方法难以进一步改善肉质。肉质的变异根本上还是受遗传因素控制，然而国内外研究小组对杜长大肉质性状的遗传解析较少，最终使得其肉品质改良的进程很慢。

发明内容

鉴于以上背景，申请人利用屠宰的610头杜×长×大三元杂商品猪(以下简称―杜长大”)，测定了9个肉质性状表型，通过全基因组关联(GWAS)分析，位置候选基因的功能注释信息，目的基因DNA全长比较测序等相结合的方法，发现PRKAG3基因中的一个错义突变位点显著影响肉质的多个性状，同时对该位点及其编码氨基酸的保守性进行分析，运用SIFT软件预测该突变是否影响蛋白质功能，并通过不同基因型酶活性检测和表达差异分析对该位点进行功能验证，为今后猪育种的标记辅助选择提供确切的遗传学证据。

本发明之一提供一种影响猪肉质性状的主效SNP标记，所述SNP标记位于猪15染色体上的编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3亚基PRKAG3基因的核苷酸序列上，即序列表SEQID NO:1所示的位于15号染色体上的基因序列，序列标注位置为第238位的C>T单核苷酸突变——它对应于10.2版本的国际猪基因组参考序列(Sscrofa 10.2)15号染色体上第133802499核苷酸。通过PCR-RFLP或者探针分型的方法检测该位点，利用标记辅助选择(MAS)方法选择有利的等位基因型个体留种，可以显著降低个体肌肉中糖原含量，从而提高肌肉pH值，降低滴水损失。

本发明之二提供了一种核酸序列，所述核酸序列为包括如上所述的SNP标记的核酸序列，所述核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。举例来说，所述核酸序列只要包括所述的SNP标记，不论其长度是多少bp，例如其长度可以是10bp、15bp、20bp、30bp、50bp、80bp、100bp、120bp、150bp、180bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp等等，那么其均是本发明所要求保护的核酸序列，但所述核苷酸序列并不限于所列举的长度。另外，所述SNP标记一般位于所选定的所述的核酸序列的中心位置或比较靠近中心的位置，例如，在20bp的选定片段中，所述SNP一般在这个20bp的DNA片段中的第7-14位中的一个位置；在1500bp的DNA片段中，所述SNP所处的位置的选择余地大大增大，其可以是在第100-1400位中的一个位置，优选在300-1200位中的一个位置，更优选在500-700位中的一个位置，这样设计的目的是有利于更加准确的检测所述的SNP标记；但是，在检测技术特别灵敏和/或特异性非常强的情况下，所述SNP标记也可以靠近所选定的核酸序列的两端中的一端，甚至是位于第一位或者末位。一般来说，所述核酸序列在为DNA序列时，该核酸序列是从15号染色体中截取的一段DNA序列。

本发明之三在于提供了一种确定猪的肉质性状遗传改良的方法，所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的如权利要求1所述的SNP标记，并根据所述SNP标记做出相应的选择：

在所述种猪核心群中选择所述种猪在所述第133802499位点为CC基因型的个体，淘汰所述种猪在该位点为CT和TT基因型的个体，以逐代提高该位点的等位基因C的频率，从而降低猪肌肉糖原含量和糖酵解潜能，提高肌肉的pH值、系水力及肉色，减少其滴水损失和加工损失，改善肉品质。

其中，常用的检测SNP的方法有：1)基于杂交方法，其至少分为a)利用ΔTm法，b)杂交加荧光探针的方法；2)基于酶的方法，其至少分为a)DNA聚合酶法，例如利用DNA聚合酶进行PCR扩增，b)连接酶法，c)限制性内切酶法，d)外切酶FEN法，e)RNase H法；3)电泳法，其至少分为SSCP单链构象多态性和DGGE/TGGE变性梯度凝胶电泳；4)直接测序法。

在一个具体的实施方式中，利用分析所述种猪的核酸序列来确定所述种猪的如权利要求1所述的SNP标记，其中所述核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。其中，分析所述种猪的核酸序列的具体的方法至少包括PCR-RFLP，PCR-测序，荧光探针等方法。

