CN108060239B - 用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒及方法 - Google Patents
用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒。本发明还涉及使用如上所述的引物对组合产品、试剂盒的区分牦牛与非牦牛牛族的方法，该方法基于等位基因特异性PCR及毛细管电泳技术进行SNP分型，根据出峰数量可快速、高效、准确的判断待检样品为牦牛制品还是普通牛制品。
Description
技术领域
本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒及方法。
背景技术
牦牛生活于高寒、高海拔以及缺氧的恶劣环境中，极端的自然环境造就了卓越的肌肉品质。近年牦牛肉以高蛋白、低脂肪、无污染等特点日益受到广大消费者的青睐。但是由于其价格与其他普通牛肉相比存在较大差异，一些不法商贩为谋取不正当利益，往往以普通牛肉及制品来冒充牦牛肉及牦牛肉制品销售给广大消费者。不仅扰乱了正常的市场秩序，侵犯了消费者权益，而且还会对牦牛产业的健康发展造成影响。因此急需开发一种行之有效的方法对市场上的牛肉来源进行鉴别。
随着分子标记技术的不断发展，DNA标记技术广泛应用于物种的区分、动植物品种的鉴定等方面，该方法灵敏度高、抗逆性好。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组中由于单个碱基变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单、易于实现高通量自动化等优点。在众多的SNP分型方法中，等位基因特异性PCR(AS-PCR)具有操作简单、成本低廉和结果准确的优势，再结合具有高灵敏度、进样微量、通量大以及自动化程度极高的毛细管电泳技术(CE)，对于各种规模的实验室的方法开发应用均具有重要的应用价值。因此，本发明筛选了一组SNP标记，并采用AS-PCR结合毛细管电泳技术开展牦牛肉与普通牛肉鉴定研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简单、经济、准确的鉴别牦牛与非牦牛牛族的方法，该方法可用于区分牦牛与非牦牛牛族肉制品及骨制品等，以防止商业欺诈。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品，其包括以下引物对：SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ IDNO:19和20。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的试剂盒，其包括如上所述的引物对组合产品以及阳性对照引物对；所述阳性对照引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:21和22所示。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种区分牦牛与非牦牛牛族的方法，包括：
提取检测牦牛和/或非牦牛牛族样本的基因组DNA，使用如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒对所述基因组DNA分别进行PCR扩增并对扩增产物进行电泳检测；
除阳性对照外：若有≤3对的引物出现扩增产物，则为牦牛；若有≥5对的引物出现扩增产物，则为非牦牛牛族。
与现有技术相比，本发明所提供的方法操作简便，数据分析简单直观，利用毛细管电泳可以在短时间内实现对多个样本进行检测，操作简便，效率高，特别适合于大量样本的分析鉴定，为保护消费者的合法权益提供保障，同时为食品安全的监管提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中牦牛样本的毛细管电泳图谱；
图2为本发明一个实施例中普通肉牛样本的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
本发明涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品，其包括以下引物对：SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ IDNO:19和20。
在本发明中，“牛族”指牛亚科下的一个族Bovini，其中包括对人类非常重要的家牛、黄牛、水牛和牦牛。这一族一般统称为牛。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的试剂盒，其包括如上所述的引物对组合产品以及阳性对照引物对；所述阳性对照引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:21和22所示。
阳性对照引物对在扩增牦牛与非牦牛牛族样品时都能扩增出条带；如果扩增不出条带，表明模板DNA质量不合格，应重新抽提DNA再进行PCR扩增。
优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。
优选的，如上所述的试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段；
更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种区分牦牛与非牦牛牛族的方法，包括：
提取检测牦牛和/或非牦牛牛族样本的基因组DNA，使用如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒对所述基因组DNA分别进行PCR扩增并对扩增产物进行电泳检测；
除阳性对照外：若有≤3对的引物出现扩增产物，则为牦牛；若有≥5对的引物出现扩增产物，则为非牦牛牛族。
优选的，如上所述的方法，所述电泳检测为毛细管电泳；
检测结果判断依据相应调整为：若扩增产物出峰数量≤3，则为牦牛；若扩增产物出峰数量≥5，则为非牦牛牛族。
优选的，如上所述的方法，在进行所述PCR扩增时，引物对SEQ ID NO:1和2、SEQ IDNO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ IDNO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20所对应的退火温度依次为：
