CN103981161A - 耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株。外切菊粉酶InuAJB13具有以下性质：最适pH5.5，在pH4.0–7.0的范围内维持50%以上的酶活性；经0.1M pH4.0–7.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达90%以上；最适温度55℃，在10–70℃内都具有酶活；0.6–4.5M的NaCl可提高酶活0.2–0.6倍；经0.2–4.5M的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持100%以上的活性；在10%（v/v）的乙醇中保持51%的活性；经3.0–15.0%（v/v）的乙醇在37℃下处理60min，仍能保持88%以上的活性；胰蛋白酶、蛋白酶K、表面活性剂、大部分金属离子及市售洗衣液对其活性无影响或影响微弱；可水解菊粉、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、β-2,6-果聚糖（Levan）和可溶性淀粉。本发明的外切菊粉酶可应用于饲料、食品、洗涤和生物燃料行业。

Description

耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株。

背景技术

菊粉（Inulin）又称为菊糖，是由β-2,1糖苷键连接而成的一种多聚果糖，其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构，主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等双子叶植物体的根部或茎部（Roberfroid et al.JNutr,2007,137:2493–2502）。菊芋俗称洋姜或鬼子姜，具有抗病能力非常强、产量高、耐寒、耐贫瘠、耐干旱、种植简易、适应性强等优点，其块茎的产量很大，可含高达20%鲜重或80%干重的菊粉（Kango et al.FoodBiotechnol,2011,25:165–212）。

菊粉酶具有2种作用方式：一种为外切菊粉酶（Exoinulinase，EC3.2.1.80），从非还原端逐个水解β-2,1糖苷键，最终生成果糖和少部分的葡萄糖；另一种为内切菊粉酶（Endoinulinase，EC3.2.1.7），水解菊粉多糖链内部的β-2,1糖苷键，生成低聚果糖（Kangoet al.Food Biotechnol,2011,25:165–212）。外切菊粉酶和内切菊粉酶都属于糖苷水解酶第32家族，该家族还包括蔗糖酶、外切β-2,6-果聚糖酶和内切β-2,6-果聚糖酶（Finn et al.Nucleic Acids Res,2008,36:D281–D288）。

外切菊粉酶水解菊粉并生成果糖及少量葡萄糖，可应用于饲料、食品、洗涤、医药和生物燃料行业，如提高饲料利用率、生产高果糖浆、防治龋齿和生物乙醇发酵（Wankeret al.Appl Environ Microbiol,1995,61:1953-1958）。耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域（如腌制菊芋的食品改良），在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源（Zhou et al.J Ind Microbiol Biot,2012,39:965–975）；耐乙醇的酶在同步糖化发酵中可提高乙醇产量和生物质利用率、缩短发酵时间（Sato et al.Journal of Biosci Bioeng,2010,110:679–683）；耐表面活性剂的酶可应用于洗涤行业（Vijayalaxmi et al.Appl BiochemBiotechnol,2013,171:382–395）；耐蛋白酶的酶可应用于饲料等多种行业（Zhou et al.J IndMicrobiol Biot,2012,39:965–975）。目前，已报导1个耐盐外切菊粉酶（专利申请号：201310275633.9），该酶为碱性酶，在酸性条件下酶活很低；还尚未报导同时具有耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶。

本发明的再一目的是提供编码上述外切菊粉酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述外切菊粉酶InuAJB13可得自鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）。InuAJB13的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的外切菊粉酶InuAJB13总共含505个氨基酸，理论分子量为55.7kDa，其中N端20个氨基酸为预测信号肽序列“MKRTLAAFIGAGLLASGAQA”，成熟的外切菊粉酶InuAJB13含485个氨基酸。该酶的最适pH值为5.5，在pH4.0–7.0的范围内维持50%以上的酶活性；经0.1MpH4.0–7.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达90%以上；该酶最适温度为55℃，在10–70℃内都具有酶活；37℃时该酶的半衰期大于60min；0.6–4.5M的NaCl可提高该酶酶活0.2–0.6倍；经0.2–4.5M的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持100%以上的活性；在10%（v/v）的乙醇中保持51%的活性；经3.0–15.0%（v/v）的乙醇在37℃下处理60min，仍能保持88%以上的活性；经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，该酶仍能分别保持115.1%和105.7%的酶活；表面活性剂（SDS、TritonX-100、Tween80）、大部分金属离子及市售洗衣液对其活性无影响或影响微弱；在pH5.5及55℃下，该酶对0.5%（w/v）的菊粉、蔗糖、棉籽糖（Raffinose）、水苏糖（Stachyose）、β-2,6-果聚糖（Levan）和可溶性淀粉的比活分别为73.7±9.3Umg^-1、1655.3±63.5Umg^-1、244.0±8.9Umg^-1、152.6±10.1Umg^-1、27.7±0.2Umg^-1、16.1±1.8Umg^-1，而对桦木木聚糖（Birchwood xylan）、山毛榉木聚糖（Beechwood xylan）、4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan、阿拉伯木聚糖（Wheat flour arabinoxylan）及p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside均无酶活；该酶可水解洋姜块茎生成果糖。