本发明之四提供了一种确定猪的肉质好坏的方法，所述方法包括：确定猪的所述的SNP标记，并根据所述SNP标记确定猪的肉质好坏：

当所述猪在所述第133802499位点的基因型为CC型时，所述猪的肉质明显优于该位点为CT基因型或TT基因型的猪。

本发明之五提供了一种根据所述的SNP标记的应用。例如，可以是在种猪肉质性状的遗传改良中的应用。

本发明之六提供了一种与如上所述的包括所述SNP标记的核酸序列核酸序列能够严谨杂交的核酸序列。该提供的核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。在这里，可以举例来说明―如上所述的包括所述SNP标记的核酸序列”，即所述核酸序列可以选自DNA序列，其位于猪的15号染色体上，且包括所述的SNP标记的核酸序列。例如，所述核酸序列可以选自SEQ ID NO:1，所述核酸序列也可以选择cDNA，例如，其可以选自SEQ IDNO:3。本发明之六提供的核酸序列能够用于种猪在肉质性状的遗传改良中的应用。

在一个具体的实施方式中，所述核酸序列具有与SEQ ID NO:1 90％以上的相似性，且其编码的蛋白质与如SEQ ID NO:3的蛋白质具有相同的功能。例如，所述核酸序列可以是根据SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列进行的人工改造的核酸序列，此人工改造的核酸序列可以用于后续的基因工程或遗传工程中，所述人工改造包括密码子的优化，一个或多个位点的定点突变、插入突变或缺失突变，或者类似所列举的这些常规手段的组合。

本发明之七提供了一种如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列在猪脂肪沉积性状中的应用。例如利用鉴定SEQ ID NO:3的第53个氨基酸是为脯氨酸(Pro)还是为亮氨酸(Leu)来判定种猪的SNP标记：

当SEQ ID NO:3的第53个氨基酸为脯氨酸(Pro)时，所述SNP标记为C；

当SEQ ID NO:3的第53个氨基酸为亮氨酸(Leu)时，所述SNP标记为T；

当SEQ ID NO:3的第53个氨基酸为脯氨酸(Pro)时，所述猪的肉质明显优于SEQ IDNO:3的第53个氨基酸为亮氨酸(Leu)的猪。

附图说明

图1.杜长大商品猪的背最长肌糖原含量，糖原酵解潜能(GP)，pH值，滴水损失，亮度(L*)，红度(a*)，黄度(b*)及肉色主观评分的GWAS分析图，上述八张图的横坐标均表示猪的染色体编号，纵坐标表示-logP值。

图2.15号染色体上PRKAG3基因区域77Kb的范围内haploview分析，最显著位点rs42与周边SNP的连锁情况图。

图3.猪AMPK Elisa试剂盒检测PRKAG3基因中错义突变rs42不同基因型(CC，CT基因型各6个)肌肉组织的AMPK酶活性差异情况。

图4.荧光定量PCR方法检测PRKAG3基因中错义突变rs42不同基因型(CC，CT基因型各6个)在肌肉组织中的表达差异情况。

图5.PCR-RFLP方法检测多态位点基因型，从图5可以看出，使用Eco0109I限制性内切酶酶切所述的PCR产物，当突变位点为C时，酶切后的片段为235bp和169bp；当突变位点为T时，酶切后的片段为404bp(即该PCR片段不能被酶切)。其中1，2，3号个体为CT基因型，4，5个体为CC基因型。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。

实施例1

1、实验动物

本发明所使用的实验猪群体共有2个：试验群体为从九江修水猪场购买的杜长大猪；验证群体为温氏猪场的杜长大商品猪。

试验群体是以杜洛克为终端父本，长白×大白的杂交猪种作为母本而得到的610三元杂交商品猪，其中包括阉割公猪306头，母猪304头。它们都是从九江修水猪场购买的，按照统一的管理条件和饲养标准进行饲养，等到达上市体重(90～100kg)后，则将这些商品猪运至南昌市的国鸿屠宰场，接着禁食24h，并采用统一电击麻醉方式及心脏放血的方式进行屠宰。

