CN109593833A

CN109593833A - klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用

Info

Publication number: CN109593833A
Application number: CN201811544910.0A
Authority: CN
Inventors: 程奇; 付玉和; 孙文丽
Original assignee: Zhejiang Shan Shi Wo Knight Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Shan Shi Wo Knight Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了一种klenow(exo‑)蛋白在RAA检测体系中的应用，基于klenow(exo‑)蛋白的RAA检测体系可以用于区分牦牛和水牛，利用大肠杆菌表达系统可以获得高纯度的klenow(exo‑)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo‑)蛋白结合RAA快速扩增技术能用于区分牦牛和水牛。

Description

klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用。

背景技术

重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA技术)，是一种利用体内扩增技术实现在核酸体外快速扩增的新型扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。RAA技术能在常温下以较短的时间实现核酸快速扩增，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光检测实现目的基因的快速检测。

Klenow(exo-)是一种中温聚合酶，该酶采用突变方式去除了校正核酸酶活性(3’-5’)和(5’-3’)缺口平移酶活性具有链置换活性。

因此提供一种将klenow蛋白应用于RAA技术的方法，用于区分实际样本是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系在区分实际样本中的应用，利用大肠杆菌表达系统可以获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合RAA快速扩增技术能用于区分牦牛和水牛。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够用于区分牦牛和水牛。

进一步，一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系用于区分牦牛和水牛，具体步骤如下：

(1)以线粒体Cytb基因(水牛：KR010068.1；牦牛：AB542193.1)为靶基因，根据水牛和牦牛序列的差异设计引物，引物序列如下：

F：5’-TGAAACTTYGGCTCYCTCCTAGGCA-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-AATGATATTTGTCCTCATGGTAGTACGTAT-3’；SEQ ID NO：2；

Y为兼并碱基；

(2)分别以牦牛和水牛的基因组DNA为模板，配制反应体系：

50ul扩增反应体系包括50pmol引物F，50pmol引物R，1mmol/L dNTP，90ng/μL SSB蛋白，120ng/μL recA重组酶蛋白，120ng/μL klenow(exo-)聚合酶蛋白，反应缓冲液，加水至50ul；

(3)扩增：将步骤(2)的反应体系摇匀，放置于37℃培养40min；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：将步骤(3)中扩增结束后的反应液进行离心，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

进一步，所述反应缓冲液的组分为：100mmol/L Tricine，pH 8.0；100mmol/L醋酸镁；5mmol/L二硫苏糖醇；5％PEG 35K；2.5mmol/L ATP；100ng/μL肌酸激酶。

进一步，步骤(4)所述离心方法为：12000rpm，离心5-10min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系在区分牦牛和水牛中的应用，具有如下技术优点：

本发明提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系在区分牦牛和水牛中的应用，利用大肠杆菌表达系统可以获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合RAA快速扩增技术能用于区分牦牛和水牛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pTrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图；

图2附图为本发明PCR法获取突变位点；

其中，1-4：PCR片段1；5-8：PCR片段2；M：2000bp核酸Marker；

图3附图为本发明overlap PCR获得目的片段；

其中，1-7：overlapPCR结果；M：2000bp核酸Marker；

图4附图为本发明重组质粒的双酶切鉴定；

其中，1：重组质粒双酶切后；2：重组质粒双酶切前；M：2000bp核酸Marker；

图5附图为本发明工程菌株诱导表达检测图；

其中，1：未诱导对照沉淀；2：未诱导对照上清；3：诱导1号菌沉淀；4：诱导2号菌上清；5：诱导2号菌沉淀；6：诱导1号菌上清；M：蛋白Marker；

图6附图为本发明目的蛋白镍柱纯化图；

其中，1：破碎后沉淀；2：0mM咪唑洗脱；3：20mM咪唑洗脱；4：40mM咪唑洗脱；5：100mM咪唑洗脱；6：500mM咪唑洗脱；M：蛋白Marker；

图7附图为本发明目的蛋白肝素柱纯化图；

其中，1-4：Heparine柱线性洗脱目的蛋白；

图8附图为本发明基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系扩增结果；

其中，1，2：水牛10ng模板；3，4：牦牛10ng模板；5，6：水牛1ng模板；7，8：牦牛1ng模板；M：2000bp核酸Marker；

图9附图为本发明PCR扩增结果；

其中，1，2：牦牛10ng模板；3，4：牦牛1ng模板；5，6：水牛10ng模板；7，8：水牛1ng模板；M：2000bp核酸Marker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1klenow(exo-)蛋白的表达和纯化