本发明提供了编码上述外切菊粉酶InuAJB13的基因inuAJB13，该基因序列如SEQID NO.2所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了外切菊粉酶InuAJB13的编码基因inuAJB13，其全长1518bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。该外切菊粉酶InuAJB13全序列与GenBank中Caulobacter sp.AP07来源的糖苷水解酶第32家族蛋白（EJL36942）全序列具有最高的氨基酸序列一致性，为68.3%。该Caulobacter sp.AP07来源的蛋白活性还未研究，只是通过序列相似性判断为糖苷水解酶第32家族的β-果糖苷酶或β-2,6-果聚糖酶或蔗糖酶，所以不能通过该Caulobacter sp.AP07来源蛋白推导出InuAJB13的活性。此外，本发明外切菊粉酶InuAJB13全序列与已报导耐盐外切菊粉酶（专利申请号：201310275633.9）全序列的氨基酸序列一致性为31.8%。以上比对结果和耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的结果说明本发明外切菊粉酶InuAJB13是一种新的外切菊粉酶。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组载体，优选为pEasy-E2-inuAJB13。将本发明的外切菊粉酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的外切菊粉酶基因基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-inuAJB13。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/inuAJB13。

本发明制备外切菊粉酶InuAJB13的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶InuAJB13表达；

3）回收并纯化所表达的外切菊粉酶InuAJB13。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/inuAJB13。

本发明提供了一个新的外切菊粉酶基因，其编码的外切菊粉酶最适pH5.5；最适温度55℃；良好的耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂特性；较好的水解各种底物包括自然底物洋姜的能力。本发明的外切菊粉酶可应用于饲料、食品、洗涤和生物燃料行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组外切菊粉酶InuAJB13的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；1：未纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13粗酶液；2：500mM咪唑洗脱亲和于Nickel-NTAAgarose中的重组外切菊粉酶InuAJB13。

图2：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的pH活性。

图3：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的pH稳定性。

图4：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的热活性。

图5：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的热稳定性。

图6：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的NaCl抗性。

图7：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的NaCl稳定性。

图8：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的乙醇抗性。

图9：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的乙醇稳定性。

图10：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13在不同时间下水解菊粉的产物分析，其中CK为菊粉和失活的InuAJB13（100℃下处理10min）。

图11：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13在不同时间下水解洋姜的产物分析，其中CK为洋姜和失活的InuAJB13（100℃下处理10min）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）同文献报道菌种性质，如Sphingobium estrogenivoransATCCBAA-1367；大肠杆菌Escherichia coliBL21（DE3）和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。

2、试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；菊粉（Inulin）购自百灵威科技公司、桦木木聚糖（Birchwood xylan）、山毛榉木聚糖（Beechwood xylan）、4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan及p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside购自Sigma公司；阿拉伯木聚糖（Wheat flour arabinoxylan）购自Megazyme公司；β-2,6-果聚糖（Levan）（来源于Zymomonas mobilis）购自Advanced Technology&Industrial公司；棉籽糖（Raffinose）购自美国Amresco公司；水苏糖（Stachyose）购自日本东京化成工业株式会社（TCI）；洋姜块茎购自本地市场；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone10g，Yeast extract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：外切菊粉酶基因inuAJB13的克隆

提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，Nacl500mM，2%SDS（w/v），pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

