CN108359678A - 一种能高效克隆和温度诱导表达的质粒载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种能够灵活地进行无背景TA克隆、粘性末端克隆和平末端克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体及其构建方法。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有能编码毒性蛋白ccdB的基因做作为负筛选标记。本质粒的灵活克隆功能和温度诱导表达功能均得到验证。由于更方便和高效，本发明所涉及的质粒将在基因工程领域发挥重要的作用。

Description

一种能高效克隆和温度诱导表达的质粒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种能够灵活地进行无背景TA克隆、粘性末端克隆和平末端克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体及其构建方法。

背景技术

质粒不仅可以被用于分子克隆，也是携带目的基因进行蛋白表达的载体。目前已经有一些表达载体可以实现在大肠杆菌中进行蛋白的高效表达，其中包括pET(StudierFW,Rosenberg AH,Dunn JJ,Dubendorff JW:Use of T7RNA polymerase to directexpression of cloned genes.Methods Enzymol 1990,185:60–89.)、pTrc(Amann E,OchsB,Abel KJ:Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression ofunfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene 1988,69(2):301–315.)和pBAD(Guzman LM,Belin D,Carson MJ,Beckwith J:Tight regulation,modulation,andhigh-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.JBacteriol 1995,177(14):4121–4130.)等高效表达载体。每一种表达载体都有自身的优缺点，往往需要根据具体的情况来选择合适的表达载体(Balzer S,Kucharova V,Megerle J,Lale R,Brautaset T,Valla S.A comparative analysis of the properties ofregulated promoter systems commonly used for recombinant gene expression inEscherichia coli.Microb Cell Fact.2013,18；12:26.)。目前最广泛应用的表达载体是pET表达载体。该载体具有T7强启动子，在IPTG诱导下进行蛋白质表达。但是采用这一表达系统需要特定的能表达T7聚合酶的菌株，如BL21(DE3)菌株等。另外，蛋白诱导表达需要IPTG作为诱导剂，而IPTG比较昂贵，而且对大肠杆菌具有一定的毒性，因此往往需要优化IPTG的加入浓度来获得最佳的蛋白表达水平。而温度诱导型表达载体(比如pBV220、pSW2和pKF396M-5)仅仅需要改变培养温度就可以实现蛋白的诱导表达(Yang XW,Jian HH,WangFP.pSW2,a Novel Low-Temperature-Inducible Gene Expression Vector Based on aFilamentous Phage of the Deep-Sea Bacterium Shewanella piezotolerans WP3.ApplEnviron Microbiol.2015,15；81(16):5519-26.；Fu L,Lu C.A novel dual vectorcoexpressing PhiX174 lysis E gene and staphylococcal nuclease A gene on thebasis of lambda promoter pR and pL,respectively.Mol Biotechnol.2013,54(2):436-44.；Chen LH,Cai F,Zhang DJ,Zhang L,Zhu P,Gao S.Large-scale purificationand characterization of recombinant human stem cell factor in Escherichiacoli.Biotechnol Appl Biochem.2017,64(4):509-518.)。这些表达系统不需要特定的表达菌株，也不需要IPTG等诱导剂，因此比pET系统更加方便。

尽管温度诱导型表达载体在蛋白表达方面有自身的特色，但是现有的温度诱导型表达载体的克隆都只能采用粘性末端克隆的方法，限定了基因克隆过程的灵活性。作为非常有效的一种克隆方法，粘性末端连接方法得到了广泛的应用。但是该方法也存在一些缺点，比如说在某些情况下，由于无法获取合适的限制性酶切位点，因此为粘性末端克隆带来了不便。除了粘性末端克隆方法以外，还有两种常见的基于T4 DNA连接酶的克隆方法，分别是平末端克隆和TA克隆。尽管近年来一些不依赖T4 DNA连接酶的克隆策略也得到快速发展，但是仍然不能完全取代依赖连接酶的克隆方法Yao S,Hart DJ,An Y.Recent advancesin universal TA cloning methods for use in function studies.Protein Eng DesSel.2016；1-6.)。平末端克隆主要是质粒载体和插入DNA片段都具有平末端，在T4 DNA连接酶的作用下实现环化。平末端克隆的效率相对比较低，但是用于克隆平末端DNA片段时不需要额外加入限制性内切酶位点。而TA克隆是利用Taq聚合酶等酶所特有的末端转移酶活性，在PCR产生的片段的3'端额外产生一个凸出的碱基“A”。该碱基刚好与T载体的3'端凸出的碱基“T”互补配对，因此可以通过T4 DNA连接酶进行连接和环化，从而实现分子克隆。TA克隆的显著优势是克隆效率高，而且不需要选择和添加合适的限制性内切酶识别序列，甚至可以克隆序列未知的DNA片段。另外现有的质粒载体普遍存在的缺点是克隆效率不高，在克隆过程中经常会出现假阳性，从而增加了后续筛选的压力。因此改造上述温度诱导型质粒，使之能够实现高效分子克隆，避免假阳性，也具有重要意义。

