CN105821021A - 一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用 - Google Patents

一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用，突变体S27B05的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与野生酶相比，突变木聚糖酶S27B05在0℃和80℃的活性、在37℃的热稳定性、在10.0mM的β‑Mercaptoethanol、CoCl2、MnSO4、Pb(CH3COO)2、ZnSO4及FeSO4中的活性、在15.0–30.0％(w/v)的NaCl中的活性及在30.0％(w/v)的NaCl中的稳定性得到了改良。本发明的突变木聚糖酶S27B05可应用于食品行业、水产饲料及低温和高盐环境生物技术领域。

Description

一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用。
背景技术
木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖。木聚糖酶可降解木聚糖，其在饲料、食品、酿酒、纺织及造纸等领域都具有应用价值。
耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性和稳定性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源；耐热酶在高温下具有催化活性且热稳定性好，具有广泛的用途，如生物质糖化和饲料制粒常在中高温进行；低温酶在低温环境中具有较高的酶活，可用于低温到中温的生境或加工过程，如水产生境常常为10-25℃，将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用。目前，绝大部分低温酶在高温无活性且热稳定性差，而绝大部分高温酶在低温无活性。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的低温酶在高温无活性且热稳定性差、而绝大部分高温酶在低温无活性的问题，提供一种木聚糖酶热盐性改良突变体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05，所述突变体S27B05的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的第二目的是提供一种编码木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05的编码基因S27b05，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三目的是提供一种包含有木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05编码基因S27b05的重组载体。
本发明的第四目的是提供一种包含木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05编码基因S27b05的重组菌。
本发明的第五目的是提供一种木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05在食品加工中的应用。
本发明的第六目的是提供一种木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05在水产饲料中的应用。
制备本发明木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05的方法按以下步骤进行：
1)将S27b05和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，获得包含S27b05的重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组突变木聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的突变木聚糖酶S27B05。
4)活性测定。
本发明的有益技术效果是：与野生酶相比，突变木聚糖酶S27B05的热盐性发生了改变。纯化的突变酶S27B05、野生纯化酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为60℃、50℃和75℃，在0℃分别具有37.3％、20.8％和6.6％的酶活，在80℃分别具有41.7％、5.2％和90.7％的酶活；木聚糖酶S27B05和rXynAHJ3在37℃下稳定，而rXynAGN16L在37℃时半衰期小于60min。木聚糖酶S27B05在10.0mMβ-Mercaptoethanol和CoCl2中的活力高于rXynAHJ3 15％左右，但低于rXynAGN16L 10％左右；在MnSO4中，木聚糖酶S27B05的酶活比rXynAHJ3高34.7％但比rXynAGN16L低31.9％；在Pb(CH3COO)2中，木聚糖酶S27B05的酶活比rXynAHJ3高13.5％；在ZnSO4中，木聚糖酶S27B05的酶活比rXynAHJ3和rXynAGN16L分别高20.8％和10.1％；在FeSO4中，S27B05的酶活比rXynAHJ3和rXynAGN16L分别高6.7％和17.7％。在反应体系中加入15.0–30.0％(w/v)的NaCl，木聚糖酶S27B05比rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活至少高18％。本发明的突变木聚糖酶S27B05可应用于食品行业、水产饲料及低温和高盐环境生物技术领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05的SDS-PAGE分析，其中，CK：蛋白质Marker；
图2：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05的pH活性；
图3：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05的pH稳定性；
图4：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05的热活性；
图5：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05的热稳定性；
图6：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05在NaCl中的活性；
图7：重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S27B05在NaCl中稳定性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli BL21-Gold(DE3)和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobacter sp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)由云南师范大学提供。
2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，山毛榉木聚糖购自Sigma公司，易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自GENESTAR公司，PopCultureTM细胞裂解液购自德国默克集团有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：突变文库的构建
①按照GENE STAR公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(Arthrobacter sp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组。
②根据GenBank记录的节杆菌(Arthrobacter sp.)木聚糖酶核苷酸序列JQ863105(SEQ ID No.3)，设计引物5'GTGCAGCCGGAGGAAAAACG 3'和5'GATGAAGGCAGGATCCGGGGT 3'，以节杆菌(Arthrobacter sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得木聚糖酶基因xynAGN16L；另根据GenBank记录的列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)木聚糖酶核苷酸序列JF745868(SEQ ID No.4)，设计引物5'GTCTCGGCCCCGCCGGACGT 3'和5'GGCTCGCTTCGCCAGCGTGG3'，以列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得木聚糖酶基因xynAHJ3。
③PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温10min。
④以上述PCR产物为模板，利用易错PCR试剂盒，按照试剂盒说明书进行基因突变。
⑤用超声打断仪Biorupter对易错PCR产物进行超声随机打断，打断产物经2％琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化。
⑥纯化后的小片段DNA自身互为引物和模板进行DNA Familyshuffling PCR，PCR反应参数为：96℃变性1min 30sec；然后94℃变性30sec，依次65℃退火90sec、62℃退火90sec、59℃退火90sec、56℃退火90sec、53℃退火90sec、50℃退火90sec、47℃退火90sec、44℃退火90sec、41℃退火90sec，72℃延伸1min 30sec，35个循环后72℃保温7min。
⑧以纯化的DNA Family shuffling PCR产物为模板，用木聚糖酶基因xynAHJ3和xynAGN16L扩增引物和反应条件进行序列全长扩增，扩增产物含突变序列和未突变序列。
⑨将序列全长扩增产物和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，经过夜培养，从转化平板中挑取单菌落于含有150μL液体LB培养液(含100μg mL-1Amp)的96孔细胞培养板中，于37℃，快速振荡培养约16h后，每孔加入40％(w/w)的甘油50μL，混匀后于-70℃保存。
实施例2：突变体的筛选