验证群体是温氏猪场的150头商品猪。按照试验群体相同的喂养和屠宰方式进行屠宰。

2、肉质表型测定

猪屠宰30分钟至45分钟后，取左胴体第10根至最后一根肋骨的背最长肌组织进行9个肉质性状表型测定，所测表型包括：糖原含量，乳酸，GP，pH值，滴水损失，肉色(Minoltaa*，b*和L*)和肉色主观评分。利用肌糖原、乳酸测试盒(购自南京建成生物研究所，货号分别为A043、A019-2)，检测每个个体肌肉样品中糖原和乳酸含量；pH值的测定是用德国梅特勒公司生产的Delta320pH Meter仪器进行测定的，测定前分别用pH为7.00及4.01的标准缓冲液进行校正，每份肌肉样品测定2次，取其平均值作为最后结果；滴水损失的测定采用EZ-管法。用圆形取样器取样，将肉样装入EZ-管(KABE Labortechnik,Numbrecht-Elsenroth,Germany)，然后在冰箱(0～4℃)中悬挂规定时间后称重。滴水损失计算为滴水重(肉样前后两次称重的差值)占初始重的百分比；用Minolta色度仪CM-2600d/2500d测定肉的亮度(L^*)、红度(a^*)和黄度(b^*)；肉色主观评分的测定首先是切开肌肉组织，使横切面暴露空气中约5-8分钟，再用NPPC标准肉色评分板进行评分，该评分板总共有6个评分值，1＝灰白色，6＝暗紫色。

3、猪全基因组60K SNP芯片扫描

本研究将屠宰的610头杜长大个体的耳样保存于75％乙醇的2mL DNA管中。采用实验室统一的标准的苯酚/氯仿抽提方式提取全基因组DNA。等到DNA充分溶解后，采用Nanodrop-1000核酸蛋白分析仪对DNA样品进行质量和浓度检测。合格DNA样品统一稀释到50ng/ul，按照Illumina公司提供的protocol对样本进行芯片扫描完成实验。利用PLINKv1.07软件对所有样本60K SNP芯片扫描分型数据进行质控，剔除检出率小于99％，次等位基因频率小于0.01，偏离哈代温伯格平衡P≤10-5的SNP标记及排除检出率小于90％的个体。质控后最终有610个个体和39369个SNP用于全基因组关联分析。利用Bonferroni方法来确定全基因组显著阈值，染色体的显著水平为2.54×10^-5(1/39369),基因组显著阈值为1.27×10^-6(0.05/39369)。由于Bonferroni确定阈值的方法比较严格，因此在分析时，采用降低的阈值(如P＝1.00×10^-4)来检测一些可能中度连锁的QTL及多效QTL。本研究用国际猪基因组参考序列10.2版本确定SNP的物理位置。

4、全基因组关联(GWAS)分析

GWAS分析结果如表1所示，从表中可以看出，GWAS在15号染色体上总共鉴别到了15个与糖原含量，滴水损失，红度(a*)，黄度(b*)，亮度(L*)，肉色评分和pH值相关的显著性位点。其中糖原含量的最强关联SNP SS478944394位于129.79Mb，滴水损失，红度(a*)，黄度(b*)最强关联SNP为位于134.39Mb的同一个SNP SS107833468。此外，在127.42Mb处存在显著影响亮度(L*)和肉色主观评分的SNP位点SS131528409以及在126.78Mb处也定位到影响pH值的SNP位点SS131528395。因此，根据GWAS结果及结合位置候选基因的功能注释信息认为PRKAG3为该QTL的强候选基因。

表1杜长大群体15号染色体上与肉质性状相关的GWAS结果

5、PRKAG3基因中R225Q，T30N，G52S和I199V与肉质的关联性分析

为了排除试验群体中混有汉普夏血缘的情况，我们首先利用PCR-RFLP的方法(见表2)对R225Q判型，结果显示该位点没有分离。接着我们根据Ciobanu等(Genetics,2001,159:1151-62)文献报道，PRKAG3基因中T30N，G52S和I199V极可能是影响商业猪种肉质性状的三个错义突变位点。因此，在本杜长大试验群体中，申请人采用PCR-RFLP的方法先检测了这三个位点的基因型及分布频率，再评估其对肉质性状的影响效应。使用PCR-RFLP方法检测多态位点基因型，使用Primer 5.0软件设计引物。PCR反应体系为：25μl的反应体系中包含40ng基因组DNA、0.2mM dNTPs、0.2μM的引物、1.5mM Mg²⁺，1×PCR缓冲液和2U TaqDNA聚合酶(Taraka)。PCR程序设计同样为降落PCR：94℃预变性5min，94℃变性30s，68℃～55℃30s，72℃50s，每个循环降低0.5℃，共26次循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，19次循环；72℃延伸1min，最后降至4℃。扩增产物用于酶切基因判型，15μl的酶切反应体系中包含PCR产物5μl，限制性内切酶2U，10×缓冲液1.5μl和去离子水8.3μl，核酸内切酶BsrbI，StyI，HphI，BsaHI的最适酶切温度为37℃，将酶切应体系在所选内切酶的最适温度下温育6小时(h)，反应产物经4.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，从而判断这4个位点的基因型。