因此，设计和构建一种能够灵活地进行无背景TA克隆、粘性末端克隆和平末端克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体，将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有广泛的应用前景的，能够灵活地进行无背景TA克隆、粘性末端克隆和平末端克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种具有广泛的应用前景的，能够灵活地进行无背景TA克隆、粘性末端克隆和平末端克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体，该载体为闭合环状双链DNA，包括温度诱导型启动子、温敏调控原件和两个多克隆位点区。多克隆位点区含有NdeI、SpeI、SalI、BsaI、BamHI、SacI、PstI等粘性末端克隆位点，也包括能进行平末端克隆的位点StuI。同时，多克隆位点区还包括能构建T载体并进行TA克隆的AhdI位点，可在载体片段两端各引入一个3’凸出单个“T”碱基，形成T载体。在两个克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB基因。

所述温度诱导型启动子为pL/pR双启动子。

所述温敏调控原件为Cits857。

所述载体还包括pMB1复制子、C末端His-tag编码序列和卡纳霉素抗性基因序列。

所述载体具有SEQ ID No:1中所示的DNA序列；载体中包含的DNA功能区有：特殊设计的多克隆位点区含有NdeI、SpeI、SalI、BsaI、BamHI、SacI、PstI等粘性末端克隆位点，进行平末端克隆的位点StuI和能构建T载体并进行TA克隆的AhdI位点；pL/pR双启动子和Cits857调控原件使得该质粒具有温度诱导型蛋白表达功能；ccdB基因序列编码毒性蛋白，作为克隆过程的负筛选标记，确保克隆没有假阳性；C末端His-tag区使得表达后的蛋白能被镍柱纯化。

一种能够灵活地克隆，并且可以进行温度诱导型蛋白表达的质粒载体的构建方法：

1)采用一对引物PHis-for1(5’-AAAAC TGCAG CACCA CCACC ACCAC CACTA AGGCTGCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATC ACAGT TAAAT TGCTAACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)，以质粒pET3a为模板进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1。

2)采用一对引物PET9-for1(5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATAT CCCTG ACTGCGTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATC ACAGT TAAATTGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)，以质粒pET9a为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2；

3)以PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物，以上述片段1和片段2混合物为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2；

4)采用一对引物PT7-for2(5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTG GTACCAGATCTCGAT CCCGC GAAAT TAATACGAC-3’)和PT7-rev2：(5’-AAAAC TGCAG CATAT GTATATCTCCTTCTT AAAGT TAAACAAAAT TATTT CTAGA GGG-3’)，以质粒pET3a为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3；

5)以PHis-for1和PT7-rev2为上下游引，以上述片段1+2和片段3混合物为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3；

6)将步骤5)获得的片段1+2+3进行PCR纯化，同时用PstI单酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳进行胶回收纯化；

7)将步骤6)纯化得到的DNA片段于连接体系内在室温下进行连接，然后转化大肠杆菌JM109，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-orig。

8)以TIE-KpnI-For(5’-CGGGG TACCG CGCCG ACCAG AACAC CTTGC CGATC-3’)和TIE-NdeI-Rev(5’-CGCGC ATATG TTCCT CCTTAATTTT TAACC AATGC TTCG-3’)为上下游引物，以质粒pBV220为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4；