58℃-62℃、53℃-57℃、58℃-62℃、53℃-57℃、53℃-57℃、53℃-57℃、58℃-62℃、53℃-57℃、58℃-62℃、58℃-62℃；
优选为60℃、55℃、60℃、55℃、55℃、55℃、60℃、55℃、60℃、60℃。
优选的，如上所述的方法，所述基因组DNA通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
优选的，如上所述的方法，所述牦牛和/或非牦牛牛族样本为牦牛和/或牦牛和/或非牦牛牛族的组织、细胞、血液、唾液、精液、骨骼或毛发；更优选的，所述组织为肌肉组织。
优选的，如上所述的方法，所述非牦牛牛族为非牦牛牛属Bos；
优选包括原牛B.primigenius、尖额牛B.acutifrons、平额牛B.planifrons、爪哇野牛B.javanicus、印度野牛B.gaurus、大额牛B.frontalis、家牛B.taurus柬埔寨野牛B.sauveli；
最优选为家牛B.taurus。
在一些实施方式中，所述家牛包括西门塔尔牛、利木赞牛、荷斯坦牛、夏洛莱牛、鲁西黄牛、郏县红牛以及南阳牛。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、样本的采集及基因组DNA提取
共采集来自青海、西藏、四川及甘肃的我国四大牦牛主产地的牦牛样本109个。普通肉牛样本，包括西门塔尔牛、利木赞牛、荷斯坦牛、夏洛莱牛、鲁西黄牛、郏县红牛以及南阳牛在内的共计227个样本。
基因组DNA提取采用商品化试剂盒(Thermo Scientific)按说明书提取。采用Nanodrop 2000c及0.8％的琼脂糖凝胶电泳测定提取DNA的纯度、浓度及片段的完整度。符合要求的样本于-20℃保存备用。
2、SNP标记的筛选
从NCBI数据库中检索与牛肉质性状相关的基因，设计通用引物并对16个牦牛样本及16个普通肉牛样本进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，利用DNAStar SeqMan Pro软件分析测序样本序列，挑选在普通肉牛样本中具有多态性但在牦牛群体中不具多态性的SNP位点，即在普通肉牛样本中既存在杂合子也存在纯合子，而在牦牛群体中仅存在一种纯合子，共10个。
3、设计AS-PCR引物
针对挑选的10个SNP位点设计AS-PCR引物，该引物只针对杂合子扩增，达到普通肉牛样本可以扩增出PCR产物，而牦牛样本则不会扩增出PCR产物。同时为提高AS-PCR引物的特异性，针对特异性稍差的引物在其3’端错配碱基，以提高引物的特异性，具体见表1。
表1用于鉴定牦牛肉与黄普通牛肉的SNP标记位点、对应的引物序列及AS-PCR扩增参数
aAS-PCR引物针对粗体序列设计(即杂合子)；
b小写字母代表扩增SNP序列；
c小写斜粗体代表在引物的3'端引入的错配碱基。
同时，设计一对针对THRSP基因的阳性照引物，该引物在普通肉牛样本及牦牛样本中均可以扩增出相应产物。AS-PCR引物及阳性对照引物信息见表1。
4、AS-PCR扩增及毛细管电泳分离
AS-PCR扩增体系见表2，扩增条件具体见表3。
表2 AS-PCR扩增体系
表3 AS-PCR扩增程序
采用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分离，具体操作如下：
(1)分别取各扩增PCR产物2μl加入到TE缓冲液中，并用TE缓冲液补齐体积至24μl，混匀；
(2)采用dsDNA 905分离胶(AATI,USA)，于7kV电压下进行分离。
5、数据分析
采用PROSize 2.0软件对分离图谱进行分析。并统计10个位点在牦牛样本及普通肉牛样本中的出峰情况。
6、结果分析
根据毛细管电泳图谱，我们统计10个SNP位点在牦牛群体及普通肉牛群体中扩增产物的情况。根据统计结果发现，109个牦牛样本产生的扩增产物出峰数量均小于等于3，而227个普通肉牛样本扩增产物出峰数均大于等于5，据此，我们可以根据出峰的数量将牦牛肉与普通牛肉区分开。图1列出了典型的牦牛样本与普通肉牛样本的毛细管电泳图谱。表4显示了两个群体的毛细管电泳检测的扩增产物情况。
表4牦牛样本与普通肉牛样本AS-PCR扩增产物数量统计
该方法操作简便，数据分析简单直观，利用毛细管电泳可以在90分钟内实现对96个样本的分析鉴定，操作简便，效率高，特别适合于大量样本的分析鉴定，为保护消费者的合法权益提供保障，同时为食品安全的监管提供技术支持。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒及方法
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaatgcacg tgggctt 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctacaggct tggagaagg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttctcatagg tcttgttcac t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgccgagaca aagtatgg 18
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaccgccaa cgctct 16
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggggaccgcc tgggacagt 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agacttccta caagagat 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgcggaaaaa acatta 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caaacggggc tctcca 16
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agttcataca gaaagcacca at 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
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<400> 11
tctatgtcca catgttcct 19
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<212> DNA