表1.外切菊粉酶基因inuAJB13的克隆与表达引物

根据外切菊粉酶的保守氨基酸序列（H-N-W-M-N-D-P-N-G和R-D-P-K-V-F-W-H-E-Q-S）合成了简并引物Inu32F和Inu32R（表1）。以鞘氨醇单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到一约408bp片段，将该片段回收后与pMD18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR（简称TAIL-PCR）上游特异性引物4条，并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3、usp4；另设计下游特异性引物2条，并将它们分别命名为dsp1、dsp2（表1）。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp4的位置设计在sp3的内侧。以鞘氨醇单胞菌基因组DNA为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，TAIL-PCR反应参数参照文献设置（Zhou JP et al.,Appl Biochem Biotech2010,160:1277–1292），特异性引物退火温度为64℃。扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到外切菊粉酶基因inuAJB13，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：重组外切菊粉酶InuAJB13的制备

以inuAJB13F和inuAJB13R为引物对（表1），鞘氨醇单胞菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到外切菊粉酶基因inuAJB13，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将外切菊粉酶基因inuAJB13和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，获得含有inuAJB13的重组表达质粒pEasy-E2-inuAJB13。将pEasy-E2-inuAJB13转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/inuAJB13。

取含有重组质粒pEasy-E2-inuAJB13的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/inuAJB13，以0.1%的接种量接种于LB（含100μgmL^-1Amp）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含100μgmL^-1Amp）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0McIlvaine缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组外切菊粉酶InuAJB13在大肠杆菌中得到了表达，经500mM的咪唑洗脱后，产物为单一条带。

实施例3：纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的性质测定

1、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的活性分析：

实施例2纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的活性测定方法采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适当稀释酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖（以果糖计）所需的酶量。对底物p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside的测定采用pNP法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加1.5mL1MNa₂CO₃终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位（U）定义为每分钟分解底物产生1μmolpNP所需的酶量。

2、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的pH活性和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将外切菊粉酶InuAJB13在37℃下和0.1MpH3.0–8.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0.1MpH3.0–7.0的缓冲液中，在37℃下处理60min，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以加ddH₂O代替缓冲液并在37℃下保温60min的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH3.0–8.0）。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的InuAJB13的酶学性质。结果表明：InuAJB13的最适pH为5.5，在pH4.0–7.0的范围内维持50%以上的酶活性（图2）；经0.1MpH4.0–7.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达90%以上（图3）。

3、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的热活性及热稳定性测定：

酶的热活性测定：在pH5.5的缓冲液中，于0–70℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液分别置于37℃、50℃和60℃中，处理0–60min后，在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的InuAJB13的酶学性质。结果表明：InuAJB13的最适温度为55℃，在10–70℃内都具有酶活（图4）；37℃时该酶的半衰期大于60min，50℃时该酶的半衰期约为15min，60℃时该酶快速失活（图5）。

4、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH5.5及55℃下，以0.3%（w/v）的菊粉为底物，依次在酶促反应的1–10min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–1.0%（w/v）的菊粉为底物，在pH5.5、55℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、V_max和k_cat。经测定，在55℃及pH5.5条件下，InuAJB13对菊粉的K_m、V_max和k_cat分别为8.9mg mL^-1、263.2μmol min^-1mg^-1和245.0s^-1。

5、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组菊粉酶InuAJB13活力的影响：

在酶促反应体系中加入一定终浓度的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃及pH5.5条件下，以菊粉为底物测定酶活性。结果（表2，表3）表明：1mM的HgCl₂完全抑制InuAJB13；添加100mM的CTAB，InuAJB13受到部分抑制；而1mM的β-Mercaptoethanol对InuAJB13有明显的促进作用，提高InuAJB13的酶活约为0.4倍；其余表面活性剂（SDS、1mM和10mMCTAB、TritonX-100、Tween80）、EDTA及大部分金属离子对该酶活性无影响或影响微弱。

表2.金属离子及化学试剂对纯化的重组InuAJB13活力的影响

表3.表面活性剂对纯化的重组InuAJB13活力的影响

6、市售洗衣液对纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13活力的影响：

用纯净水配制一定终浓度的市售洗衣液（pH自然），并添加0.5%（w/v）的菊粉，在37℃下，加入适量重组外切菊粉酶InuAJB13酶液测定酶活性。结果（表4）表明，0.6%(v/v)的蓝月亮（薰衣草香型深层洁净护理）对该酶部分抑制，0.3%(v/v)的洗衣液和0.6%(v/v)的其它洗衣液对该酶活性无影响或影响微弱。