9)将片段4和步骤7)获得pANY-orig同时用KpnI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，经过T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌JM109，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-TIE；

10)以CcdB-For2-middle(5’-GCCTG TCGAC CCTGG GTCTG GAGAC CGGCTTACTAAAAGC CAGATAACAG TATGC G-3’)和CcdB-Rev2-middle(5’-CCAGG CCTGA CCATAGGTCG ACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATAAGGGA GCCTG AC-3’)为上下游引物，以质粒PhisKan5(Freuler F,Stettler T,Meyerhofer M,Leder L,Mayr LM(2008)Developmentof a novel Gateway-based vector system for efficient,multiparallel proteinexpression in Escherichia coli.Protein Expr Purif 59:232–241)为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5；

11)以CcdB-For2(5’-CGCGCATATGACTAG TAGGC CTGTC GACCC TGGGT CTGGAGACCGGC-3’)和CcdB-Rev2(5’-CATCT GCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGAC CATAG GTCGACGAGAGACCGACTGG C-3’)为上下游引物，以步骤10所获得的片段5为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段6；

12)将片段6和步骤9)获得的pANY-TIE同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，经过T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DB3.1，再经抗性筛选即得质粒载体pANY3(物理图谱如图1所示)；

上述DNA连接体系为含175U T4 DNA连接酶(TaKaRa Co.)，1×连接buffer，约30ng酶切得到的待连接片段。

与现有的温度诱导型表达载体相比，本发明pANY3具有以下显著优势：

1)现有的温度诱导型表达载体只能通过粘性末端克隆的方法进行克隆，因此克隆的过程受到很多限制；而pANY3具有两个多克隆区，提供了多个不同的粘性末端克隆位点，可以有效地避免这种限制作用。另外，pANY3的多克隆位点区还含有AhdI位点，可以通过酶切在载体片段两端各引入一个3’凸出一个“T”碱基，从而制备成T载体，用于TA克隆。此外，多克隆位点区还含有能产生平末端的酶切位点，可以实现平末端克隆，所以克隆的方式更为灵活多样。

2)通常情况下，大片段的克隆效率较低。而pANY3的载体部分仅有3kb，远远小于包括温度诱导型质粒pBV220在内的常见的质粒载体，使得该载体的克隆效率明显优于现有载体。

3)在现有温度诱导型载体的制备过程中，质粒由于酶切不够彻底等原因，经常会导致非重组转化子的本底过高，产生大量假阳性。而在制备载体的过程中，虽然可以通过电泳和胶回收的方法帮助去除这些未经酶切的质粒，这样不仅增加了工作量，而且效果往往不够理想。而pANY3在两个克隆位点间隔区引入了毒蛋白基因ccdB，作为负筛选标记。这样，在载体制备过程中不需要胶回收等复杂步骤，就可以彻底清除前载体污染，实现零背景克隆。

4)不同于现有的温度诱导型质粒pBV220，pANY3还具有C末端组氨酸标签His-tag，因此既可以对克隆的片段进行表达，又可以方便地进行蛋白质纯化。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pANY3质粒图。(a)pANY3质粒的物理图谱。其中pL和pR为温度诱导型启动子；cItS857为温度诱导调控原件；MCS-1和MCS-2为多克隆位点区；ccdB为毒蛋白的基因序列，ccdB蛋白通过干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，抑制大多数大肠杆菌(如JM109、DH5α、BL21等)的生长增殖，但是不抑制特殊大肠杆菌菌株(如DB3.1)的生长繁殖；His-tag为编码组氨酸尾巴的序列；Kana为编码卡那霉素抗性蛋白的基因；pMB1 replicon为大肠杆菌pMB1型复制子。(b)pANY3质粒中两个多克隆位点区所含有的多克隆位点。

图2为本发明实施例提供的pANY3-TA-pfLamA的质粒图。其中pL和pR为温度诱导型启动子；cItS857为温度诱导调控原件；MCS-1和MCS-2为多克隆位点区；His-tag为编码组氨酸尾巴的序列；Kana为编码卡那霉素抗性蛋白的基因；pMB1replicon为大肠杆菌pMB1型复制子；pfLamA为编码pfLamA酶的基因序列。