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atgatgagga tgaggtagag 20
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ttggactaag ctctcgtg 18
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aggctcctct gtctatgg 18
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catcattcat ttattcaatc 20
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<211> 18
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<213> 人工序列
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ctcagaaatg caactgta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcgctccgtg acctccag 18
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agctggccct gagcct 16
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atgtggggcc tgatggt 17
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gagcaggtgg tgatgatc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggtgaagtag ttgtagag 18
Claims (12)
1.一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品，其包括以下引物对：SEQ IDNO: 1和2、SEQ ID NO: 3和4、SEQ ID NO: 5和6、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 9和10、SEQID NO: 11和12、SEQ ID NO: 13和14、SEQ ID NO: 15和16、SEQ ID NO: 17和18、SEQ IDNO: 19和20。
2.一种用于区分牦牛与非牦牛牛族的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对组合产品以及阳性对照引物对；所述阳性对照引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 21和22所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tth、Pwo、Kod、Klenow片段。
5.一种区分牦牛与非牦牛牛族的方法，其特征在于，包括：
提取检测牦牛和/或非牦牛牛族样本的基因组DNA，使用权利要求1所述的引物对组合产品、或权利要求2-4任一项所述的试剂盒对所述基因组DNA分别进行PCR扩增并对扩增产物进行毛细管电泳检测；
除阳性对照外：若有≤3对的引物出现扩增产物，则为牦牛；若有≥5对的引物出现扩增产物，则为非牦牛牛族。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述PCR扩增时，引物对SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO: 3和4、SEQ ID NO: 5和6、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 9和10、SEQ IDNO: 11和12、SEQ ID NO: 13和14、SEQ ID NO: 15和16、SEQ ID NO: 17和18、SEQ ID NO:19和20所对应的退火温度依次为：
58℃-62℃、53℃-57℃、58℃-62℃、53℃-57℃、53℃-57℃、53℃-57℃、58℃-62℃、53℃-57℃、58℃-62℃、58℃-62℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述PCR扩增时，引物对SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO: 3和4、SEQ ID NO: 5和6、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 9和10、SEQ IDNO: 11和12、SEQ ID NO: 13和14、SEQ ID NO: 15和16、SEQ ID NO: 17和18、SEQ ID NO:19和20所对应的退火温度依次为60℃、55℃、60℃、55℃、55℃、55℃、60℃、55℃、60℃、60℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述牦牛和/或非牦牛牛族样本为牦牛和/或非牦牛牛族的组织、血液、唾液、精液、骨骼或毛发。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述组织为肌肉组织。
11.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其特征在于，所述非牦牛牛族为非牦牛牛属。
12.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其特征在于，所述非牦牛牛族包括原牛B. primigenius、尖额牛B. acutifrons、平额牛B. planifrons、爪哇野牛B. javanicus、印度野牛B. gaurus、大额牛B. frontalis、家牛B. taurus、柬埔寨野牛B. sauveli。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108060239A (zh) | 2018-05-22 |
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