(1)目的片段的扩增

以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1，R1和F2，R2进行PCR扩增，扩增后分别获得片段1和片段2(片段1为klenow(exo-)蛋白酶I，片段2为包含两个氨基酸突变的一小段序列)，进行胶回收。通过PCR方式引入突变位点，设计引物时使两个片段带有20bp左右的同源重组区域，PCR扩增获得大小分别为1725bp的片段1(SEQ ID NO：3)，和132bp的片段2(SEQ ID NO：4)，结果见图2。片段1扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。片段2扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃30s，共32个循环；72℃10min。

然后以回收的片段1和片段2等比例混合为模板，以F2和R1为上下游引物进行Over-lap PCR，获得大小约2000bp的klenow(exo-)目的片段(SEQ ID NO：5)，结果见图3。反应体系均为25ul，反应后产物以1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳后以胶回收试剂盒回收klenow(exo-)目的片段PCR产物。Over-lap PCR扩增参数为94℃5min；94℃40s，54℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。

其中，引物序列如下：

F1：5’-AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT-3’；SEQ ID NO：6；

R1：5’-CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG-3’；HindIII；SEQ ID NO：7；

F2：5’-CATGCCATGGATCATCATCACCATCACCACATGATTTCTTA

TGACAACTACGTCACCA-3’；NcoI；SEQ ID NO：8；

R2：5’-AAATGCAAATACCGGCGCTTTTTCCAG-3’；SEQ ID NO：9。

(2)重组表达质粒的构建及诱导表达

以质粒提取试剂盒提取pTrc99a质粒载体，然后以NcoI，HindIII限制性内切酶分别双酶切质粒载体和胶回收的klenow(exo-)目的片段。酶切体系如下：质粒载体或klenow(exo-)目的片段1ug，限制性内切酶各1ul，10×buffer 2ul，补加去离子水至总体积20ul。酶切后产物以纯化试剂盒纯化。将酶切后的klenow(exo-)目的基因片段和线性化后的质粒载体以2:1的比例配制10ul连接体系。连接反应条件为25℃连接3h。其中，pTrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图如图1所示。

连接产物转化大肠杆菌克隆菌株：连接反应结束后将连接产物加入100ul DH5α感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，冰浴2min，加入500ul LB培养基。37℃200r/min摇床培养1h后，取200ul菌液涂布于含氨苄抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜培养。

挑取单克隆至LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6左右。取1ul菌液作为模板，以F2、R1为引物进行菌落PCR鉴定，阳性克隆可见2000bp的条带。对阳性克隆质粒进行双酶切，结果如4所示，经双酶切后明显可见约2000bp目的条带及4000bp线性化质粒条带。并将双酶切验证正确的阳性菌落送至杭州擎科生物科技有限公司测序，将测序正确无突变的阳性克隆菌株冻存种子并提取质粒。将提取的质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中。

挑取转化后的2个单菌落(命名为1号菌和2号菌)分别接种至5ml LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，对照不加IPTG，于37℃诱导4h，收集少量菌体，超声破碎菌体后离心，分离上清液与沉淀，将破碎后上清和沉淀加入loading buffer沸水浴3-5min后进行SDS-PAGE，鉴定诱导表达结果。SDS-PAGE结果表明，工程菌在37℃经IPTG诱导4h后，超声破碎取上清及沉淀进行SDS-PAGE，在约65KDa处有明显的目的蛋白条带，与预期的Klenow(exo-)蛋白大小一致，结果见图5。

(3)阳性克隆菌的摇瓶发酵及klenow(exo-)蛋白的纯化

挑单克隆菌接种至100ml LB培养基中，37℃200r/min过夜培养作为一级种子，然后将一级种子以2％的比例接种至600ml LB培养基中，共接种6瓶。37℃200r/min培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，于37℃诱导4h。