然后申请人对这四个位点进行关联性分析，结果表明(见表3)，三个错义突变位点(T30N，G52S和I199V)都显著影响性状a*值，其相关程度分别为0.007，0.04和0.008。其中，T30N显著影响了乳酸，滴水损失，红度和黄度，NN基因型个体有更高的GP值和滴水损失，这意味着T是有利等位基因。G52S在这个群体中影响了糖原含量和a*值两个肉质性状。对于突变位点I199V来说，次等位基因频率(MAF)为0.22。纯合子VV个体比杂合子IV及纯合子II个体有更高的糖原含量，乳酸，GP，pH，滴水损失，红度和亮度。该位点对GP，pH，滴水损失，红度和亮度有显著影响。很显然，T30N，G52S和I199V与表型关联程度远不及GWAS最高点的P值，说明这三个错义突变位点不是影响本试验杜长大群体肉质性状的QTL因果突变点。

表2 PCR-RFLP方法判定R225Q，T30N，G52S和I199V基因型

表3 PRKAG3基因中的T30N，G52S和I199V对肉质性状的效应

6、PRKAG3基因中新增69个SNP位点与肉质的关联性分析

6.1PRKAG3基因DNA全长测序

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的PRKAG3基因DNA序列，自行设计了16对引物测序(表4)，引物的的设计采用Premier 5.0软件。

选取糖原含量最高位点的三种基因型共6个个体进行PCR扩增。采用改良型的降落PCR(Touch down PCR)扩增程序进行扩增，PCR反应体系为25μl，其中包括40ng基因组DNA、0.2mM dNTPs、0.2μM/L的引物、1.5mM Mg²⁺，1×PCR缓冲液和2U TaqDNA聚合酶(Takara)。降落PCR程序设计为：94℃预变性5min；然后进入PCR扩增程序，94℃变性30s，68℃～55℃30s，72℃50s，每循环一次降0.5度，共26次循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，19次循环；72℃延伸1min，最后降至4℃。所得到的产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海生工生物工程有限公司测序，测序结果采用DNA Star软件包的Seqman程序进行分析。通过序列对比方法，除R225Q，T30N，G52S和I199V外共发现了90个多态位点(表5)。

表4 PRKAG3基因引物信息

表5 PRKAG3基因全长测序搜寻到共90个SNP突变位点

6.2 QTL区域增加69个SNP位点分型质谱

根据PRKAG3基因测序结果，结合Ensembl上SNP的注释信息以及国内外其他研究小组在杜洛克，长白，大白，杜长大商品猪中对PRKAG3基因的研究情况，最后申请人基于SNP的连锁情况，位置信息，生物学预测结果等原则挑选了69个SNP(见表6)进行分型质谱。结果发现，PRKAG3基因中的一个错义突变rs42显著影响糖原含量(P＝7.09×10^-49)，GP(P＝7.66×10^-16)，pH(P＝6.05×10^-6)，滴水损失(P＝2.66×10^-12)，亮度(P＝1.54×10^-12)，红度(P＝1.82×10^-9)，黄度(P＝1.44×10^-7)和肉色主观评分(P＝1.33×10^-8)(见附图1，表7)。在杜长大607头个体中仅见rs42两种基因型(CC基因型和CT基因型)，且CT基因型个体仅有17个，故属于低频突变。CT基因型个体的平均糖原含量为43.98umol/g，其平均滴水损失为6.49％；CC基因型个体的平均糖原含量为8.87umol/g，滴水损失为3.26％。因此，T等位基因可增加肌肉糖原含量，从而相应地增加了肌肉滴水损失，而C等位基因作用则正好相反。从附图2可以看出，rs42在一个536bp单倍型框中，但与周边的SNP的r²值太小，像是一个断点，这与rs42是稀有突变相一致。生物信息学分析发现该突变位点及其编码的氨基酸在物种中是相对保守的，且突变会导致相应的氨基酸发生改变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。用SIFT软件对该位点进行功能预测，结果显示该位点对蛋白质的功能是有影响的，同时rs42对蛋白质功能有影响在其他文献中也得到重复结果。然后申请人在536bp的单倍型框中构建了四种单倍型及算出各自频率：AGTCG：0.093，GACCA：0.399，GGCCA：0.494and GGCTA：0.014。其中除了rs42突变位点，最后一种单倍型与第三种单倍型很相似，说明该单倍型主要来源于第三种单倍型。