1)从保存突变文库的96孔细胞培养板中取2μL菌液，接种于含200μL/孔液体LB培养液(含100μg mL-1Amp)的96深孔板中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600>1.0(约20h)，加入含2mM IPTG和100μg mL-1Amp的200μL液体LB培养液，于20℃，160rpm过夜诱导。
2)诱导结束后加入40μL/孔的PopCultureTM细胞裂解液，在25℃下，震荡裂解细胞30min。
3)取50μL含1.0％(w/v)山毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH＝7.0)及50μL细胞裂解产物，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应2h。反应结束后加入150μL DNS试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取OD540nm的值，以只含有pEASY-E2空载体的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株裂解液反应组作为对照。
4)取有木聚糖酶活性的突变体细胞裂解产物10μL，另取90μL含0.5％(w/v)山毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH＝7.0)，加入10％(w/v)和25％(w/v)的NaCl，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应10min。
5)反应结束后加入150μL DNS试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取OD540nm的值，以不含NaCl的对应突变体裂解液反应组作为对照。
6)比较突变体与野生重组酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活大小，获得在10％(w/v)和25％(w/v)NaCl中酶活提高的1个突变体，编号为S27B05，该突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例3：突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶制备
将含突变体S27B05、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。
然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH＝7.0Tris–HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。
SDS-PAGE结果(图1)表明，突变酶S27B05、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3都获得了纯化，产物为单一条带。
实施例4：突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的性质测定
1)突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的活性分析
活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量。
2)突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的pH活性和pH稳定性测定：
酶的最适pH测定：将酶液置于37℃下和pH＝4.0–12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于pH＝3.0–12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：McIlvaine buffer(pH＝3.0–8.0)和0.1M glycine–NaOH(pH＝9.0–12.0)。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的木聚糖酶的酶学性质。结果表明：S27B05和rXynAGN16L的最适pH都为5.5，rXynAHJ3的最适pH为6.0(图2)，在pH＝9.0–12.0时，S27B05的酶活比rXynAGN16L和rXynAHJ3高8–24％(图2)；在pH＝5.0时，S27B05和rXynAHJ3稳定而rXynAGN16L不稳定，但在pH＝10.0–11.0时，S27B05不稳定而rXynAGN16L和rXynAHJ3稳定(图3)。
3)突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的热活性及热稳定性测定：
酶的热活性测定：在pH＝7.0的缓冲液中，于0–90℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃处理0–60min后，在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的木聚糖酶的酶学性质。结果表明：S27B05、rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为60℃、50℃和75℃，在0℃分别具有37.3％、20.8％和6.6％的酶活，在80℃分别具有41.7％、5.2％和90.7％的酶活(图4)；S27B05和rXynAHJ3在37℃下稳定，而rXynAGN16L在37℃时半衰期小于60min(图5)。
4)不同金属离子及化学试剂对突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶活力的影响：
在酶促反应体系中加入10.0mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃及pH＝7.0条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定酶活性。结果(表1)表明，10.0mM的HgCl2可完全抑制S27B05、rXynAGN16L和rXynAHJ3；S27B05在β-Mercaptoethanol和CoCl2中的活力高于rXynAHJ3 15％左右，但低于rXynAGN16L 10％；在MnSO4中，S27B05的酶活比rXynAHJ3高34.7％但比rXynAGN16L低31.9％；在Pb(CH3COO)2中，S27B05的酶活比rXynAHJ3高13.5％；在ZnSO4中，S27B05的酶活比rXynAHJ3和rXynAGN16L分别高20.8％和10.1％；在FeSO4中，S27B05的酶活比rXynAHJ3和rXynAGN16L分别高6.7％和17.7％。
表1.金属离子及化学试剂对突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3活力的影响
5)突变体S27B05及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶在NaCl中的活性及稳定性：
酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0–30.0％(w/v)NaCl，于pH7.0及37℃下进行酶促反应。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的木聚糖酶的酶学性质。结果表明：在反应体系中加入15.0–30.0％(w/v)的NaCl，S27B05比rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活至少高18％(图6)。
酶在NaCl中的稳定性测定：将纯化的酶液置于3.0–30.0％(w/v)NaCl水溶液中，在37℃下处理60min，然后在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未加NaCl的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的木聚糖酶的酶学性质。结果表明：在3.0–30.0％(w/v)的NaCl中，S27B05和rXynAHJ3非常稳定，经3.0–30.0％(w/v)的NaCl处理60min，S27B05和rXynAHJ3的酶活几乎没有变化；与S27B05和rXynAHJ3相比，rXynAGN16L在30.0％(w/v)的NaCl中稳定性稍差，rXynAGN16L经30％(w/v)的NaCl处理60min后，酶活剩余73.5％(图7)。
6)蛋白酶抗性测定：
酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍(w/w)的胰蛋白酶(pH＝7.5)和蛋白酶K(pH＝7.5)在37℃对重组酶处理1h，然后在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以置于蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。结果表明：经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，S27B05、rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活几乎无损失。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05，其特征在于，所述突变体S27B05的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05的编码基因S27b05，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述包含有木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05编码基因S27b05的重组载体。
4.根据权利要求2所述的包含木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05编码基因S27b05的重组菌。
5.根据权利要求1～4任一项所述木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05在食品加工中的应用。
6.根据权利要求1～4任一项所述木聚糖酶热盐性改良突变体S27B05在水产饲料中的应用。
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