表4.市售洗衣液对纯化的重组InuAJB13活力的影响

7、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的NaCl抗性及NaCl稳定性测定：

酶的NaCl抗性测定：在酶促反应体系中加入0.2–4.5MNaCl，于pH5.5及37℃下进行酶促反应。酶的NaCl稳定性测定：将纯化的酶液置于0.2–4.5M的NaCl水溶液中，在37℃下处理60min，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未加NaCl但在37℃下保温60min的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的InuAJB13的酶学性质。结果表明：0.6–4.5M的NaCl可提高该酶酶活0.2–0.6倍（图6）；经0.2–4.5M的NaCl在37℃下处理60min，该酶仍能保持100%以上的活性（图7）。

8、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的乙醇抗性及乙醇稳定性测定：

酶的乙醇抗性测定：在酶促反应体系中加入3.0–20.0%（v/v）乙醇，于pH5.5及37℃下进行酶促反应。酶的乙醇稳定性测定：将纯化的酶液置于3.0–20.0%（v/v）的乙醇中，在37℃下处理60min，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未加乙醇但在37℃下保温60min的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的InuAJB13的酶学性质。结果表明：随着乙醇含量的增加，InuAJB13活性逐渐降低，但在3.0–10.0%（v/v）的乙醇范围内可维持50%以上的酶活性（图8）；经3.0–15.0%（v/v）的乙醇在37℃下处理60min，该酶仍能保持88%以上的活性（图9）。

9、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13的蛋白酶抗性测定：

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍（w/w）的胰蛋白酶（pH7.5）和蛋白酶K（pH7.5）在37℃对重组酶处理1h，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以置于蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。结果表明：经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，InuAJB13仍能分别保持115.1%和105.7%的酶活。

10、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13对底物的降解：

在pH5.5及55℃下，该酶对0.5%（w/v）菊粉、蔗糖、棉籽糖（Raffinose）、水苏糖（Stachyose）、β-2,6-果聚糖（Levan）和可溶性淀粉的比活分别为73.7±9.3U mg^-1、1655.3±63.5U mg^-1、244.0±8.9U mg^-1、152.6±10.1U mg^-1、27.7±0.2U mg^-1、16.1±1.8Umg^-1，而对桦木木聚糖（Birchwood xylan）、山毛榉木聚糖（Beechwood xylan）、4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan、阿拉伯木聚糖（Wheat flour arabinoxylan）及p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside均无酶活。该酶菊粉酶活力/蔗糖酶活力约为0.4，表明该酶为菊粉酶（陈晓明等食品与生物技术学报,2009,28:577–588）。

11、纯化的重组外切菊粉酶InuAJB13水解菊粉和洋姜块茎的产物分析：

水解菊粉的产物分析：产物分析反应体系含4.5mL0.5%（w/v）的菊粉，0.5mL适当稀释酶液（共0.5U酶液）。在pH5.5及37℃下，依次在酶促反应的10min–6h内终止反应并分析水解产物。产物分析采用薄层层析法（使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型）。

水解洋姜块茎的产物分析：产物分析反应体系含27mL10%（w/v）已晒干洋姜粉，3mL适当稀释酶液（共45U酶液）。在pH5.5及37℃下，依次在酶促反应的10min–6h内终止反应并分析水解产物。产物分析采用薄层层析法（使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型）。

薄层层析步骤如下所示：

（1）配制展开剂（冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀），取适量倒入展开槽，静置30min左右；

（2）将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样（每次0.5μL，吹干，共点3次）；

（3）将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

（4）待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

（5）第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂（1g二苯胺溶于50mL丙酮中，溶解后加入1mL苯胺及5mL85%的磷酸，混匀，现用现配）；

（6）几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显色。

结果表明：在不同时间下，InuAJB13水解菊粉和洋姜块茎的产物均为果糖和少部分的葡萄糖，表明InuAJB13是外切型菊粉酶（图10，图11），InuAJB13对洋姜块茎具有较好的降解作用。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶InuAJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

2.一种编码权利要求1所述的外切菊粉酶InuAJB13的外切菊粉酶基因inuAJB13，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

3.一种包含权利要求2所述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组载体。 

4.一种包含权利要求2所述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组菌株。