在4℃，6000rpm条件下离心30min，弃上清，收集菌体；用破碎缓冲液(缓冲液A：30mM PB(pH7.4)，20mM咪唑，500mM氯化钠)重悬菌体；将重悬后菌液以ATS高压均质机(800Mpa，4℃)破碎3次；打开离心机预冷后以4℃，16000rpm离心破碎液，离心后液体用镍柱做亲和层析。分别用缓冲液(B:30mM PB(pH7.4)，40mM咪唑，500mM氯化钠，C:30mM PB(pH7.4)，100mM咪唑，500mM氯化钠，D：30mM PB(pH7.4)，500mM咪唑，500mM氯化钠)洗脱；洗脱后将目的蛋白透析至缓冲液E中(E：20mM Tris，50mM氯化钾，1mM DTT，1mM EDTA)。

透析后以缓冲液E为平衡液，以缓冲液F(E：20mM Tris，2M氯化钾，1mM DTT，1mMEDTA)为洗脱液线性洗脱。洗脱后目的蛋白再次透析至E缓冲液中，SDS-PAGE检测。冻存至-80℃冰箱中待用。

镍柱亲和层析后，SDS-PAGE结果显示，在65KDa处40Mm，100mM咪唑洗脱液中均有明显的目的蛋白且位置正确，其中100mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度较高，如图6所示。可用于目的蛋白的进一步纯化。

通过GE公司预装柱Heparine HP除去部分目的蛋白中残留的核酸，并对目的蛋白进行进一步的精细纯化。

经上述两步纯化后获得纯度相对较高的目的蛋白，结果如图7所示，可用于进一步的活性检测。图7中1-4来源于同一个蛋白洗脱峰，其中1、4分别为蛋白刚起峰和最后峰落下来时的样品，2、3为峰最高点时的蛋白，因取样时间不同，导致浓度不同。

实施例2基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系在区分牦牛和水牛中的应用

F：5’-TGAAACTTYGGCTCYCTCCTAGGCA-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-AATGATATTTGTCCTCATGGTAGTACGTAT-3’；SEQ ID NO：2；

Y为兼并碱基；

F引物与水牛靶序列匹配，与牦牛靶序列在3端有两个连续突变，R序列与水牛，牦牛靶序列均完全匹配；

(2)提取基因组DNA

分别称取30mg的水牛肉和牦牛肉加入组织裂解液F(BIOG组织DNA提取试剂盒，百代生物)中，70℃水浴20min，12000rpm离心10min，取上清用水稀释至10^-1，10^-2分别检测核酸浓度约为10ng，1ng；以此为模板，配制反应体系：

50ul扩增反应体系包括50pmol引物F，50pmol引物R，1mmol/L dNTP，90ng/μL SSB蛋白，120ng/μL recA重组酶蛋白，120ng/μL klenow(exo-)聚合酶蛋白，反应缓冲液，加水至50ul；反应缓冲液的组分为：100mmol/L Tricine，pH 8.0；100mmol/L醋酸镁；5mmol/L二硫苏糖醇；5％PEG 35K；2.5mmol/L ATP；100ng/μL肌酸激酶；

(3)扩增：将步骤(2)的反应体系摇匀，放置于37℃培养40min；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：将上述扩增结束后的反应液进行离心，12000rpm离心5-10min，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图8所示，表明基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系能明显区分牦牛和水牛。

利用PCR对牦牛和水牛分别进行检测，PCR反应体系：核酸浓度为10ng或1ng的模板，50pmol引物F，50pmol引物R，200umol/L dNTP，1.5mmol/L镁离子，120ng/μL taq DAN聚合酶(购自生工生物)，10×buffer 5ul(购自生工生物)，加水至50ul；PCR反应条件：94℃5min，94℃40s，57℃40s，72℃2min，共32个循环，72℃延伸10min。检测结果如图9所示，PCR体系均能扩增，无法有效区分牦牛和水牛。

上述结果表明，本发明的RAA反应体系对于SNP的检测效果明显。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 浙江善测禾骑士生物科技有限公司

<120> klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgaaacttyg gctcyctcct aggca 25

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aatgatattt gtcctcatgg tagtacgtat 30