表6杜长大群体中PRKAG3基因区域的多态位点及其频率

表7 rs42对肉质性状的效应

7、AMPK酶活性的检测

PRKAG3编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3亚基，因此错义突变rs42很有可能会改变AMPK酶活性。于是我们选取CC，CT基因型个体肌肉组织各6个，利用从上海酶联生物公司购买的猪AMPK Elisa试剂盒(ml026824)进行酶活性的测定。结果发现突变个体与野生型相比，会显著抑制酶活性(见附图3)。同样，R225Q突变个体肌肉糖原含量也较高，AMPK酶活性比野生型低(Science,2000,288:1248-1251)。

8、PRKAG3表达差异检测

AMPK酶活性检测采用同样的肌肉组织共12个，根据TRNzol-A+总RNA提取试剂盒提供的实验流程完成对肌肉组织总RNA的提取。用NanoDrop1000超微量分光光度计对RNA进行浓度检测和质量检测，并在PCR上65℃变性5min，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带完整性。按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)的操作说明书，我们将合格的RNA样品反转录成cDNA，主要的步骤包括：1、除去基因组DNA。在提取的总RNA中加入相应的试剂后42℃温育2min；2、反转录反应。向第一步反转录产物中加入相应的试剂后在37℃温育15min，85℃5s，4℃终止反应。最后将得到的产物cDNA进行定量，做实时荧光定量PCR，分析PRKAG3基因两种基因型个体在组织中的表达情况。其具体过程如下：先根据PRKAG3基因的cDNA序列设计引物(见表8)，然后将cDNA稀释到至200ng/ul，以GAPDH(见表8)的扩增产物作为内参，同时以无RNA酶的超纯水做阴性对照，每个个体重复3次，取平均值作为最后结果用于分析。

结果表明，CC基因型个体PRKAG3平均表达量高于CT型，但两者差异未到显著水平(P>0.05)(附图3)。这与R225Q突变的结果是相一致的，R225Q突变个体会使PRKAG3基因mRNA丰度降低(Journal of Biological Chemistry,2004,279:38441–38447)。

表8 qRT-PCR引物信息

9、扩大实验群体验证错义突变效应

将温氏150头商品猪进行屠宰，然后用试验群体一样的方法测量肌肉组织糖原含量，乳酸及GP。使用PCR-RFLP方法检测R225Q，G52S，I199V及rs42(表9)多态位点基因型，其方法同上述5一样。此外，申请人也发明了利用探针对该位点进行分型(表10)。其扩增体系为：10ul反应体系包括3.4ul水，5ul Taqman Genotyping Master Mix，0.2ul 10mM上游引物，0.2ul 10mM下游引物，0.1ul 10mM探针1，0.1ul 10mM探针2，1ul DNA。反应程序为：首先AD-pre read读取初始背景(本底)荧光信号，然后AQ-PCR扩增，50℃，2min；95℃，10min，40个循环，最后AD-post read读取PCR反应结束后荧光信号，除去本底信号，分析后自动分簇给出判型结果。

结果显示R225Q在群体中并没有分离，在150头商品猪中只检测到了3个个体为杂合子基因型CT，其余147头猪全部为CC基因型，次等位基因频率为0.01。关联性分析结果表明该突变对糖原含量效应显著(表11)。