图3为本发明实施例提供的pANY3-Hj-Xyn的质粒图。其中pL和pR为温度诱导型启动子；cItS857为温度诱导调控原件；MCS-1和MCS-2为多克隆位点区；His-tag为编码组氨酸尾巴的序列；Kana为编码卡那霉素抗性蛋白的基因；pMB1replicon为大肠杆菌pMB1型复制子；Hj-Xyn为编码Hj-Xyn酶的基因序列。

图4为SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平和纯化效率图。M：protein ladder；1：含pETM11空质粒的菌的粗提液；2：含pETM11空质粒的菌的纯化；3：未经过温度诱导表达的含有pANY3-TA-pfLamA质粒的菌粗提液；4：经过温度诱导表达后的含有pANY3-TA-pfLamA质粒的菌粗提液；5：经过温度诱导表达后的含有pANY3-TA-pfLamA质粒的菌用Ni-NTA进行蛋白纯化的产物；6：未经过温度诱导表达的含有pANY3-Hj-Xyn质粒的菌粗提液；7：经过温度诱导表达后的含有pANY3-Hj-Xyn质粒的菌粗提液；8：经过温度诱导表达后的含有pANY3-Hj-Xyn质粒的菌用Ni-NTA进行蛋白纯化的产物。

图5为DNS法测定pANY3表达pfLamA和Hj-Xyn的酶活性图。(a)pfLamA的酶活测定。1：DNS空白对照；2：凝结多糖未经酶催化的对照；2：凝结多糖经纯化后的pfLamA酶催化后的产物的DNS。(b)Hj-Xyn的酶活测定。1：DNS空白对照；2：木聚糖未经酶催化的对照；2：木聚糖经Hj-Xyn酶催化后的产物的DNS。

图6为含有pANY3-TA-pfLamA和pANY3-Hj-Xyn质粒的菌进行温度诱导型表达时，诱导温度对蛋白表达量的影响。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明作进一步的解释说明。质粒为闭合环状的双链DNA，含有两个多克隆位点区，其中包括能进行粘性末端克隆的位点和平末端克隆的位点，同时还包括能构建T载体并进行TA克隆的位点。这些位点使得该质粒可灵活地采用不同方式进行分子克隆。在两个多克隆位点区之间存在一个ccdB表达框，可在多数大肠杆菌菌株中组成型表达毒性蛋白ccdB，作为负筛选标记。另外，本质粒载体还含有温度诱导型pL/pR双启动子，并含有Cits857调控原件，可用于温度诱导型蛋白表达。另外，本质粒载体还可以用于蛋白的纯化。各功能均得到验证。本发明所涉及的质粒载体因其更方便和高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。

实施例1:质粒载体pANY3的获得

1)采用一对引物PHis-for1(5’-AAAAC TGCAG CACCA CCACC ACCAC CACTA AGGCTGCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATC ACAGT TAAAT TGCTAACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)，以质粒pET3a为模板进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfubuffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸2min。反应结束前用72℃延伸10min。

2)采用一对引物PET9-for1(5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATAT CCCTG ACTGCGTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATC ACAGT TAAATTGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)，以质粒pET9a为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1xPfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸2min。反应结束前用72℃延伸10min。

3)以PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物，以上述片段1和片段2混合物为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸3min。反应结束前用72℃延伸10min。

4)采用一对引物PT7-for2(5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTG GTACCAGATCTCGAT CCCGC GAAAT TAATACGAC-3’)和PT7-rev2：(5’-AAAAC TGCAG CATAT GTATATCTCCTTCTT AAAGT TAAACAAAAT TATTT CTAGA GGG-3’)，以质粒pET3a为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸2min。反应结束前用72℃延伸10min。

5)以PHis-for1和PT7-rev2为上下游引，以上述片段1+2和片段3混合物为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸6min。反应结束前用72℃延伸10min。

6)将步骤5)获得的片段1+2+3进行PCR纯化，同时用PstI单酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳进行胶回收纯化；

7)将步骤6)纯化得到的DNA片段于连接体系内在室温下进行连接，然后转化大肠杆菌JM109，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-orig。