<210> 3

<211> 1725

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

accgacagcc ttgataacat ctctgctaac ctggtcgggc tttcttttgc tatcgagcca 60

ggcgtagcgg catatattcc ggttgctcat gattatcttg atgcgcccga tcaaatctct 120

cgcgagcgtg cactcgagtt gctaaaaccg ctgctggaag atgaaaaggc gctgaaggtc 180

gggcaaaacc tgaaatacga tcgcggtatt ctggcgaact acggcattga actgcgtggg 240

attgcgtttg ataccatgct ggagtcctac attctcaata gcgttgccgg gcgtcacgat 300

atggacagcc tcgcggaacg ttggttgaag cacaaaacca tcacttttga agagattgct 360

ggtaaaggca aaaatcaact gacctttaac cagattgccc tcgaagaagc cggacgttac 420

gccgccgaag atgcagatgt caccttgcag ttgcatctga aaatgtggcc ggatctgcaa 480

aaacacaaag ggccgttgaa cgtcttcgag aatatcgaaa tgccgctggt gccggtgctt 540

tcacgcattg aacgtaacgg tgtgaagatc gatccgaaag tgctgcacaa tcattctgaa 600

gagctcaccc ttcgtctggc tgagctggaa aagaaagcgc atgaaattgc aggtgaggaa 660

tttaaccttt cttccaccaa gcagttacaa accattctct ttgaaaaaca gggcattaaa 720

ccgctgaaga aaacgccggg tggcgcgccg tcaacgtcgg aagaggtact ggaagaactg 780

gcgctggact atccgttgcc aaaagtgatt ctggagtatc gtggtctggc gaagctgaaa 840

tcgacctaca ccgacaagct gccgctgatg atcaacccga aaaccgggcg tgtgcatacc 900

tcttatcacc aggcagtaac tgcaacggga cgtttatcgt caaccgatcc taacctgcaa 960

aacattccgg tgcgtaacga agaaggtcgt cgtatccgcc aggcgtttat tgcgccagag 1020

gattatgtga ttgtctcagc ggactactcg cagattgaac tgcgcattat ggcgcatctt 1080

tcgcgtgaca aaggcttgct gaccgcattc gcggaaggaa aagatatcca ccgggcaacg 1140

gcggcagaag tgtttggttt gccactggaa accgtcacca gcgagcaacg ccgtagcgcg 1200

aaagcgatca actttggtct gatttatggc atgagtgctt tcggtctggc gcggcaattg 1260

aacattccac gtaaagaagc gcagaagtac atggaccttt acttcgaacg ctaccctggc 1320

gtgctggagt atatggaacg cacccgtgct caggcgaaag agcagggcta cgttgaaacg 1380

ctggacggac gccgtctgta tctgccggat atcaaatcca gcaatggtgc tcgtcgtgca 1440

gcggctgaac gtgcagccat taacgcgcca atgcagggaa ccgccgccga cattatcaaa 1500

cgggcgatga ttgccgttga tgcgtggtta caggctgagc aaccgcgtgt acgtatgatc 1560

atgcaggtac acgatgaact ggtatttgaa gttcataaag atgatgttga tgccgtcgcg 1620

aagcagattc atcaactgat ggaaaactgt acccgtctgg atgtgccgtt gctggtggaa 1680

gtggggagtg gcgaaaactg ggatcaggcg cactaaaagc ttggg 1725

<210> 4

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catgccatgg atcatcatca ccatcaccac atgatttctt atgacaacta cgtcaccatc 60