表9 PCR-RFLP方法检测rs42位点基因型

表10利用探针对rs42位点进行分型

表11验证群体中突变位点rs42对糖原含量，乳酸和GP的效应

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

序列表

<110> 江西农业大学

<120>

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 404

<212> DNA

<213> Sus Scrofa

<220>

<223> 猪PRKAG3基因的部分DNA序列1

<400> 404

CACAAGGGGG AGGACAACTG CATTGCTGAT CCAGGGGTCC AGGGATCCAG GTGGCCAACT 60

CAGGACAGAG CCACTGTCTT CTCTGTGACT CTCTGAGACT CAGCTCTCTC ACCTGCAAAA 120

TGGGGCCACA GCATTCAGGC TTCCCAAGGT TGCAATGAGG ATGAATGGAG ACAGCAGATG 180

AGGAAGTTCT CTGGAAGAGG GAGTTACTGT CCTCTCCCTC CCGCTCCCCG AACAGGTCCC 240

CAGTCCAGGC CAGTTGCTGA GTCCACCGGG CAGGAGGCCA CATTCCCCAA GGCCACACCC 300

TTGGCCCAAG CCGCTCCCTT GGCCGAGGTG GACAACCCCC CAACAGAGCG GGACATCCTC 360

CCCTCTGACT GTGCAGCCTC AGCCTCCGAC TCCAACACAG ACCA 404

<110> 江西农业大学

<120> 一种影响猪肉质性状的SNP及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 169

<212> cDNA

<213> Sus Scrofa

<220>

<223> 猪PRKAG3基因的部分cDNA序列2

<400> 169

GTCCCCAGTC CAGGCCAGTT GCTGAGTCCA CCGGGCAGGA GGCCACATTC CCCAAGGCCA 60

CACCCTTGGC CCAAGCCGCT CCCTTGGCCG AGGTGGACAA CCCCCCAACA GAGCGGGACA 120

TCCTCCCCTC TGACTGTGCA GCCTCAGCCT CCGACTCCAA CACAGACCA 169

<110> 江西农业大学

<120> 一种影响猪肉质性状的SNP及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> Sus Scrofa

<220>

<223> 猪PRKAG3基因蛋白序列3

<400> 395

MSFLEQGESR SWPSRAVTTS SERSHGDQGT KASRWTRQED VEEGGPPGPR EGPQSRPVAE 60

STGQEATFPK ATPLAQAAPL AEVDNPPTER DILPSDCAAS ASDSNTDHLD LGIEFSASAA 120

SGDELGLVEE KPAPCPSPEV LLPRLGWDDE LQKPGAQVYM HFMQEHTCYD AMATSSKLVI 180

FDTMLEIKKA FFALVANGIR AAPLWDSKKQ SFVGMLTITD FILVLHRYYR SPLVQIYEIE 240

EHKIETWREI YLQGCFKPLV SISPNDSLFE AVYALIKNRI HRLPVLDPVS GAVLHILTHK 300

RLLKFLHIFG TLLPRPSFLY RTIQDLGIGT FRDLAVVLET APILTALDIF VDRRVSALPV 360

VNETGQVVGL YSRFDVIHLA AQQHTTTGHE CGRSP 395

Claims

1.一种确定杜长大猪的肉质性状遗传改良的方法，所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的SNP标记，所述SNP标记的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的15号染色体上的从5’端起的第133802499位点的核苷酸，所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第239位点的核苷酸，且该位点的核苷酸为Y；其中，所述Y为T或C；并根据所述SNP标记做出相应的选择：

在所述种猪核心群中选择所述种猪在所述第133802499位点为CC基因型的个体，淘汰所述种猪在该位点为CT和TT基因型的个体，以逐代提高该位点的等位基因C的频率，从而降低猪肌肉糖原含量和糖酵解潜能，提高肌肉的pH值、系水力及肉色，减少其滴水损失，改善肉品质。

2.一种确定杜长大猪的肉质的方法，所述方法包括：确定猪的SNP标记，所述SNP标记的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的15号染色体上的从5’端起的第133802499位点的核苷酸，所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第239位点的核苷酸，且该位点的核苷酸为Y；其中，所述Y为T或C；

3.一种猪的SNP标记在杜长大种猪肉质性状的遗传改良中的应用；其中，所述SNP标记的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的15号染色体上的从5’端起的第133802499位点的核苷酸，所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第239位点的核苷酸，且该位点的核苷酸为Y；其中，所述Y为T或C；所述肉质性状为猪肌肉糖原含量、糖酵解潜能、肌肉的pH值、系水力、肉色、滴水损失。