8)以TIE-KpnI-For(5’-CGGGG TACCG CGCCG ACCAG AACAC CTTGC CGATC-3’)和TIE-NdeI-Rev(5’-CGCGC ATATG TTCCT CCTTAATTTT TAACC AATGC TTCG-3’)为上下游引物，以质粒pBV220为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸3min。反应结束前用72℃延伸10min。

9)将片段4和步骤7)获得pANY-orig同时用KpnI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，经过T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌JM109，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-TIE；

10)以CcdB-For2-middle(5’-GCCTG TCGAC CCTGG GTCTG GAGAC CGGCTTACTAAAAGC CAGATAACAG TATGC G-3’)和CcdB-Rev2-middle(5’-CCAGG CCTGA CCATAGGTCG ACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATAAGGGA GCCTG AC-3’)为上下游引物，以质粒PhisKan5(Freuler F,Stettler T,Meyerhofer M,Leder L,Mayr LM(2008)Developmentof a novel Gateway-based vector system for efficient,multiparallel proteinexpression in Escherichia coli.Protein Expr Purif 59:232–241)为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfubuffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸3min。反应结束前用72℃延伸10min。

11)以CcdB-For2(5’-CGCGCATATGACTAG TAGGC CTGTC GACCC TGGGT CTGGAGACCGGC-3’)和CcdB-Rev2(5’-CATCT GCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGAC CATAG GTCGA CGAGAGACCG ACTGG C-3’)为上下游引物，以步骤10所获得的片段5为模板，进行PCR扩增，扩增产物命名为片段6。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸3min。反应结束前用72℃延伸10min。

12)将片段6和步骤9)获得的pANY-TIE同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，经过T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DB3.1，再经抗性筛选即得质粒载体pANY3(物理图谱如图1所示)；该质粒具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

SEQ ID No:1pANY3(3734bp)：

caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccgcgccgaccagaacaccttgccgatcagccaaacgtctcttcaggccactgactagcgataactttccccacaacggaacaactctcattgcatgggatcattgggtactgtgggtttagtggttgtaaaaacacctgaccgctatccctgatcagtttcttgaaggtaaactcatcacccccaagtctggctatgcagaaatcacctggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaattaacattccgtcaggaaagcttggcttggagcctgttggtgcggtcatggaattaccttcaacctcaagccagaatgcagaatcactggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaagcttaggtgagaacatccctgcctgaacatgagaaaaaacagggtactcatactcacttctaagtgacggctgcatactaaccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagggctaaattcttcaacgctaactttgagaatttttgtaagcaatgcggcgttataagcatttaatgcattgatgccattaaataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtctgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttttcataaattgctttaaggcgacgtgcgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgttaaatctatcaccgcaagggataaatatctaacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgcatgtactaaggaggttgtatggaacaacgcataaccctgaaagattatgcaatgcgctttgggcaaaccaagacagctaaagatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaaaaaataaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgacgctcttaaaaattaagccctgaagaagggcagcattcaaagcagaaggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggttaaaaattaaggaggaacatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctggagaccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggaaagcggaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtcggtctctcgtcgacctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag

实施例2:将内切-β-1,3-葡聚糖酶pfLamA基因克隆进pANY3

1)用AhdI酶切质粒pANY3，酶切反应体系如下：120μl酶切体系中包含10U AhdI内切酶(NEB公司)，4μg pANY3质粒DNA，1×buffer。37℃酶切6小时后，经过酶切后的大片段即是T载体，命名为pANY3-T，不需胶回收。

2)以pfLamA-For-AhdI(5’-GGCAT GGTCC CTGAA GTGAT AGAAA TAGAT GGAAAACAG-3’)和pfLamA-Rev-AhdI(5’-AGGAC CACTA ACGAA TGAGT AAACC CTTAC ATAAT CC-3’)为正反引物，以质粒pET9d-pfLamA(Ilari A,Fiorillo A,Angelaccio S,Florio R,Chiaraluce R,van der Oost J,Consalvi V.Crystal structure of a family 16endoglucanase from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus--structural basisof substrate recognition.FEBS J.2009；276(4):1048-1058.)为模板，进行PCR扩增。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸2min。反应结束前用72℃延伸10min。

