CN110106263B - 浦东白猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法 - Google Patents

浦东白猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法，通过提取生猪肉或肉制品的基因组DNA，经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，根据测序结果特点位点的SNP基因型鉴定浦东白猪及其肉制品；所述的Sanger测序，其鉴定位点为：pig18‑52722267、pig8‑146130825、pig9‑10041850和pig13‑213464983位点处出现特异突变；本发明解决现有技术中尚未有浦东白猪及其肉制品相关的鉴定方法的问题。

Description

浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法
技术领域
本发明涉及的是一种食品安全监测领域，具体涉及一种浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法。
背景技术
浦东白猪主要分布在上海南汇及川沙等地。其特点是繁殖率高，性成熟早，平均每胎产仔12头左右，阉割后，安静少动，适合软圈饲养，50年代前，是川沙县的当家品种。其因肉质鲜美，称为“糯猪”而广受消费者欢迎。浦东白猪体型外貌与西方长白猪和大白猪相似，在生产中存在用西方猪种冒充浦东白猪的情况。另一方面，浦东白猪分布区域与太湖猪种(二花脸猪、梅山猪、枫泾猪、沙乌头猪、米猪、嘉兴黑猪)分布区域有重合，生产中存在混淆的情况。通过传统方法将浦东白猪与其他品种猪区分难度很大，尤其是宰杀后的分割猪及其处理后的肉制品。随着测序技术的发展，分子标记也由一代的限制性片段长度多态性(RFLP)，第二代的数目可变串联重复多态性(SSR)，发展到了单核苷酸多态性(SNP)。第三代分子标记SNP相对于前两代分子标记具有变异丰富、对DNA样本要求低、稳定性高、测定准确、检测方法简便且通量高等优点。目前，第三代分子标记SNP已广泛应用于亲子鉴定、动植物品种(品系)鉴定、遗传育种等领域。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种鉴定浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法，利用第三代分子标记鉴别及Sanger测序技术鉴别浦东白猪及生肉制品，解决现有技术中尚未有浦东白猪及其肉制品相关的鉴定方法的问题，提供了一种结果准确、操作简单、价格低廉的鉴定浦东白猪及其肉制品的方法和相关专用引物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合，包括：pig18-52722267、pig8-146130825、pig9-10041850和pig13-213464983，所述pig18-52722267表示猪18号染色体第52722267位位点，pig8-146130825表示猪8号染色体第146130825位位点，pig9-10041850表示猪9号染色体第10041850位位点，pig13-213464983表示猪13号染色体第213464983位位点。
进一步地，基于SNP标记组合的浦东白猪及其生肉制品鉴定方法，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为浦东白猪及其肉制品。
进一步地，所述的PCR扩增，pig18-52722267处的上下游引物的序列如SEQ IDNO.1～2所示，pig8-146130825处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，pig9-10041850处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示，pig13-213464983处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
进一步地，测序产物鉴定位点对比信息如下表所示：
SNP REF ALT
pig18-52722267 T C
pig8-146130825 G T
pig9-10041850 G A
pig13-213464983 C T
表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。
进一步地，所述的鉴定位点信息为：各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明以浦东白猪品种特有SNP位点为鉴定依据，从分子层面研究鉴别浦东白猪的方法，并以Sanger测序为主要分子鉴定方法，能够将浦东白猪与与常见西方猪种、太湖流域地方品种猪鉴定区分，例如：小梅山猪、枫泾猪、中梅山猪、二花脸猪、嘉兴黑猪、米猪、沙乌头猪、长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、巴克夏等。
具体实施方式
以下对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
本发明涉及一种浦东白猪及生肉制品的SNP标记，包括：pig18-52722267、pig8-146130825、pig9-10041850和pig13-213464983，所述pig18-52722267表示猪18号染色体第52722267位位点，pig8-146130825表示猪8号染色体第146130825位位点，pig9-10041850表示猪9号染色体第10041850位位点，pig13-213464983表示猪13号染色体第213464983位位点。
本发明提供了一种基于上述SNP标记组合的浦东白猪及生肉制品鉴定方法，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为浦东白猪及其肉制品。
所述的PCR扩增，其中涉及的引物如表1所示：
表1扩增位点引物及产物信息
Figure BDA0002078678070000031
表中F代表上游引物，R代表下游引物，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置
所述的PCR扩增，反应体系为模板DNA 1ng/uL、引物1uL、H2O3.8uL、2×Taq PCRMasrer Mix50uL；和/或，所述PCR反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。
所述的凝胶电泳，其条带长度要求为如表1所示。
测序产物鉴定位点对比信息如表2所示：
表2测序产物鉴定位点对比信息
SNP REF ALT
pig18-52722267 T C
pig8-146130825 G T
pig9-10041850 G A
pig13-213464983 C T
表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。