cttgatgaag aaacactgaa agcgtggatt gcgaagctgg aaaaagcgcc ggtatttgca 120

tttgctaccg ca 132

<210> 5

<211> 1857

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

catgccatgg atcatcatca ccatcaccac atgatttctt atgacaacta cgtcaccatc 60

cttgatgaag aaacactgaa agcgtggatt gcgaagctgg aaaaagcgcc ggtatttgca 120

tttgctaccg caaccgacag ccttgataac atctctgcta acctggtcgg gctttctttt 180

gctatcgagc caggcgtagc ggcatatatt ccggttgctc atgattatct tgatgcgccc 240

gatcaaatct ctcgcgagcg tgcactcgag ttgctaaaac cgctgctgga agatgaaaag 300

gcgctgaagg tcgggcaaaa cctgaaatac gatcgcggta ttctggcgaa ctacggcatt 360

gaactgcgtg ggattgcgtt tgataccatg ctggagtcct acattctcaa tagcgttgcc 420

gggcgtcacg atatggacag cctcgcggaa cgttggttga agcacaaaac catcactttt 480

gaagagattg ctggtaaagg caaaaatcaa ctgaccttta accagattgc cctcgaagaa 540

gccggacgtt acgccgccga agatgcagat gtcaccttgc agttgcatct gaaaatgtgg 600

ccggatctgc aaaaacacaa agggccgttg aacgtcttcg agaatatcga aatgccgctg 660

gtgccggtgc tttcacgcat tgaacgtaac ggtgtgaaga tcgatccgaa agtgctgcac 720

aatcattctg aagagctcac ccttcgtctg gctgagctgg aaaagaaagc gcatgaaatt 780

gcaggtgagg aatttaacct ttcttccacc aagcagttac aaaccattct ctttgaaaaa 840

cagggcatta aaccgctgaa gaaaacgccg ggtggcgcgc cgtcaacgtc ggaagaggta 900

ctggaagaac tggcgctgga ctatccgttg ccaaaagtga ttctggagta tcgtggtctg 960

gcgaagctga aatcgaccta caccgacaag ctgccgctga tgatcaaccc gaaaaccggg 1020

cgtgtgcata cctcttatca ccaggcagta actgcaacgg gacgtttatc gtcaaccgat 1080

cctaacctgc aaaacattcc ggtgcgtaac gaagaaggtc gtcgtatccg ccaggcgttt 1140

attgcgccag aggattatgt gattgtctca gcggactact cgcagattga actgcgcatt 1200

atggcgcatc tttcgcgtga caaaggcttg ctgaccgcat tcgcggaagg aaaagatatc 1260

caccgggcaa cggcggcaga agtgtttggt ttgccactgg aaaccgtcac cagcgagcaa 1320

cgccgtagcg cgaaagcgat caactttggt ctgatttatg gcatgagtgc tttcggtctg 1380

gcgcggcaat tgaacattcc acgtaaagaa gcgcagaagt acatggacct ttacttcgaa 1440

cgctaccctg gcgtgctgga gtatatggaa cgcacccgtg ctcaggcgaa agagcagggc 1500

tacgttgaaa cgctggacgg acgccgtctg tatctgccgg atatcaaatc cagcaatggt 1560

gctcgtcgtg cagcggctga acgtgcagcc attaacgcgc caatgcaggg aaccgccgcc 1620

gacattatca aacgggcgat gattgccgtt gatgcgtggt tacaggctga gcaaccgcgt 1680

gtacgtatga tcatgcaggt acacgatgaa ctggtatttg aagttcataa agatgatgtt 1740

gatgccgtcg cgaagcagat tcatcaactg atggaaaact gtacccgtct ggatgtgccg 1800

ttgctggtgg aagtggggag tggcgaaaac tgggatcagg cgcactaaaa gcttggg 1857

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aagcgccggt atttgcattt gctaccgcaa ccgacagcct tgataacat 49

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cccaagcttt tagtgcgcct gatcccagtt ttcg 34

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

catgccatgg atcatcatca ccatcaccac atgatttctt atgacaacta cgtcacca 58

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aaatgcaaat accggcgctt tttccag 27

Claims

1.klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用，其特征在于，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够用于区分牦牛和水牛。

2.一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系用于区分牦牛和水牛，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以线粒体Cytb基因为靶基因，根据水牛和牦牛序列的差异设计引物，引物序列如下：

F：5’-TGAAACTTYGGCTCYCTCCTAGGCA-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-AATGATATTTGTCCTCATGGTAGTACGTAT-3’；SEQ ID NO：2；

Y为兼并碱基；

(2)分别以牦牛和水牛的基因组DNA为模板，配制反应体系：

(3)扩增：将步骤(2)的反应体系摇匀，放置于37℃培养40min；

3.根据权利要求2所述的一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系用于区分牦牛和水牛，其特征在于，所述反应缓冲液的组分为：100mmol/LTricine，pH 8.0；100mmol/L醋酸镁；5mmol/L二硫苏糖醇；5％PEG 35K；2.5mmol/L ATP；100ng/μL肌酸激酶。

4.根据权利要求2所述的一种基于klenow(exo-)蛋白的RAA检测体系用于区分牦牛和水牛，其特征在于，步骤(4)所述离心方法为：12000rpm，离心5-10min。