3)将上述步骤2得到的片段与T载体pANY3-T进行连接，连接体系为：175U T4DNA连接酶(TaKaRa Co.)，30ng PCR和酶切产物，1×连接buffer，加水到20μl。37℃反应2小时。

将连接产物按照常规方法转化大肠杆菌JM109菌株后，挑取经Kana抗性筛选得到的菌落，液体培养，提取质粒，进行测序鉴定，将测序鉴定TA连接成功的质粒命名为pANY3-TA-pfLamA(物理图谱如图2所示)，该质粒具有序列表中序列2核苷酸序列。随机测序的结果表明，所有的克隆均为阳性克隆，没有假阳性克隆出现。所以，pANY3可以有效的进行T载体制备，用于TA克隆。

SEQ ID No:2pANY3-TA-pfLamA(3839bp)：

caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccgcgccgaccagaacaccttgccgatcagccaaacgtctcttcaggccactgactagcgataactttccccacaacggaacaactctcattgcatgggatcattgggtactgtgggtttagtggttgtaaaaacacctgaccgctatccctgatcagtttcttgaaggtaaactcatcacccccaagtctggctatgcagaaatcacctggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaattaacattccgtcaggaaagcttggcttggagcctgttggtgcggtcatggaattaccttcaacctcaagccagaatgcagaatcactggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaagcttaggtgagaacatccctgcctgaacatgagaaaaaacagggtactcatactcacttctaagtgacggctgcatactaaccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagggctaaattcttcaacgctaactttgagaatttttgtaagcaatgcggcgttataagcatttaatgcattgatgccattaaataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtctgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttttcataaattgctttaaggcgacgtgcgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgttaaatctatcaccgcaagggataaatatctaacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgcatgtactaaggaggttgtatggaacaacgcataaccctgaaagattatgcaatgcgctttgggcaaaccaagacagctaaagatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaaaaaataaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgacgctcttaaaaattaagccctgaagaagggcagcattcaaagcagaaggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggttaaaaattaaggaggaacatatgactagtaggcctgtcgaccctggcatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggtcctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag

实施例3:将里氏木霉内切木聚糖酶Hj-Xyn基因克隆进pANY3

1)以里氏木霉cDNA为模板，Hj-Xyn-NdeI-For(5’-GGAGG TAAAA CATAT GACGATCCAA CCAGG CACGG GCTAC AACAA CGG-3’)和Hj-Xyn-PstI-Rev(5’-AAAAC TGCAGGCTAACGGTG ATGCT TGCAGAACCG CTGCT G-3’)为正反引物进行PCR扩增。PCR扩增的反应条件为：引物各10μmol/L，2U Pfu酶，1x Pfu buffer，0.2mmol/L dNTPs，模板2ng左右，加灭菌的去离子水到20μl。PCR扩增的循环程序为：94℃预变性2min，随后25个循环的94℃变性30s，63℃退火30s和72℃延伸3min。反应结束前用72℃延伸10min。

2)将上述步骤1得到的片段与pANY3用NdeI和PstI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，经过T4 DNA连接酶连接。连接体系为：175U T4DNA连接酶(TaKaRaCo.)，30ng酶切产物，1×连接buffer，加水到20μl。37℃反应2小时。将连接产物转化大肠杆菌JM109，挑取经Kana抗性筛选得到的菌落，液体培养，提取质粒，进行测序鉴定，将测序鉴定成功的质粒命名为pANY3-Hj-Xyn(物理图谱如图3所示)。该质粒具有序列表中序列3核苷酸序列。随机测序的结果表明，所有的克隆均为阳性克隆，没有假阳性克隆出现。所以，pANY3可以有效的进行粘性末端克隆。SEQ ID No:3pANY3-Hj-Xyn(3596bp)：