如表2所示，各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义，例如一头待测猪A在pig18-52722267位点，如果测序数据为T，则认为待测猪A在pig18-52722267位点不具备鉴定意义；如果测序数据为C，则认为待测猪A在pig18-52722267位点具有鉴定意义。
由于单个位点作为鉴定依据的存在假阳性错判，且错判概率较高，所以本发明利用位点组合作为鉴定Marker。
各个品种鉴定位点组合鉴定Marker信息如表3所示。
表3鉴定标记组合信息
Figure BDA0002078678070000041
如表3所示，Marker1-4为浦东白猪鉴定标记组合，例如当待测猪A具备4个Marker组合中的任意一种位点突变组合的时候，则认为待测猪A为浦东白猪。
所述的浦东白猪肉制品是指浦东白猪分割肉及以浦东白猪为原料加工制备的腌制品和熟食制品。
随机选取待测猪种耳组织样本5份，采用SDS法提取组织DNA。
利用引物对DNA样品进行PCR反应扩增。
PCR反应的反应体系为10uL体系：模板DNA 1ng/uL、引物1uL、H2O3.8uL、2×TaqPCR Masrer Mix50uL；和/或，PCR反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。
用2％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，凝胶电泳条件为电流10A，电压100伏，时间40分钟。不同引物对扩增产物与表1中的标准产物长度进行比对，产物长度在误差范围内且与标准产物长度一致，则认为扩增结果合格。
将合格的样本PCR扩增产物进行Sanger测序，得到各个检测位点的信息，对测序结果进行分析：
表4样本测序结果SNP多态性分析表
样品/SNP REF ALT 1 2 3 4 5
pig18-52722267 T C √ √ √
pig8-146130825 G T √ √ √
pig9-10041850 G A √ √ √
pig13-213464983 C T √ √
表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型，√代表检测到突变基因型。
如表4所示，由测序数据可得，若只采用单一位点作为鉴定依据，一头待测猪同时归属于多个品种。
利用位点组合Marker的方式来进行鉴定：1号猪在pig18-52722267位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定1号猪不是浦东白猪；2号猪在pig18-52722267、pig8-146130825、pig9-10041850位点检测到突变，符合Marker1信息，鉴定2号猪是浦东白猪；3号猪在pig8-146130825、pig9-10041850位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定3号猪不是浦东白猪；4号猪在pig18-52722267、pig13-213464983位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定4号猪不是浦东白猪；5号猪在pig8-146130825、pig9-10041850、pig13-213464983位点检测到突变，符合Marker4，鉴定5号猪为浦东白猪。
目前国内外没有关于浦东白猪种及其肉制品品种(品系)鉴定的相关专利，将第三代分子标记运用于浦东白猪及其肉制品品种(品系)鉴定，填补了市场的空缺，有效解决了浦东白猪(品系)的鉴伪问题。该鉴定方法相对于现有利用第一代分子标记(RFLP)和第二代分子标记(SSR)做猪种鉴定的专利，具有操作更加简单、结果更加准确、快速高效的优点。同时本发明利用第三代分子标记SNP克服了前两代分子标记可使用位点少的缺点，相对前两代分子标记的鉴别技术来说，也简化了鉴别方法。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gcgttttggg gactcgtgat a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
actctgccgt ttctcctcct a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
agaggagcgg ggtctttgc 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
cgttgtcaac ttttgtctac ctca 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tagatgtgag ccccagcagt t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
acttctgctc cccgcaccg 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
cactcaggat attcacaatc tgg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
ttaaaacgac cacggcaact c 21

Claims (1)

1.一种基于SNP标记组合的浦东白猪及其生肉制品鉴定方法，浦东白猪及生肉制品的SNP标记组合包括：pig18-52722267、pig8-146130825、pig9-10041850和pig13-213464983，所述pig18-52722267表示猪18号染色体第52722267位位点，pig8-146130825表示猪8号染色体第146130825位位点，pig9-10041850表示猪9号染色体第10041850位位点，pig13-213464983表示猪13号染色体第213464983位位点，其特征在于，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为浦东白猪及其肉制品；
所述的PCR扩增，pig18-52722267处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，pig8-146130825处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，pig9-10041850处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示，pig13-213464983处的上下游引物的序列如SEQ IDNO.7～8所示；
测序产物鉴定位点对比信息如下表所示：
SNP REF ALT pig18-52722267 T C pig8-146130825 G T pig9-10041850 G A pig13-213464983 C T
表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。
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