catatgacgatccaaccaggcacgggctacaacaacggctatttctactcttactggaacgacggtcatggtggtgttacctatactaatggccctggtggccagttcagcgtcaattggagcaattccggcaacttcgttggtggtaaaggctggcagccgggcaccaagaataaggtgattaactttagcggttcctacaatccgaatggcaacagctacctgagcgtgtacggctggagccgtaatccgctgattgaatactatatcgtggagaactttggtacgtacaacccgtccaccggtgccaccaaactgggtgaggttactagcgatggtagcgtgtatgatatctatcgcacccagcgtgttaatcaaccgtcgattattggtacggcgaccttttatcaatactggagcgtgcgtcgcaaccaccgttctagcggcagcgtcaacaccgcaaaccactttaatgcgtgggctcagcagggtttgaccctgggtacgatggactaccaaatcgtcgcggtcgaaggttatttcagcagcggttctgcaagcatcaccgttagcgtcgaccaccaccaccaccaccactaagagctcctgcagcaccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccgcgccgaccagaacaccttgccgatcagccaaacgtctcttcaggccactgactagcgataactttccccacaacggaacaactctcattgcatgggatcattgggtactgtgggtttagtggttgtaaaaacacctgaccgctatccctgatcagtttcttgaaggtaaactcatcacccccaagtctggctatgcagaaatcacctggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaattaacattccgtcaggaaagcttggcttggagcctgttggtgcggtcatggaattaccttcaacctcaagccagaatgcagaatcactggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaagcttaggtgagaacatccctgcctgaacatgagaaaaaacagggtactcatactcacttctaagtgacggctgcatactaaccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagggctaaattcttcaacgctaactttgagaatttttgtaagcaatgcggcgttataagcatttaatgcattgatgccattaaataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtctgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttttcataaattgctttaaggcgacgtgcgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgttaaatctatcaccgcaagggataaatatctaacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgcatgtactaaggaggttgtatggaacaacgcataaccctgaaagattatgcaatgcgctttgggcaaaccaagacagctaaagatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaaaaaataaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgacgctcttaaaaattaagccctgaagaagggcagcattcaaagcagaaggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggttaaaaattaaggaggaa

实施例4:pANY3用于蛋白表达和纯化的功能验证

1)将上述实施例2和3中所获得的pANY3-TA-pfLamA和pANY3-Hj-Xyn转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在30度培养，用42度进行温度诱导型表达。提取经过诱导表达前后的pfLamA和Hj-Xyn的粗酶液。作为对照，将质粒pET11转化大肠杆菌BL21(DE3)，同样进行温度诱导型表达和粗提液的提取。

2)将含有步骤1)中所述的转化不同质粒的大肠杆菌工程菌用TB培养基培养，诱导表达，并用HIS GraviTrap Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(上海超研生物科技有限公司)进行纯化。将上述纯化前后的粗酶液和纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析(如图4所示)。结果表明，pANY3既能用于有效地表达蛋白，又因其具有组氨酸尾巴，可以用Ni-NTA进行蛋白纯化。

3)以凝结多糖和木聚糖为底物，用步骤2)得到的纯化的酶分别进行反应。凝结多糖在pfLamA作用下生成低聚凝结多糖和葡萄糖，而木聚糖在Hj-Xyn作用下生成低聚木糖和木糖。葡萄糖和木糖为还原糖，因此通过DNS法测定催化反应的发生和产物的浓度(如图5所示)。结果进一步表明，pANY3可以有效的进行蛋白质表达和纯化，纯化后的酶pfLamA和Hj-Xyn都有很强的酶活性。

4)并用不同的温度(32度到45度)进行温度诱导型表达，通过比较不同温度诱导后的蛋白表达量，确定最适的诱导温度(如图6所示)。结果表明pANY3-TA-pfLamA和pANY3-Hj-Xyn的最佳诱导温度分别为42度和39度。而且诱导温度对蛋白表达量的影响明显。所以在采用pANY3进行不同蛋白表达时，需要优化表达温度。

Claims (8)

1.一种大肠杆菌质粒载体，其特征在于：质粒为闭合环状双链DNA，含有两个多克隆位点(MCSs)，所述多克隆位点为能进行粘性末端克隆的位点和平末端克隆的位点，和能构建T载体并进行TA克隆的位点。

2.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体还包括C末端His-tag编码序列、pMB1复制子和卡那霉素抗性基因。

3.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体启动子为温度诱导型pL/pR双启动子，并含有Cits857调控原件。

4.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述两个克隆位点区含有NdeI、SpeI、SalI、BsaI、BamHI、SacI或PstI粘性末端克隆位点，也包括能进行平末端克隆的位点StuI；同时还包括能构建T载体并进行TA克隆的AhdI位点。

5.按权利要求4所述的质粒载体，其特征在于：所述在载体片段两端各引入一个3’凸出单个“T”碱基，形成T载体。

6.按权利要求1-4所述的质粒载体，其特征在于：所述载体为SEQ ID No:1中所示的碱基序列。

7.一种权利要求1所述的质粒的构建方法，其特征在于：

1)以pET3a质粒为模板，用引物PHis-for1和PHis-rev1进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1；PHis-for1和PHis-rev1的引物序列为：PHis-for1(5’-AAAAC TGCAG CACCA CCACCACCAC CACTA AGGCT GCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATCACAGT TAAAT TGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)；

2)以pET9a质粒为模板，用引物PET9-for1和PET9-rev1进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2；PET9-for1和PET9-rev1的序列为：PET9-for1(5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATATCCCTG ACTGC GTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC-3’)和PET9-rev1(5’-CAAAG GCCAGCAAAA GGCCA GGAAC CGTAAAAAGG CCGCG TTGCT GGCGT TT-3’)；

3)将上述片段1和片段2混合，并以混合物为模板，以PHis-for1和PET9-rev1为引物进行重叠延伸PCR，扩增产物命名为片段1+2；

4)以pET3a质粒为模板，用引物PT7-for2和PT7-rev2进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3；PT7-for2和PT7-rev2引物的序列为：PT7-for2(5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTGGTACC AGATC TCGAT CCCGC GAAAT TAATACGAC-3’)和PT7-rev2(5’-AAAAC TGCAG CATATGTATATCTCC TTCTT AAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GGG-3’)；

5)以上述片段1+2和片段3混合物为模板，PHis-for1和PT7-rev2为引物进行重叠延伸PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3，并用PCR纯化试剂盒纯化；

6)将上述纯化后的片段1+2+3用PstI单酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收；

7)将步骤6)得到的片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物纯化后转化大肠杆菌JM109菌株，得到质粒载体pANY-orig；

8)以质粒pBV220为模板，用引物TIE-KpnI-For和TIE-NdeI-Rev进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4；TIE-KpnI-For和TIE-NdeI-Rev的引物序列为：TIE-KpnI-For(5’-CGGGGTACCG CGCCG ACCAG AACAC CTTGC CGATC-3’)和TIE-NdeI-Rev(5’-CGCGC ATATG TTCCTCCTTA ATTTT TAACC AATGC TTCG-3’)；

9)将步骤8)获得PCR产物(即片段4)和步骤7)获得pANY-orig同时用KpnI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶,回收酶切产物；

10)然后将酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌JM109菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-TIE；

11)以质粒pHisKan5(Freuler et al.2008)为模板，用引物CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5；CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle引物的序列为：CcdB-For2-middle(5’-GCCTG TCGAC CCTGG GTCTG GAGAC CGGCT TACTAAAAGC CAGAT AACAG TATGC G-3’)和CcdB-Rev2-middle(5’-CCAGG CCTGA CCATA GGTCGACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATA AGGGA GCCTG AC-3’)；

12)以上述片段5为模板，用引物CcdB-For2和CcdB-Rev2进行PCR扩增，扩增产物命名为片段6；CcdB-For2和CcdB-Rev2引物的序列为：CcdB-For2(5’-CGCGC ATATG ACTAG TAGGCCTGTC GACCC TGGGT CTGGA GACCG GC-3’；Nde I underlined)和CcdB-Rev2(5’-CATCTGCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGAC CATAG GTCGA CGAGA GACCG ACTGG C-3’；PstIunderlined)；

13)将步骤12)获得PCR产物(即片段6)和步骤10)获得pANY-TIE同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶,回收酶切产物；

14)将步骤13)得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌DB3.1菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY3。

8.按权利要求7所述的质粒载体的构建方法，其特征在于：所述连接体系为含175U T4DNA连接酶(TaKaRa Co.)，1×连接buffer，约30ng酶切产物。